IRA WIASTUTI

SKRINING FARMAKOFOR DAN PENAMBATAN MOLEKUL

KANDUNGAN SENYAWA AKTIF BIJI MELINJO
(Gnetum gnemon L.) TERHADAP EPIDERMAL GROWTH FACTOR
RECEPTOR (EGFR) SEBAGAI ANTIKANKER PARU

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS GARUT

2019
 BAB IV

PENELITIAN

4.1 Preparasi Reseptor

Makromolekul yang digunakan dalam penelitian ini adalah Epidermal

Growth Factor Receptor (EGFR) dari Antikanker paru yang diperoleh dari

Protein Data Bank (PDB) pada situs (http://www.rcsb.org.pdb) dengan ID 3W2S

makromolekul diunduh dengan format (.pdb).

4.2 Preparasi Ligan

Senyawa uji yang digunakan adalah senyawa dari biji melinjo diambil dari

pubchem dengan format 2D dan dibuat 3D menggunakan ChemDraw ultra 12.0

dengan format (.sdf). Untuk obat pembanding, menggunakan obat Erlotinib yang

diunduh dari situs PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) dengan format

(.pdb).

4.3 Skrining Farmakofor

4.3.1 Pencarian Database Senyawa Active dan Decoys

Basis ligan diperlukan database ligan active dan decoys dari reseptor

Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR). Dapat diunduh pada situs

DUD.E (http://dude.docking.org/)

4.3.2 Penentuan Farmakofor Database Senyawa Active dan Decoy

Ditentukan farmakofor dari database senyawa active menggunakan

aplikasi Ligandscout 4.4 dengan cara diklik Ligan-based; (file > Open >

22
 23

Actives_final.sdf.gz > Open File > Set Seletected cluster IDs to Training >

Create Ligan Based Pharmacophore > setelah itu diubah number of omited

featuers for merged pharmacophore menjadi 3 > Ok.

Selanjutnya ditentukan farmakofor dari database senyawa decoy

menggunakan aplikasi Ligandscout 4.4 dengan cara diklik Ligan-based

(file > Open > Decoys_final.sdf.gz > Open File > Set Seletected cluster

IDs to Training > Create Ligan Based Pharmacophore setelah itu diubah

number of omited featuers for merged pharmacophore menjadi 3 > Ok.

4.3.3 Validasi dan Skrining Farmakofor

Dilakukan validasi pada Ligandscout 4.4 yang bertujuan untuk

mengetahui bahwa perangkat lunak dapat digunakan pada penelitian ini.

Validasi dilakukan dengan cara membuat database active dan decoy yang

dikumpulkan dari website yang telah dipercaya DUDe. Database active

yang digunakan, merupakan kumpulan ligan yang diketahui dan terbukti

memiliki aktivitas terhadap Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)

pada antikanker paru dan database decoy merupakan ligan yang memiliki

struktur yang mirip dengan ligan active namun tidak memiliki aktivitas atau

tidak menimbulkan interaksi pada reseptor.

4.3.4 Pemodelan Molekul Senyawa Uji

Pemodelan molekul senyawa uji adalah untuk mencari model terbaik

pada LBDD dengan ROC Curve terbaik maka dipilihnya model tersebut

untuk dilakukan skrining senyawa uji dan ligan standar sebagai kontrol
 24

positifnya. Proses yang dilakukan adalah import model farmakofor berbasis

Ligan dari entry PDB > ke dalam ‘Screening perspective’ menggunakan

‘Exchange data Widget’ atau dijalankan versi yang sudah disimpan

menggunakan entry ‘Open’ pada menu ‘File’ diklik tombol ‘Load

Screening Database’ untuk menjalankan skrining database `Senyawauji-

Final.ldb’, dan diklik tombol yang sama dan jalankan database ‘Decoys-

Final.ldb’. diklik sekali pada selector tristate disebelah kiri nama database

untuk menandai “Senyawauji.ldb’ sebagai database yang mengandung

senyawa aktif (simbol database hijau), dan klik dua kali pada selector

tristate dikiri ‘Decoy-final.ldb’ untuk menandai database ini sebagai decoy

(simbol database merah). Selanjutnya dipilih farmakofor model ‘3W2S’

dari daftar ‘Pharmacophores’ untuk memastikannya dapat ditampilkan

dalam tampilan 3D. Di Klik tombol ’Perfom Screening’ untuk memulai

skrining virtual.

Kemudian dipilih kedua farmakofor dalam tabel `Pharmacophores`.

