PENERJEMAHAN BUKU

“Bancroft's Theory and Practice”

(Hal 148-164)

DISUSUN OLEH :
ITAM YULIATI
B181009
TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK

POLITEKNIK MEDICA FARMA HUSADA MATARAM

2019/2020

REVIEWS
 Penempelan plastik untuk mendeteksi dalam mikroskop cahaya untuk deteksi
beberapa histologis atau sitologis halusberubah, bagian lebih tipis dari 5 m biasanya
sangatmemfasilitasi pemeriksaan yang akurat. Keduanya paling terkenalcontohnya
adalah untuk biopsi ginjal dan interpretasijaringan hematopoietik, tempat reduksi
parafinketebalan bagian sekitar 2μm telah menyebabkan lebih mudah dandiagnosis
lebih akurat melalui deteksi minorkelainan-kelainan histologis yang dikaburkan
dibagian yang lebih tebal. Pengalamannya telah membuktikan hal itubagian yang
lebih tipis, dikombinasikan dengan optik berkualitas tinggi,akan memberikan
penilaian yang lebih akurat dengan cahayamikroskopi dari kelainan histologis minor
padabiopsi ginjal.
Hasil darikemungkinan untuk mikroskop cahaya resolusi tinggitelah terbatas,dan
meskipun bagian yang sedikit lebih tipisdapat diproduksi saat ini dengan lilin dan
mikrotom, artefak yang diproduksi di bagian lilinmembatasi potensi perbaikan
morfologi.Dan artefak sering kurang jelas jika plastik digunakansebagai media
embedding.
Sebagai aplikasi dan histologisprosedur telah dikembangkan, ada beragam
teknik dan penggunaan yang diterapkan pada bagian plastik untukmikroskop cahaya
resolusi tinggi, yaitu sebagai berikut :

1. Media penyisipan plastik

Plastik diklasifikasikan menurut bahan kimianyakomposisi menjadi epoksi,
poliester, atau akrilik. Itu yang membuat perubahan dalam kondisi fisik media
penyematandari cair ke padat disebut polimerisasi dandibawa dengan menggabungkan
molekul untuk menghasilkanmakromolekul kompleks yang terdiri dari unit berulang.
Makromolekul, Ini disebut polimer (berasal dariKata Yunani poly artinya 'banyak'
dan mer arti'Part'), disintesis darimolekul sederhana yang disebutmonomer ('bagian
tunggal'). Beberapa bahannya diperlukan untuk menghasilkan plastik yang cocok
sebagai embeddingmedia untuk bahan biologis dan selanjutnya untuk pemeriksaan
histologis.Beberapa bahan ini bisamenghadirkan potensi masalah kesehatan dan
keselamatan, dan memang demikianPenting agar semua bahan kimia digunakan
dalam formulasiplastik ditangani sesuai dengan lokal dan legalpersyaratan keamanan.
Reaksi kimia antaraberbagai bahan dalam kit embedding plastik,termasuk proses
polimerisasi, sangat kompleksdan lebih mirip dengan data yang ditemukan di industri
polimer.

2. Plastik epoksi
Disini menjelskan bahwa berbagai plastik epoksi telah menemukan yang
terluasaplikasi sebagai media embedding untuk ultrastructuralmempelajari, karena
plastikterpolimerisasi cukupsulit untuk mengizinkan bagian setipis 30-40 nm
untukdipotong,dan stabil dalam berkas elektron. Embed-dingjadwal untuk berbagai
resin epoksi yang digunakan dalam elektronmikroskop diberikan dalam Bab 22, dan
hanya penjelasan singkatgaris besar sifat dan kegunaannya diberikan di sini.
Epoksiplastik mendapatkan namanya dari grup aktifmelalui berpolimerisasi.

Halaman 45
Media penyisipan plastik141
Kelompok epoksida atau oksiran dapat dilekatkan pada suatujumlah struktur kimia
yang hampir tak terbatas dalam tunggalatau konformasi multifungsi. Tiga jenis
epoksiplastik digunakan dalam mikroskopi: plastik berdasarkan keduanyabisphenol A
(Araldite), gliserol (Epon), ataucyclohexene dioxide (Spurr). Nama dalam paren-tesis
ini adalah yang umum digunakan oleh ahli mikroskop danjangan menyampaikan
informasi struktural apa pun.Plastik penyisipan epoksi adalah bal-anced yang hati-
haticampuran plastik epoksi, katalis, dan akselerator,setiap komponen memiliki
pengaruh langsung padasifat fisik dan mekanik plastik yang disembuhkan.Sistem
katalis yang digunakan adalah anhidrida / aminajenis .
Katalis anhidridadapat berupa rantai panjang alifatik anhy-dride,
misalnyadodecenyl succinic anhydride (DDSA), atau aromatikanhidrida cincin yang
menyatu, misalnya anhidrida metil nadik(MNA). Anhidrida rantai panjang bertindak
sebagai internalplasticizer yang membuat blok lebih fleksibel danumumnya tangguh,
sedangkan MNA adalahmolekul yang kaku itumenghasilkan pengerasan dan
pengerasan blok yangdisembuhkan.Kedua katalis meningkatkan hidropho-bicity
dariplastik, tetapi sifat ini dapat dikurangi dengan cara mengoksidasirantai alkil dan
cincin aromatik dengan peroksida.Amina yang digunakan sebagai akselerator adalah
mono-ataupoli-fungsional. Sebagai amina membentuk aduk dengan
epoksidakelompok,penggunaan amina poli-fungsional, misalnyadimetilamino metil
fenol (DMP 30),dapat menyebabkanpembentukan struktur tiga dimensi, yanglambat
berdifusi dan karenanya lambat menyusup jaringan.
Dengan demikian amina mono-fungsional, dan etanolaminbenzyl dimethyl amine
(BDMA), lebih kondusifuntuk kali infiltrasi lebih cepat. Satu-satunya yang umum
lainnyaaditif dalam campuran plastik epoksi adalah dibutil ftalat(DBP), sebagai
plasticizer eksternal untukmelunakkan blok, terutama dalam formulasi
'Araldite'.Tingkat di mana setiap plastik epoksimenginfiltrasijaringan tergantung pada
kepadatan jaringan dan ukurannyamolekul difusi. Epoksi berbasis gliserolplastik
(Epon) memiliki viskositas yang lebih rendah tetapi seringdijual sebagai campuran
isomer, dan perawatan harus dilakukandilakukan dalam memilih fraksi yang paling
cocokisomer.
Plastik berbahan dasar Cyclohexene dioxide (Spurr)dapat diperoleh murni dan
menyusup tercepat, memiliki aviskositas rendah (7 centipoise pada 25 ° C). Infiltrasi
disuhu yang lebih tinggi lebih cepat, meskipun aglomer-atesdapatmembentuk dan ini
meniadakan peningkatan difusikoefisien.
Sifat fisik plastik epoksi adalahsangat dipengaruhi oleh tingkat polimerisasi
mereka. Diindustri, formulasi yang sama seperti yang digunakan dalam
mikroskopidisembuhkan pada suhu lebih dari 150 ° C hinggabeberapa hari,
sedangkan blok jaringan pada 60 ° C beradasangat kurang. Curing cepat selama 1 jam
pada120 ° C menghasilkan banyak tautan silang, tetapi sulitblok rapuh; 18 jam pada
60 ° C menghasilkan lebih kerasblok yang lebih cocok untuk sectioning dan sub-
mikroskop berurutan. Komponen banyak epoksiplastik beracun, dan satu, vinylcy-
clohexane dioxide(VCD), dikenal sebagai carcino-genic. Karena itu sarung
tanganharus selalu dipakai saat menangani plastik ini,dan fasilitas yang memadai.

