Praktikum Kalibrasi Alat

Kalibrasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Disusun Oleh: kelompok I

Isma Masrurotul F NIM.18231006

UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
Jl. Kaliurang km 14.5, Sleman, Yogyakarta 55584
2019/2020
I. Dasar teori
HPLC (Tinggi Performa Cair Kromatografi) atau biasa juga disebut dengan
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan
awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik lanjut yang diterima secara luas
untuk analisis bahan obat, baik dalam jumlah besar atau dalam sediaan farmasetik.
Kromatografi Cair Berperforma Tinggi (high performance liquid chromatography,
HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untukzat cair yang biasanya disertai
dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya
untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat
tertentu.
Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa
diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa
sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu
dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan
kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.
HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk
material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih
besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini
memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.
Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode
pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat
peka.
HPLC berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan
diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50µm sedangkan
laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi. Aplikasi analisis HPLC adalah untuk
penentuan kualitatif dan penentuan kuantitatif. Prinsip dasar HPLC sebenarnya adalah
dinamika dan migrasi dengan menggunakan dua fasa. HPLC biasanya digunakan untuk
senyawa untuk yang berberat molekul tinggi dan tidak menguap, dimana penyerapan
semakin baik jika molekul berada pada bentuk terkecil sehingga pemisahan pun juga
akan semakin baik. Setelah pemisahan ini, selanjutnya diidentifikasikan secara kualitatif
dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut secara
kuantitatif.

 Penentuan Kualitatif HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada

waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu
retensi sampel dibandingkan dengan larutanstandar.
 Penentuan Kuantitatif Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat
dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:
 1. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel
2. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama
3. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan
menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.
4. Berdasarkan area kromatogram
5. Berdasarkan tinggi puncak kromatogram
Umumnya hasil analisis HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam
kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis
komponendalam sample. Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan
mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling
bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan
konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi
sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup
bersih dari impuritis.

II. Tujuan praktikum

Melakukan pemantauan kinerja alat KCKT

III. Alat
Alat yang digunakan selama praktikum berlangsung yaitu Seperangkat alat HPLC,
ultrasonik, gelas beker, kertas saring, labu ukur 50 mL

IV. Bahan
Bahan yang diperlukan dalam praktikum ini adalah Parasetamol standar, metanol,
dan air suling/akuades

V. Prosedur kerja
a. Pembuatan fasa gerak

metanol : akuades

Di buat campuran dengan perbandingan (7:3) sebanyak 500 mL.

Dihomogenkan pada ultrasonik.

Fase gerak
b. Pembuatan larutan standar 100 ppm

5 mg standar paracetamol.

Di Larutkan dalam fase gerak pada labu ukur 50 mL,

diultrasonik hingga homogen.

Disaring larutan

Filtrasi Residu

Larutan standar 100 ppm

area
c. Optimasi alat HPLC

Alat HPLC

Di tentukan tekanan laju alir fasa gerak

Di pilih jenis pompa yang digunakan

Alat HPLC siap

d. Pengukuran waktu retensi dan luas area

Sampel

Di Masukkan ke dalam vial

Di Ukur waktu retensi dan luas area dengan HPLC

Di Lakukan pengulangan sebanyak 5 sampai 6 kali

 Waktu retensi dan luas area
VI. Hasil dan Pembahasan
6.1 data pengamatan
a. Akurasi Laju Alir

Laju Alir Pengulanga Volume Waktu Waktu

(mL/menit) n Akhir (mL) (menit) Teori
1 20,05
2 20,23
3 20,50
0,5 10 20
4 19,85
5 20,21
6 20,33
1 9,98
2 10,17
3 10,35
1 10 10
4 9,68
5 10,06
6 10,24
1 5,31
2 5,07
3 5,19
2 10 5
4 4,88
5 4,91
6 5,21
b. Akurasi Injektor

No Parameter Nilai
1 Massa Awal 0,5382
2 Massa Akhir 0,2178
3 Densitas 0,9982
c. Presisi sistem

Pengulangan Waktu retensi (menit) Luas area

1 1,701 3143,66
2 1,703 3152,22
3 1,706 3111,13
4 1,703 3178,29
5 1,710 3099,78
6 1,705 3139,57
d. Penentuan Linearitas

Konsentrasi (%) Waktu Retensi Luas Area

 0,1 1,701 17749,14258
0,2 1,703 25863,08594
0,3 1,703 31436,64063
0,4 1,706 33420,32813
0,5 1,702 36115,85547

