Hasnah Lidiawati. 062112706. 2015.

Optimasi Fase Gerak pada penetapan kadar

campuran dextromethorphane HBr dan diphenhydramine HCl dalam sirup dengan
metode HPLC. Dibimbing Oleh Drs. Husain Nashrianto, M.S dan Ade Heri
Mulyati, M.Si.

RINGKASAN

Campuran dextromethorphane HBr dan diphenhydramine HCl

merupakan salah satu jenis kombinasi dalam formula sediaan sirup. Jumlah
sampel yang banyak dapat menyebabkan terjadinya keterlambatan dalam analisis,
beberapa strategi untuk mempercepat proses analisis beberapa zat aktif
diantaranya analisis secara bersamaan dalam satu analisis secara simultan. Dalam
analisis zat aktif secara simultan diperlukan optimasi fase gerak dan laju alir
sehingga diperoleh kondisi yang optimal. Tujuan penelitian ini untuk menentukan
perbandingan fase gerak dan laju alir yang diperlukan agar diperoleh kondisi yang
optimal dalam analisis campuran dextromethorphane HBr dan diphenhydramine
HCl dalam sirup dengan metode HPLC.
Penelitian dilakukan dengan menggunakan kolom Waters Sunfire C8
(4,6 mm x 250 mm, 5µm) dengan panjang gelombang 220 nm yang sebelumnya
dilakukan pendahuluan yaitu penentuan panjang gelombang maksimum dari
Dextromethorphan HBr dan Diphenhydramine HCl dalam sirup dengan
menggunakan metode spektrofotometri. Kemudian dilakukan uji kesesuaian
sistem dengan cara memodifikasi perbandingan fase gerak asetonitril dengan asam
trifluoro asetat (TFA) 0,1 % yaitu (30:70), (35:65), (38:62), dan (40:60) dengan
laju alir yang berbeda pada satu komposisi fase gerak yaitu 1,0 mL/menit, 1,2
mL/menit, dan 1,4 mL/menit dengan parameter resolusi, simpangan baku relatif
(SBR), tailing factor yang memenuhi persyaratan. Kemudian dilakukan uji
validasi pada metode dengan parameter presisi, akurasi, dan linearitas.
Berdasarkan hasil uji kesesuaian sistem didapatkan kondisi yang
optimal dalam komposisi fase gerak Acetonitril : TFA 0,1% dengan perbandingan
(30:70) dan laju alir 1,4 mL/menit dengan resolusi sebesar 3,157 dengan
persyaratan ≥ 2,5. Setelah dilakukan uji validasi didapat hasil pengujian linearitas
dengan koefisien korelasi (r) Dextromethorphan HBr sebesar 0,9999, dan
Diphenhydramine HCl sebesar 0,9999 dengan persyaratan r ≥0,9980, pengujian
akurasi menunjukkan rata-rata % recovery Dextromethorphan HBr sebesar
100,665 % dan Diphenhydramine HCl sebesar 100.901 %, pengujian presisi dan
diperoleh hasil RSD Dextromethorphane HBr sebesar 1,2 % dan
Diphenhydramine HCl sebesar 0,4 %.

Kata kunci : Optimasi; Fase Gerak; Campuran dalam Sirup; HPLC

1
I. Pendahuluan
Kromatografi cair kinerja
tinggi mempunyai kemajuan dalam
teknologi kolom, sistem pompa
tekanan tinggi, dan detektor yang
sensitif. Dengan teknologi ini,
kromatografi cair dapat
menghasilkan pemisahan yang cepat
dalam banyak hal, dengan
keunggulan zat-zat yang tidak
menguap atau tidak tahan panas,
tanpa penguraian atau tanpa perlu
membuat yang dapat menguap.
Disamping itu, komposisi fase gerak
berpengaruh nyata terhadap kinerja
kromatografi dan harus dikendalikan
dengan cermat (Depkes RI, 1995).