Halaman 46
142
Penempelan plastik untuk mikroskop cahayadisediakan untuk menghilangkan uap
kimia danpembuangan limbah beracun ( Causton 1981 ).

Memotong dan menodai epoksibagian untuk mikroskop cahaya

Potongan dan pewarnaan ultra tipis untuk elektronmikroskopi dibahas secara rinci
dalam Bab 22. Tidak mungkin mendapatkan ketebalan yang memuaskan0,5–1 µm
pada mikrotom standar menggunakan pisau baja,jadi bagian semi-tipis diproduksi
menggunakan gelas ataupisau berlian, dan potong di microtome
bermotor.Menggunakan potongan khusus kaca dan peralatan, duajenis pisau kaca
dapatdisiapkan: lebih banyakbentuk segitiga umum pisau Latta-Hartmann atau
Pisau Ralph, yang memiliki ujung tombak yang lebih panjang.
Bagi seorang pengamat yang berpengalaman dalam interpretasinya,ada sedikit
keraguan untuk cahaya resolusi tinggimikroskop, toluidine blue adalah yang paling
bermanfaat danpewarnaan informatif yang diaplikasikan pada bagian jaringan embed-
deddalam plastik epoksi. Jika noda dipanaskan dan digunakan padapH basa tinggi,
mudah menembus plastik dannoda berbagai komponen jaringan warna biru
nuansa dan intensitas yang berbeda, tanpa nilai yang berartipewarnaan media
embedding. Bagi yang lebih suka polikromatiknoda, berbagai formulasi, misalnya
Paragon, dapat digunakanyang menyerupai pewarnaan H&E. Banyak pewarnaan
teknik dapat diterapkan setelah resin permukaan memilikitelah 'dietsa' menggunakan
natrium hidroksida alkohol ( Janes1979 ), tetapi hasilnya tidak selalu dapatdiandalkan.
Lainjenis pra-perawatan terdiri dari oksidasi osmium-jaringan tetap tanpa etsa (
Bourne & St John 1978 )sehingga larutan encer bisa lebih ternodasecara konsisten.
Beberapa laporan menggambarkan penerapanimunohistokimia ke bagian epoksi untuk
cahayastudi mikroskopis setelah perawatan dengan natriumetoksida /metoksida (
Giddings et al. 1982 ; McClug-gage et al. 1995 ; Krenacs et al. 2005 ), tetapi praktik
inijarang digunakan. Secara umum, untuk sebagian besarkesempatan ketika
mikroskop cahaya resolusi tinggidiperlukan, lebih disukai untuk menggunakan bagian
plastik akrilikkarena potensi penanganannya lebih mudah dan kualitas
pewarnaan tercapai, meskipun beberapa teknologi sepertiimunohistokimia.

3. Plastik poliester
Plastik ini awalnya diperkenalkan untuk elec-tronmikroskop pada pertengahan
1950-an, tetapi segeradigantikan oleh epoksida unggul untuk ultrastrukuraltujuan.Saat
ini mereka jarang digunakanmikroskopi, meskipun Mawhinney dan Ellis (1983)
telah melaporkan penggunaan embed undecalci-fiedtulang untuk studi mikroskop
cahaya.