Angka dalam braket (“{1} and {2}”) menggambarkan jumlah farmakofor.

Dimasukan 1 atau 2 kedalam bidang boolean expression menunjukkan

bahwa hit virtual dalam skrining ini berjalan baik pada farmakofor yang

pertama maupun yang kedua > ditekan tombol skrining lagi untuk

mengulang skrining, dan ditekan tombol kurva ROC lagi untuk

membandingkan statistik skrining virtual.

 25

4.3.5 Pembuatan Database Senyawa Uji

Kumpulan senyawa uji yang telah dibuat dengan Chemdraw Ultra

dan dibuat 3D dengan meminimisasi energinya dimasukan ke dalam ligan

prespective dengan tipe test berbeda dengan database active dan decoy

sebelumnya.

4.3.6 Skrining Farmakofor Senyawa Uji

Model yang sudah berada pada screening prespective dilakukan

skrining balik menggunakan database senyawa uji dengan standarnya dan

Ligandscout 4.4 akan memprosesnya sehingga dihasilkan beberapa

senyawa terbaik dengan melihat tingkat kemiripannya atau fit score.

Senyawa uji yang memiliki nilai fit score yang tinggi dipilih sebagai

senyawa yang disinyalir memiliki aktivitas dan interaksi yang sama

berdasarkan kesamaan farmakofornya.

Skrining digunakan pada ‘screen pharmacophore against external

library’ yang terdapat pada menu ‘pharmacophore’menu > dipilih berkas

senyawa uji > ditekan tombol titik tiga untuk membuka dialog berkas > dan

dipilih jumlah fitur yang dihilangkan.

4.4 Penambatan Molekul

Penambatan senyawa ligan pada reseptor dilakukan terlebih dahulu

persiapan reseptor EGFR dari antikanker paru yang diperoleh dari Protein Data

Bank (PDB) pada situs http://www.rcsb.org.pdb dengan ID 3W2S. Makromolekul

 26

diunduh dengan format (.pdb) dengan menghilangkan senyawa standarnya >

kemudian dilakukan penambatan molekul pada senyawa > file > insert > pilih

senyawa > insert file > persiapan ligan > optimasi geometri pilih menu molecule

> minimaize MMFF94 Energy Of Molecule sampai ligan stabil > lakukan

penambatan molekul > Molecule > Dock Ligan > AutoDock Vina 1.1 > Ok.

Penambatan molekul dilakukan dari reseptor yang digunakan kemudian

menghilangkan ligan standarnya, setelah itu persiapan ligan hit senyawa uji yang

memiliki nilai hit yang tinggi akan dipilih sebagai senyawa yang memiliki

aktivitas dan interaksi yang sama berdasarkan kesamaan farmakofornya.

 BAB V

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini telah dilakukan pada kandungan senyawa tanaman biji

melinjo (Gnetum gnemon L.) yang potensial terhadap reseptor Epidermal Growth

Factor (EGFR) sebagai antikanker paru dengan menggunakan dua metode yaitu

skrining farmakofor dan penambatan molekul (molecular docking). Dimana

skirining farmakofor bertujuan untuk mendeteksi senyawa aktif tanaman yang

memiliki hit atau fitur kimia yang mirip berdasarkan kesamaan sifat fisikokimia,

berupa sifat elektronik, hidrofobik dan sterik dari senyawa-senyawa yang

dilaporkan aktif.

Metode yang digunakan dalam mempelajari interaksi tersebut yakni

penambatan molekul yaitu penelitian menggunakan komputasi untuk melihat

interaksi antara ligan dengan reseptor. Hasil dari penambatan molekul ini adalah

berupa skor penambatan dan hasil visualisasi secara virtual. Skor penambatan

yang dianggap baik adalah skor yang nilainya lebih kecil, karena menggambarkan

senyawa yang diuji secara penambatan molekul tersebut akan melekat dengan

sangat baik dengan reseptornya dan tidak membutuhkan banyak energi untuk

berikatan.

Makromolekul yang digunakan dalam penelitian ini adalah Epidermal

Growth Factor Receptor (EGFR) dari Antikanker paru yang diperoleh dari situs

Protein Data Bank (PDB) dengan ID 3W2S resolusi 1.9Å. Nilai resolusi persis

didefnisikan sebagai suatu metode untuk mendeteksi tingkat akurasi pemetaan

27
 28

kompleks antara ligan dan enzim yang disinari dengan sinar X. Nilai resolusi yang

baik mempunyai nilai kurang dari 2Å. Nilai resolusi yang kecil menandakan

kompleks ligan dengan enzim itu cenderung lebih akurat hasil pemetaan antara

atom-atom penyususnnya. Struktur 3D makromolekul protein dapat dilihat pada

(Gambar III.8).

