SPEKTROFOTOMETRI

PENDAHULUAN
HUKUM BEER-LAMBERT Pengurangan intensitas cahaya monokromatis yang melalui suatu larutan berwarba berlangsung secara eksponensial dan bergantung pada panjang larutan yang dilalui cahaya dan kadar zat dalam larutan. Hukum Beer-Lambert menghasilkan persamaan sebagai berikut : Log I / I0 = -kcl Dimana : I0 = Intensitas cahaya masuk I = Intensitas cahaya keluar k = konstanta yang didasarkan pada sifat-sifat zat dalam larutan c = konsentrasi zat tersebut l = panjang larutan yang dilalui cahaya
Pembandingan I/I0 disebut sebagai transmisi sinar (T) dan dinyatakan dalam persen (%). Serapan (absorbance) = A atau disebut juga kerapatan optik (optical density) = OD, merupakan istilah yang lebih sering digunakan dan berasal dari persamaan :

A = -log T Jadi Ada juga rumus : A=kcl A=Ecl

Dengan : A = serapan, densitas optik yaitu jumlah cahaya yang diserap

E = koefisien ekstingsi, yaitu serapan senyawa dengan kadar 1 M, pada panjang gelombang tertentu dengan diameter kuvet / panjang larutan yang dilalui cahaya = 1 cm
c = kadar sample yang diperiksa l = diameter kuvet / panjang larutan yang dilalui cahaya = 1 cm

Dari : I = I0 e
kl

I = I0 e Keterangan : I = intensitas yang keluar I0 = intensitas mula-mula

k l

Transmitten

I T = ---- = e I0
-E c l

Diambil lognya saja untuk memudahkan perhitungan :

I Log ------- = k c l I0

I Log ------ = A I0

Dikenal sebagai absorbance

Absorbance berbanding lurus dengan kadar zat

Penggunaan spektrofotometri ada 2 cara : 1. Langsung / absolute, bila E diketahui, A bisa menyatakan kadar. c=A/E 2. Gunakan larutan standar (tidak langsung), larutan standar 5% diperiksa absorbance.

Ambil larutan yang tidak diketahui : U . cstandar C = ----------------absorbance

Keterangan : U = absorbance yang tidak diketahui Jika berat molekul (BM) diketahui dapat dicari koefisien ekstinsi (E) Jika BM tidak diketahui, dilakukan perbandingan

Scanning panjang gelombang bertujuan untuk mencari gelombang dari yang tinggi sampai dengan yang dekat UV.

MAC (Molar Absorbance Coefisien) atau E (koefisien estingsi). Syarat-syarat suatu zat agar diketahui MAC-nya : 1. Zatnya murni 2. Zatnya kering 3. BM-nya diketahui 4. Bila E-nya tidak diketahui maka harus digunakan larutan standar sebagai perbandingan Contoh : larutan glukosa 1 M, berarti 180 gr/1 liter.

Elektrofosa digunakan untuk mengetahui pergerakan suatu molekul dalam muatan listrik.

Keterangan gambar : 1 = tombol on/off 2 = tombol pengatur panjang gelombang 3 = tombol pengatur cahaya (A=0, T= 100%) 4 = penunjuk panjang gelombang 5 = penunjuk serapan dan % transmittance (A dan %T) 6 = tempat sample dengan tutup Spectronic 20 merupakan single bearm. Dalam percobaan, tidak dapat tepat linear. Oleh sebab itu harus degradasi atau dicari rata-ratanya dan dibuat garis lurusnya.

Pada setiap penetapan secara kalorimetri selalu, 1. Dipergunakan larutan blanko 2. Dipergunakan larutan uji 3. Penetapan duplo, pengulangan uji larutan sebanyak 2 kali dengan tujuan memperkecil kesalahan larutan standar sebagai pembanding terhadap

Larutan blanko mengandung semua pereaksi kecuali bahan yang diperiksa. Blanko dimaksudkan untuk menghilangkan interferensi yang dapat disebabkan oleh zat lain yang terdapat dalam larutan yang menyerap cahaya pada panjang gelombang yang sama. Untuk itu zat yang diperiksa diganti dengan akuades dengan volume yang sama.

