Pertukaran Sister chromatid (SCE) adalah fenomena yang terjadi secara luas di alam ini

menunjukkan bahwa ia mewakili atau merupakan ekspresi dari proses yang relevan secara
biologis yang telah dipertahankan melalui evolusi. Namun, makna biologisnya dan mekanisme
pembentukannya belum sepenuhnya dijelaskan. Bukti telah diperoleh bahwa terjadinya SCE
membutuhkan sel untuk melewati sintesis DNA ada juga beberapa data yang menunjukkan
bahwa garpu replikasi adalah situs di mana peristiwa ini terjadi. Telah dilaporkan bahwa SCE
dapat disebabkan oleh adanya lesi DNA pada saat replikasi atau oleh perubahan proses yang
terakhir ini. Sintesis DNA, dan khususnya pembentukan garpu replikasi, adalah saat di mana
SCE paling mungkin terjadi, karena ini adalah ketika untaian ganda homolog berdekatan dan
peristiwa rekombinasi homolog bisa terjadi dengan lebih mudah. Bukti yang jelas baru-baru ini
dilaporkan terkait SCE dengan rekombinasi homolog. Dan perbaikan replikatif pada eukariota
suatu mekanisme diusulkan yang memungkinkan duplikasi DNA di hadapan lesi; lesi ini
selanjutnya dapat dihilangkan dengan proses perbaikan terkait atau setelah replikasi.

Dalam model seperti itu, perantara Holliday dapat diselesaikan dengan menghasilkan
pertukaran untai ganda atau sederhana, yang menentukan apakah pertukaran kromatid sister tidak
terjadi atau tidak. Dalam konteks ini, pendekatan untuk menentukan makna biologis adalah
untuk menetapkan apakah produksi SCE terkait dengan penghapusan kerusakan DNA atau
toleransi lesi. Untuk membedakan antara dua kemungkinan ini, diperlukan bukti yang
memungkinkan seseorang untuk menentukan apakah lesi dapat menyebabkan SCE di divisi
berikutnya dan apakah umum untuk SCE terjadi di lokus yang sama di divisi sel berikutnya.

Induksi di setiap pembelahan sel diperkirakan dengan perbedaan jauh kemudian dalam
sel-sel proliferatif, menunjukkan bahwa tidak semua lesi yang menginduksi SCE diperbaiki
selama pembelahan sel. Namun, bukti yang diperoleh dengan protokol pewarnaan kromatid dua
nada yang biasa dilakukan tidak memungkinkan kita menentukan dengan jelas kegigihan atau
perbaikan lesi yang menginduksi SCE. Mengingat bahwa pewarnaan diferensial memerlukan dua
pembelahan sel, SCE yang dianalisis dapat menjadi akumulasi SCE yang terjadi pada dua
pembelahan sel. Untuk membedakan induksi SCE di setiap pembelahan sel, pengobatan mutagen
diterapkan pada kelompok yang berbeda dalam setiap siklus sel; SCE

Namun, efek pembatalan dalam sel yang terpapar di divisi pertama dan efek substitusi
bromodeoxyuridine (BrdU) pada mereka yang terpapar di divisi kedua membuat interpretasi
sulit. Protokol yang didasarkan pada pewarnaan diferensial tiga arah (TWDS) SCE
memungkinkan seseorang untuk menentukan SCE yang terjadi di masing-masing dari tiga
generasi sel berturut-turut dan bahkan frekuensi di mana SCE terjadi di lokus yang sama.
Menggunakan protokol ini dalam limfosit manusia atau sel CHO in vitro, telah dilaporkan bahwa
paparan tunggal terhadap mitomisin C, sinar UV, radiasi pengion atau EMS mampu menginduksi
SCE dalam divisi yang berurutan, tetapi tidak pada lokus yang sama.