Ligan-ligan dihasilkan dan dimodelkan struktur 2D dan 3D menggunakan

program ChemBioDraw Ultra. Kemudian struktur 3D tersebut diminimisasi

energinya agar konformasi yang terbentuk mencapai energi terendah seperti

kondisi senyawa tersebut di alam. Metode minimisasi energi yang digunakan

adalah metode Minimize MMFF94 Energy of Molecule yang terdapat dalam paket

program Ligandscout 4.4. Minimalisasi energi bertujuan untuk menemukan

konformasi paling sesuai dari suatu molekul untuk berikatan dengan enzim.

Struktur 2D senyawa uji dapat dilihat pada (Gambar III.11-III.32).

Selanjutnya dilakukan tahap analisis sifat ligan. Menurut Lipinski’s Rule

of Five, syarat molekul obat yang baik untuk dikonsumsi melalui rute peroral

adalah nilai log P ≤ 5, berat molekul ≤ 500, gugus hidrogen donor ≤ 5, gugus

hidrogen akseptor ≤ 10, dan refraktifitas molar sebaiknya dalam rentang 40-130.

Tetapi yang umum digunakan adalah aturan berat molekul, gugus donor ikatan

hidrogen, gugus akseptor donor ikatan hidrogen, dan nilai log P. Semakin nilai log

P mendekati 5, maka hidrofobisitasnya akan semakin tinggi. Telah dilakukan

analisis pada 22 senyawa uji biji melinjo (Gnetum gnemon L.) terdapat 12

senyawa yang masuk ke dalam aturan Lipinski’s Rule of Five. Sifat ligan

berdasarkan Lipinski’s Rule of Five dapat dilihat pada (Tabel V.5).

 29

Ketentuan Lipinski’s Rule of Five, digunakan sebagai parameter atau

syarat molekul obat yang baik untuk dikonsumsi melalui rute peroral dengan

melihat bagus tidaknya permeabilitas dan absorbsi suatu obat. Jika permeabilitas

dan absorbsi obat bagus maka obat tersebut memenuhi aturan Lipinski’s Rule of

Five.

Tahap selanjutnya dilakukan skrining farmakofor dengan menggunakan

database active dan decoy. Database active merupakan kumpulan ligan yang

diketahui dan terbukti memiliki aktivitas terhadap Epidermal Growth Factor

Receptor (EGFR) dan database decoy merupakan ligan yang memiliki struktur

yang mirip dengan ligan active namun tidak memiliki aktivitas atau tidak

menimbulkan interaksi pada reseptor. Dari database active yang berjumlah 832

dan decoy 10.442 yang diambil dari total active hanya 20 dan decoy 100 hal

tersebut dikarenakan keterbatasan sistem komputasi karena jika semua database

active dan decoy digunakan proses skrining akan berjalan lambat dan tidak

berjalan dengan baik. Setelah itu database dibuat menjadi cluster untuk

mengelompokkan sejumlah senyawa yang telah terkumpul berdasarkan variasi

struktur yang ada. Kelompok struktur akan muncul dan setiap kelompoknya hanya

satu ligan yang bertipe training, sisanya dalam kelompok tersebut dibuat ignored

hal ini berpengaruh pada tahap selanjutnya yaitu pembuatan farmakofor agar tidak

memperberat kerja dari aplikasi Ligandscout 4.4 karena pembuatan farmakofor

hanya berdasarkan pada tipe training.

Pembuatan farmakofor ini tentunya bertujuan untuk membuat farmakofor

pada gugus-gugus fungsional pada struktur ligan yang ada. Pembuatan farmakofor
 30

ini akan mengklasifikasikan model dari farmakofor keseluruhanya, model yang

akan diperlihatkan dari satu variasi hingga maksimum model yang dapat

dihasilkan. Pada Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), dihasilkan 10

model farmakofor, dimana memiliki variasi fitur farmakofor yang berbeda. Dapat

dilihat pada (Gambar V.5). Pemindahan setiap modelnya pada screening

prespective diskrining dengan menggunakan database yang telah disiapkan

sebelumnya hingga didapatkan ROC curve. Hasil validasi skrining farmakofor

didapatkan nilai ROC curve yang berbeda. Kurva ROC merupakan parameter

kualitas validasi paling umum yang digunakan untuk evaluasi pemodelan

farmakofor dimana kurva ROC ini terdiri atas sumbu X yang merupakan laju

senyawa inaktif yang cocok terhadap model farmakofor dan sumbu Y merupakan

laju senyawa bioaktif yang secara tepat dikenali oleh model farmakofor. Dapat

dilihat pada (Tabel V.2).

