Replikasi DNA (Percobaan Meselson-Stahl) dan

Replikasi DNA pada Plasmid Bakteri melalui Rolling Circle Replication

Resume

Disusun untuk Memenuhi Tugas Matakuliah Genetika Lanjut

yang dibina oleh Prof. Dr. A.D. Corebima, M.Pd

Oleh:
Dasriani / 170341864573
Kelas A

PENDIDIKAN BIOLOGI
PASCASARJANA
UNIVERSITAS NEGERI MALANG
Februari 2018
1. Replikasi DNA (Percobaan Meselson-Stahl)
DNA melakukan replikasi atau penggandaan untuk memperbanyak diri.
Terdapat tiga cara replikasi DNA yang berkembang di kalangan para ilmuwan,
yaitu: (1) semi konservatif, setiap untaian DNA menjadi cetakan bagi
pembentukan setiap untaian baru, sehingga pada akhir proses replikasi akan
dihasilkan dua untaian ganda yang masing-masing mengandung satu untaian lama
dan satu untaian baru, (2) konservatif, masing-masing untaian ganda DNA secara
bersama-sama membentuk dua untaian baru, sehingga dihasilkan satu untaian
ganda lama dan satu untaian ganda baru dan (3) dispersive, fragmen-fragmen dari
untaian ganda DNA berpisah dan melakukan pemanjangan, sehingga berdasarkan
pola ini akan dihasilkan dua untaian ganda baru yang masing-masing terdiri dari
untaian lama dan untaian baru yang tersusun secara berselang-seling.

Gambar 1. Replikasi DNA (Sumber: Snustad dan Simmons, 2012).

Pada tahun 1958, Matthew Meselson dan Franklin Stahl menunjukkan

bahwa replikasi Escherichia coli secara semikonservatif. Melakukan percobaan
dengan menggunakan radioisotop 15
N dan N. Unsur nitrogen
14 15
N lebih berat
daripada N. Awalnya Escherichia coli ditumbuhkan di dalam media yang
14

mengandung 15N pada senyawa-senyawa basa nitrogennya (biakan awal ini

disebut generasi 0 dan generasi berkutnya disebut generasi 1, 2 dan seterusnya).
Sebagian dari bakteri yang ditumbuhkan pada 15N diisolasi DNAnya dan sebagian
lainnya ditumbuhkan pada media yang mengandung 14N. Sebagian dari generasi 1
ini DNAnya disiolasi dan sebagian lagi dibiarkan tumbuh pada media yang sama
untuk menghasilkan generasi 2, begitu dan seterusnya. Hasil dari DNA yang
diisolasi dari masing-masing generasi kemudian disentrifugasi secara terpisah
tentunya di dalam gradien kerapatan CsCl. Dengan menggunakan teknik ini,
Meselson dan Stahl mampu membedakan antara tiga kemungkinan cara replikasi
DNA dengan mengikuti perubahan dalam kepadatan DNA dari sel-sel tumbuh
pada media 15N dan kemudian dipindahkan ke medium 14N untuk berbagai periode
waktu yang disebut percobaan pengalihan kepadatan.
Kepadatan DNA adalah hampir sama dengan
kepadatan solusi terkonsentrasi garam berat seperti
cesium klorida (CsCl). Sebagai contoh, kepadatan
6M CsCl adalah sekitar 1,7 g/cm3. E. coli DNA
yang mengandung 14
N memiliki densitas 1.710
g/cm3. Pergantian N
15
N untuk meningkatkan
14

kepadatan E. coli DNA untuk 1,724 g/cm3. Ketika

solusi 6M CsCl disentrifugasi pada kecepatan yang
sangat tinggi untuk jangka waktu yang lama,
gradien kerapatan kesetimbangan terbentuk
(Gambar 2).
Hasil dari percobaan menunjukkan bahwa
DNA generasi 0 hanya membentuk satu pita. Pada
generasi 1, terdapat satu pita yang letaknya berbeda
dari generasi 0, yaitu terletak sedikit di atas pita
generasi 0. Ini menunjukkan bahwa DNA generasi
1 Lebih ringan dari generasi 0 dan progeny DNA
generasi 1 adalah hybrid. Pada generasi 2, adanya Gambar 2. Keseimbangan Densitas
Gradien CsCl (Sumber: Snustad dan
dua pita, satu terletak pada posisi yang sama Simmons, 2012).

dengan generasi 1 dan lainnya terdapat di atasnya, namun dengan intensitas yang
sama. Hal ini menunjukkan bahwa tidak ada lagi untaian ganda berat yang disusun
hanya oleh N, tetapi terdapat untaian-untaian ganda yang lebih ringan, yaitu
15

yang disusun oleh 15N dan 14N atau keduanya oleh 14N dan progeny DNA generasi
2 adalah setengah hybrid dan setengah light. Pada generasi 3, menunjukkan
bahwa konsentrasi DNA untaian ganda yang tersusun dari 14N dan 14N lebih besar
dari pada DNA yang tersusun dari N dan
14 15
N dan progeny DNA generasi 2
adalah satu dari empat adalah hybrid dan tiga dari empat adalah light (Gambar 3).