PROSEDUR PEMAKAIAN SPECTRONIC 20 BAUSH-LOMB

1. Memutar tombol ( 1 ) ( tombol sebelah kiri ) ke kanan. Membiarkan 15 menit untuk memanaskan alat. Mengatur tombol sampai menunjuk angka 0 pada petunjuk %T. 2. Memutar tombol ( 2 ) ( tombol yang di sebelah atas alat ) untuk memilih panjang gelombang sesuai panjang gelombang yang diinginkan. 3. Memasukkan kuvet yang berisi paling sedikit 3 mL aquades ke dalam tempat sample ( sebelum memasukkan kuvet, pastikan bahwa kuvet daam keadaan kering dengan mengeringkannya menggunakan kertas tisu ). Menutup penutup tempat sample. 4. Memutar tombol ( 3 ) ( tombol yang terletak di sebelah kanan ) sehingga %T menunjuk angka 100 atau A menunjuk angka 0. 5. Mengangkat kuvet yang berisi aquades dari tempat sample ( 6 ). Mengganti isi kuvet dengan larutan blanko, kemudian membaca serapannya. 6. Mengganti larutan blanko dalam kuvet dengan larutan standar atau larutan uji. Kemudian membaca serapannya.

HAL-HAL YANG PERLU DIPERHATIKAN SELAMA PEMERIKSAAN

1. Pada tiap pemeriksaan jangan lupa menutup tempat kuvet. 2. Tabung kuvet yang akan dibaca harus dalam keadaan bersih. 3. Bila pada dinding tabung kuvet terdapat udara, hilangkan dengan menjentikjentikan tabung dengan jari. 4. Jangan sampai menumpahkan cairan yang diperiksa ke dalam lubang tempat kuvet atau pada alat. 5. Pastikan bahwa larutan yang akan diperiksa sudah tercampur dengan baik sebelum melakukan pengukuran. 6. Pengukuran selalu dikerjakan dalam duplo, 7. Untuk penetapan pada panjang gelombang yang berada pada tiap panjang gelombang, alat harus ditera dengan aquades. ( A harus menunjuk angka 0 atau 100% T ).

PERCOBAAN 1

Tujuan Dasar

: Menentukan panjang gelombang dengan serapan maksimum. : Suatu zat berwarna menyerap cahaya pada panjan gelombang tertentu. :

Alat dan Pereaksi

1. Spektrofotometer Spectronic-20 2. Kuvet 3. Larutan hematin alkalis (1 ml darah diencerkan dengan amonia encer sampai mencapai volume 500 mL) Cara Kerja : 1. Menyediakan 2 tabung kuvet pada tabung 1 masukkan 5 mL akuades (sebagai blanko) dan pada tabung ke-2, 5 mL larutan hematin alkalis. 2. Membaca serapan larutan itu pada panjang gelombang antara 500 dan 600 nm dengan interval 10 nm. Perhatikan bahwa pada setiap pembacaan pada suatu panjang gelombang alat ditera dengan blanko yang berisi akuades (A=0 atau T=100%) 3. Membuat kurva dengan panjang gelombangsebagai sumbu x dan A sebagai sumbu y.

