net/publication/328979920
Antioksidan
Book · October 2017
CITATIONS READS
0 565
4 authors:
23 PUBLICATIONS
14 CITATIONS 2 PUBLICATIONS
0 CITATIONS
3 PUBLICATIONS
0 CITATIONS 3 PUBLICATIONS
0 CITATIONS
Some of the authors of this publication are also working on these related projects:
ii
seperti vitamin E, vitamin C, flavonoid dan karotenoid. Khususnya
flavonoid yang berada di dalam tanaman masih belum berbentuk
molekul bebas, sehingga pada penelitian kami di Fakultas Farmasi,
UGM menghidrolisis baik dengan asam maupun basa untuk membuat
flavonoid bebas sehingga meningkat aktivitas antioksidannya (IC50
cukup rendah).
Dengan selesainya penulisan buku ini, bukan berarti tidak
ada proses lebih lanjut secara ilmiah dan teknologinya. Walaupun
masih jauh dari sempurna, semoga informasi ilmiah dalam buku
ini dapat bermanfaat bagi mahasiswa dan masyarakat pada
umumnya. Akhir kata, kami bersyukur pada Allah SWT yang
telah melimpahkan karunianya untuk menerbitkan buku ini dan
mengucapkan banyak terimakasih kepada semua pihak pada
kontribusi dalam penulisan buku ini terutama Frau Prof. Dr.
Ulrike Holzgrabe di Universitas Wuerzburg, Frau Dr. Isolde
Friederick di Loerrach, Frau Dr. Carola Uffinger di Wuerzburg,
Bapak Prof. Dr. Subagus Wahyuono, Bapak Prof. Dr. Agung
Endro Nugroho, Ibu Dr. Andayana Puspitasari, Bapak Prof.Dr.
Achmad Mursyidi, Ibu Dr. Ritmaleni, dan Deutscher
Akademischer Austauschdienst (DAAD)-Bonn-Jakarta.
DAFTAR ISI
ii
1. 1. Pengertian Oksidan ......................................................... 1
1. 2. Pengertian Radikal Bebas ............................................... 3
1. 3. Sumber Radikal Bebas ................................................... 7
1.3.1. Anion Superoksida ................................................ 10
1.3.2. Radikal Hidroksil .................................................. 12
1.3.3. Hidrogen Peroksida ............................................... 13
1.3.4. Oksigen Singlet ..................................................... 14
1.3.5. Radikal endogen .................................................... 16
1.3.6. Radikal eksogen .................................................... 17
1. 4. Tahapan Reaksi Pembentukan Radikal Bebas ............. 18
1.4.1. Tahap inisiasi ........................................................ 18
1.4.2. Tahap propagasi .................................................... 19
1.4.3. Tahap terminasi ..................................................... 20
1. 5. Efek Radikal Bebas ...................................................... 20
1.5.1. Efek Negatif Radikal Bebas .................................. 20
1.5.2. Efek Positif Radikal Bebas.................................... 26 BAB II
ANTIOKSIDAN DAN JENISNYA............................... 29
2.1. Pengertian Antioksidan ................................................ 29
2.2. Jenis Antioksidan ......................................................... 31
2.2.1. Antioksidan alami ................................................. 31
2.2.2. Antioksidan sintetik .............................................. 48
BAB III UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN .............................. 56
3. 1.Uji Aktivitas Antioksidan secara in vitro
..................................................................................................... 56
3.1.1. Menggunakan bahan kimia........................................... 56
3.1.1.1. Uji DPPH .............................................................. 56
3.1.1.2. Pengukuran diena terkonjugasi ............................. 61
ii
3.1.1.3. Pengukuran bilangan para−anisidin ..................... 62
3.1.2. Menggunakan materi biologis ............................... 73
3.2. Uji Aktivitas Antioksidan secara in
vivo ...................... 74
3.2.1. Glutation peroksidase
(Gpx) ................................. 74
3.2.2. Uji Enzim
Katalase ............................................... 76
3.2.3. Penentuan Kadar Malonaldehid (MDA)
Plasma... 88
BAB IV PENELITIAN MENGENAI ANTIOKSIDAN ............ 92
4.1. Uji Aktivitas Antioksidan dan Deteksi Senyawa Buah
Talok (Muntingia calabura L.) ................................................... 92
4.2. Uji Aktivitas Penangkapan Radikal dan Deteksi
Golongan Senyawa Ekstrak Etanolik Terpurifikasi Batang
Brotowali Tinospora crispa (L.)Miers ...................................... 107