4. Plastik akrilik
Plastik akrilik yang digunakan untuk mikroskop adalah ester dariasam akrilat
(CH 2 ·· CH · COOH) atau lebih umumasam metakrilat (CH ·· C (CH 3 ) · COOH),
dan seringdisebut sebagai akrilat dan metakrilat, masing-masingsecara aktif.
Mereka digunakan secara luas untuk mikroskopi cahaya,tetapi beberapa telah
dirumuskan sehingga elektron itumikroskop dapat dilakukan, baik sebagai tambahan
ataukhusus. Banyak campuran dapat dirancang untukmenghasilkan plastik yang
menyediakan berbagai macamproperti, dan akibatnya ada beragampotensi kegunaan.
Butil, metil, dan glikol metakrilat(yang terakhir secara kimia monomer 2-hidroksietil
methacrylate atau HEMA) semuanya diperkenalkan untukmikroskop elektron, tetapi
sekarang jarang digunakan (kecuali sebagaikomponen campuran) karena plastik
menggangguberkas elektron. Namun, kesuksesan yang lebih besar telah terjadidicapai
dalam produksi dan pewarnaan semi-tipisbagian untuk mikroskop cahaya resolusi
tinggi.
Akrilik konvensional disembuhkan dengan bebas kompleksreaksi berantai
radikal.
 Halaman 47

Media penyemat plastik 143

ikatan rangkap dari monomer akrilik, dan yang kemudiansendiri pecah
menjadiradikal pada gilirannya.Proses pembukaanikatan rangkap karbon-karbon dan
membentuk kovalentautan. Dengan cara ini polimer dibentuk dengan bergabung
unit monomer bersama-sama menghasilkan ali-fatic yang panjangrantai. Akhirnya,
untuk melengkapi polimer, sebuah fenilradikal bukan mole-cule menempel monomer
lainke situs aktif untuk memblokir dan mengakhiri lebih lanjutreaksi.Radikal
dapatdiproduksi secara spontan oleh cahaya ataupanas, dan akibatnya plastik akrilik
danplastiknyamonomer harus disimpan dalam botol gelap dalam dingintempat.
Akrilik mengandung beberapa bagian per jutahidrokuinon untuk mencegah
polimerisasi prematur,dan untuk sebagian besar aplikasi ini dapat tetap
kapanmenyiapkan campuran embedding.
Benzoil peroksida adalahsumber radikal yang paling umum, karena rusak
turun pada 50-60 ° C, tetapi penambahan terariumamina aromatik, misalnya N , N
-dimetilanilin atau dimetilp -toluidine, dapat menyebabkan peroksida terurai menjadi
radikal pada 0 ° C, sehingga plastik dapat disembuhkan dengan rendahatau
suhukamar. Benzoil peroksida kering adalahmudah meledak dan karenanya disuplai
basah
air, atau sebagai pasta dicampur dengan dibutyl phthalate, atau sebagaipartikel-
partikel plastis. Dalam beberapa campuran, airnya adalahharus dihapus dan perawatan
harus dilakukan agar keringjauh dari sinar matahari langsung atau
panas.Azobisisobutyronitrile dan Perkadox 16 adalah lainnyakatalis yang telah
digunakan, tetapi sejauh ini yang palingpopuler adalah benzoil peroksida. Peka
terhadap cahaya
fotokatalis seperti benzil dan benzoin (beragamjenis) digunakan untuk polimerisasi
akrilik disuhu nol menggunakan cahaya panjang gelombang pendek.
Untuk meningkatkan kualitas sectioningblok akrilik, pelunak atau pelunak sering
ditambahkan ke dalam campuran. Contohnya adalah2-butoksietanol,2-
isopropoksietanol, polietilenglikol 200/400 dan dibutil ftalat. Beberapa akrilik
campuran membutuhkan sejumlah kecil cross-linkermenstabilkan matriks plastik
terhadap fisikkerusakan yang disebabkan oleh berkas elektron (Lowicrylplastik) atau
larutan pewarnaan (Technovit 8100). Sebuahcontoh dari agen cross-linking adalah
difungsionaletilena glikol dimetakrilat, yang menyediakancross-link hidrofilik ible.
Tidak seperti epoksida, ituviskositas akrilik rendah dan karenanya infiltrasi
pendekkali mungkin, meskipun ukuran dan sifatjaringan, bersama dengan pemrosesan
dan penanamansuhu, akan mempengaruhi waktu yang dibutuhkan.
Poli (2-hidroksietil metakrilat)„Glikolmethacrylate '(GMA) telah terbukti
populermedia embedding untuk mikroskop cahaya karena itusangat hidrofilik,
memungkinkan banyak tingtorialmetode pewarnaan untuk diterapkan, namun cukup
sulit ketikadidehidrasi menjadi bagian yang baik pada sebagian besar buku tebal
mikro.Berbagai campuran telah dilaporkan, dengan hasil itubeberapa dapat dibuat dari
bahan ataudibeli sebagai kit komersial, tetapi banyak yang didasarkan pada
resep yang diterbitkan oleh Ruddell (1967) .
Monomer dapat terkontaminasiasam metakrilat, yang dapat menyebabkan
beberapapewarnaan latar belakang, tetapi ini dapat dikurangi denganmembeli HEMA
asam rendah atau berkualitas tinggikit berpemilik seperti JB4, JB4 Plus
(PolysciencesInc., USA), Technovit 7100, atau Techno-vit 8100(Kulzer, Jerman).
Butyl methacrylate sekarang jarangdigunakan untuk tujuan histologis apa pun kecuali
sebagaibahan dalam campuran akrilik, misalnya Unicryl (InggrisBioCell
International, UK), karena telah terbuktitidak dapat diandalkan dan
menghasilkanartefak jaringan yang cukup besarselama polimerisasi.
Tersedia juga polihidroksi aromatikresin dimethacrylate (Histocryl, LR White &
LR Golddari London Resin Company, UK). Histocryl adalahdimaksudkan untuk
keperluan mikroskop cahaya tetapi LR Whitedan LR Gold dapat digunakan untuk
cahaya dan elektromikroskopi karena mereka menggabungkan hidro-filisitas dengan
stabilitas berkas elektron. LR White dapat dipolimerisasidengan penambahan dimetil