HASIL

Panjang Gelombang (nm) 500 510 520 530 540 550 560 570 580

Serapan 0,095 0,1 0,095 0,075 0,06 0,045 0,03 0,02 0,01

590 600

0,01 0,009

PERTANYAAN 1. Pada panjang gelombang berapa hematin alkalis memperlihatkan serapan maksimum? 2. Mengapa diperlukan tindakan warm-up dari spektrofotometer sebelum dipergunakan? JAWABAN 1. Natrium Kobalt Nitrat memperlihatkan serapan maksimum pada panjang gelombang 510 nm, yaitu 0,1. 2. Karena tindakan warm up berguna untuk menstabilkan keadaan spektrofotometer, sehingga hasil yang didapatkan dapat menjadi seakurat mungkin. Dengan demikian, tidak akan terjadi kesalahan dalam pengukuran nilai absorban. KESIMPULAN Dari percobaan yang kita lakukan diatas, kita dapat menarik kesimpulan, bahwa
masing-masing panjang gelombang mempunyai daya serapan cahaya yang berbeda-beda. Setiap zat menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu dan akan menyerap secara maksimum pada panjang gelombang tertentu. Pada percobaan yang telah kami lakukan,

bahwa serapan (Abs) maksimum terjadi pada panjang gelombang 510 nm, dan setelah itu kurva mulai menurun.

GRAFIK

PERCOBAAN 2
Tujuan Dasar : Membuktikan hukum Beer-Lambert : Jumlah cahaya yang diserap oleh suatu larutan pada panjang gelombang tertentu sebanding dengan kadar zat dalam larutan. Bila hukum BeerLambert ini dilakukan oleh larutan tersebut, maka kurva hubungan serapa (A) dengan kadar zat akan merupakan garis lurus.

Alat dan Pereaksi : 1. Pektrofotometer Spectronic-20 2. Kuvet 3. Darah oksalat atau heparin 4. Pipet Mohr 10 ml 5. Labu volumetrik 100 ml 6. 6 tabung reaksi 7. Kertas grafik Cara Kerja :

1. Mengencerkan 1 ml darah oksalat dalam labu volumetrik menjadi 500 ml dengan larutan ammonia encer (4 ml amonia pekat dalam 1 L aquades). Kemudian mengocok dengan membalik-balikannya. 2. Meneteskan dengan pipet ke dalam 6 buah tabung reaksi masing-masing : 0,0 mL ; 2,0 mL ; 4,0 mL ; 6,0 mL ; 8,0 mL ; dan 10 mL darah amonia tersebut. Kemudian menambahkan

amonia encer ke dalam 6 tabung berturut-turut : 10 mL ; 8 mL ; 6 mL ; 4 mL ; 2 mL ; 0,0 mL. 3. Kemudian membaca serapa tiap-tiap tabung dengan menggunakan tabung 1 sebagai blanko pada panjang gelombang maksimum yang didapat pada percobaan 1. 4. Membuat kurva pada selembar kertas grafik dengan A (serapan) sebagai sumbu y dan pengenceran sebagai sumbu x.

Hasil %T 0.5 1 1.5 2 3

: A (Serapan) 0.1 0.2 0.24 0.39 0.51

X 0,5 1 1,5 2 3 X=8

Y 0,1 0,2 0,24 0,39 0,51 y=1,44

XY 0,05 0,2 0,36 0,78 1,53 XY=2,92

X2 0,25 1 2,25 4 9 X2=16,5

Y2 0,01 0,04 0,0576 0,1521 0,2601 Y2=0,51 98

Perhitungan :

X = --------- = -------- = 1,6 n 5

1,44

Y = ----------- = ----------- = 0,288 n 5

X . Y XY - ------------------n a = -------------------------------(X)2 2 X - ---------n

8 . 1,44 2,92 - -----------5 = ---------------------------82 16,5 - -------5

= 0,17

b = y ax = 0,288 (0,17 . 1,6) = 0,288 0,272 = 0,016

y = ax + b y = 0,17x + 0,016

y1 = 0,17x1 + 0,016 = 0,17 . 0,5 + 0,016 = 0,101 Abs

y2 = 0,17x2 + 0,016 =0,17 .1 + 0,016 = 0,186 Abs

y3 = 0,17x3 + 0,016 = 0,17 . 1,5 + 0,016 = 0,271 Abs

y4 = 0,17x4 + 0,016 = 0,17 . 2 + 0,016 = 0,356 Abs

y5 = 0,17x5 + 0,016 = 0,17 . 3 + 0,016 = 0,526 Abs

Pertanyaan

1. Apakah anda mendapat garis lurus pada kurva yang anda buat? Bagaimana bentuk kurvanya bila yang anda gunakan pada sumbu y adalah transmittance (T)? 2. Apa yang harus anda lakukan bila serapan suatu tabung berisi larutan yang sama berada di luar batas-batas kurva yang anda buat?