Dari sepuluh model farmakofor yang didapat, hanya model 6 yang

merupakan model terbaik dikarenakan memiliki nilai AUC100 sebesar 0,88 dengan

nilai hit sebanyak 61 hit dalam model tersebut terdapat fitur farmakofor yaitu 1

Hydrogen Bond Donor, 2 Hydrogen Bond Acceptor, 2 Hydrophobic Interactions,

terdapat juga 1 Aromatic Ring, dan 2 Positive Ionizable Area. Ini artinya, metode

tersebut dapat digunakan karena memenuhi persyaratan yaitu nilai AUC 100 ≥ 70%

atau 0,7. Model 6 dipilih karena memiliki skor tinggi pada pembuatan farmakofor,

skrining senyawa uji dapat dilakukan dengan menggunakan model tersebut.

Setelah mendapatkan model terbaik dengan ROC curve terbaik yaitu

model 6, kemudian dilakukan skrining senyawa uji dan ligan standar sebagai
 31

kontrol positifnya. Proses yang dilakukan sama dengan pada saat melakukan

validasi. Kumpulan senyawa uji yang telah dibuat dengan Chemdraw dan dibuat

menjadi bentuk 3D dengan meminimisasi energinya, dimasukkan ke dalam ligan

prespective dengan tipe test yang berbeda dengan database active dan decoy

sebelumnya. Model yang sudah berada pada screening prespective akan dilakukan

skrining balik menggunakan database senyawa uji dengan standarnya dan

Ligandscout 4.4 akan memprosesnya hingga menghasilkan beberapa senyawa

terbaik dengan melihat tingkat kemiripanya atau fit score. Senyawa uji yang

memiliki nilai fit score yang tinggi akan dipilih sebagai senyawa yang disinyalir

memiliki aktivitas dan interaksi yang sama berdasarkan kesamaan farmakofornya.

Dari hasil skrining senyawa uji dihasilkan 5 senyawa hit dari 22 senyawa

uji yang terkandung dalam biji melinjo yaitu Isorhapontigenin, Gnetifolin K,

Gnemonoside C, Glucosides dan Gnetifolin E dengan nilai pharmacophore fit

score berturut-turut sebesar 45.12%, 44.39%, 44,15%, 44,08% dan 43,81%.

Standar fit score untuk Erlotinib adalah 62.86%. Senyawa yang memiliki fit score

terbaik adalah Isorhapontigenin dengan fit score 45,12% senyawa tersebut

memiliki aktivitas terbaik terhadap Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)

karena adanya kesamaan model farmakofor dengan senyawa-senyawa aktif

sebelumnya yang telah diketahui sebagai ligan standar dari Epidermal Growth

Factor Receptor (EGFR) dan disinyalir memiliki interaksi dengan Erlotinib. Nilai

fit score dapat dilihat pada (Tabel V.3).

Selanjutnya melakukan validasi pada Ligandscout 4.4 dengan tujuan untuk

membuktikan bahwa perangkat lunak yang digunakan sesuai dan tepat dengan
 32

perangkat keras sehingga hasil penambatan molekul yang diperoleh akan akurat

dan presisi. Validasi program yaitu dilakukan dengan cara re-docking dan

penumpukkan (overlay) struktur. Tahapan re-docking adalah untuk mengetahui

kelayakan perangkat lunak yang digunakan untuk proses penambatan molekul.

Kelayakan ini dinilai menggunakan parameter melalui nilai konstanta inhibisi

(Ki). Hasil re-docking dan overlay didapatkan nilai RMSD 1,49 nilai tersebut

sudah sesuai karena < 2. Hasil re-docking overlay (Gambar V.1) dan dinyatakan

dalam (Tabel V.1) yang membuktikan bahwa perangkat lunak yang digunakan

dalam penelitian terbukti sah dan benar karena nilai RMSD kurang dari 2Å. Jika

nilai RMSD tidak sesuai maka proses validasi yang dilakukan tidak valid, karena

jarak antar ligan standar dan ligan hasil penambatan molekul tidak berhimpit serta

jauh dari posisi seharusnya ligan standar berada.