Halaman 48
144
Penempelan plastik untuk mikroskop cahayap -toluidine, sedangkan LR Gold
disembuhkan dengan penambahan tersebutbenzil dan paparan lampu halogen kuarsa
khusus untuk embedding suhu di bawah nol. Laintermasuk plastik akrilik
yangdikeringkan pada suhu rendahLowicryl HM20, HM23 (hidrofobik) dan K4M,
K4M
Plus, K11M (hidrofilik), dan Unicryl (sebelumnyadisebut Bioacryl). Lowicryl dapat
disembuhkan olehpenambahan fotokatalis benzoin yang terpaparsinar ultraviolet.
Padahal dalam beberapa kasus plastik inidapat digunakan untuk studi mikroskop
cahaya, merekabenar-benar dimaksudkan dan lebih cocok untuk elektronmikroskopi.
Berbagai kit embedding plastik telahdipasarkan dengan nama yang berbeda
(terutamaKisaran Technovit), yang telah menyebabkan kebingungan ( Tangan
1995a ), dan ada pengenalan baru yang konstankit milik, masing-masing dengan
klaim menunjukkan merekakesesuaian untuk studi tertentu, yang sering membuatnya
sulit bagi ilmuwan untuk mengetahui mana yang harus dipilih.
Saat ini banyak dari kit ini tersedia dari TABB,Inggris dan / atau Poli-sains,
AS.Selama bertahun-tahun metil metakrilat (MMA) telahtelah banyak digunakan
karena kekerasannya sebagai idealmedia embedding untuk tulang yang tidak
didekalsifikasi, keras lainnyajaringan, dan jaringan dengan stent atau implan, dan
lagiada kit eksklusif seperti Technovit 9100,(Kulzer) OsteoBed (Polysciences) dan
Acrylo-sin
(Dorn & Hart Microedge Inc.).

5. Aplikasi bagian akrilik

Sebagian besar aplikasi untuk cahayamikroskopi, tetapi sebagai pemahaman
untuk-mulasiakrilik telah meningkat, demikian juga berbagai plastiktelah
diperkenalkan yang mungkin jugaberguna untuk beberapa studi mikroskop elektron.
Beberapaplastik ini, seperti Lowicryl, telahdikembangkan terutama untuk
mikroskop elektron saja( Carlemalm et al. 1982 ; Acetarin et al. 1986 ), sedangkan
LR White dan Unicryl ( Scala et al. 1992 ) dapat digunakanuntuk tujuan apa pun.
Namun, untuk berbagai teknisalasannya, tidak semua plastik serba guna praktis untuk
studi mikroskop cahaya resolusi tinggi rutin.
Banyak teknik pewarnaan 'sederhana'niques dapat diterapkan, tetapi beberapa
mungkin memerlukan modifikasifikasi atau menghadirkan kesulitan khusus untuk
yang digunakan padabagian parafin. Semua media hidrofilik akrilik adalahtidak larut,
dan akibatnya semua pewarnaan terjadi denganplastik in situ. Contoh paling jelas
dimana yang terakhirterjadi adalah kesulitan yang dimiliki molekul besarmenembus
matriks plastik selama immu-pewarnaan nohistokimia. Plastik akrilik
dapatdipolimerisasi dengan cara yang berbedacara dengan menggunakan akselerator
kimia, panas, atau cahaya.
Metode optimal tergantung pada beberapa faktor,termasuk studi yang diperlukan
dan kepraktisanmetode yang dipilih. Polimerisasi juga dapat diinduksi padasuhu
rendah, dan dengan beberapa plastik Lowic-ryl,pemrosesan dan penyematan dapat
dilakukan disuhu turun ke −70 ° C. K4M adalah yang paling populer,dan dikatakan
pada −35 ° C untuk meningkatkan ultrastrukturalpelestarian dan pewarnaan
imunohistokimia.

6. Pewarnaan tinctorial
Akrilik telah menjadi populer untuk cahaya resolusi tinggiMikroskopi terutama
karena kemudahan dengan
Halaman 49
Aplikasi bagian akrilik 145
bagian mana yang bisa diwarnai. Pewarnaan luar biasadicapai pada jaringan yang
tertanam di salah satu dari berbagaiCampuran / kit GMA dan akrilik lainnya seperti
LR White,meskipun plastiknya tidak bisa dilepas. Banyak sekali(tetapi tidak semua)
metode pewarnaan histologis rutin mungkinditerapkan, termasuk H&E, PAS, van
Gieson, alcianbiru, Perls, metode elastis, Giemsa, dan perakteknik untukreticulin.
Modifikasi darimetode standar untuk bagian parafin mungkindiperlukan dan, karena
London Resin (Histocryl, LRPutih, dan LR Emas) semuanya dilunakkan dengan
alkoholkemungkinan kehilangan bagian dari slide, alkohollarutan pewarnaan seperti
yang digunakan dalam metode elastisharus dihindari. Pendekatan alternatif adalah
dengan menggunakan MMA manaplastik dapat dengan mudah dilepaskan sebelum
pewarnaan, menggunakanprosedur dan solusi serupa tetapi dengan
sedikitdiperpanjang waktu untuk yang digunakan secara rutin untuk dewaxingbagian
parafin.
Namun,prosedur jenis ini tidak cocok untuk semi-tipisbagian yang dijelaskan dalam
bab ini untuk resolusi tinggimikroskop cahaya.

