UJIAN AKHIR SEMESTER

MATA KULIAH: BIOTEKNOLOGI FARMASI

WAKTU PENGERJAAN: 100
CLOSE BOOK

1. Jelaskan maksud gambar (skema vektor ekspresi) di bawah ini, beserta fungsi
masing-masing element: (25)

2. Jelaskan perbandingan sistem ekspresi pada mamalia, bacteria, dan yeast!(15)

3. Dalam pengobatan dengan terapi gen dapat dilakukan baik secara in-vivo maupun ex-
vivo, dengan menggunakan penghantar berupa non-viral dan viral delivery. Kira-kira
teknik atau metode yang manakah yang anda pilih untuk melakukan pengobatan
penyakit dengan terapi gen?(15).
4. Jelaskan dan uraikan prinsip kerja/prosedur teknik immunoprecipitasi, apakah
bedanya dengan immunobloting? Dapatkah kedua metode digabung?(15)
Nomor 5 silahkan diamati jurnal dibawah:

5. Jelaskan bagaimana desain konstruk dari vektor ekspresi dan transformasi pada beras!
Berdasarkan data dari jurnal tersebut, apakah pembuatan tanaman transgenik tersebut
termasuk berhasil atau tidak?Mengapa begitu? (30)

JAWAB

1. Plasmid atau virus didesain untuk ekspresi protein. Vector ekspresi harus
memiliki element seperti promotor, RBS, terminator dan start kodon. Vektor
digunakan untuk memperkenalkan gen tertentu ke dalam sel target, dan dapat
memerintahkan mekanisme sel untuk digunakan untuk sintesis protein untuk
menghasilkan protein yang dikodekan oleh gen. Vektor ekspresi adalah alat
dasar dalam bioteknologi untuk produksi protein . vector direkayasa untuk
mengandung sekuens yang bertindak sebagai penambah dan promotor yang
mengarah pada transkripsi gen. umunya yang digunakan sebagai inang untuk
produksi protein adalah Escherichia coli, tetapi jenis sel lainnya juga dapat
digunakan. Contoh penggunaan vektor ekspresi adalah
 produksi insulin.  Promotor yang digunakan dalam vektor ekspresi biasanya
tidak dapat diinduksi , yang berarti bahwa sintesis protein hanya dimulai ketika
diperlukan oleh pengenalan induser seperti IPTG . Gambar tersebut merupakan
gambar elemen genetic atau komponen utama dari vector yang dibutuhkan untuk
ekspresi protein.
a. Promotor : terdapat TATA BOX yang berfungsi sebagi pengarah enzim
RNA polimerase sehingga arah transkripsi dari 5'-3', serta merupakan tempat
pembukaan heliks. (proses translasi)
b. Operator : berfungsi sebagai tempat perlekatan protein represor. Jika tidak
ada protein represor melekat, transkripsi tidak berjalan. (proses translasi)
c. Ribosome Binding Site (RBS) : proses penerjemahan protein terdiri dari
RBS, ATG, GENE, dan kodon STOP. Sedangkan untuk protein terdiri dari
ATG, GENE, dan kodon STOP.
d. Terminator : terminasi translasi diakhiri ketika terdapat nukleotida
(UAAA, UAG, UGA)
2. MAMALIA
Vektor ekspresi mamalia memiliki keuntungan untuk ekspresi protein mamalia
dan lebih diinginkan dari pada sistem non-mamalia eukariotik lainnya dimana
protein yang diekspresikan mungkin tidak mengandung glikosilasi yang benar.
Digunakan untuk memproduksi protein yang berasosiasi dengan membran yang
membutuhkan pendamping untuk pelipatan dan stabilitas yang tepat serta
mengandung banyak modifikasi pasca-translasi. Kelemahannya, adalah hasil
rendah dari produk dibandingkan dengan vektor prokariotik serta sifat mahal
dari teknik yang terlibat. Teknologi yang rumit, dan potensi kontaminasi dengan
virus hewan dari ekspresi sel mamalia juga telah menempatkan kendala pada
penggunaannya dalam produksi industri skala besar.Vektor ditransfusikan ke
dalam sel dan DNA dapat diintegrasikan ke dalam genom dengan rekombinasi
homolog dalam kasus transfeksi stabil, atau sel-sel dapat ditransfusikan secara
sementara. Contoh vektor ekspresi mamalia termasuk vektor adenoviral , pSV
dan seri pCMV vektor plasmid, vektor vaccinia dan retroviral , serta
baculovirus. Promotor untuk cytomegalovirus (CMV) dan SV40 umumnya