Jawaban

1. Pada kurva yang dibuat, garis yang dihasilkan tidak membentuk suatu garis lurus. Ini dikarenakan data yang dibuat tidak akurat sehingga tidak dapat membuat garis lurus.

2. Jika serapan suatu tabung berisi larutan yang sama berada diluar batas-batas kurva yang dibuat, maka kita harus membuat suatu grafik dengan garis lurus, yang harus ditentukan dengan menggunakan rumus y= ax-b

Kesimpulan

Jumlah suatu cahaya yang diserap suatu zat pada panjang gelombang tertentu berbanding lurus dengan kadar zat dengan larutan yang dipakai. Semakin tinggi kadar zat, semakin banyak cahaya yang diserap. Dengan demikian, hukum Beer-Lambert terbukti, bahwa intensitas cahaya monokromatis tergantung pada panjang gelombang dan kadar suatu zat dalam suatu larutan. Seharusnya, jika larutan ini mengikuti hukum BeerLambert, garis grafik yang dihasilkan adalah garis lurus. Tetapi karena percobaan yang dilakukan kurang akurat dan kurangnya ketelitian praktikan pada saat melakukan praktikum, sehingga garis yang didapat pada grafik bukan merupakan garis lurus.

Grafik

PEMBAHASAN 3
Tujuan diketahui. Dasar : menentukan kadar suatu larutan yang belum :kadar suatu zat dapat diketahui membandingkannya dengan kadar standar : dengan

Alat dan pereaksi

1. Spektrofotometer spektronik-20 2. Kuvet 3. 3 buah tabung reaksi 4. Pipet Mohr 10 mL 5. Kertas grafik 6. Larutan hematin alkalis (U1, U2, U3) Cara kerja :

1. Menyiapkan 3 buah tabung reaksi yang bersih dan kering 2. Mengisi tabung pertama dengan 5 ml larutan U1 3. Mengisi tabung kedua dengan 5 ml larutan U2 4. Mengisi tabung ketiga dengan 5 ml larutan U3 5. Membaca serapan dan menghitung kadar larutan U1, U2,U3 berdasarkan kurva yang dibuat pada pelajaran 2. Hasil Larutan U1 U2 : Serapan maksimum 0,08 0,13 pada kadar 0,40% 0,65%

U3

0,24

1,25%

Kadar U1, U2, dan U3 dengan menggunakan rumus CU1 = 0,08 x 0,5 % = 0,40 % 0,1 CU2 = 0,13 x 0,5 % = 0,65 % 0,1 CU3 = 0,25 x 0,5 % = 1,25 % 0,1

Kesimpulan

Pada percobaan ketiga ini dapat disimpulkan bahwa kadar suatu zat dalam larutan dapat diketahui dengan membandingkannya dengan kadar standar yaitu membandingkan antara jumlah serapan zat dengan kadar standar yang telah diketahui. Dengan menggunakan panjang gelombang maksimum (yaitu = 510 nm), kita dapat mengetahui daya serap sampel, lalu membandingkannya dengan larutan standar cobalt nitrat 0.5% dengan rumus : Kadar = A rata-rata x 0,5% A
max

Untuk menentukan kadar suatu larutan yang telah diukur serapannya dapat menggunakan rumus : Cu = A yang diuji x Cstandar A standar

Grafik

Daftar Pustaka

Bagian Biokimia FKUI. Biokimia : Eksperimen Laboratorium . 2001. Jakarta : Widya Medika.