Penelitian sebelumnya
pemisahan dextromethorphane HBr
dan diphenhydramine HCl dalam
sirup dapat ditentukan dengan
menggunakan perbandingan fase
gerak asetonitril dengan asam
trifluoro asetat (TFA) 0,1 %
sebanyak (38:62) dengan jenis kolom
Water Atlantis dc 18 (4,6 mm x 150
mm, 5µm) dengan panjang
gelombang 220 nm, dengan laju alir
1,0 mL/menit. Daya pemisah
(resolusi) yang didapat yaitu 1,5.
(Muhamad Faisal Fuad, 2012).
Berdasarkan penelitian
sebelumnya, peneliti melakukan
penetapan kadar dextromethophan
HBr dan diphenhydramine HCl
dalam sirup dengan cara
memodifikasi perbandingan fase
gerak dan laju alir untuk
mendapatkan kondisi yang optimal
dalam analisis.
Penelitian dilakukan
dengan jenis kolom Waters Sunfire
C8 (4,6 mm x 250 mm, 5µm) dengan
panjang gelombang 220 nm yang
sebelumnya akan dilakukan uji
kesesuaian sistem dengan cara
memodifikasi perbandingan fase
gerak asetonitril dengan asam
2
trifluoro asetat (TFA) 0,1 % yaitu
(30:70), (35:65), (38:62), dan (40:60)
dengan laju alir yang berbeda pada
satu komposisi fase gerak yaitu 1,0
mL/menit, 1,2 mL/menit, dan 1,4
mL/menit dengan parameter resolusi,
simpangan relatif deviasi, dan tailing
faktor. Pengujian kesesuaian sistem
dilakukan untuk mengetahui apakah
alat, metode dan sistem HPLC yang
digunakan dapat memberikan hasil
yang baik dalam proses analisis.
Kemudian akan dilakukan uji
validasi pada metode.
II. Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan
dengan tiga tahap yaitu uji
identifikasi Diphenhydramien HCl
dan Dextrometrophan HBr dengan
cara memodifikasi perbandingan fase
gerak asetonitril dengan asam
trifluoro asetat (TFA) 0,1 % yaitu
(30:70), (35:65), (38:62), dan
(40:60), uji kesesuaian sistem dengan
cara memodifikasi perbandingan fase
gerak asetonitril dengan asam
trifluoro asetat (TFA) 0,1 % yaitu
(30:70), (35:65), (38:62), dan (40:60)
dengan laju alir yang berbeda pada
satu komposisi fase gerak yaitu 1,0
mL/menit, 1,2 mL/menit, dan 1,4
mL/menit dengan parameter resolusi,
simpangan relatif deviasi, dan tailing
faktor. Pengujian kesesuaian sistem
dilakukan untuk mengetahui apakah
alat, metode dan sistem HPLC yang
digunakan dapat memberikan hasil
yang baik dalam proses analisis.
Kemudian akan dilakukan uji
validasi pada metode dengan
parameter presisi, akurasi, dan
linearitas.
Metode Kerja
Kondisi HPLC
Kolom : Waters Sunfire C8 (4,6 mm
x 250 mm, 5µm)
Detektor : UV-220 nm
Volume injek : 20 µL
Syarat kesesuaian sistem
Laboratorium QC kimia-fisika
PT.Harsen:
Relatif Standar Deviasi(RSD)≤ 2,0%
Lempeng Teoritis (n) ≥ 750
Tailing ≤ 2,0
Resolusi ≥ 2,5
Fase Gerak :
Dicampurkan asetonitril dengan
asam trifluoro asetat 0,1 % dengan
perbandingan fase gerak (30:70),
(35:65), (38:62), dan (40:60)
kemudian homogenkan, saring
dengan menggunakan penyaring
berukuran 0,45 µm dan disonikasi
selama 30 menit.
Uji Kesesuaian Sistem HPLC
Ditimbang sebanyak 54,0 mg
diphenhydramine HCl dan sebanyak
40,0 mg Dextromethorphane HBr.
Dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0
mL, dilarutkan dan encerkan dengan
aquades hingga tanda batas. Dipipet
sebanyak 10,0 mL larutan
dimasukkan ke dalam labu takar 50,0
mL encerkan dengan aquades hingga
tanda batas, dihomogenkan.
Kemudian disonikasi 10 menit dan
saring dengan filter 0,25 µm.
Diphenhydramine HCl konsetrasi
216 µg/mL dan Dextromethorphan
HBr 160 µg/mL. Kemudian
disuntikkan ke dalam sistem HPLC
dengan volume penyuntikan 20 µl
pada kondisi HPLC menggunakan
perbandingan fase gerak asetonitril
dengan asam trifluoro asetat (TFA)
0,1 % yaitu (30:70), (35:65), (38:62),
dan (40:60) dengan laju alir yang
berbeda pada satu komposisi fase
gerak yaitu 1,0 mL/menit, 1,2
3
mL/menit, dan 1,4 mL/menit.
Kemudian parameter kesesuaian
sistemnya yang meliputi resolusi
(daya pisah), RSD, lempeng teoritis
dan faktor asimetri puncak.
Uji identifikasi
Uji identifikasi terhadap
diphenhydramine HCl dan
Dextromethorphane HBr dilakukan
dengan membandingkan waktu
retensi atau waktu tambat baku
diphenhydramine HCl dan
Dextromethorphane HBr terhadap
waktu retensi larutan sampel, diukur
pada panjang gelombang 220 nm.
Untuk mengetahui peak
diphenhydramine HCl dan
Dextromethorphane HBr perlu
dilakukannya penginjekkan masing-
masing baku tunggal. Kemudian
disuntikkan ke dalam system HPLC
dengan volume 20 µL pada kondisi
HPLC menggunakan fase gerak
asetonitril dengan asam trifluoro
asetat (TFA) 0,1 % yaitu (30:70),
(35:65), (38:62), dan (40:60).
Uji Validasi
Linearitas
Dipipet sampel sirup dengan
konsentrasi campuran 25%, 50%,
100%, 150% dan 200%. Encerkan
dengan aquades hingga tanda batas,
dihomogenkan dan saring dengan
menggunakan filter 0,45µm.
Konsentrasi Diphenhydramine HCl
yaitu 54 ppm, 108 ppm, 216 ppm,
324 ppm, 432 ppm dan konsentrasi
Dextromethorphan HBr yaitu 40
ppm, 80 ppm, 160 ppm, 240 ppm,
320 ppm. Kemudian disuntikkan ke
dalam sistem HPLC dengan volume
penyuntikan 20 µl pada kondisi
HPLC menggunakan fase gerak yang
telah memenuhi syarat kesesuaian
sistem.
Akurasi
Dipipet sejumlah sampel sirup
dengan konsentasi 50%, 100%, dan
150% masing-masing sebanyak 3
kali. Encerkan dengan aquades
hingga tanda batas, dihomogenkan
dan saring dengan menggunakan
filter 0,45µm. Kemudian disuntikkan
ke dalam sistem HPLC dengan
volume penyuntikan 20 µl pada
kondisi HPLC menggunakan fase
gerak yang telah memenuhi syarat
kesesuaian system. Dihitung
%recovery dan simpangan baku
relatif. Kriteria penerimaan
%recovery 98,0%-102%.
Presisi
Dipipet 10,0 mL sampel sirup
dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0
mL, dilarutkan dengan aquades
hingga tanda batas. Kemudian
disonikasi 10 menit dan saring
dengan filter 0,25 µm. Dipipet 2,0
mL dimasukkan ke dalam labu ukur
50,0 mL larutkan dengan aquades
hingga tanda batas, dihomogenkan.
Pengulangan sebanyak 6 kali.
Kemudian disuntikkan ke dalam
sistem HPLC dengan volume
penyuntikan 20 µl pada kondisi
HPLC menggunakan fase gerak yang
telah memenuhi syarat kesesuaian
sistem. Masing-masing dilakukan
disuntikkan sebanyak 1 kali sebagai
persyaratan presisi.