7. Enzim histokimia
Kemampuan untuk memproses, menanamkan, dan mempolimerisasi beberapa
plastik akrilik pada suhu rendah memungkinkan beberapaEnzim harus dipertahankan
dan ditunjukkan dalam jaringanbagian. Banyak enzim dihancurkan secara rutin
fiksasi dan pemrosesan, tetapi di bawah terkendaliBagian jejunum difiksasi dengan
kalsium formal dantertanam dalam glikol metakrilat (JB4) yang menunjukkan asam
hidrolitikaktivitas fosfatase di makrofag (lamina propria) danlisozim di villi
menggunakan hexazonium pararosanilin. Asliperbesaran × 325. (Direproduksi dengan
izin dari Hand,NM, 1999. Penyematan plastik untuk mikroskop cahaya. Panduan
untukahli histologi. Contoh Teknologi .
Histoteknologi No. HT-6. 29-35.© Perhimpunan Ahli Patologi Klinik
Amerika.)kondisi beberapa enzim (terutama hidrolitik) mungkinterlokalisasi,
termasuk yang diilustrasikan dalam Fiksasi, pemrosesan, dan polimerisasi
semuanyabiasanya dilakukan pada 4 ° C, dan sebagian dikeringkan sampaitutup kaca
atau geser pada suhu kamar semalam(daripada 60 ° C) sebelum melakukan
enzimpewarnaan histokimia.
Berbagai fiksatif aldehida telah dikembangkan.dikutip, tetapi dalam pengalaman
penulis ini 10% formalkalsium seperti yang direkomendasikan oleh Dawson (1972)
milikiterbukti berhasil. Pewarnaan yang ditingkatkan bisa lebih jauhtercapai jika
jaringan kemudian dicuci pada suhu 4 ° C di3% larutan sukrosa buffered. Hand
(1988)

Halaman 50

Penggunaan GMA untuk studi histokimia enzim adalahlebih disukai, karena akrilik
ini mungkin yang paling mudahmenangani dan menghasilkan hasil terbaik. Berbagai
enziminvestigasi histokimia telah dijelaskan menggunakanbeberapa teknik berbeda
pada jaringan yang tertanam plastiktermasuk identifikasi tipe sel ( Beckstead1983 ),
cephaloridine neph-rotoxicity pada tikus ( Bennett1982 ), dan penilaian malabsorpsi
pada jejunum( Hand 1987 ).Perkembangan selanjutnya dijelaskan oleh Thompson
danGermain (1983) menggunakan pemrosesan segar (tidak tetap)jaringan distabilkan
dengan polyvinyl pyrollidine (MW44.000) pada −25 ° C dan tertanam di LR Gold.
Polimerisasi diinduksi dengan menyinari plastikmengandung fotokatalis benzil
dengan cahaya biru darilampu halogen kuarsa.Prosedur khusus inimenawarkan
potensi untuk menunjukkan enzim, termasuk
mereka yang sensitif terhadap fiksasi, tetapi pada kenyataannyahanya tambahan
enzim dem-onstrated untuk itubertahan fiksasi ringantelah menjadi enzim oksidatif
suksinat dehy-drogenase ( Gbr. 8.4 ).
Enzim lain yang telahditunjukkan dalam jaringan tetap termasuk asam fosfatase
asam,adenosine triphosphatase (membran), alkalifosfatase, kloroasetat esterase,
dipep-tidyl(amino) peptidase IV, laktase, laktat dehidro-genase,leucine
aminopeptidase, α-galactosidase, glukosa-6-fosfat, fosfat dehidrogenase, α-
glukuronidase,γ-glutamyl transpeptidase, NADH, α-naphthyl acetate,esterase non-
spesifik, 5α-nucleotidase, peroxidase, dansucrase. Setelahpewarnaan berhasil,
perawatan harus dilakukandiambil untuk memastikan bahwa difusi dan kehilangan
enzim tidakterjadi selama prosedur pencucian dan pemasangan.

8. Imunohistokimia
Selama 30 tahun terakhir, banyak laporan
telahditerbitkanmenggambarkanituaplikasidariimunohistokimia ke jaringan yang
tertanam akrilikbagian, bahkan dengan kit GMA yang dikembangkan secara
khususuntuk penggunaan ini(ImmunoBed dari Polysciences Inc.,AMERIKA
SERIKAT).

Halaman 51

Penerapan bagian akrilik 147

immunostaining adalah bahwa banyak dari akrilik itutidak larut dalam bentuk
terpolimerisasi. Meskipun begituterlalu sederhana penjelasan untuk menyiratkan
bahwa semuamasalah adalah karena ketidakmampuan polimerterlibat, tidak ada
keraguan bahwa kehadiranmedia penyematan dapat menghadirkan kesulitan yang
berat( Gerrits 1988 ).
Banyak makalah berdasarkan publikasi klasikBeckstead (1985) dan Casey et al.
(1988) telah mencobabuat kondisi ringan dengan memperbaiki, memproses, dan
kemudianmempolimerisasi plastik pada suhu rendah dalam suatuberupaya melindungi
antigen sensitif, dan menghasilkan aMatriks "lebih longgar" yang lebih kondusif
untukmemungkinkan reagen imunologis besar untuk pene-tratemelalui situs antigen.
Selain itu, sudah lama diakuibahwa antigen jaringan dapat diubah secara kimiawi
olehreagen dalam media penyisipan plastik ( Takamiyaet al. 1980 ). Aplikasi novel
yang lebih baru dariimmunostaining menggunakan prosedur khusus denganGMA
telah dijelaskan oleh Howat et al. (2005) untukmicroarrays jaringan.
Satu prosedur khusus yang direkomendasikan olehNewman et al. (1983) untuk
LR White menggunakanteknik peningkatan, di mana DAB diintensifkanmenggunakan
metode emas-sulfida-perak untuk mendeteksi immu-reaktivitasnohistokimia.
Menggunakan molekul kecilantibodi berat dan kromogen seperti amino-
ethylcarbazole (AEC) disarankan untuk ditingkatkanimmunostaining dengan
ImmunoBed (Polysciences).Padahal imunohistokimia dimungkinkan pada semua
plastik akrilik, prosedur non-rutin yang diperlukan,ditambah dengan hasil yang sering
buruk, jangan mendorong usiajenis pemeriksaan histologis untuk cahayamikroskopi.
Terhadap latar belakang ini, sebuah alternatifKonsep menggunakan plastik
berdasarkan MMA adalahdikembangkan ( Hand et al. 1989 ; Hand & Morrell 1990 ).
Rincian lebih lanjut adalahdibahas nanti dalam bab iniberkaitan
denganpewarnaan imunohistokimia pada bagian MMA.
Bagian dari hipofisis yang difiksasi formalin tertanam dalam metil
metakrilat yang menunjukkan lokalisasi hormon adrenokortikotropin
(ACTH) dengan pewarnaan imunoperoksidase. Chromogen 3,3 α-
diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB).