6.2 Analisis Data

a. Penentuan akurasi laju alir
0,5 mL/menit

Laju Alir Volume Waktu

Pengulangan Waktu (menit)
(mL/menit) Akhir (mL) Teori
1 20,05
2 20,23
3 20,50
0,5 10 20
4 19,85
5 20,21
6 20,33
Rata-Rata 20,20
Akurasi Laju Alir 0,98
1 mL/menit

Laju Alir Volume Waktu Waktu

Pengulangan
(mL/menit) Akhir (mL) (menit) Teori
1 9,98
2 10,17
3 10,35
1 10 10
4 9,68
5 10,06
6 10,24
Rata-Rata 10,08
Akurasi Laju Alir 0,80
2 mL/menit

Laju Alir Volume Waktu Waktu

Pengulangan
(mL/menit) Akhir (mL) (menit) Teori
1 5,31
2 5,07
3 5,19
2 10 5
4 4,88
5 4,91
6 5,21
 Rata-Rata 5,095
Akurasi Laju Alir 1,90

b. Penentuan akurasi injektor

No Parameter Nilai
1 Massa Awal 0,5382
2 Massa Akhir 0,2178
3 Densitas 0,9982
  Volume Injeksi 0,0535
c. Penentuan presisi sistem
Presisi waktu retensi

Waktu retensi (Xi-

Pengulangan Xbar Xi-Xbar
(menit) Xbar)^2
1 1,701 -0,0037 1,3444E-05
2 1,703 -0,0017 2,7778E-06
3 1,706 0,0013 1,7778E-06
1,705
4 1,703 -0,0017 2,7778E-06
5 1,710 0,0053 2,8444E-05
6 1,705 0,0003 1,1111E-07
Rata-rata 1,705 SUM 4,9333E-05
SD 0,0031
%RSD 0,18
Presisi luas area

Pengulangan Luas area Xbar Xi-Xbar (Xi-Xbar)^2

1 3143,664 6,2212 38,7029147
2 3152,221 14,7782 218,39421
3 3111,132 -26,3108 692,259951
3137,4428
4 3178,291 40,8482 1668,57272
5 3099,782 -37,6608 1418,33837
6 3139,567 2,1242 4,51208403
SUM 4040,78025
SD 63,5277911
%RSD 2,02482705
d. Penentuan linearitas

Konsentrasi (%) Waktu Retensi Luas Area

0,1 1,701 17749,14258
0,2 1,703 25863,08594
0,3 1,703 31436,64063
0,4 1,706 33420,32813
 0,5 1,702 36115,85547
Slope 44291
Intersep 15630
R2 0,9231

Kurva Kalibrasi
40,000
Luas Area
f(x) = 44290.67 x + 15629.81
20,000 R² = 0.92

0
0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55
Konsentrasi

6.3 Pembahasan
HPLC adalah suatu teknik kromatografi yang menggunakan fasa gerak cair,
bisa digunakanuntuk lanjut sekaligus untuk analisis.Berdasarkan kekuatan /
kepolaran fasa geraknya KCKT dibagi menjadi:

• Fasa normal : Fasa gerak kurang kutub dibandingkan fasa diam

• Fasa Terbalik : Fasa gerak lebih kutub dibandingkan fasa diam

Fase normal HPLC

Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non kutub misalnya
heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter intern 4.6 mm (dan mungkin
kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. Senyawa-senyawa kutub
dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang kutub
dibandingkan degan senyawa-senyawa non kutub. Oleh karena itu, senyawa yang
non kutub kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

Fase balik HPLC

Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika melanjutkan menjadi non kutub
melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara
sederhana baikterdiri atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut kutub
digunakan terdiri campuran udara dan alkohol seperti metanol. Dalam kasus ini,
akan berada sisa yang kuat antara pelarut kutub dan molekul kutub dalam campuran
yang melalui kolom. Penginapan yang terjadi tidak akan sekuat sisa antara rantai-
rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dsebuah molekul-
molekul kutub dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul kutub dalam
campuran akan menghabiskan lama untuk bergerak bersama dengan pelarut.
Senyawa-senyawa non kutub dalam campuran akan mungkin membentuk sisa
dengan gugus hidrokarbon karena keberadaan dispersi gaya mobil van der Waals.
Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan
pemutusan ikatan hidrogen bahkan berbicara senyawa-senyawa tersebut berada
dalam molekul-molekul udara atau metanol misalnya. Oleh bagaimanapun,
senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak
lambat dalam kolom. Ini berarti itu molekul- molekul kutub akan bergerak lebih
cepat melalui kolom.Di dalam kromatografi cair komposisi dari terlarut atau rasa
gerak adalah salah satu dari variabel yang berpengaruh lanjut. Ada variasi yang
sangat luas pada terlarut yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat
umum yang sangat sisa, yaitu rasagerak harus :

