Replikasi DNA Berdasarkan Eksperimen Meselson-Stahl dan Rolling Circle Replication.

RQA
Disusun untuk memenuhi tugas matakuliah Genetika I
Dibimbing oleh Prof. Dr. Siti Zubaidah, M.Si. dan Deny Setiawan, M.pd.

Oleh:
Kelompok 1/Offering G 2018

Dimas Ricko Widyatama (180342618069)

Qori Dini Ayu Febriyanti (180342618028)
Sania Sayyida Ummah (180342618002)

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
PROGRAM STUDI BIOLOGI
Februari 2020
Replikasi DNA Tipe Semikonservatif

Makhluk hidup melestrarikan keturunannya melalui reproduksi. Reproduksi memiliki

prinsip penyampaian atau penyaluran informasi genetik dari indukke keturunannya. Watson Crick
menemukan bahwa pasangan basa dapat menyediakan bahan dasar untuk terjadinya proses
replikasi DNA. Apabila dua untai DNA dipisahkan (dengan memutus ikatan hidrogennya), masing-
masing untaian induk secara langsung dapat mensintesis untaian baru yang lengkap. Dengan kata
lain, tiap untain induk DNA akan menyediakan template untuk membentuk untaian
komplemennya. Mekanisme terbentuknya DNA baru dengan cara demikian (Untai DNA lama
memisah, dan masing-masing untaian akan membentuk untaian DNA yang baru) disebut dengan
tipe replikasi semikonservatif.
Terdapat 3 hipotesis dan kemungkinan mengenai model replikasi DNA, yaitu 1)
semikonservatif, 2) Konservatif, yaitu DNA induk tetap utuh (untaiannya tidak terpisah), dan
langsung terbentuk double helix yang baru dan 3) dispersive, yaitu segmen dari untai induk
terputus-putus. Lalu potongan tersebut memisah dan membentuk potongan baru yang akan
bersambung dengan potongan untai DNA yang lama.

Percobaan “Meselson-Stahl Experiment”

Salah satu tes berkenaan dengan pernyataan Watson dan Crick’s mengenai pernyataan
DNA bereplikasi secara semikonservatif adalah M. S. Meselson dan F. W. Stahl. Yang
dipublikasikan pada tahun 1985. Hasil uji mereka menunjukkan bahwa kromosom pada E.Coli
bereplikasi secara semikonservatif.
Dalam percobaannya, M. S. Meselson dan F. W. Stahl menumbuhkan beberapa generasi E.
15
Coli pada medium yang mengandung isotop nitrogen yang berat yaitu N yang diganti dengan
isotop nitrogen yang lebih ringan, yaitu 14N. Purin dan Pirimidin pada DNA mengandung nitrogen.
15
Oleh sebab itu sel DNA yang ditumbuhkan pada N akan memiliki densitas yang tinggi daripada
DNA yang ditumbuhkan pada 14N. Karena molekul yang memiliki beda densitas dapat dipisahkan
melalui prosedur equilibrium density-gradient centrifugation, mereka dapat membedakan 3
kemungkinan model dari replikasi DNA dengan mengamati perubahan densitas DNA yang
ditumbuhakan pada 15N dan 14N dalam variasi waktu yang berbeda.
Saat larutan berkadar garam tinggi disentrifus pada kecepatan yang sangat tinggi, maka
gradient densitas equilibrium akan terbentuk. Hasil dari proses sentrifus adalah garam akan turun
menuju bagian bawah tabung. Adanya difusi, menyebabkan garam kembali ke bagian atas tabung
menuju area yang kadar garamnya rendah. DNA yang memiliki gradien tertentu akan berpindah
pada area yang densitasnya sama dengan densitas DNA. Apabila campuran DNA yang
15 14
mengandung N dan N disentrifus, molekul DNA akan terpisah menjadi 2 ikatan yang
mengandung DNA “berat” (densitas tinggi) dan dan satu untaian lain mengandung DNA “ringan”
(densitas rendah).
15
Meselson dan Stahl mengambil sel yang telah ditumbuhkan pada medium N lalu
14
memindahkan dan menumbuhkanya dalam medium N, diperoleh hasil bahwa DNA tersebut
selalu bereplikasi secara semikonservatif. Semua DNA diisolasi dari sel, dan setelah diamati
ternyata untai DNAnya terdiri dari setengah DNA yang densitasnya tinggi dan setengahnya
memiliki DNA yang densitasnya ringan. Penelitian selanjutnya telah diverifikasi kesimpulan
Meselson dan Stahl yang menyatakan DNA bereplikasi secara semikonservatif dan telah
menerapkannya pada banyak organisme lainnya.