Halaman 52
148Penempelan plastik untuk mikroskop cahaya
Bagian tumor ovarium dengan formalin yang melekatmetil metakrilat menunjukkan
pewarnaan imunoperoksidasesitokeratin 7 mengikuti pretreatment menggunakan
antigen microwavepengambilan.
9. Hibridisasi in situ
Hanya beberapa metode yang telah dijelaskan untuk in situhibridisasi pada
berbagai bagian plastik menggunakan keduanyateknik isotop atau non-isotop. Belajar
oleh Gerejaet al. (1997, 1998) dan Doverty (2005, 2007) , keduanyamenggunakan
metode non-isotop pada bagian MMA, milikimenunjukkan mRNA gen Sox dalam
jaringan ayam, dankappa (κ) dan lambda (λ) mRNA di sumsum tulang
trephines, masing-masing.
Bagian dari kelenjar getah bening formalin yang tertanam dimetil metakrilat
menunjukkan pewarnaan imunoperoksidase Tlimfosit dengan anti-CD3 setelah
pretreatment dengan trypsinpencernaan dan pengambilan antigen yang diinduksi
panas berikutnya menggunakan apanci presto. Chromogen DAB.
(Direproduksi,dengan izin,dari Hand, NM, 1999. Penyematan plastik untuk
mikroskop cahaya. Panduanuntuk ahli histologi. Contoh Teknologi . Histoteknologi
No. HT-6. 29–35. © Masyarakat Ahli Patologi Klinik Amerika.)
A. Solusi b
Polietilen glikol 40015 bagianN , N- dimetilanilin1 bagian
B. Fiksasi
Memperbaiki jaringan dalam formalin, misalnya saline formal, netralformalin
buffered, atau paraformaldehyde buffered.
C. Memproses dan menanamkan
Jika perlu, bilas jaringan dengan benarbuffer selama 15 menit.Dehidrasi hingga
70%, 90%, dan 100%etanol. Untuk blok rata-rata 10 × 5 × 2 mm,gunakan
duaperubahan 15 menit di setiap solusi.Menyusup dalam dua perubahan solusi
a,masing-masing untuk1 jam.Cantumkan dalam campuran berikut:Solusi a42
bagianSolusi b1 bagianPolimerisasi pada suhu kamar, tahan cetakandalam air dingin
untuk menghilangkan panas yang dihasilkan oleh
 Halaman 53
Jadwal pemrosesan plastik akrilik 149
reaksi eksotermis. Polimerisasi harusselesaikan dalam 2-4 jam.
D. Catatan
Spesimen hanya boleh diproses di bawahtudung asap dengan ekstraksi.
Pemrosesan terbaik dicapai jika spesimendiaduk terus menerus pada roller mixer.
Seharusnya alikuot kecil benzoil peroksidadikeringkan dengan hati-hati dari panas
langsung dan sinar mataharikarena berpotensi meledak. Itu harus sepenuhnya
dilarutkan dalam larutan infiltrasi dan ini mungkinmemakan waktu hingga 30 menit.
Beberapa sistem cetak blok adalahtersedia secara komersial, tetapi
terbukamemungkinkan sistem baki pencetakan polypropylenejaringan yang akan
dipasang langsung ke blok rintisan(Polysciences Inc., USA). Untuk mencapai yang
baikpolimerisasi, cetakan harus ditempatkan di dalamdesikator gelas dan oksigen
dikeluarkan dengan mengisiruang dengan nitrogen bebas oksigen. Ituruang kemudian
disegel.Campuran plastik akrilik paling baik disiapkan dijumlah yang dibutuhkan,
lebih disukai menggunakan yang besarbotol kaca tertutup. Dianjurkan untuk
mengukurjumlah berdasarkan volume.Solusi limbah yang mengandung plastik
komponen harus ditangani dan dibuangsesuai dengan persyaratan lokal dan
hukum.benzoyl peroxide plasticized (C) dalam 100 mlsolusi A atau yang setara,
sampai padatannyasepenuhnya larut).
Kebanyakan jaringan membutuhkaninfiltrasi minimal 3 jam tergantung pada
alamdan ukuran jaringan. Jaringan padat yang padat sepertitulang paling baik
diinfiltrasi semalaman pada suhu 4 ° C.Sematkan dalam media sematan segar
(tambahkan 1 mllarutan B sampai 25 ml larutan A atausetara) pada suhu kamar dalam
cetakan. Ituwaktu yang dibutuhkan untuk polimerisasi penuh bervariasi dengansuhu,
oksigen atmosfer, dll., tetapi di kamarsuhu (22 ° C) mungkin perlu 1-2 jam.Untuk
penyelidikan histokimia enzim, lebih baikhasil akan diperoleh dengan menggunakan
pra-dinginseluruh solusi, dengan pemrosesan danembedding pada 4 °C. Dalam
keadaan seperti ini,polimerisasi mungkin memakan waktu 6-12 jam.