4.3. Perbandingan Inhibisi Ekstrak Air Buah Mahkota
Dewa
(Phaleria macrocarpa, (Scheff). Boerl.) dan Vitamin C Terhadap
Fotodegradasi Tirosin................................................................ 123
4.4. Uji Penangkapan Radikal oleh Fraksi−fraksi Ekstrak
Bunga Kecombrang (Nicola speciosa (BI.) Horan) dan Buah
Talok (Muntingia calabura, L.) Menggunakan DPPH ............. 124
DAFTAR PUSTAKA ............................................................... 128
BAB I ........................................................................................ 128
BAB II ....................................................................................... 132
BAB III ..................................................................................... 137
BAB IV ..................................................................................... 148
ii
DAFTAR GAMBAR
ii
Gambar 24. Rumus struktur DPPH ............................................. 57
Gambar 25. Mekanisme reaksi DPPH dengan antioksidan ........ 60
Gambar 26. Reaksi resonansi pada radikal DPPH ...................... 60
Gambar 27. Reaksi antara radikal ABTS dan antioksidan .......... 67
Gambar 28. Reaksi antara antioksidan dengan reagen FRAP..... 71
Gambar 29. Mekanisme penangkapan endogen peroksida seluler
..................................................................................................... 79
Gambar 30. Kerja enzim dalam menghambat radikal bebas dalam
tubuh ............................................................................................ 80
Gambar 31. Sisi aktif Cu−Zn−SOD ............................................ 81
ii
Gambar 43. Hubungan kadarsenyawa uji dengan % penangkapan
radikal DPPH fraksi air terhidrolisis 1 jam ................................. 97
Gambar 44. Kromatogram hasil pemisahan senyawa ekstrak buah
talok beserta fraksi buah talok................................................... 101
Gambar 45. Kromatogram fraksi air dan fraksi air terhidrolisis buah
talok .................................................................................. 103
Gambar 46. Kromatogram fraksi air sebelum dan sesudah hidrolisis
buah talok .................................................................. 104
Gambar 47. Kromatogram fraksi air sebelum dan sesudah hidrolisis
buah talok .................................................................. 105
Gambar 48. Kromatogram fraksi air terhidrolisis asam buah talok
................................................................................................... 106
Gambar 49. Morfologi batang brotowali .................................. 108
Gambar 50. Kromatogram pemisahan senyawa ekstrak batang
brotowali ................................................................................... 111
Gambar 51. Kromatogram ekstrak etanolik batang brotowali dan
fraksinya .................................................................................... 114
Gambar 52. Kromatogram ekstrak etanolik batang brotowali dan
fraksinya .................................................................................... 116
Gambar 53. Profil kromatogram ekstrak batang brotowali setelah
disemprot pereaksi DPPH .........................................................
117 Gambar 54. Morfologi daun
mengkudu .................................... 118
Gambar 55. Profil kromatogram ekstrak etanolik daun mengkudu
dan fraksinya ............................................................................. 119
Gambar 56. Profil kromatogram fraksi air terhidrolisis ekstrak daun
mengkudu dengan pembanding kuersetin ........................ 120
Gambar 57. Profil kromatogram ekstrak daun mengkudu dengan
penyemprotan DPPH ................................................................. 121
Gambar 58. Perbandingan aktivitas penangkapan radikal oleh
ekstrak daun mengkudu.............................................................
ii
122 Gambar 59. Morfologi buah mahkota
dewa ............................. 123
Gambar 60. Morfologi bunga kecombrang ............................... 125
Gambar 61. Morfologi buah talok ............................................. 126
Gambar 62. Kromatogram fraksi etil asetat dari ekstrak etanolik
bunga kecombrang ....................................................................