Setelah mendapatkan hasil senyawa yang hit dilakukan penambatan

molekul pada 5 senyawa uji dengan menggunakan Autodock Vina yang terdapat

pada Ligandscout 4.4 dengan menggunakan reseptor Epidermal Growth Factor

Receptor (EGFR) dengan ID: 3W2S. Pada tahap ini, dilakukan penambatan

molekul Isorhapontigenin terhadap Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)

terlebih dahulu, kemudian dilanjutkan dengan penambatan molekul Gnetifolin K,

Gnemonoside C, Glucosides, Gnetifolin E dan selanjutnya Erlotinib terhadap

Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR). Senyawa uji yang dilakukan

penambatan molekul dengan menggunakan Ligandscout 4.4 memperlihatkan hasil

binding affinity (∆G) yang akan dihitung kedalam nilai Ki dengan melihat nilai

RMSD < 2 serta memperlihatkan ikatannya dengan asam amino.

 33

Selain didapatkan nilai energi bebas, perlu juga dilakukan perhitungan konstanta

inhibisi (Ki). Pengaruh nilai Ei terhadap nilai Ki, sesuai dengan persamaan

berikut.

Keterangan : Ki = e [(∆G x 1000) / RT]

Ki = Konstanta inhibisi (M)

e = eksponensial

∆G = energi bebas Gibbs (kkal/mol)

R = 1.98719

T = 298K

Ki merupakan kestabilan kompleks yang terbentuk antara protein dengan

ligan. Setelah dilakukan penambatan molekul dengan menggunakan aplikasi

Ligandscout 4.4 hasilnya di dapatkan senyawa Gnemonoside C dengan nilai

energi bebas sebesar -24,20 kkal/mol dan nilai konstanta inhibisi 1,78 nM yang

memiliki nilai energi bebas lebih rendah dibandingkan dengan ligan pembanding

Erlotinib. Dapat dilihat pada (Tabel V.5).

Kemudian dilakukan analisis sisi aktif reseptor untuk melihat interaksi

antara ligan standar yaitu Erlotinib dengan residu-residu asam amino yang berada

di sekitar sisi aktifnya. Reseptor Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)

dengan ligan pembanding Erlotinib membentuk ikatan hidrogen dengan asam

amino yaitu THR854A dan empat Ikatan Hidrofobik VAL726A, LEU777A,

ALA767A dan ALA763A. Farmakofor yang dimiliki oleh Gnemonoside C sendiri

yaitu THR854A yang memiliki kesamaan dengan ligan pembanding Erlotinib

pada pemodelan farmakofor yaitu THR854A. Dapat dilihat pada (Gambar V.4).
 BAB VI

SIMPULAN DAN SARAN

6.1 Simpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan pada 22 senyawa dari

tanaman biji melinjo (Gnetum gnemon L.) dengan menggunakan metode skrining

farmakofor dan penambatan molekul terhadap reseptor Epidermal Growth Factor

Receptor (EGFR) hasilnya didapatkan 5 senyawa hit dengan nilai pharmacophore

fit score berturut-turut yaitu Isorhapontigenin 45.12%, Gnetifolin K 44.39%,

Gnemonoside C 44,15%, Glucosides 44,08% dan Gnetifolin E 43,81% yang

disinyalir memiliki aktivitas dan interaksi yang sama dengan ligan standar

berdasarkan kesamaan farmakofornya. Kemudian hasil penambatan molekul di

dapatkan senyawa gnemonoside C dengan nilai energi bebas sebesar -24,20

kkal/mol dan nilai konstanta inhibisi 1,78 nM yang memiliki nilai energi bebas

lebih rendah dibandingkan dengan ligan standar Erlotinib. Dapat disimpulkan

bahwa senyawa Gnemonoside C diprediksi memiliki potensi dan aktivitas yang

lebih baik sebagai antikanker paru dengan menghambat kerja reseptor Epidermal

Growth Factor Receptor (EGFR) dibandingkan dengan senyawa aktif lain dari

biji melinjo (Gnetum gnemon L.).

6.2 Saran

Perlu adanya konfirmasi dan dibuktikan lebih lanjut mengenai senyawa uji

yang terpilih, meliputi pengembangan senyawa aktif menjadi obat melalui

langkah-langkah proses pengembangan obat baru dengan molecular dynamic.

34
 35

Serta perlu dilakukan penelitian secara in vitro dan in vivo dari isolat kandungan

biji melinjo tersebut dan perlu adanya modifikasi agar struktur senyawa memiliki

kemampuan yang lebih baik.