1. Murni, tidak berada kontaminan

2. Tidak mengingat dengan wadah (pengepakan)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "Sampel pemulihan"
7. Diperdagangkan bisa diperoleh dengan harga murah (masuk akal
harga)Istirahat, semua terlarut yang sudah digunakan langsung membuang
karena prosedurpemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal
biayanya.

Pengukuran yang telah dilakukan, penentuan akurasi adalah ukuran seberapa

dekat suatu pengukuran dengan nilai yang sebenarnya dari kualitas yang diukur,
akurasi laju alir yang didapat dari 0,5 mL/menit sebesar 0,98 mL/menit, dari 1
mL/menit sebesar 0,80 mL/menit dan dari 2 mL/menit sebesar 1,90 mL/menit.
Penentuan akurasi injektor mendapatkan volume injektor sebesar 0,0535.
Pengukuran presisi yaitu derajat keunggulan dari suatu teknik yang digunakan untuk
mendapatkan hasil. Presisi mengukur tingkat yang mana hasilnya mendekati
satusama lain atau berkerumunan bersama-sama. Semakin tinggi level presisi, maka
semakin kecil variasi antar pengukuran. Penentuan presisi sistem pada waktu retensi
mendapatkan hasil sebesar 0,18% hasil ini memenuhi syarat mutunya ≤ 2% dan
untuk presisi luas area mendapatkan hasil 2,02% hasil ini tidak memenuhi syarat
mutu nya karena lebih dari 2%. Penentuan linearitas Linearitas merupakan
kemampuan metode untuk mendatangkan hasil uji yang secara langsung sebanding
dengan konsentrasi analit dalam suatu rentang kerja yang diberikan. Penentuan
linearitas dengan kurva kalibrasi antara konsentrasi dengan luas area menghasilkan
 y = slope 44291x + intersep 15630 dengan koefisien determinasi (R 2) 0,9231 hasil
ini kurang dari syarat mutunya yaitu ≥0,995 dan kofisien korelasinya (r) 0,9608
hasil ini memenuhi syarat mutu yaitu ≥0,95.

VII. Kesimpulan
Berdasarkan hasil dari praktikum kalibrasi alat HPLC bahwa nilai akurasi laju alir
yang didapat dari 0,5 mL/menit sebesar 0,98 mL/menit, dari 1 mL/menit sebesar 0,80
mL/menit dan dari 2 mL/menit sebesar 1,90 mL/menit. Penentuan akurasi injektor
mendapatkan volume injektor sebesar 0,0535. Presisi sistem pada waktu retensi 0,18%
dan pada luas area 2,02% dengan linearitas y = 44291x + 15630 dan R2 0,9231.

DAFTAR PUSTAKA

Andayani. 1998. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ( HPLC ). Batam. Badan Tenaga Nuklir
Nasional, Batam.

Anief , M. 2006. Ilmu Meracik Obat Teori dan Praktek. Yogyakarta. Gadjah Mada University
Press.

Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksana Validasi Metode Dan Cara Perhitungannya, Majalah Ilmu
Kefarmasian, Vol 1 : 117:135

Muaharraf, S.G ., Fatima, U.,Sultana, R.,2012, Strees, degradatinstudies and development of

stability-indicating TLC-densitometry method for determination of Prednisolone acetate
and chlramphenicol in thier individual and combined pharmaceytical formulation,
chemistry central journal, 6:7

Rohman , A., Gandjar I.G.,2007, Kimia Farmasi Analisis, Yogyakarta, Pustaka Pelajar

Waston, D.G., 2005, Analisis Farmasi, Jakarta, Penerbit Buku Kedokteran

VALIDASI

Bandung, 14 juli 2020

Disetujui oleh, Diperiksa oleh, Dibuat oleh,
Dosen Pengampu Asisten Praktikan

Ganjar Fadillah, S.Si., M.Si. - Isma Masrurotul F