127 Gambar 63. Kromatogram fraksi etil asetat buah
talok ............ 127
ii
DAFTAR TABEL
DAFTAR SINGKATAN
ii
NBT : Nitro Blue Tetrazolium
ORAC : Oxygen Radical Absorbance
PRX : Peroxiredoksin
ROS : Radikal Oksigen Singlet
SNR : Senyawa Nitrogen Reaktif
SOD : Superoxide Dismutase
SOR : Senyawa Oksigen Reaktif
TBA : Tersier Butil
TBARS : Thiobarbituric Acid Reactive Substances
UV : Ultraviolet
ii
BAB I OKSIDAN
1. 1. Pengertian Oksidan
Secara biokimia, oksidasi merupakan proses pelepasan
elektron dari suatu senyawa. Senyawa yang dapat menarik
atau menerima elektron disebut oksidan atau oksidator
(Winarsi, 2007). Dalam ilmu kimia, pengertian oksidan
adalah senyawa penerima elektron yaitu senyawa penarik
elektron misalnya ion ferri (Fe2+).
Pengertian oksidan dan radikal bebas (free radicals) sering
dibaurkan karena keduanya memiliki kemiripan sifat.
Aktivitas kedua jenis senyawa ini sering menghasilkan akibat
sama walaupun prosesnya berbeda. Sebagai contoh
perhatikan dampak H2O2 (hidrogen peroksida) dan radikal
bebas OH (radikal hidroksil) terhadap glutation (GSH) :
OH :GSH + OH
H2O + GS (radikal glutation)
GS +
GS
GSSG
Walaupun ada kemiripan dalam sifat-sifatnya namun
dipandang dari sudut ilmu kimia, keduanya harus dibedakan.
Oksidan, dalam pengertian ilmu kimia, adalah senyawa
penerima elektron, (electron acceptor), yaitu senyawasenyawa
yang dapat menarik elektron. Ion ferri (Fe3+), misalnya, adalah
suatu oksidan :
1
Fe3+ + e- Fe2+
Atom hidrogen :
H
Atom oksigen :
O
dan H2O
• H:O:H H
+
OH
•
•
H:O:H H+ + :O H
1
Dalam hal ini, yang terbentuk bukanlah radikal tetapi ion-ion,
sehingga proses tersebut dinamakan ionisasi. Untuk ionisasi
molekul air tak diperlukan masukan energi yang besar,
sehingga dalam keadaan “biasa” air mengalami ionisasi.
X:H +
OH X
+ HOH
radikal baru
radikal hidroksil
Sifat radikal bebas yang mirip dengan oksidan terletak pada
kecenderungannya untuk menarik elektron. Jadi sama halnya
dengan oksidan, radikal bebas adalah penerima elektron.
Namun perlu diingat bahwa radikal bebas adalah oksidan
tetapi tidak setiap oksidan adalah radikal bebas.
1
Untuk mencapai kestabilan atom atau molekul, radikal bebas
akan bereaksi dengan molekul di sekitarnya untuk
memperoleh pasangan elektron (Rohman, 2006). Adanya
elektron tidak berpasangan ini menyebabkan radikal bebas
secara kimiawi menjadi sangat aktif. Radikal bebas dapat
bermuatan positif (kation), negative (anion) atau tidak
bermuatan (netral). Skema pembentukan radikal bebas seperti
terlihat pada Gambar 1.
1
tersebut menggambarkan elektron tidak berpasangan
(Fessenden, 1986).
Menurut Kumar et al. (2005) radikal bebas menyebabkan
kerusakan sel dengan 3 cara:
• Peroksidasi komponen lipid dari membrane sitosol
Menyebabkan serangkaian reduksi asam lemak
(autokatalisis) mengakibatkan kerusakan membrane dan
organel sel.
• Kerusakan DNA
Kerusakan DNA ini dapat mengakibatkan mutasi DNA
bahkan dapat menimbulkan kerusakan sel.