Gambar 3. Replikasi DNA secara Semikonservatif pada E. Coli Menurut Percobaan

Meselson-Stahl (Sumber: Snustad dan Simmons, 2012).

2. Replikasi DNA pada Plasmid Bakteri melalui Rolling Circle Replication

Pada percobaan Meselson dan Stahl ekstrak DNA yang diperoleh dari sel-
sel E. coli berada dalam keadaan terfragmentasi sehingga replikasi molekul DNA
dalam bentuknya yang utuh sebenarnya belum diketahui. Replikasi DNA
kromosom dalam keadaan utuh pada prokariot ternyata berbentuk melingkar atau
sirkular dan baru dapat diamati menggunakan teknik autoradiografi dan
mikroskopi elektron. Dengan kedua teknik ini terlihat bahwa DNA berbagai virus,
kloroplas, dan mitokondria melakukan replikasi yang dikenal sebagai replikasi θ
(theta) karena autoradiogramnya menghasilkan gambaran seperti huruf Yunani
tersebut. Selain replikasi θ, pada sejumlah bakteri dan organisme eukariot dikenal
pula replikasi yang dinamakan replikasi lingkaran menggulung (rolling circle
replication). Rolling circle replication merupakan suatu gambaran mengenai
proses replikasi asam nukleat yang dengan cepat dapat mengkopi molekul sirkular
dari DNA atau RNA seperti plasmid, genom dari bakteriophage, dan genom
lingkaran RNA viroid.
Tahap-tahap Rolling Circle Replication
Bakteriofag X174 merupakan perwakilan dari kelompok virus kecil
baik bakteri maupun eukariotik yang menyimpan informasi genetik yang berupa
untai tunggal DNA melingkar. Ketika virus menginfeksi sel inang E.coli single
starnded DNA (untai +) dikonversi menjadi bentuk helix ganda yang disebut
dengan Replikasi Bentuk /RF atau yang disebut dengan (untai -). RF parental
double stranded menghasilkan RF progeni (double stranded). Menurut Gardner
dkk (1991) bahwa replikasi pada X174 dibagi menjadi tiga tahap:
 Tahap 1: Pembentukan molekul induk RF
Setelah DNA bakteriofag, dalam bentuk untaian (+), diinjeksikan ke dalam
sel inang, kemudian dilakukan pelekatan protein SSB pada DNA bakteriofag,
diikuti oleh pembukaan lilitan oleh enzim DNA girase yang ada pada sel inang.
Proses ini selanjutnya diikuti dengan pengikatan protein n, n’, n”, serta protein i,
DNA B, dan DNA C. Enzim primase kemudian melekat sehingga terbentuk
primosom. Dengan adanya hidrolisis ATP yang dikatalisis oleh n’, primosom
kemudian begerak dengan arah 5’→3’ serta membentuk RNA primer. Inisiasi
pembentukan primer berlangsung secara acak. Dengan adanya primer maka DNA
polimerase III yang ada pada inang akan melakukan perpanjangan sintesis DNA
dengan membentuk fragmen Okazaki. Celah-celah diantara fragmen-fragmen
Okazaki tersebut diisi oleh aktivitas DNA polimerase I yang sekaligus
menghilangkan primer. Fragmen-fragmen yang terbentuk selanjutnya diligasi
dengan menggunakan aktivitas DNA ligase. Untaian (-) dan (+) selanjutnya
dililitkan satu sama lain oleh DNA girase sehingga terbentuk molekul RF dupleks.
 Tahap 2: Pembentukan turunan RF
 DNA helikase dan protein SSB berikatan dengan molekul RF dupleks
sehingga molekul tersebut menjadi terbuka. Aktivitas protein gpA selanjutnya
membuat takik pada untaian DNA (+). DNA polimerase III kemudian
menambahkan nukleotida-nukleotida pada ujung 3’ takik tersebut dengan
menggunakan untaian (-) sebagai cetakan sehingga ujung untaian DNA (+) induk
akan terdesak. Pada saat ini dilakukan sintesis untaian DNA (+) yang baru dengan
mekanisme sintesis secara kontinu. Untaian DNA (+) induk akhirnya akan lepas
dan menggulung lagi. DNA gpA selanjutnya akan membuat takik lagi pada
untaian DNA (+) baru sekaligus menyambung untaian DNA (+) yang terlepas
dengan membentuk ikatan fosfodiester. DNA (+) induk yang terlepas tersebut
selanjutnya akan digunakan lagi sebagai cetakan untuk membentuk untaian DNA
(-) seperti yang dilakukan pada tahap 1. Sampai tahap ini dilakukan replikasi RF
sampai kurang lebih 35 kali. Pengubahan RF induk menjadi turunan RF
memerlukan waktu sekitar 20 menit.
 Tahap 3: Sintesis untaian DNA (+)
Tahapan ini dilakukan untuk membentuk untaian (+) saja dengan
menggunakan untaian (-) sebagai cetakan dengan mekanisme replikasi lingkaran
berputar. Pada tahap ini sintesis DNA dilakukan secara kontinu. Protein gpA yang
masih melekat pada dupleks kembali membuat takik pada untaian DNA (+).
Enzim DNA helikase selanjutnya terikat pada untaian DNA (-) pada takik
tersebut. Bersama-sama dengan primosom dan protein SSB, helikase membuka
DNA pada waktu primosom melakukan sintesis primer yang dimulai pada ujung
3’ untaian DNA (-). DNA polimerase III kemudian melakukan polimerisasi
molekul primer. Untaian DNA (+) yang lama pada dupleks kemudian di desak ke
luar dengan mekanisme lingkaran berputar. Secara simultan, protein selubung
bakteriofag, yang dihasilkan dengan menggunakan sistem sintesis protein sel
inang, dilekatkan pada molekul DNA yang tersebut, sehingga untaian DNA (+)
yang terlepas tersebut tidak dapat digunakan lagi sebagai cetakan untuk sintesis
untaian DNA (1). Akhirnya protein gpA memotong untaian DNA yang terlepas
tersebut pada titik awal replikasi. Kemudian dilakukan penutupan lingkaran DNA
dengan membuat ikatan fosfodiester. Pada tahapan akhir ini ditambahkan lebih
banyak lagi protein selubung pada untaian DNA (+) sehingga terbentuk partikel
virus yang baru. Secara skematis mekanisme replikasi DNA untai tunggal
bakteriofag dapat dilihat pada Gambar 4 berikut ini.