Dalam sel-sel sumsum tulang murine in vivo, juga dengan paparan tunggal, diamati
bahwa -rays menyebabkan 100% lesi yang mampu menginduksi SCE pada lokus yang sama,
demikian juga, telah dicatat bahwa beberapa mutagen kimia menghasilkan efek yang sama, tetapi
dengan probabilitas 50% atau kurang. Dalam protokol TWDS, hubungan antara waktu paparan
mutagen dan jalannya duplikasi DNA sangat penting untuk interpretasi, karena dengan asumsi
bahwa SCE terjadi pada garpu duplikasi. Lesi DNA yang diinduksi di belakang garpu akan
menghasilkan SCE selama pembelahan sel berikutnya; ini bisa disalahartikan sebagai persistensi
lesi.

Tujuan dari penelitian ini adalah sebagai berikut:

 untuk menentukan arah induksi SCE pada divisi pertama (SCE-1), kedua (SCE-2) dan
ketiga (SCE-3) tergantung pada waktu pemaparan terhadap etilnitrosourea (ENU).
 menetapkan apakah pajanan mutagen menyebabkan lesi DNA yang memunculkan SCE
pada divisi yang berurutan (persisten) dan bahkan pada lokus yang sama.
 untuk menentukan pengaruh penggabungan BrdU ke dalam DNA pada induksi dan
kegigihan memunculkan SCE.

Hewan

BALB / c tikus jantan berumur dua hingga tiga bulan dengan berat 30 g digunakan dalam
percobaan ini. Hewan-hewan tersebut ditempatkan di kandang plastik di bawah kondisi suhu dan
periode gelap-cahaya yang terkontrol dan diberi makan dengan Purina chow untuk tikus kecil
dan ad libitum air.

Protokol
 Protokol yang diikuti untuk menentukan induksi SCE dalam tiga generasi sel berikutnya
dalam sel sumsum tulang murine didasarkan pada pewarnaan diferensial tiga-cara kromatid
saudara perempuan. Tikus menerima dosis BrdU yang rendah (0,2 mg / kg berat badan dengan
pt) sebelum divisi pertama (waktu 0) dan dosis tinggi (2,0 mg / kg berat badan pt) sebelum siklus
kedua divisi (12 jam setelah inisiasi). BrdU sebelumnya telah diadsorpsi ke arang aktif. Dosis 25
mg / kg ENU (dalam air) diberikan s.c. untuk berbagai kelompok tikus 3, 6, 9, 12, 18, 24 atau 30
jam setelah injeksi pertama BrdU (dosis BrdU rendah). Eksperimen tambahan dilakukan dengan
paparan 3, 6 dan 12 jam sebelum dosis BrdU pertama. Colchicine (3.75.mg/kg) diberikan i.p. 2
jam sebelum membunuh dengan dislokasi serviks dan 36 jam setelah injeksi BrdU pertama.

Waktu perawatan dengan dua dosis BrdU dan dengan colchicine dan pewarnaan
diferensial dalam tiga nada memungkinkan pemilihan populasi sel yang dibagi tiga kali antara
pemberian pertama BrdU dan akhir percobaan, dengan asumsi waktu pembuatan rata-rata 12
jam. Ini juga memungkinkan seseorang untuk memprediksi tingkat substitusi BrdU dalam untai
DNA pada saat pemberian ENU (Gambar 1). Protokol memungkinkan seseorang untuk skor SCE
yang terjadi di divisi pertama, kedua dan ketiga dalam sel dan untuk menyimpulkan apakah
mereka terjadi di situs yang sama dalam divisi yang berurutan (Gambar 1). Bahan Kimia BrdU,
ENU dan colchicine diperoleh dari Sigma Chemicals. Administrasi ENU Dosis ENU 25 mg / kg
ditetapkan dalam percobaan awal menggunakan protokol pewarnaan dua-nada yang biasa,
sebagai dosis yang menyebabkan SCE maksimum bersamaan dengan hanya efek sitotoksik
sedang (data tidak ditunjukkan). Yang terakhir ditentukan sebagai efek pada indeks mitosis dan
waktu generasi rata-rata.