III. Hasil dan Pembahasan
Optimasi dilakukan
dengan menyuntikkan larutan
Diphenhydramine HCl konsentrasi
216 µg/mL dan Dextromethorphan
HBr dengan konsentrasi 160 µg/mL
kedalam sistem HPLC dengan
perbandingan fase gerak asetonitril
4
dengan asam trifluoro asetat (TFA)
0,1 % yaitu (30:70), (35:65), (38:62),
dan (40:60). Pada uji fase gerak ini
dengan komposisi fase gerak
asetonitril dengan asam
trifluoroasetat (TFA) 0,1 % (30:70)
terjadi pemisahan Dextromethorphan
HBr dan Diphenhydramine HCl
terpisah secara sempurna. Hasil
resolusi yang memenuhi syarat PT
Harsen ≥ 2,5 adalah komposisi fase
gerak asetonitril dengan asam
trifluoro asetat (TFA) 0,1 % yaitu
(30:70). Nilai resolusi yang rendah
menunjukkan bahwa
diphenhydramine HCl dan
dextromethorphan HBr tidak terpisah
sempurna hal ini disebabkan karena
penambahan pelarut organik
(asetonitril) pada komposisi yang
lain terlalu banyak menyebabkan
penurunan tingkat kepolaran fase
gerak sehingga sampel berinteraksi
kuat dengan fase gerak dan terelusi
cepat.
Dari data kesesuaian
sistem pada tabel diatas menujukkan
bahwa campuran Dextromethorphan
HBr dan Diphenhydramine HCl
dengan menggunakan komposisi fase
gerak asetonitril : TFA 0,1% (30:70)
dengan laju alir 1,4 mL/menit
memiliki waktu retensi lebih cepat
dari laju alir yang lain. Pada laju alir
1,4 mL/menit memiliki nilai resolusi,
faktor asimetris dan simpangan baku
relatif yang memenuhi persyaratan
tempat dilakukannya penelitian.
Penurunan nilai lempeng
teoritis pada laju alir 1,4 mL/menit
disebabkan karena interaksi sampel
dengan fase diam kecil menyebabkan
sampel menjadi cepat terelusi dan
waktu retensi cepat. Nilai lempeng
teoritis dipengaruhi oleh pemilihan
pada kolom. Kolom yang
memberikan jumlah lempeng teoritis
yang besar dan nilai HETP yang
kecil akan mampu memisahkan
komponen-komponen dalam suatu
campuran yang lebih baik yang
berarti bahwa efisiensi kolom
semakin besar.
Nilai faktor simetri
merupakan faktor yang membuat
suatu bentuk puncak menjadi
asimetris. Faktor simetri disebabkan
dari mekanisme reaksi hidrofobik
tergantung pada kemurnian partikel
silika yang ada dalam kolom KCKT
pada saat pemisahan yang
berinteraksi dengan senyawa analisa
yang membuat puncak menjadi
asimetris. Pengembangan metode
dan penelitian membutuhkan kolom
yang bagus dan murni untuk
mendapatkan hasil puncak yang
sempurna dan untuk menghindari
terjadinya tailing peak.
dalam pemilihan data persamaan
kurva baku yang didasarkan pada
nilai r terhitung, nilai A (intersept),
nilai B (slope), dan SE (standard
error). Dalam penelitian ini,
parameter utama dipilih adalah
berdasarkan nilai r terhitung.
Berdasarkan hasil uji linearitas untuk
Dextromethorphan HBr y = 19881x -
30425, dengan nilai r = 0,9999. Hal
ini menunjukkan respon analit
terhadap alat linier atau cukup tinggi.
Maka dapat dinyatakan bahwa hasil
uji linieritas memenuhi syarat yaitu
nilai koefisien korelasi (r) ≥ 0,9980.