• Modifikasi protein teroksidasi karena cross linking
protein, melalui mediator sulfidril atas beberapa asam
amino labil seperti sistein, metionin, lisin dan histidin.
Ada berbagai radikal bebas turunan dari C dan N, akan
tetapi yang paling banyak diketahui adalah radikal
oksigen. Radikal bebas bisa terbentuk ketika komponen
makanan diubah menjadi bentuk energi melalui proses
metabolisme. Pada proses metabolisme ini, sering kali
terjadi kebocoran elektron. Dalam kondisi ini, mudah
sekali terbentuk radikal bebas seperti anion superoksida,
hidroksil dan lain-lain. Radikal bebas juga dapat terbentuk
dari senyawa lain yang sebenarnya bukan radikal bebas,
tetapi mudah berubah menjadi radikal bebas misalnya
H2O2 (Kikuzaki, et al., 2002).
1
normal, inflamasi, kekurangan nutrisi maupun sebagai respon
adanya radiasi sinar gama, UV, polusi lingkungan dan asap
rokok (Wijaya, 1996). Menurut Mohammed et al. (2009),
radikal bebas dapat menyebabkan kerusakan. Radikal bebas
bersifat reaktif dan jika tidak diinaktifkan akan dapat merusak
makromolekul pembentuk sel yaitu protein, karbohidrat,
lemak dan asam nukleat.
1
Radikal bebas memiliki reaktivitas sangat tinggi. Hal ini
ditunjukkan oleh sifatnya sangat menarik atau menyerang
elektron di sekelilingnya. Senyawa radikal bebas juga dapat
mengubah suatu molekul menjadi suatu radikal. Kemiripan
sifat antara radikal bebas dan oksigen terletak pada agresivitas
untuk menarik elektron di sekelilingnya. Berdasarkan sifat
ini, radikal bebas dianggap sama dengan oksidan. Akan
tetapi, tidak setiap oksidan adalah radikal bebas. Radikal
bebas lebih berbahaya dibandingkan dengan senyawa oksidan
non radikal. Hal ini berkaitan dengan tingginya reaktivitas
senyawa radikal bebas tersebut kemudian mendorong untuk
terbentuknya radikal bebas baru. Bila senyawa radikal baru
bertemu dengan molekul lain akan terbentuk baru lagi dan
seterusnya proses itu berlangsung. Reaksi ini akan terus
berlangsung dan akan berhenti jika reaktivitasnya diredam
oleh senyawa bersifat antioksidan (Meydani, 2000).
1
(eksogen). Dari dalam tubuh mencakup superoksida (O2),
hidroksil (OH), peroksil (ROO), hidrogen peroksida
(H2O2), singlet oksigen (O2), oksida nitrit (NO), dan
peroksinitrit (ONOO). Secara endogen, sebagai respon
normal dari rantai peristiwa biokimia dalam tubuh, radikal
bebas terbentuk akan mempengaruhi ekstrasel dan intrasel.
Radikal endogen dapat terbentuk sebagai sisa proses
metabolism (proses pembakaran) protein, karbohidrat dan
lemak pada mitokondria, proses peradangan atau inflamasi,
reaksi antara besi logam dan transisi dalam tubuh, fagosit,
xantin oksidase, peroksisom maupun pada kondisi iskemia.
Mekanisme timbulnya radikal endogen yakni autooksidasi,
aktivitas oksidasi siklooksigenase, lipooksigenase,
dehidrogenase dan peroksidase serta pada sistem transport
elektron (Muchtadi, 2013). Sedangkan radikal eksogen antara
lain berasal dari: asap rokok, polusi, radiasi, sinar UV, obat,
pestisida, limbah industri, dan ozon (Wolf, 2002). Adapun
beberapa jenis radikal bebas endogen dapat dilihat dalam
Tabel 1.
Tabel 1. Radikal Bebas Biologis (Endogen)
1
Tipe radikal bebas turunan oksigen reaktif sangat signifikan
dalam tubuh. Oksigen reaktif ini mencakup hidroksil (OH),
peroksil (ROO), hidrogen peroksida (H2O2), oksigen singlet
(O2), oksida nitrit (NO) dan asam hipoklorit (HOCl).