Persiapan luncuran Hewan-hewan dibunuh dengan dislokasi serviks 2 jam setelah

pemberian colchicine. Kedua femur dibedah dan sel-sel sumsum tulang diperoleh dengan
menyuntikkan larutan garam di salah satu ujung tulang. Sel-sel yang diperoleh diperlakukan
dengan larutan hipotonik, difiksasi seperti yang dilaporkan sebelumnya dan akhirnya jatuh ke
slide dingin. Slide dikeringkan selama setidaknya 24 jam sebelum pewarnaan dengan metode
fluoresensi plus Giemsa, sebagai sedikit dimodifikasi. Analisis dan metode statistik Frekuensi
SCE-1, SCE-2 dan SCE-3 (Gambar 1) dinilai dalam 30 sel / hewan. SCE-3 dalam keturunan
kromosom dari untai DNA BrdU-tidak tersubstitusi, yang memiliki chromatid bernoda gelap
(SCE-3D), dan mereka dari untai DNA tersubstitusi rendah BrdU, yang memiliki chromatid
bernoda pucat (SCE-3P), adalah dianalisis dalam sel yang sama. Signifikansi statistik antara
kelompok-kelompok ditentukan dengan uji-t Student dan perbedaan dalam frekuensi SCE antara
SCE-3D dan SCE-3P ditentukan oleh uji-t berpasangan menggunakan program Excel untuk PC.
66

Gambar 1. Protokol TWDS untuk kromatid ditampilkan. Gambar ini menjelaskan bagaimana
diferensial penggabungan BrdU dalam tiga divisi berikutnya memungkinkan seseorang untuk
menentukan SCE di masing-masing tiga divisi, serta untuk menetapkan probabilitas bahwa SCE
terjadi pada lokus yang sama di divisi kedua dan ketiga karena lesi yang ulet. Seperti yang
ditunjukkan, ketika SCE terjadi di divisi-divisi ini di lokus yang sama, paparan terhadap mutagen
pada divisi kedua akan secara paradoks menyebabkan peningkatan SCE dengan penampilan
yang terjadi pada divisi pertama. Garis kontinyu mewakili substitusi BrdU yang tidak
disubstitusikan, garis putus-putus dan substitusi BrdU tinggi. Gambar tersebut menunjukkan
kromosom gelap dan pucat yang berasal dari untai yang tidak tersubstitusi dan diganti BrdU,
masing-masing, hadir setelah divisi pertama.
Rasional untuk mencapai tujuan

Protokol TWDS untuk kromatid yang ditunjukkan pada Gambar 1 memungkinkan untuk
menentukan SCE di masing-masing dari tiga divisi berikutnya. Ini memungkinkan kami untuk
menjelajahi yang berikut ini.

 Jalannya induksi SCE di masing-masing dari tiga divisi sebagai tiga divisi sel berturut-
turut ini berlangsung. Ini dilakukan dengan mengekspos hewan ke ENU pada waktu yang
berbeda.
 Induksi SCE pada divisi yang berurutan setelah paparan (persistensi), serta probabilitas
bahwa SCE terjadi pada lokus yang sama pada divisi kedua dan ketiga (tenacity). Yang
terakhir ditentukan dalam sel yang terpapar ENU selama divisi kedua (seperti yang
ditunjukkan pada Gambar 1); ketika SCE terjadi di divisi kedua dan ketiga di lokus yang
sama, paparan di divisi kedua akan secara paradoks menyebabkan peningkatan SCE
dengan penampilan mereka yang terjadi di divisi pertama.
 Efek BrdU pada induksi SCE oleh ENU. Hal ini dilakukan dengan menentukan (a) efek
penggabungan kumulatif BrdU dalam divisi berikutnya dan (b) perbedaan dalam
sensitivitas terhadap induksi lesi yang memunculkan SCE dari untaian DNA BrdU yang
tersubstitusi dan tidak tersubstitusi-BrdU. Perbedaan seperti itu dibuat dengan
membandingkan frekuensi induksi SCE-3D dengan frekuensi SCE-3P.

