Nama : Fety Puspita Sari

NPM : A 183 014

Kelas : Konversi 2018

1. Cari dan gambarkan :

A. Konstruksi Vektor Kloning (Contoh : pGEM T-Eazy)
Vektor klonning adalah vektor yang digunakan untuk perbanyakan atau kloning
gen. Contoh dari vektor klonning, seperti pCAMBIA 1305.1, pNU400, dan pGEM-T
Easy merupakan suatu vektor linear yang memiliki tambahan nukleotida T pada kedua
ujung 3’ atau ujung “ T ” overhang. Plasmid ini memilki ukuran 3015 bp dengan dua
promoter yaitu SP6 RNA polymerase promoter dan T7 RNA polymerase promoter.
Plasmid pGEM-T Easy memiliki gen lac-Z yang dapat menyandi enzim β-galaktosidase
yang dapat merubah Isopropil-β- (X-gal) yang ditambahkan menjadi berwarna biru.
MCS (Multiple Cloning Site) pada plasmid merupakan bagian dari lac-Z. Apabila gen
lac-Z tersisipi oleh fragmen DNA lain, maka akan merusak susunan basa gen lac-Z
sehingga tidak dapat diekspresikan dan menyebabkan koloni berwarna putih
(Sambrook, 1989). Plasmid ini juga memiliki resistensi terhadap antibiotik ampicillin.

Gambar 1. Peta plasmid pGEM-T Easy (Promega, 2009)

Nama : Fety Puspita Sari
NPM : A 183 014
Kelas : Konversi 2018
B. Konstruksi Vektor Ekspresi (Contoh : PET Blue)
Vektor ekspresi merupakan vektor yang tidak hanya dapat bereplikasi sendiri, tetapi
juga mengandung sinyal-sinyal ekspresi, sehingga gen yang dikloning juga dapat
ditranskripsi menjadi mRNA dan kemudian ditranslasi menjadi protein. Tiga sinyal
ekspresi yang paling penting antara lain promoter transkripsi, terminator transkripsi, dan
tempat pengikatan ribosom (Brown 1987:191).
Contoh vektor ekspresi adalah vektor pET. Vektor ekspresi pET didesain untuk
meningkatkan dan mempermudah proses kloning, deteksi, dan pemurnian protein target.
Vektor ekspresi pET mengandung beberapa elemen yang penting seperti gen lacI yang
mengkode protein lac repressor, promoter T7 yang hanya spesifik dengan T7 RNA
polimerase (Novagen, 2004 : 2). Contoh vektor ekspresi pET adalah pETBlue-1 dan
pETBlue-2.
1. pETBlue-1 : Merupakan salah satu vektor plasmid ekspresor E. coli yang
dikembangkan oleh Novagen. pETBlue-1 merupakan plasmid sirkuler yang
memiliki panjang 3476 pasang basa. Penomoran sekuens plasmid pETBlue-1
dimulai dari basa pertama dari sekuens promoter T7. Pada pETBlue-1 terdapat
multiple cloning region di daerah 267-297 diantaranya oleh enzim EcoR V (278),
EcoR I (282) Ava I (291), Sma I (293), dan Srf I (293). Tempat kloning blunt-end
pETBlue-1 tepat berada di belakang daerah pemotongan enzim EcoR V (Backer et
al., 2003; Gaynutdinov et al., 2003).
Nama : Fety Puspita Sari
NPM : A 183 014
Kelas : Konversi 2018