Spesies oksigen reaktif (ROS) dibagi menjadi 2 kelas yakni
Oxygen centered non radicals dan Oxygen centered radicals.
Oxygen centered radicals meliputi beberapa jenis yakni anion
superoksida (O2), radikal hidroksil (OH), radikal alkoksil
(RO) dan radikal peroksil (ROO). Sedangkan Oxygen
centered non radicals meliputi hidrogen peroksida (H2O2) dan
oksigen singlet (1O2). Efek ditimbulkan oleh ROS
ditunjukkan pada Gambar 2.
1
dapat dibentuk oleh sistem enzim prooksidaif, oksidasi lipid,
iradiasi, inflamasi, merokok dan polusi udara (Halliwel, 1994;
Muchtadi, 2013). Beberapa spesies ROS dapat terlihat pada
Gambar 3.
1
XH + 2O2 + H2O → X−OH + 2 O*2− + H+
Enzim xantin oksidase dalam keadaan normal tak
terdapat di dalam sel mamalia. Enzim xantin oksidase
terbentuk dari enzim lain yaitu xantin dehidrogenase.
XH + NAD+ + H2O → X−OH + NADH + H+
(xantin) (asam urat)
Dalam keadaan iskemia atau hipoksemia, XD berubah
menjadi XO melalui proses proteolisis :
XD XO + peptide
Perubahan ini tak reversibel. Sebagai akibatnya,
apabila kemudian pasokan oksigen kembali normal,
terbentuklah ion superoksida yang justru dapat
merusak jaringan (reperfusion injury)
Ion superoksida sendiri sebenarnya tak terlalu reaktif.
Bentuk reaktifnya ialah radikal peroksida yang
terbentuk melalui reaksi sebagai berikut :
O2 + H OOH
Radikal peroksil
Seperti halnya radikal lain, radikal inipun sangat
reaktif dan akan membentuk radikal baru serta H2O2:
XH + OOH X + H2O2
Dari reaksi diatas kiranya jelas bahwa radikal peroksil
jauh lebih berbahaya dibandingkan dengan H2O2 . Ion
superoksida akan sangat berbahaya apabila terdapat
bersamaan dengan H2O2 karena akan membentuk
radikal hidroksil (OH) :
O2 + H2O2 O2 + OH + OH
1
(Reaksi Haber – Weiss)
Reaksi ini memerlukan ion Fe+++ atau Cu++ dan
diperkirakan terjadi melalui dua tahap, yaitu :
1
Reaksi ini memerlukan ion Fe+++ atau Cu++ dan
diperkirakan terjadi melalui dua tahap, yaitu :
1
menghasilkan hidrogen peroksida kemudian dapat
direduksi menjadi air atau menjadi radikal hidroksil.
1
memindahkannya ke oksigen triplet untuk
membentuk oksigen singlet (Liedias and Hansberg,
2000).
Oksigen singlet terbentuk pada reaksi terkatalisis
enzim tertentu, di antaranya:
Enzim monooksigenase menggunakan sitokrom p450,
apabila enzim tersebut menggunakan peroksida sebagai
substrat.
1
Tabel 2. Spesies Oksigen Reaktif
No Radikal
1 O2 superoksida HOCl hipoklorit
2 HO hidroksil Fe=O Kompleks
besi oksigen
3 HO2 hidrokperoksil LOOH lipid
hidroperoksida
4 NO2 nitrogen dioksida LO2 lipid peroksil
5 NO nitrit oksida LO lipid alkoksil
6 H2O2 hidrogen peroksida
7 1
O2 singlet oksigen
Sumber: Gordon, et al., 2001
1
Proses oksidasi xantin yakni senyawa berada pada
sebagian besar jaringan tubuh dan cairan yang bertindak
sebagai enzim katalisator perubahan hipoksantin menjadi
xantin hingga menjadi asam urat kemudian menghasilkan
hidrogen peroksida.
Reaksi melibatkan besi dan logam lain.
Olahraga dengan latihan lebih lama dan intensif maka
akan mengkonsumsi oksigen lebih banyak.