Gambar 4. Mekanisme replikasi DNA untai tunggal bakteriofag

Rolling Circle Replication diawali dengan pemotongan ikatan

fosfodiester pada daerah tertentu yang menghasilkan ujung 3’ dan ujung 5’.
Pembentukan (sintesis) untai DNA baru terjadi dengan penambahan
deoksinukleotida pada ujung 3’ yang diikuti oleh pelepasan ujung 5’ dari
lingkaran molekul DNA. Sejalan dengan berlangsungnya replikasi di seputar
lingkaran DNA, ujung 5’ akan makin terlepas dari lingkaran tersebut sehingga
membentuk ’ekor’ yang makin memanjang.
 Gambar 4. Mekanisme rolling-circle replikasi DNA. Bahan untuk kromosom progeni
(dalam kasus ini, DNA beruntai tunggal untuk virus ΦX174) diproduksi dengan
penyalinan terus menerus di seputar lingkaran DNA bercelah ganda, dengan untai utuh
berfungsi sebagai cetakan. Electron micrograph milik David Dressler, Universitas
Harvard. (Sumber: Snustad dan Simmons, 2012).

Daftar Rujukan
Gardner, Eldon John, Michael J. Simmons dan D. Peter Snustad. 1991. Principle
of Genetics Eighth Edition. New York: John Wiley and Sons Inc.

Snustad, D. P. dan Simmons, M. J. 2012. Principles of Genetics Sixth Edition.

New York : John Wiley & Sons, Inc.

Pertanyaan dan Jawaban

Pertanyaan:
1. Sel-sel E.coli yang ditumbuhkan dalam medium normal yang mengandung 14N
ditransfer ke medium yang mengandung nitrogen isotope 15
N, untuk satu
generasi pertumbuhan. Bagaimana 14
N dan 15N tersebar dalam DNA bakteri
setelah satu generasi turunannya?
Jawaban: Karena DNA bereplikasi secara semikonservatif, untai DNA induk
yang mengandung N akan dipertahankan dan digunakan sebagai cetakan
14

untuk sintesis untai komplemen yang baru yang mengandung 15N. Sehingga,
setiap DNA heliks ganda akan memiliki untai N dan untai
14 15
N seperti
ditunjukkan gambar berikut.

2. Jelaskan fungsi gen protein A dalam Rolling Cycle Replication?

Jawaban : Bakteriofage X174 gen A protein adalah protein kunci dalam
replikasi X174, yang memiliki satu set kegiatan yang terdiri dari:
 Gen A Protein memiliki aktifitas endonuklease pada tempat yang specific
yang memotong pada untai positif yang asli atau tertentu.
 Gen A protein kemudian mempertahankan energy pada saat memotong
untaian phospodiester melalui suatu ikatan kovalen dari ujung 5’
terminalnya.
 Gen A protein tetap berikatan pada ujung 5’ terminal untai positif dan
replikasinya bercabang sementara cabangnya melintasi strand lingkar (-)
yang komplit.
 Ketika untai positif lengkap setelah disintesis, gen A protein memotong
daerah asal yang baru. Ikatan dari 3’- hydroxyl dan 5’ phosporil dan
kembali lagi menjadi ikatan kovalen dengan termin 5’positif untai yang
baru dihasilkan. Siklus dari aktivitas protein gen A diulang kembali
sampai jumlah populasi dari keturunan RFs ( Stage II) atau menghasilkan
keturunan strand positif Pada stage III.