Autoradiografi dari Perbanyakan Kromosom Bakteri

Visualisasi dari perbanyakan kromosom pertama kali dicetuskan oleh J. Cairns pada tahun
1963 menggunakan teknik autoradiografi. Autoradiografi sangat berguna dalam mempelajari
metabolism DNA, karena DNA dapat secara spesifik dilabeli dengan menumbuhkan sel pada
[3H]thymidin.
Cairns menumbuhkan E.Coli pada medium yang mengandung [3H]thymidine untuk
berbagai variasi waktu, melisiskan sel dengan perlahan, dan dengan hati-hati mengoleksi
kromosom pada membrane filter. Audiografi ini lebih lanjut mengindikasikan bahwa gulungan
yang terbuka dari untai induk DNA yang komplemen dan replikasi semikonservatifnya terjadi
secara simultan.
Interpretasi Cairns mengenai audiografi adalah bahwa replikasi secara semikonservatif
dimulai pada sebuah sisi pada kromosom, yang disebut “origin”, dan berjalan secara berurutan dan
satu arah disekitar struktur yang sirkular. Bukti yang selanjutnya menunjukkan bahwa interpretasi
yang asli harus dikoreksi pada satu titik, yaitu proses replikasi sebenarnya berjalan dua arah. Dua
garpu replikasi akan berpindah kearah yang berlawanan secara berurutan disekitar kromosom
sirkular.

Asal yang khusus dan Replikasi Dua Arah

Hasil penelitian Cairn tidak memberikan informasi apakah asal mula replikasi adalah
dimulai pada titik yang khusus atau terjadi secara acak pada kromosom. Pernyataan bahwa replikasi
terjadi secara dua arah dapat digambarkan lebih simpel dengan eksperimen pada virus bakteri, yaitu
bakteriofag. Bakteriofag memiliki kromosom yang kecil yang mengandung molekul linear DNA
yang tunggal, yang panjangnya hanya 17,5 mikrometer. Akhir dari untai tunggal DNA yang disebut
“Kohesif” yang saling melengkapi satu sama lain. Kohesif ini dapat membentuk pasangan basa
untuk membentuk ikatan hydrogen yang berbentuk sirkular.
Bagian dalam kromosm yang memfasilitasi terjdinya replikasi secara dua arah adalah
perubahannya menjadi area yang mengandung konsentrasi tinggi dari adenine dan timin dan area
yang mengandung guanin dan sitosin dalam jumlah yang banyak. Bagian yang banyak
mengandung adenine dan guanine ini digunakan sebagai tanda fisik oleh M. Schones dan R.B.
Inman untuk mendemonstrasi, menggunakan teknik yang disebut peta denaturasi, yang
menyatakan bahwa kromosom bakteriofag dimulai pada daerah khusus dan diproses dua arah
daripada satu arah.
Saat DNA disingkap pada temperature yang tinggi (100OC) dan pada pH yang tinggi
(11,4), hidrogen dan ikatan hidrofobik yang mengikat untai ganda akan rusak dan untai ganda akan
terpisah. Proses ini disebut proses denaturasi. Ikatan antara A-T lebih mudah untuk diputus
dibanding dengan ikatan G-C, karena ikatan hidrogen A-T lebih sedikit. Saat kromosom lamda
disingkap pada pH 11,05 selama 10 menit dibawah kondisi yang sesuai, maka A-T akan mengalami
denaturasi dan membentuk Gelembung denaturasi. Gelembung denaturasi dapat dijadikan sebagai
tanda fisik apakah kromosom lamda dalam bentuk linear, sirkular, atau dalam bentuk θ. Schoen
dan Inman menunjukkan bahwa kedua titik cabang bereplikasi membentuk bentukan garpu yang
berpindah pada arah yang berlawanan disekitar kromosom sirkular.
Replikasi dua arah dari area tertentu telah ditunjukkan oleh beberapa organisme yang
memiliki kromosom yang bereplikasi sebagai struktur linear. Replikasi dari kromosom Fag T7
dimulai pada titik khusus yang dimulai pada salah satu titik pada bagian akhir untuk membentuk
struktur bentukan seperti “mata”.
Replikasi molekul DNA pada kromosom eukariotik juga berjalan dua arah. Namun,
replikasi dua arah tidak terjadi secara universal. Kromosom dari colifag, seperti kromosom lamda
adalah berbentuk sirkular saat tahap replikasi, bereplikasi satu arah dari titik asal tertentu. Apakah
asal replikasi pada organisme selalu berasal dari titik yang khusus, hingga sampai saat ini belum
diketahui.