Halaman 55
Jadwal pemrosesan plastik akrilik 151
Pemrosesan terbaik dicapai jika spesimendiaduk terus menerus pada roller
mixer.Aliquot kecil benzoil peroksida harus dikeringkanhati-hati, jauhkan dari panas
langsung dan sinar matahari seperti ituberpotensi meledak. Itu harus
sepenuhnyadilarutkan dalam larutan infiltrasi dan ini mungkinmemakan waktu hingga
30 menit.
Waktu dan suhu polimerisasi adalahmendasar untuk karakter fisik finalblok. Suhu
atau waktu yang meningkat akanmenghasilkan blok yang sangat saling terkait yang
rapuhdan mungkin sulit untuk diwarnai.

10. Memotong bagian plastik akrilik

Bagian semi-tipis dari GMA, MMA, dan LR White dariketebalan 2–3 μm dapat
dipotong dengan pisau baja pada astandar mikrotom, tetapi kualitas semi-tipis yang
lebih baikbagian akan diperoleh dengan menggunakan pisau kaca pada amikrotom
bermotor Entah Latta- segitigaPisau Hartmann atau Ralph bermata panjang lebih
cocok, tapipilihan tergantung terutama pada ukuran cetakan / blok.
Menggunakan campuran MMA yang dijelaskan, thepenangas air perludipanaskan
pada suhu 65-70 ° C untukbagian ini untuk diratakan. LR bagian Putih
melayangkeluar dengan alkohol 70% atau 30–40% aseton pada hot-platepada 60 °
C.PenggunaanSlide Superfrost Plus (tanpa perekat) untuk tulangsampel terbukti
memuaskan (D. Blythe, pribadikomunikasi).

11. Bagian plastik akrilik pewarnaan

LR White adalahdilunakkan dengan alkohol, jadi setelah selesai pewarnaan itu

Direkomendasikan bahwa bagian dibasahi dan dikeringkan pada ahot-plate pada 60 °
C selama beberapa menit sebelum dicelupkandi xylene dan dipasang. Bagian MMA
membutuhkanmedia penyisipan plastik harus dilepas sebelumpewarnaan, dan ini
mungkin mudah dicapai dengan merendamnyaslide dalam xylene selama 10-20 menit
pada 37 ° C.
Untuk bagian MMA, 30 menit dalam hematoxylindan 5 menit dalam pewarnaan
1% buffer eosinlebih disukai, tetapi bagian harus dicuci dengan cepat diair dan etanol
sebagai eosin cepat dihilangkan.

12. Metode hematoksilin dan eosin

Noda di hematoxylin alum Harris atau Gill untuk10–20 menit.Cuci dengan
airledeng.Jika perlu, bedakan alkohol asam 1%selama 2-3 detik.Biru dalam air keran.
Cuci dalam air selama 15 menit.Noda dalam eosin berair 1% yang difilter dalam 1%
kalsium klorida selama 3 menit.Cuci air keran selama 30 detik.Bercak kering.Bilas
dalam etanol selama 20 detik.Bilas dengan xylene.Pasang di DPX.
Catatan
Abaikan langkah 3 dan 9 untuk LR White.
Halaman 56
152
Penempelan plastik untuk mikroskop cahaya
13. Imunohistokimiapewarnaan pada bagian MMA
Bagian dapat diwarnai dengan protokol dan proseduryang mengikuti erat apa
yang digunakan untuk par-affinbagian, menggunakan teknik imunoperoksidase rutin
seperti teknik tipe avidin-biotin yang sensitif danprosedur imunohistokimia berbasis
polimer.DAB dapat digunakan sebagai kromogen dan intensifikasitidak diperlukan
untuk visualisasi. Inkubasi dilakukanpada suhu kamar dan pada dasarnya reagen
dan waktu dari berbagai tahap seperti biasa, meskipunpewarnaan optimal beberapa
antigen mungkin memerlukan perubahandalam pra-perawatan dan / atau pengenceran
antibodi.
DiSelain penerapan berbagaiantibodi poliklonal dan monoklonal, kelinciantibodi
monoklonal juga baru-baru inisukses ( L. Kemiskinan , komunikasi per-sonal ).
Untukmenghindari hasil yang buruk atau salah, penting selamapewarnaan bahwa
bagian tidak diperbolehkan mengering, yangterjadi lebih cepat daripada untuk bagian
parafin.Seperti bagian parafin, salah satu yang palingAspek atic dariimunostaining
adalah penggunaanpengobatan. Enzim pencernaan dengan trypsin telahdigunakan
untuk beberapa antigen, tetapi pengenalan panasprosedur termediasi, baik
menggunakan oven microwave( Hand et al. 1996 ) atau pressure cooker ( Hand
Church 1998 ) dengan larutan natrium sitrat telah membantusecara signifikan untuk
meningkatkan dan menstandarisasi pewarnaan.
Namun, beberapa detail prosedur yang tepat mungkinberbeda dari yang untuk
bagian parafin, dan untuk beberapaantigen kombinasi dari pra-perawatan mungkin
diperlukan untuk mencapai hasil terbaik. Pra-dimediasi panaspengobatan juga
mengambil antigenisitas lebih baik di arsipmaterial ( Hand et al. 1996 ). Untuk detail
yang lebih besar,pembaca disarankan untuk merujuk ke sejumlah artikel ( Hand1995b
; Blythe et al. 1997 ; Hand & Church 1997 ),meskipun pengembangan studi oleh
Blythe et al.sekarang telah mengarah ke pretreatment menggunakan pressure cook
danreagen deteksi berbasis polimer ( D. Blythe , personalkomunikasi).
Dalam beberapa tahun terakhir prosedur amplifikasi didasarkan padatyramide
telah diperkenalkan pada immuno-histokimia, menghasilkan sangat sensitifteknik
intensifikasi. Meski begitu prosedurnyaawalnya ditujukan untuk bagian parafin dan
bermanfaatketika antibodi tertentu hanya menghasilkan sinyal lemahmenggunakan
teknik konvensional, jugaberhasil diterapkan ke jaringan yang tertanam MMA(
Jackson et al. 1996 ).Protokol dan teknik yang diuraikan sebelumnya
bisamenghasilkan pewarnaan imunohistokimia yang sangat baik dantelah digunakan
secara rutin, terutama pada undecalcifiedtrephines sumsum tulang hematologis (
Blythe et al.1997 ) dan folikel rambut ( Randall & Foster 2007 ).

