2. Dapat melakukan preparasi dengan cepat dan akurat serta dapat mengikuti manual
pengoprasian HPLC.
PRINSIP PERCOBAAN
Sampel dilarutkan dengan asetonitril:buffer pH (2:3), lalu diultrasonik selama 5 menit, sampel
disaring dengan kertas saring khusus, filtrat diinjeksikan ke dalam kolom kemudian terbawa oleh
fasa geraknya dengan flow rate 1 ml/menit dan ditangkap oleh detektor UV dengan λ 200 nm
dengan sistem gerak isokratik. Hasil analisa menampilkan konsentrasi dalam satuan ppm
dibandingkan terhadap standarnya dilihat dari waktu retensi 1,4 menit dan luas area puncak
kromatogram.
DASAR TEORI
Pada umumnya sel eukariota dengan inti sel memiliki konsentrasi asam askorbat yang jauh lebih
pekat, yang diserap melalui transporter SVCT1 atau/dan SVCT2, dibandingkan dengan konsentrasi
pada eritrosit maupun konsentrasi di dalamplasma darah.[3] Misalnya pada konsentrasi plasma
atau eritrosit sekitar 40–80 μM, konsentrasi asam askorbat pada sitoplasma limfosit dapat
mencapai 4 mM. Di antara para mamalia, manusia memiliki rasio plasma asam askorbat lebih kecil
dan asam urat lebih tinggi, oleh karena mutasi genetik dengan ekspresi oksidase L-
gulonolakton dan urikase.
Asam askorbat merupakan antioksidan menakjubkan yang melindungi sel dari stres ekstraselular,
dengan peningkatan proliferasi sel endotelial, stimulasisintesis kolagen tipe IV,
degradasi oksidasi LDL, menghambat aterosklerosis dan stres intraselular dengan memelihara
kadar α-tocopherol pada eritrosit danneuron, dan melindungi hepatosit dari stress oksidatif akibat
paparan alkohol alil. Sifat antioksidan tersebut berasal dari gugus hidroksil dari nomor C 2 dan 3
yang mendonorkan ion H+ bersama-sama dengan elektronnya menuju ke berbagai
senyawa oksidan seperti radikal bebas dengan gugus oksigen atau nitrogen, peroksida dan
superoksida. Meskipun demikian, di dalam sitoplasmadengan konsentrasi senyawa Fe yang tinggi,
asam askorbat dapat bersifat pro-oksidan oleh karena reaksi redoks Fe3+ menjadi Fe2+ yang
mencetuskan senyawa superoksida dan pada akhirnya menjadi radikal bebas dengan gugus
shidroksil yang sangat reaktif. Vasodilasi/penyempitan pembuluh darah yang umumnya
disebabkan oleh turunnya sekresi NO oleh sel endotelial juga dapat diredam asam askorbat
dengan meningkatkan sekresi NO oleh sel endotelialmelalui lintasan NO sintase atau siklase
guanilat, mengreduksi nitrita menjadi NO, dan menghambat oksidasi LDL.
Asam askorbat juga memainkan peran yang sangat penting sebagai koenzim dan
pendonor elektron di dalam reaksi organik enzimatik dioksigenase seperti hidroksilasi pada
karnitiaEGF; atau mono- dan di-oksigenasi pada berbagai neurotransmiter dan sintesis hormon
peptida, noradrenalin, kolesterol dan asam amino; demetilasi histon dan asam nukleat; dealkilasi
oksidatif DNA;tmeningkatkan kualitas asam suksinat, asam malat dan gliserol 3-fosfat di
dalammitokondria; homeostasis gaya gerak proton; deglikanasi senyawa proteoglikan; menangkap
ROS berlebih hingga menurunkan stres oksidatif. Salah satu fungsi kofaktor yang sangat dikenal
adalah dengan hidroksilase prolil dan lisil yang mengkopling hidroksilasi pada hypoxia-inducible
factor-1α dan prokolagen.
Oleh karena kapasitasnya sebagai antioksidan yang meredam spesi oksigen reaktif yang dapat
menyebabkan hipertensi, asam askorbat sering dianggap dapat menurunkan tekanan darah tinggi.