DNA Polimerase dan Sintesis DNA Secara In Vitro

 Sistem in vitro adalah suatu proses biologi yang memecah sel menjadi oragnel yang
bermacam macam, makromolekul, dan komponen lain, dan menyusun kembali bagian tadi pada
tabung percobaan. Sintesis DNA secara in vitro pertama kali disempurnakan oleh Arthur Korn berg
dan temannya pada 1957. Kornberg menerima penghargaan nobel pada tahun 1959 karena berhasil
mengisolasi enzim dari E. Coli yang berguna untuk mengkatalis penambahan ikatan dari nukleotida
untuk membentuk rantai DNA. Enzim ini hanya aktif apabila terdapat ion Mg2+ dan sebelum
terbentuknya DNA. DNA ini harus menyedikan dua komponen esensial, satu menyediakan fungsi
primer dan yang lain yaitu berfungsi sebagai template.
Sejak konberg menemukan dan secara mendalam bekerja dengan DNA Polimerase pada
E.coli, ada banyak jumlah DNA polymerase yang dapat diisolasi dan dapat diberi ciri dari
organisme yang berbeda. Tiga DNA polymerase yang dapat diidentifikasi dn dipelajari dari E. coli
dan B. subtilis adalah DNA polymerase I, II, dan III, dan baru baru ini DNA polymerase ke empat
telah diisolasi dari thimus anak sapi dan tulang sum-sum kelinci.
Fungsi polimerase secara persis adalah belum jelas. Walaupun demikian, pada E. coli dan
B. subtilus, DNA polimerase III, daripada DNA polimerase I, adalah enzim replikasi yang utama.
Bukti kuat untuk hal ini berasal dari penelitian dari mutan yang disebut polA mutan yang
jumlahnya kurang pada DNA polymerase I. polA ini mereplikasi DNA mereka dengan cara yang
normal, namun kurang baik dalam memperbaiki kerusakan DNA mereka. Bukti ini dan bukti yang
lain enunjukkan bahwa fungsi utama DNA polimerase I adalah untuk perbaikan. Sementara DNA
polimerase III memiliki peran yang penting dalam replikasi DNA karena saat mutan tumbuh pada
kondisi saat DNA polimerase III tidak disintesis, maka sintesis DNA akan terhenti.

Kebanyakan DNA polimerase prokariotik yang dipelajari tidak hanya terjadi dari 5’ 3’
tetapi juga memiliki 3’ 5’ aktivitas eksonukleus. Aktivitas keduanya (enzim polymerase dan
eksonuklease) terdapat pada protein makromolekul yang sama. 3’ 5’ aktivitas eksonuklease
mengkatalis perpindahan nukleotida satu persatu dari titik 3’ bagian akhir untai DNA. Aktivitas
3’5’ nuklease membawa proofreading (hal yang dibenarkan) yang dibutuhkan untuk
karakteristik ketelitian dari replikasi DNA. Aktivitas 5’3’ nuclease dari DNA polimerase
prokariotik juga sangat penting karena berfungsi pada perpindahan segmen DNA yang rusak akibat
sinar ultraviolet dan hal lain. 5’3’ eksonuklease dari polimerase, seperti pada DNA polimerase I
E.coli juga berfungsi untuk perpindahan primer RNa dari DNA. Aktivitas eksonuklease 3’5’
tidak ditemukan pada DNA polimerase eukariotik. Pada eukariotik, fungsi dari aktivitas 5’3’
eksonuklease yang terkait dengan DNA polimerase pada prokariotik harus dijalankan oleh enzim
yang terpisah.