Jadwal pemrosesan dan penyematan untuk Lowicryl K4M

( Al-Nawab & Davies 1989 )

Jadwal berikut telah digunakan pada ginjalbiopsi jarum di mana bagian 2 µm dan
90 nm beradakemudian potong untuk mikroskop cahaya dan elektronstudi
mikroskopis, masing-masing.
Fiksasi
4% paraformaldehyde selama 2 jam disuhu kamar.
Dehidrasi
50% metanol pada −20 ° C selama 30 menit.
80% metanol pada suhu -20 ° C selama 60 menit.
90% metanol pada −20 ° C selama 60 menit.
Infiltrasi
1 bagian metanol dan 1 bagian Lowicryl K4M di−20 ° C selama 30 menit.1
bagian metanol dan 2 bagian Lowicryl K4M di−20 ° C selama 60
menit.100%Lowicryl K4M pada −20 ° C selama 60 menit.100% Lowicryl K4M pada
−20 ° C semalam.
Polimerisasi
Sematkan jaringan dalam Lowicryl K4M segar dalam gelatinkapsul dan foto-
polimerisasi pada 35 ° C semalammenggunakan iradiasi ultraviolet tidak langsung
(difus) dari aLampu neon Philips TLAD 15 W / 05(puncak panjang gelombang pada
360 nm). Kapsulnya adalahtersuspensi dalam rendaman etanol dengan kutub
bawahnyadirendam dalam alkohol untuk menghilangkan panas yang
menumpukselama proses polimerisasi, dan kemudiandihapus dan diiradiasi pada suhu
kamar untuklanjut 1–2 hari untuk meningkatkan properti sectioning.

Halaman 57
Masa depan embedding plastik akrilik 153
Masa depan embedding plastik akrilik
Sebagai diagnosis histologis menjadi lebihmenuntut dengan meningkatnya
penggunaan yang canggihteknik, demikian juga memiliki teknologi plastikprosedur
penanaman telah maju. Penanaman barumedia terus dikembangkan, dan ada
mengakui bahwa fleksibilitas akrilat dapatterkadang memberikan penyematan yang
paling cocokmedia untuk investigasi tertentu. Banyakaplikasi untuk mikroskop
cahaya resolusi tinggi,tetapi beberapa dapat digunakan untuk mikroskop elektron.
Studiseperti yang dilaporkan oleh Bowdler et al. (1989) dan Al-
Nawab dan Davies (1989) telah menggabungkan keduanyamikroskop dan mikroskop
elektron pada hal yang samabiopsi menggunakan LR White dan Lowicryl K4M,
masing-masing, maka perbandingan langsung dem-onstratingantara teknikimunohis-
tokimia pada cahayamikroskop dengan yang ada di tingkat mikroskop elektron.
Plastik akrilik khusus telah diformulasikan untukpemrosesan dan penempelan
jaringan suhu rendah,terutama untuk mikroskop elektron, seperti suhudi atas 50 ° C
dikenal untuk mempromosikan denaturasiprotein, menyebabkan hilangnya aktivitas
enzim dan reduksidalam antigenisitas.
Tiga penyematan suhu rendahprosedur telah digunakan dengan plastik Lowicryl:
substitusi beku, pengeringan beku, dan progresifmenurunkan tempera-ture (PLT).
Bagaimana media embedding plastik dan masa depanteknik mereka berdampak pada
praktik histologis rutindipertanyakan, tetapi untuk beberapa prosedur khususgunakan
media penyisipan plastik untuk tetap bertahanperlu dan / atau bermanfaat.

Halaman 60

Bagaimana pewarnaan histologis bekerja 9

Richard W. Horobin

Teori umum tentang pewarnaan

Mengapa noda dimasukkan ke dalam jaringan?
Penyerapan noda sering disebabkan oleh jaringan pewarna atau jaringan
pereaksiafinitas. Dalam literatur pewarnaan histologis, untuk mengatakankomponen
jaringan memiliki afinitas yang tinggi untuk pewarnahanya berarti bahwa, di bawah
kondisi penggunaan,komponen menjadi sangat ternoda. Afinitas adalahNamun juga
digunakan untuk menggambarkan kekuatan-kekuatan yang menarik itudianggap
mengikat pewarna ke jaringan.
Ahli kimia fisik menggunakan istilah afinitas pada yang pertamaakal, dan
penggunaannya diadopsi di sini. Afinitas itubesarnya tergantung pada setiap faktor
yang mendukung ataumenghambat gerakan ini. Noda-jaringan, pelarut-noda,dan
interaksi noda-noda semua harus dipertimbangkan, sebagaimemang harus interaksi
solvent-solvent. penyerapan pewarna dan pereaksi adalahseringkali multistep, baik
dalam ruang maupun waktu. Pereaksi mungkin
awalnya memasuki jaringan karena, katakanlah, atraksi coulomb.
Begitu masuk, ia bisa membentuk ikatan kovalen dengan
beberapapengelompokan jaringan. Intensitas pewarnaan juga mungkindibatasi oleh
kelarutan noda dalam pelarut dan jaringanlingkungan.
Berbagai kontribusi untuk afinitas jaringan-noda adalah
diuraikan dalam Tabel 9.1 , dan dibahas di bawah ini. Prac-
proses pewarnaan ini biasanya melibatkan beberapa hal
faktor-faktor.