Hal ini membuktikan bahwa adanya
korelasi yang baik antara konsentrasi
zat dengan respon metode yang
dipakai.
Kurva Linearitas Dextromethorphane
HBr

Uji Validasi
Linearitas
Linearitas bertujuan
untuk menunjukkan ada atau
tidaknya hubungan yang linear
antara konsentrasi zat aktif dengan
Berdasarkan hasil uji linearitas untuk
respon metode yang digunakan.
Diphenhydramin HCl y = 35020x -
Linearitas cenderung korelasi antara
88541, dengan nilai r = 0,9999. Hal
dua variable biasanya dinyatakan
ini menunjukkan respon analit
dalam koefisien korelasi (r). Kurva
terhadap alat linier atau cukup tinggi.
yang didapat berupa garis lurus
Maka dapat dinyatakan bahwa hasil
(linear) karena r yang didapat
uji linieritas memenuhi syarat yaitu
memenuhi persyaratan untuk garis
nilai koefisien korelasi (r) ≥ 0,9980.
linear (r ≥ 0,9980).
Hal ini membuktikan bahwa adanya
Hasil uji linieritas dari
korelasi yang baik antara konsentrasi
campuran Dextromethorphan HBr
zat dengan respon metode yang
dan Diphenhydramin HCl dengan
dipakai.
konsentrasi 25 %, 50 % 100 %, 150
Kurva Linearitas Diphenhydramine
% dan 200 %. Konsentrasi
HCl
Diphenhydramine HCl yaitu 54 ppm,
108 ppm, 216 ppm, 324 ppm, 432
ppm dan konsentrasi
Dextromethorphan HBr yaitu 40
ppm, 80 ppm, 160 ppm, 240 ppm,
320 ppm. Ada beberapa
pertimbangan yang diperhatikan

5
 Akurasi sebesar 0,4 % hal ini menunjukkan
Akurasi dilakukan pada hasil saat dilakukan pengulangan
tiga titik konsentrasi yaitu 50 %, analisis metode tersebut memenuhi
100%, dan 150 % yang dilakukan syarat.
sebanyak 3 kali pengerjaan.
Pelaporan hasil dalam bentuk persen
perolehan kembali (recovery) yang IV KESIMPULAN
bertujuan untuk melihat variasi nilai Hasil optimasi fase gerak
persentase perolehan kembali pada analisis campuran
parameter akurasi yang didapat Dextromethorphan HBr dan
dengan nilai sebenarnya. Diphenhydramin HCl dalam sirup
Berdasarkan menunjukkan obat batuk dengan metode HPLC
nilai % recovery Dextromethorphan dengan menggunakan kolom Waters
HBr sebesar 100,665 dan Sunfire C8 (4,6 mm x 250 mm, 5µm)
Diphenhydramine HCl 100,902. yaitu dalam komposisi fase gerak
Kedua hasil akurasi ini memenuhi Acetonitril : TFA 0,1% dengan
persyaratan uji akurasi yaitu 98,0- perbandingan (30:70) dan laju alir
102,0 %. Metode ini akurat karena 1,4 mL/menit dengan resolusi
memberikan hasil konsentrasi sebesar 3,157 dengan persyaratan ≥
terukur hampir sesuai dengan nilai 2,5. Hasil validasi didapat hasil
yang sebenarnya. pengujian linearitas didapatkan hasil
koefisien korelasi (r)
Presisi Dextromethorphan HBr sebesar
Uji presisi yang dilakukan 0,9999, dan Diphenhydramine HCl
merupakan Repeatability System sebesar 0,9999. Hasil validasi
(Keterulangan Sistem) dengan didapat hasil pengujian akurasi
melakukan pengukuran terhadap luas menunjukkan rata-rata % recovery
area dan waktu retensi secara Dextromethorphan HBr sebesar
berulang sebanyak 6 kali 100,665 % dan Diphenhydramine
pengulangan pada kondisi yang sama HCl sebesar 100,902 %, Hasil
untuk masing-masing larutan sampel validasi didapat hasil pengujian
yang homogen dan kondisi yang kadar Dextromethorphan HBr dan
sama. Diphenhydramine HCl didapat hasil
Nilai presisi yang kadar Dextromethorphan HBr
dinyatakan dengan parameter standar sebesar 99,667 % dan
deviasi relative (% RSD) dimana Diphenhydramine HCl sebesar
kriteria seksama diperoleh jika 100,683 % pada pengujian presisi
dan diperoleh hasil RSD
Area Area % Kadar % Kadar
Dextromethorphan Diphenhydramine Dextromethorphan Diphenhydramine Dextromethorphane HBr sebesar 1,2
HBr HCl HBr HCl
1 3188507 7563923 100,352 100,571 % dan Diphenhydramine HCl
2 3180183 7582758 100,100 100,822
3 3215713 7615631 101,219 101,259 sebesar 0,4 %.