Sebuah penelitian menunjukkan bahwa asam askorbat dapat menurunkan rasio plasma C-reactive
protein, 8-isoprostane, danmalondialdehyde-modified LDL, meskipun tidak selalu diiringi oleh
penurunan tekanan darah.
Asam askorbat juga digunakan sebagai terapi anti kanker pada jenis-jenis tertentu oleh karena
sifatnya yang menekan sitokina IL-18 dan enzim hialuronidase pada degradasi asam
hialuronat[9] guna mencegah metastasis,[10] stimulasi kolagen untuk mengisolasi sel tumor in vivo,
mencegah efek onkogenik virus dan karsinogen. Asam askorbat diketahui bersifat toksik terhadap
beberapa jenis sel kanker, namun tidak bersifat demikian terhadap sel normal tubuh. Studi klinis
menunjukkan bahwa pemberian vitamin C dosis tinggi, baik melalui injeksi maupun asupan, dapat
meredakan simtoma patogen dan memperpanjang harapan hidup penderita kanker stadium
lanjut, seperti RCC, tumor kandung kemih, limfoma sel B.
Tubuh kita memerlukan vitamin C untuk dimanfaatkan sebagai bahan pertumbuhan dan
pemeliharaan jaringan tubuh. Ia diperlukan dalam pertumbuhan dan menjaga kesehatan kolagen ,
protein berserat yang merupakan penyusun utam tulang, ligamen, tendon dan pembuluh darah.
Selain baik dalam menjaga kesehatan jaringan, vitamin C dalam tubuh kita digunakan dalam
meningkatkan sistem kekebalan tubuh sehingga kita memiliki pertahanan yang baik dari berbagai
macam gangguan mikroorganisme. Dengan demikian, vitamin C efektif dalam mengatasi beberpa
jenis komplikasi akibat flu dan pilek seperti terjadinya infeksi paru-paru dan pneumonia serta
efektif dalam mengatasi beberapa gangguan tubuh yang terjadi akibat stres oksidatif.
Selain diperlukan dalam mengatasi berbagai jenis penyakit, vitamin C diperlukan untuk sintesis
norepinefrin neurotransmitter. Karnitin merupakan turunan asam amino hidrofilik dibuat dari
asam amino metionin dan lisin dengan bantuan vitamin C. Karnitin mengangkut lemak ke
mitokondria dalam sel untuk menghasilan energi.
Kromatografi pertama kali diperkenalkan oleh TSWETT pada tahun 1903, ia menggunakannya
untuk pemisahan senyawa-senyawa berwarna dan nama kromatografi diambil dari senyawa-
senyawa yang berwarna. Senyawa berwarna yang di gunakan TSWETT sebagai sampel adalah
pigmen-pigmen daun, karena warnanya maka cepat terlihat lokasinya dalam kolom. Saat ini
kromatografi tidak lagi digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa berwarna saja. Senyawa-
senyawa tidak berwarna dapat dilihat melalui floresensi dalam sinar ultraviolet.
Pada dasarnya semua teknik kromatografi menggunakan dua fasa, yaitu fasa diam (stationary) dan
fasa gerak (mobile); pemisahan-pemisahan tergantung pada gerakan relative dari dua fasa ini.
Perlu diperhatikan bahwa fasa gerak yang digunakan tidak mempunyai efek terhadap fasa diam
atau hanya sangat lemah diserap oleh fasa diam.
HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana
pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan
kromatografi kolom.
HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain
dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi
sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.
HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material
terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi
antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang
lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) adalah metoda kromatografi cair bertekanan
tinggi. HPLC sangat berguna untuk analisis kimia secara kualitatif dan kuantitatif senyawa organic
atau anorganik yang berkadar sangat kecil, dalam skala ng/L. juga metoda ini hanya memerlukan
jumlah cuplikan yang sangat kecil(ml). oleh karena itu HPLC, misalnya dapat digunakan dalam
analisis cuplikan Kimia Lingkungan, Farmasi, atau kedokteran. (Tim Dosen Kimia Instrumen.2001:1)
Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit
dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/ area standar. Pada prakteknya teknik
perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu konsentrasi
standar. Oleh karena itu, lebih akurat dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.
