Pada percobaan High Performance Liquid Chromatografr (HPLC),

bertujuan untuk..... HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang

dilakukan dengan memakai fase diam yang terikat secara kimia pada
penyangga halus yang distribusi ukuranya sempit ( kolom ) dan fase gerak
yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan memakai
tekanan tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi
dan waktu yang relative singkat.
Injektor (penyuntikan sampel)
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung
kedalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom
menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan
katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal
atau eksternal. Injeksi sample seluruhnya otomatis dan tidak akan
mengharapkan bagaimana mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar.
Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan
kromatografi gas.
Pada saat pengisian, sampel digelontor melewati keluk sampel dan
kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan katup
diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan
menggelontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikkan dengan keluk
sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1 %. Penyuntikkan ini mudah
digunakan untuk otomatisasi dan sering digunakan untuk autosampler pada
KCKT.
Injektor merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom.
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom
menuju detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur
berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel
menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.
Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan
bergantung pada: tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh
pada laju alir dari pelarut) kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari
material apa, tetapi juga pada ukuran partikel) komposisi yang tepat dari
pelarut temperatur pada kolom 1. Elusi Gradien Elusi Gradien
didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis
kromatografi berlangsung.

Analisis dan Pembahasan

Pada percobaan KCKT atau Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
dengan judul “Analisis Asam Cuka” ini bertujuan untuk menentukan kadar
asam cuka pasar secara KCKT.
Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit
berdasarkan kepolarannya. Adapun prinsip kerja dari alat HPLC adalah
ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka
sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-
senyawa kimia (analit) sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Hasil
pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector
(spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang
gelombang tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya
dicatat oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan
integrator atau menggunakan personal computer (PC) yang terhubung
online dengan alat HPLC tersebut.

Pada prinsipnya kerja HPLC adalah sama yaitu pemisahan analit-

analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa
diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling
membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC
digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit
akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai
kedektetor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada
spectrum yang puncak-puncaknya terpisah. Ukuran skala polaritas :
golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi <
golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alcohol <
golongan asam.
Dalam percobaan ini, langkah pertama yang dilakukan
Sebelum melakukan percobaan kami meyiapkan alat dan bahan
yang digunakan diantaranya adalah asam cuka standar, asam cuka pasar,
aquades, pipet, tabung reaksi, gelas ukur, labu ukur, serta seperangkat alat
KCKT Hewlet Packard.
Larutan induk yang digunakan dalam percobaan ini adalah larutan
induk asam cuka, larutan tak berwarna, dengan berbagai konsentrasi yaitu
( 1; 1,5; 2).10-2 M; 9.10-3 M; 0,1 M ) yang telah disiapkan oleh koas.
Percobaan dimulai dengan menyiapkan 100 µL larutan standar
dengan berbagai konsentrasi. Kemudian memasukkan larutan ke dalam
syring yang telah dibersihkan dengan aquades dan larutan standar asam
cuka. Menginjeksikan ke dalam spektrofotometri HPLC yang telah diatur
pada panjang gelombang 240 nm dengan kecepatan alir fasa gerak 1
mL/menit. Menyimpannya dalam folder kromatogram kemudian
menentukan kurva standarnya.
Dalam percobaan ini luas puncak larutan standar yang kami
dapatkan yaitu
Konsentr Luas Waktu
asi (M) Puncak Retensi
0 0 0
9x10-3 180,9782 4,067
9
-2
1x10 251,6137 4,266
5
1,5x10-2 306,9322 4,226
2
2x10-2 433,7090 4,242
0,1 2304,531 4,067
01
Dari data tersebut kami menentukan kurvanya yaitu
 Dari kurva tesebut kami mendapatkan persamaan y yaitu
y = 13144x + 14,503 dengan R2 sebesar 0,9993
Langkah selanjutnya yaitu menginjeksikan larutan asam cuka pasar
yang telah diencerkan kemudian memplotkan luas puncak kromatogram
yang kami dapatkan ke dalam kurva standar. Kemudian menentukan kadar
asam cuka pasar yang kami gunakan sebagai sampel.
Kadar asam cuka pasar dengan luas area sampel 608,87225 sebesar
y = 23144 x – 14.503
602.87225 = 23144 x – 14.503
602.87225 + 14.503 = 23144 x
x = 0,02667
Sampel diencerkan dari 1 mL asam cuka pasar menjadi 10 mL,
maka faktor pengenceran menjadi :
V
D= 2
V1
10 mL
D= =10 mL
1 mL
Kemurnian larutan (M) sebesar 25 % = 0,25
Kadar sampel = interpolated amount (x) X DX M
= 0,02667 x 10 x 0.25= 0,066 Molar
Persamaan reaksi dalam percobaan ini adalah :
CH3COOH (aq) + H2O(l) CH3COOH(aq)
I.Kesimpulan