4 3166118 7523355 99,658 101,026
5 3134452 7550236 98,661 100,032
6 3113470 7550236 98,000 100,389
Mean 3166407 7572334 99,667 100,683 V. Daftar Pustaka
SDV 37237 33483 1,172 0,445
%RSD 1,2 0,4 1,2 0,4 BPOM. 2003. Petunjuk Oprasional
metode memberikan simpangan baku Cara Pembuatan Obat yang Baik
relatif ≤ 2 %. Pada tabel didapat % (CPOB). Badan Pengawasan Obat
RSD Dextromethorphan HBr sebesar dan Makanan. Jakarta.
1,2 % dan Diphenhydramine HCl

6
Danusantoso, H. 2001. Analisis Obat Putro, S. 2006. Kromatografi Cair
Batuk. Universitas Trisakti. Kinerja Tinggi Dalam Bidang
Jakarta. Farmasi. Fakultas Farmasi
David, G. Watson. 2004. Kimia Universitas Sumatra Utara.
Farmasi Analisis. Buku Ajar Medan
untuk mahasiswa farmasi dan Muhamad Faisal Fuad. 2012.
praktisi kimia farmasi. Universiti Pengembangan metode analisis
press. Surabaya. Dextromethorphan HBr dan
Depkes RI. 1995. Farmakope Diphenhydramine HCl dalam
Indonesia. Edisi IV. Departemen sediaan obat batuk cair secara
Kesehatan Republik Indonesia. Ultra Performance Liquid
Jakarta. Chromatography (UPLC)
Dong,M.W. 2006. Modern HPLC for Pengujian dextrometorphan HBr dan
and or practicing scientists. John Diphenhydramin. Universitas
Wiley and Sons. New York. Sanata Dharma. Yogyakarta.
Gritter, R.J, 2006. Pengantar Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi
Kromatografi. Penerbit ITB. Analisis. Pustaka pelajar.
Bandung. Universitas Sumatra Utara.
Harmita. 2004. Petunjuk Medan
pelaksanaan validasi metode dan Tjay, Tan Hoan dan Kirana
cara perhitungannya. Majalah Rahardja. 2007. Obat-obat
ilmu kefarmasian. Vol I, No 3. Penting Khasiat, Penggunaan dan
halaman 117-135. Departemen efek-efek samping. Edisi Keenam.
Farmasi FMIPA UI. Depok. PT Elex Media Komputindo.
Kartasubrata, Julia. 2001. Dasar – Jakarta.
Dasar Kromatografi. Pusat United States Pharmacopiea. 2012.
Penelitian Kimia Lembaga Ilmu USP. Volume 3-B. USA.
Pengetahuan Indonesia. Bandung. Wibisono, Y. 2005. Metode
Kazakevich,Y. and LoBrutto,R. stastistik. Gajah mada university
2007. HPLC for pharmaceutical press. Jogjakarta.
scientints. John Wiley and Sons.
Inc 3-4,15. New York.
Kibbe, orthur H. 2000. Hand book of
pharmaceutical excipient. Edisi
III. Pharmaceutical Press. USA.