Injeksi Sampel
Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana mengetahui
apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan
kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).
Waktu Retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut
sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan
sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-
senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu
retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel)
Jenis-Jenis Kromatografi
Jenis retensi solute merupakan dasar dalam HPLC karena pemisahan senyawa bergantung pada
jenis dan kekuatan interaksi solute dengan fasa diam. Mekanisme retensi dapat dikelompokan
menjadi 5 katagori :
1. Kromatografi Adsorbsi
Kromatografi adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yang agak polar.
Partikel- partikel silica atau alumina biasanya digunakan sebagai adsorben. Gugus – gugus polar
silanol pada permukaan silica dan gugus – gugus polar aluminol pada permukaan alumina
bertindak sebagai tempat-tempat adsorbs untuk molekul polar. Jenis kromatografi ini
menggunakan fasa gerak non polar dan jenis kromatografi ini disebut kromatografi fasa normal.
2. Kromatografi Partisi
Dalam kromatografi ini, biasanya fasa gerak lebih polar daripada fasa diam sehingga
kromatografi jenis ini disebut juga kromatografi fasa terbalik. Fasa diam (polar atau nonpolar)
dilapisi pada suatu pendukung inert dan dipak kedalam sebuah kolom. Kemudian rasa gerak
dilewatkan melalui kolom. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi cair cair (LLC).
3. Kromatografi Fasa terikat
Kromatografi fasa terikat dilakukan dalam dua cara, yaitu fasa normal dan fasa balik. Fasa diam
dari fasa terikat terdiri dari suatu pengepak silica yang disalinasi (misalnya C8 dan C18), fasa
diam yang dipakai adalah C5 atau C15 BPC packing. Fasa gerak terdiri dari suatu larutan buffer
(ditambah suatu kosolven organik seperti methanol atau asetonitril untuk pemisahan fase
terikat) dan suatu penambahan ion tanding, yang muatannya berlawanan dengan molekul
sampel. Fasa terikat mempunyai beberapa keuntungan merupakan fasa yang stabil.
4. Kromatografi Penukar Ion
Kromatografi penukar ion merupakan teknik pemisahan campuran – campuran ion atau
molekul – molekul yang dapt diionkan. Ion – ion bersaing dengan ion fasa gerak untuk
memperebutkan tempat berikatan dengan fasa diam.
5. Kromatografi eksklusi ukuran
Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat.
Pemisahan terjadi karena solute – solute berdifusi masuk dan keluar pori- pori material paking
kolom. Molekul- molekul yang lebih besar, tidak dapat masuk kedalam jaringan dan lewat
melalui kolom tanpa ditahan.
Instrumentasi HPLC
Adapun Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi atau HPLC :
1. Fasa gerak
Fasa gerak dalam HPLC adalah zat cair. HPLC mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak. Dalam
HPLC, fasa gerak selain berfungsi membawa komponen – komponen campuran menuju
detektor, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solute – solute. Oleh karena itu, fasa gerak
dalam HPLC merupakan salah satu factor penentu keberhasilan proses pemisahan.
a. Persyaratan fasa gerak HPLC
Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa
persyaratan berikut :
1) Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang dianalisis.
2) Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatogram.
3) Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan dalam kolom
4) Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun
5) Zat cair tidak kental
6) Fasa gerak harus sesuai dengan detektor
2. Pompa
Pompa dalam HPLC berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi
serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan :
a. Menghasilkan tekanan sampai 600 psi
b. Kecepatan alir berkisar 0,1 – 10 mL / menit
c. Bahan tahan korosi
Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua tipe pompa
yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant
displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan
pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur
(pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk,
menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan
aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan
aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.
Pompa HPLC
3. Injektor
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang
minimum dari material kolom. Ada dua model umum :
a. Stopped Flow
b. Solvent Flowing
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
a. Stop-Flow
Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran
dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi
tidak dipengaruhi
b. Septum
Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada kromatografi Gas.
Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 - 70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak
tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair.Partikel kecil dari septum yang
terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c. Loop Valve
Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 µ dan
dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang
lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop
pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.