Tabel I menunjukkan frekuensi SCE yang diinduksi dalam tiga divisi berikutnya oleh paparan
ENU pada waktu yang berbeda sehubungan dengan pemberian dosis BrdU pertama. Data
menunjukkan bahwa ENU menginduksi peningkatan yang signifikan dalam SCE-1 sehubungan
dengan kontrol pencocokan dari 3 hingga 12 jam. Pada 18, 24 dan 30 jam, frekuensi menurun ke
nilai serendah nilai kontrol. Berkenaan dengan SCE-2, frekuensi secara signifikan lebih tinggi
daripada kontrol dari 3 hingga 24 jam, dengan maksimum pada 18 jam. Frekuensi SCE-2 pada
30 jam mirip dengan kontrol. Frekuensi SCE-3 secara signifikan lebih tinggi setiap saat, bahkan
pada 3 jam, meskipun ada peningkatan yang lebih besar pada 24 dan 30 jam. Peningkatan dalam
induksi SCE ditunjukkan pada Tabel I diplot pada Gambar 2; dua skala digunakan karena
induksi SCE-1 jauh lebih rendah daripada SCE-2 dan SCE 3.
 Penting untuk menunjukkan yang berikut: 9 jam adalah waktu frekuensi SCE-1
maksimum tetapi memiliki nilai minimum SCE-2 dan SCE-3; 18 jam adalah waktu induksi
maksimum SCE-2, tetapi ketika level SCE-1 dan SCE-3 minimum muncul; 30 jam adalah waktu
induksi SCE-3 tertinggi, tetapi ketika induksi SCE-1 dan SCE-2 dapat diabaikan. Induksi SCE
tertinggi di setiap pembelahan sel tampaknya sesuai dengan momen sebelum duplikasi DNA,
karena setelah waktu ini, jalannya duplikasi DNA mengurangi frekuensi SCE dalam pembelahan
sel saat ini. Ini karena ada kemungkinan yang lebih besar bahwa lesi diproduksi di belakang
garpu duplikasi, yaitu di untai yang baru-baru ini disintesis, menyebabkan jumlah SCE yang
lebih besar di divisi berikutnya. Gambar 3 menunjukkan data yang diplot sebagai persentase dari
induksi maksimum, mengingat hanya SCE yang diinduksi dalam divisi sel paparan ENU.

Skema model induksi SCE di divisi selanjutnya dapat dibangun dari kurva. Bentuk kurva,
terutama yang sesuai dengan SCE-2, menunjukkan bahwa pembelahan sel dalam sumsum tulang
adalah kontinu dan bahwa durasi fase G1, G2 dan M pembelahan sel diabaikan. Dalam keadaan
ini, data menunjukkan bahwa SCE terjadi selama fase S dan khususnya pada garpu replikasi.
Kesimpulan yang diperoleh dari data yang mendukung model menyiratkan bahwa pembelahan
sel sel yang diteliti berlangsung 9 jam, bukan 12 jam disimpulkan dari waktu generasi rata-rata.
Ini berarti siklus sel dalam penelitian ini berada di luar fase sehubungan dengan perjalanan
teoretisnya. Sinkronisasi ini disebabkan oleh pemilihan subset sel yang sedang dianalisis oleh
administrasi BrdU, penangkapan sel-sel dalam metafase dengan colchicine pada waktu tertentu
dan protokol TWDS untuk kromatid. Hasilnya akan memungkinkan kami untuk meningkatkan
protokol TWDS in vivo, dengan menentukan waktu yang paling tepat untuk perawatan BrdU dan
colchicine, sehingga memperoleh persentase sel yang jauh lebih tinggi dengan TWDS.