Gambar 2. Peta Vektor Ekspresi pETBlue-1

Gambar 2. Peta Vektor Ekspresi pETBlue-1

2. pETBlue-2 : Merupakan vektor ekspresi yang mengandung gen resisten ampisilin

dan gen lacZα yang berperan dalam seleksi antibiotik dan seleksi biru putih. Seleksi
biru putih bersifat terpisah dari ekspresi protein target karena terletak sedemikian
rupa hingga orientasinya berlawanan dengan orientasi ekspresi protein target.
pETBlue-2 memiliki Multiple Cloning Site (MCS) untuk enzim restriksi NcoI,
EcoRV, SmaI, Ecl136II, SacI, BamHI, EcoRI, BsrGI, AscI, BssHII, PstI, Sse8387I,
SalI, AatII, HincII, ClaI, MluI, Nsp V, Hind III, Eag I, Not I, Pvu II, Bst1107 I, Pml
I, Xho I, Pac I (Novagen, 2004 : 17). Vektor pETBlue-2 merupakan vektor ekspresi
berukuran 3652 bp yang dibuat untuk kloning dan ekspresi protein. Vektor
pETBlue-2 memiliki fragmen His.Tag™ yang digunakan untuk deteksi dan
purifikasi protein target (Novagen, 2004: 12). Vektor ekspresi pETBlue-2 juga
dilengkapi dengan, multiple cloning site , dan situs ORI. Vektor pETBlue-2
dilengkapi dengan elemen promoter T7 yang dikenali oleh T7 RNA polimerase.
Vektor tersebut membawa gen β-lactamase (bla) yang memberikan resistensi
terhadap ampisilin dan dapat seleksi biru putih (Novagen 2004: 13). Vektor pET
lainnya yang sering digunakan untuk kloning dan ekspresi protein antara lain pET-
21, pET-23, pET-24, dan pET-39b (Novagen, 2004: 12-13).
Nama : Fety Puspita Sari
NPM : A 183 014
Kelas : Konversi 2018

Gambar 3. Peta Vektor Ekspresi pETBlue-2

 Nama : Fety Puspita Sari
NPM : A 183 014
Kelas : Konversi 2018
2. Buat Bagan (Dilengkapi Gambar) Tahapan Produksi Protein Rekombinan (Contoh : Insulin)

DNA interest Vektor

Vektor Amplifikasi
Amplifikasi (kloning)
(kloning)
(Gen insulin) 1
(pGEM
(pGEM T-Eazy)
T-Eazy) direstriksi
direstriksi 11
1 direstriksi
direstriksi
Gen
Gen resistensi
resistensi
Konfirmasi 2 Insulin
Insulin
direstriksi antibiotik
antibiotik Konfirmasi
0 SDS-PAGE
SDS-PAGE
Gen
Gen galaktosa
galaktosa 0
Protein
Protein insulin
insulin 0
murni
murni Kultur
Kultur 0 Diambil
Diambil White
White Koloni
Koloni

1
Pemurnian
Pemurnian 9
Produksi White-blue
White-blue screening
(Sentrifugasi)
(Sentrifugasi) Produksi dalam
dalam screening

bioreaktor
bioreaktor medium
medium LB
LB 8
2
Diligasi menjadi DNA rekombinan 0 ++ IPTG
IPTG
Screening
Ditransformasi
Ditransformasi ke
inang
inang melalui
melalui
ke 0 Enzim
Enzim restriksi
restriksi
&
& ligase
ligase Inang
Inang Produksi
Produksi E.Coli
3 Replikasi kejut
kejut listrik
listrik atau
atau E.Coli
CaCl
CaCl22 0
Inang
Inang Perbanyakan
Perbanyakan E.Coli
E.Coli
PCR 7 Produksi
PCR
Clonning
Clonning gen
gen insert
insert
Ampisilin
Ampisilin
X-Gal
X-Gal Vektor
Vektor ekspres
ekspres (pET
(pET Blue)
Blue)
direstriksi
direstriksi
5 6
Screening Panen plasmid Gen
4 Sekuensing
rekombinan insulin
White-blue
White-blue screening
screening
Diambil
direstriksi
Diambil
White
White Diligasi
Koloni
Koloni
Nama : Fety Puspita Sari
NPM : A 183 014
Kelas : Konversi 2018

DAFTAR PUSTAKA

Brown, Terry A. (2010). Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. Wiley-
Blackwell. ISBN 978-1-4051-8173-0. 35-36.
Novagen. 2004. pETBlue Perfectly Blunt Clonning Kit. Darmstadt, Jerman : 17.
Novagen. 2006. pET system manual. Darmstadt, Jerman: 80.
Sambrook, J., E. F. Fritsch & T. Manniatis. (1989). Molecular cloning a loboratory
manual. 2nd ed. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York: xxxviii + 5.31
+ 6.9.