digunakan dalam vektor ekspresi mamalia untuk mendorong ekspresi gen.
BAKTERI
 Rangkaian ekspresi pilihan untuk ekspresi banyak protein adalah Escherichia
coli karena produksi protein heterolog dalam E. coli relatif sederhana dan
nyaman, serta cepat dan murah. Sejumlah besar plasmid ekspresi E. coli juga
tersedia untuk berbagai kebutuhan. Bakteri lain yang digunakan untuk produksi
protein termasuk Bacillus subtilis .Sebagian besar protein heterolog
diekspresikan dalam sitoplasma E. coli . Protein yang memiliki ikatan disulfida
sering kali tidak dapat terlipat dengan benar karena berkurangnya lingkungan
dalam sitoplasma yang mencegah pembentukan ikatan seperti itu, dan solusi
yang memungkinkan adalah menargetkan protein ke ruang periplasma dengan
menggunakan terminal-N urutan sinyal . Kemungkinan lain adalah
memanipulasi lingkungan redoks sitoplasma. Promotor yang digunakan untuk
vektor ini biasanya didasarkan pada promotor lac operon atau promotor T7 , dan
biasanya diatur oleh operator lac . Contoh vektor ekspresi E. coli adalah seri
pGEX vektor di mana glutathione S-transferase digunakan sebagai mitra fusi
dan ekspresi gen di bawah kendali promotor tac, dan seri pET dari vektor yang
menggunakan promotor T7 .
3. Penggunaan metode ex-vivo secara non viral delivery karena Mengurangi
respons imun yang merugikan, Lebih mudah diproduksi dan dapat diproduksi
untuk industri farmasi dalam jumlah besar, Partikel nano disintesis secara kimia,
Memiliki potensi untuk disampaikan secara sistemik tetapi farmakodinamik dan
selektivitas untuk jaringan target perlu divalidasi.
4. Imunopresipitasi telah lama digunakan sebagai alat untuk menilai keberadaan
suatu protein, sementara imunoblotting memberikan cara yang lebih akurat
untuk menghitung jumlah protein yang ada. Immunoblotting juga berfungsi
untuk menetapkan atau memverifikasi identitas protein yang diisolasi dalam
presipitasi imun. Kedua metode tersebut dapat digabung karena saling
berketerkaitan.
Prinsip imunopresipitasi didasarkan pada :
1) pelarutan protein membran dengan menggunakan deterjen nonionic
2) interaksi selanjutnya dari antibodi spesifik dengan antigen membran terlarut,
3) pemulihan kompleks antibodi-antigen dengan mengikat pada dukungan yang
tidak larut, dengan demikian memungkinkan prosedur pencucian untuk
menghilangkan molekul yang tidak terikat.
5. Termasuk berhasil karena Dalam studi ini, dua puluh transforman diduga beras
dihasilkan pada pemilihan higromisin dimana 16 tanaman ditemukan positif
untuk gen cry2AX1 pada PCR pengujian kadar logam. Chimeric cry2AX1 gen
dibangun menggunakan sekuens DNA yang sesuai dengan 585 N-terminal dan
48 C-terminal asam amino Cry2Aa dan Cry2Ac, masing-masing, yang diisolasi
dari strain Bt asli. Urutan asam amino Cry2AX1 berbeda dari Cry2Aa selama
sepuluh residu dalam hamparan 24 asam amino (595-618) (Udayasuriyan et al.
2010 ). Dioptimalkan kodon, sintetis cry2AX1 gen (Nomor Aksesi
GQ332539.1) secara translasi menyatu pada angka 5 0 mengakhiri urutan beras
kloroplas transit peptida (rtp) dari rbcS gen (DNA 148 bp sesuai dengan beras
rbcS transit peptide (rtp; Jang et al. 1999 ). Gen fusi yang didorong oleh
promotor konstitutif ubiquitin jagung dikloning dalam vektor biner pUH
(Agarwal et al. 2002 ) pelabuhan mana hptII ( coding untuk hygromycin
phosphotransferase), gen penanda tanaman yang dapat dipilih. Konstruk di atas,
pUH-rtp-2AX1 ( Ara. 1 ) dimobilisasi untuk dilucuti Agrobacterium strain,
LBA4404 untuk percobaan transformasi beras. Varietas beras populer, ASD16
digunakan untuk transformasi. Itu Agrobacteriumtransformasi yang dimediasi
dilakukan sesuai dengan protokol yang dijelaskan oleh Hiei dan Komari
( 2008 ). Tanaman transgenik putatif yang telah diregenerasi dipertahankan
dalam rumah kaca transgenik.