Data dari Gambar 2 ditafsirkan dalam hal model induksi SCE dalam divisi berturut-turut
menunjukkan sebagai berikut: (i) frekuensi SCE-1, SCE-2 dan SCE-3 secara preferensi
meningkat dengan paparan selama pembelahan sel yang sesuai, menyiratkan bahwa mereka
disebabkan oleh lesi DNA yang diinduksi baru-baru ini dari ekspresi langsung dan, seperti yang
disebutkan sebelumnya, adalah hasil dari kemajuan duplikasi DNA; (ii) ENU tidak
meningkatkan frekuensi SCE-1 pada paparan selama divisi kedua (18 jam), menunjukkan bahwa
mutagen ini tidak dapat menginduksi 'SCE-1 seperti' SCE yang timbul dari SCE yang diproduksi
di Mekanisme SCE dan duplikasi DNA
 Gambar. 2. Induksi SCE-1, SCE-2 dan SCE-3 oleh paparan pada waktu yang berbeda
selama tiga pembelahan sel setelah pemberian BrdU pertama (waktu 0). Data tersebut mewakili
peningkatan SCE sehubungan dengan kontrol saat ini, yang berasal dari hasil yang ditunjukkan
pada Tabel I. Dua skala digunakan karena induksi SCE-1 secara substansial lebih rendah
daripada SCE-2 dan SCE-3.

Gambar. 3. Model induksi SCE di divisi berikutnya. Garis tebal mewakili induksi SCE
aktual dalam tiga divisi berikutnya, diplot sebagai persentase dari induksi maksimal pada setiap
pembelahan sel sehubungan dengan waktu; garis-garis halus mewakili kemajuan teoretis induksi
SCE pada tiga divisi sel. Kursus terkait duplikasi DNA berikutnya dan penggabungan BrdU
ditunjukkan. Garis kontinyu mewakili substitusi BrdU yang tidak disubstitusikan, garis putus-
putus dan substitusi BrdU tinggi.

lokus yang sama pada divisi kedua dan ketiga oleh lesi DNA ulet (lihat Gambar 1); (iii)
ENU mampu mendorong peningkatan yang sama pada SCE-2 dan SCE-3, bahkan lebih tinggi
daripada SCE-1, dengan paparan pada waktu yang berbeda selama siklus sel pertama. Hasil ini
tidak dapat dijelaskan dengan adanya lesi DNA yang sangat persisten yang secara kebetulan
dinyatakan sebagai SCE dalam pembelahan sel yang berurutan. Untuk mengeksplorasi
pengamatan bahwa ENU dapat menghasilkan SCE di tiga divisi berikutnya setelah paparan,
hewan adalah s.c. disuntikkan dengan dosis ENU yang digunakan sebelumnya yang sama, pada
3, 9 atau 12 jam sebelum pemberian BrdU pertama, yang berarti hampir lima divisi sel sebelum
analisis. Hasil pada Tabel II menunjukkan bahwa untuk semua kali frekuensi SCE-1, SCE-2 dan
SCE-3 secara signifikan berbeda dari kontrol yang sesuai; mereka juga mengungkapkan bahwa
peningkatan frekuensi SCE-1 lebih rendah daripada untuk SCE-2 dan yang terakhir lebih rendah
dari peningkatan SCE-3. Paparan ENU 3 dan 6 jam sebelum administrasi BrdU pertama.

Meningkatkan SCE dalam tiga pembelahan sel berikutnya dengan proporsi yang sangat
mirip (1,4: 2: 3), sementara paparan 12 jam sebelum pemberian BrdU meningkatkan frekuensi
SCE-1 sebesar 1,0 dan frekuensi SCE-2 dan SCE-3 sebesar ~ 3,0. Faktanya, peningkatan SCE-3
praktis konstan. Ini menegaskan bahwa ENU mampu menginduksi SCE untuk beberapa
pembelahan sel setelah terpapar dalam sel dengan DNA yang tidak disubstitusi dan bahwa
induksi ini meningkat pada divisi berikutnya setelah paparan ENU.