Injektor
Proses injeksi
4. Kolom
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari gelas
berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tempat terjadinya pemisahan campuran
menjadi komponen-komponennya. Bergantung keperluannya kolom utama dapat digunakan
untuk analisis atau preparatif. Untuk keperluan preparatif, setiap komponen yang keluar dari
kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction
colector. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi
percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
a. Kolom analitik
Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom.
Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros
mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm. Kolom utama berisi fasa diam dan
jenisnya bervariasi bergantung keperluan, misalnya dikenal kolom C-18, c-8, cyanopropyl.
Kolom jenis C-18 dan C-8 paling banyak dipakai dalam HPLC.
b. Kolom preparatif
Umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm.
Kolom C-18
5. Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom
(analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif).Detektor yang baik memiliki
sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan
memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan
fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh. Detektor KCKT yang
umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel
panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang
lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi
eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV. Detektor-
detektor lainnya antara lain:
- Detektor Fluorometer
- Detektor lonisasi nyala
- Detektor Spektrofotometer Massa
- Detektor Refraksi lndeks
- Detektor Elektrokimia
- Detektor Reaksi Kimia
Detektor UV
Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa- senyawa organic. Detektor UV
dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehingga panjang gelombang UV yang
digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yang diukur. Walaupun demikian,
biasanya panjang gelombang yang digunakan 254 nm karena kebanyakan senyawa organik
menyerap sinar UV pada sekitar panjang gelombang.
6. Rekorder
Berfungsi menampilkan hasil dari pemisahan kromatografi. Kromatogram berupa waktu retensi
(sumbu x) dan intensitas penyerapan (sumbu y). Hal ini dapat digunakan untuk analisis kualitatif
suatu komponen. Area puncak setara dengan konsentrasi sehingga dapat digunakan untuk
analisis kuantitatif.
Hasil kromatogram akan kurang baik dikarenakan adanya pelebaran puncak. Pelebaran yang
terjadi dapat disebabkan oleh tiga faktor, yaitu :
a. Difusi Eddy
Difusi Eddy terjadi karena perbedaan waktu kedatangan komponen ke detektor yang
menyebabkan puncak kromatogram melebar. Hal ini disebabkan karena terdapat perbedaan
ukuran partikel penyusun kolom yang tidak merata.
b. Transfer massa
Transfer massa terjadi karena perbedaan waktu kedatangan komponen ke detektor yang
menyebabkan puncak kromatogram melebar.
c. Difusi longitudinal
Difusi longitudinal terjadi karena perbedaan waktu kedatangan komponen ke detektor yang
menyebabkan puncak kromatogram melebar.
Kelebihan HPLC
KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam banyak hal kedua teknik
ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang sama membaiknya. Bila derivatisasi
diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-
zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian
bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih besar bagi para
analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada KCKT karena teknik ini dapat
digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya digunakan.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik, antara lain:
Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikan sekitar
15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisis kurang dari 5 menit
bisa dicapai
Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif
dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan
terutama dicapai hanya dengan rasa diam.
Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa gerak
pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
Sensitivitas detektor: Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi
kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-detektor
Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram(10-12 gram). Detektor-
detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan
dalam KCKT
Kolom yang dapat digunakan kembali: Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT
dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sma
sebelum darijenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan
Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik :zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG
karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisi spsesies ionik. KCKT dengan
tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat –zat tersebut.
Mudah rekoveri sampel: Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan
destruktif(kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel
tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector.Solvennya dapat
dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukarion memerlukan prosedur
khusus.
(Effendy De Lux Putra, 2004: 8)
Kerugian HPLC
Kerugian dari penggunaan HPLC yaitu :
Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu
Hanya bisa digunakan untuk asam organik
Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusi
Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas
ALAT & BAHAN
1. Alat: 2. Bahan:
Alat HPLC Gelas kimia 600 ml KH2PO4
Injektor HPLC Kertas saring khusus Aquabidest
Labu ukur 50 ml dan 25 ml Neraca analitis H3PO4
Botol semprot Asam askorbat
Kaca arloji Sampel obat vitamin C
Pipet tetes
SINGKATAN PROSEDUR
6. Kalibrasi Baku
7. Report Hasil Pengukuran
DATA PENGAMATAN
Siap diinjeksikan
6. Bagian-bagian alat HPLC
Fase gerak
CBM
Stabilizer
Kolom
Detektor
Injektor
Pompa
1. Mode operasional yang digunakan pada praktikum kali ini adalah mode isokratik dimana
komposisi fasa gerak dan laju kolom dibuat tetap sebesar 1 mL/menit.