Induksi maksimum SCE-2 dan SCE-3 hampir empat dan lima kali lebih tinggi daripada
induksi SCE-1 maksimum, seperti yang ditunjukkan pada Tabel I dan Gambar 2. Ini tampaknya
menunjukkan bahwa penggabungan BrdU memainkan peran penting dalam sensitivitas. sel
untuk induksi SCE oleh ENU, terutama lesi ekspresi langsung. Secara teoritis, dalam perjalanan
duplikasi DNA (Gambar 3) pada 9 jam DNA akan secara BrdU diganti dengan BrdU rendah.
Setelah waktu ini dan hingga 18 jam, dua jenis untai ganda DNA harus dibentuk: keduanya akan
memiliki untai tunggal diganti dengan BrdU tinggi, tetapi satu dengan untai tunggal tidak
tersubstitusi yang saling melengkapi dan yang lainnya dengan untai pengganti BrdU rendah yang
saling melengkapi. Pada 30 jam, tiga jenis untaian ganda harus dibentuk: dua serupa dengan
yang ada di divisi kedua, tetapi yang lain dengan substitusi bifilar ganda BrdU yang tinggi.
Dalam keadaan seperti itu, induksi SCE tampaknya tergantung pada penggabungan BrdU. Untuk
menjelaskan bagaimana penggabungan BrdU mempengaruhi induksi SCE oleh ENU, hubungan
antara penggabungan BrdU dan frekuensi SCE per kromosom selama tiga pembelahan sel
ditunjukkan pada Tabel III. Penggabungan BrdU diperkirakan secara tidak langsung sebagai
jumlah untai tersubstitusi dikalikan dengan dosis BrdU yang diberikan selama substitusi untaian
ini. Data pada saat induksi maksimum digunakan dengan asumsi bahwa pada saat itu duplikasi
untuk setiap pembelahan sel telah selesai. Data menunjukkan bahwa induksi SCE sebanding
dengan penggabungan BrdU. Gambar 4 menunjukkan bahwa hubungan berbanding lurus dengan
dosis, dengan r = 0,99. Perkiraan induksi SCE sebesar 25 mg / kg ENU dengan tidak adanya
BrdU adalah 1,9 SCE / sel.

SCE-3P, yaitu kromosom yang dihasilkan dari untai yang tidak tersubstitusi dan berganti-
ganti BrdU hadir masing-masing setelah divisi pertama. Data dari paparan ENU baik sebelum
atau setelah administrasi BrdU pertama dipertimbangkan. Kurva untuk SCE-3P tampaknya
menunjukkan ketergantungan pada penggabungan BrdU. Di divisi pertama dan kedua ada
peningkatan SCE kecil tapi signifikan sehubungan dengan kontrol, kecuali untuk nilai yang
diperoleh pada 6 jam. Fakta bahwa untai tersubstitusi-BrdU ini tidak ada pada saat paparan ini
menyiratkan bahwa beberapa lesi yang diinduksi ENU dalam DNA yang tidak disubstitusi dapat
membuat untai DNA tersubstitusi BrdU yang baru disintesis rentan terhadap induksi SCE pada
divisi selanjutnya. Eksposur selama divisi kedua dan ketiga terus meningkatkan frekuensi SCE-
3P. Induksi SCE-3D secara statistik signifikan sehubungan dengan kontrol pada setiap saat
perawatan. Kurva untuk induksi SCE-3D jauh lebih kompleks. Dalam siklus sel sebelum
penggabungan BrdU ada peningkatan yang sebanding dengan waktu. Lesi yang tahan lama ini
diinduksi selama siklus pertama dan kedua terutama SCE-3D; walaupun ini sudah diperkirakan,
acara tersebut mengkonfirmasi bahwa ENU sebenarnya dapat menginduksi lesi yang tahan lama
pada DNA asli. Setelah peningkatan pertama