2. Pelarut yang digunakan dikombinasikan komposisinya bertujuan untuk memberikan faktor
kapasitas yang cocok sehingga faktor human error dapat dihindarkan.
3. Fase gerak yang digunakan sudah memenuhi persyaratan fasa gerak HPLC yaitu: jernih,
murah, mudah diperoleh, dan tidak kental.
4. Proses degassing dilakukan untuk menghomogenkan dan menghilangkan gelembung-
gelembung gas pada larutan induk. Karena dengan adanya gas dalam larutan sampel dapat
menghambat pergerakan eluen sehingga terganggunya pemisahan pada kolom karena
larutan sampel tidak merata dan akan menyebabkan terjadinya pelebaran puncak
kromatogram. Selain itu, penghilangan gas ini juga diperlukan untuk menghindari noise pada
detektor terutama fase organik berair.
5. Pembuatan larutan standar tersebut dilakukan secara kuantitatif. Oleh karena itu,
penimbangan larutan baku asam askorbat harus tepat, pemipetan larutan induk harus tepat,
pengenceran larutan baku menjadi larutan standar harus pas sampai tanda batas. Pembuatan
masing – masing konsentrasi dan pelabelan harus dilakukan secara teliti untuk mencegah
terjadinya kekeliruan.
6. Ketidaksesuaian kadar vitamin C pada label dengan hasil HPLC dikarenakan praktikan yang
kurang teliti saat melakukan pengenceran dan kurang nya pemahaman praktikan tentang
HPLC.
7. Alat HPLC diset sesuai dengan kebutuhan pengukuran yaitu dengan panjang gelombang 200
nm, laju alir 1 mL/menit.Pada saat memasukan larutan standar maupun larutan sampel tidak
terlalu banyak cukup dengan 20 mikoliter, karena jika terlalu banyak dapat menyebabkan
band broadening (pelebaran peak) dan pada saat memasukan cuplikan pada syringe tidak ada
gelembung udara agar menghasilkan pemisahan yang baik. Sebelum digunakan, syringe harus
dibilas dengan mengunakan metanol agar terbebas dari kotoran.
8. Pada proses pemasukan cuplikan kedalam alat HPLC dilakukan dengan menggunakan alat
injeksi syiringe. Syringe disuntikan melaui septum (seal karet), cuplikan yang masuk kemudian
dialirkan oleh fasa gerak dengan bantuan pompa.
9. Kesesuaian kadar vitamin C pada label sebesar 95-105% tapi kesesuaian kadar yang kita dapat
hanya sebesar 20,99%, ini terjadi karena praktikan yang kurang teliti saat melakukan
pengenceran dan kurang nya pemahaman praktikan tentang HPLC.
KESIMPULAN
Dari praktikum kali ini untuk menganalisis kesesuaian kadar vitamin C dalam sampel menggunakan
instrumen HPLC didapat kesesuaian kadar vitamin C sebesar 20,99%.
DAFTAR PUSTAKA
Mulja, M., Suharman. (1995). Analisis Instrumental. Surabaya: Airlangga University Press.
Al-Anshory, Jamaludin. 2007. Diktat Pelatihan HPLC. Bandung : Universitas Padjadjaran
Budiasih, Endang, dkk. 1999. Analisis Instrumentasi. Malang: Universitas Negeri Malang
Day, R.A., A.L. Underwood. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta: Erlangga.
https://id.wikipedia.org/wiki/Asam_askorbat
http://www.openwetware.org/images/a/a1/Laporan_PRAKTIUM_HPLC%3b_ANALISA_TABLET_
VITAMIN_C.pdf
Paraf Nilai