(Halliwel, 2004)
1
Gambar 4. Sumber radikal eksogen
1
dengan oksigen khususnya pada temperatur tinggi
sehingga menghasilkan radikal.
RH → radikal bebas R, ROO, RO, HO
ROOH → RO + OH
2ROOH → RO + ROO + H2O
ROOR → 2RO
1.4.2. Tahap propagasi
Tahap ini merupakan awal pemanjangan rantai radikal
atau pemanjangan reaksi dimana radikal bebas akan
diubah menjadi radikal bebas lain. Pada tahap
R + 3O2 → ROO
ROO + RH → ROOH + R
1.4.3. Tahap terminasi
1
Senyawa radikal akan bereaksi dengan radikal lain
sehingga potensi propagasinya rendah. Konversi
radikal peroksi dan alkil ke non radikal mengakhiri
reaksi propagasi, sehingga mengurangi perpanjangan
rantai kinetik. Reaksi terminasi signifikan terjadi
ketika konsentrasi oksigen sangat rendah. Kombinasi
radikal alkil menyebabkan cross linking
mengakibatkan peningkatan viskositas dan berat
molekul.
R + R’ → RR R + ROO → ROOR ROO +
ROO → ROOR + O2
Pada tahap terminasi, akan terbentuk spesies non
radikal karena radikal bebas bereaksi satu sama lain.
Sedangkan hidroperoksida akan terdekomposisi
menjadi produk alkohol, asam keton dan substrat lain
yang lebih stabil.
1
Gambar 5. Atherosklerosis (National Heart and Lung Institute, 2015)
1
DNA ini sering justru menimbulkan mutasi, karena
dalam memperbaiki DNA tersebut sistem perbaikan
DNA cenderung membuat kesalahan (error prone ),
dan apabila mutasi ini mengenai gen-gen tertentu
yang disebut onkogen, maka mutasi tersebut dapat
menimbulkan kanker (Reynertson, 2007). Sel
mengandung DNA rusak tersebut bila membelah
sebelum diperbaiki, akan mengakibatkan perubahan
genetic secara permanen. Hal tersebut merupakan
langkah awal dalam proses karsinogenesis. Oksidasi
DNA oleh senyawa radikal bebas dapat menginisiasi
terjadinya kanker (Langseth, 1995). Kerusakan DNA
akibat radikal bebas dapat dilihat pada Gambar 6.
1.5.1.2.Kerusakan protein
Oksidan dapat merusak protein karena dapat
mengadakan reaksi dengan asam-asam amino yang
menyusun protein tersebut. Diantara asam-asam
amino penyusun protein yang paling rawan adalah
sistein. Sistein mengandung gugusan sulfidril (SH)
1
dan justru gugusan inilah yang paling peka terhadap
serangan radikal bebas seperti radikal hidroksil :
RSH + OH RS + H2O
RS + RS RSSR
Pembentukan ikatan disulfida (-S-S-) menimbulkan
ikatan intra atau antar molekul protein tersebut
kehilangan fungsi biologisnya (misalnya enzim
kehilangan aktivitasnya).
1.5.1.3.Kerusakan lipid peroksida
Radikal bebas dapat menyebabkan kerusakan
oksidatif pada ikatan lemak tak jenuh dalam
membran fosfolipid (Soleas, et al., 2002). Peroksidasi
lipid pada mebran merusak struktur membran dan
menyebabkan hilangnya fungsi dari organel sel.
Mekanisme peroksidasi lipid dapat terlihat pada
Gambar 7.
1
Komponen terpenting membran sel adalah fosfolipid,
glikolipid dan kolesterol. Dua komponen pertama
mengandung asam lemak tak jenuh. Justru asam
lemak tak jenuh ini (asam-asam linoleat, linolenat
dan arakidonat) sangat rawan terhadap
seranganserangan radikal, terutama radikal hidroksil.
Radikal hidroksil dapat menimbulkan reaksi rantai
yang dikenal dengan nama peroksidasi lipid
LH + OH L + H2O
Asam lemak Radikal lipid
L + O2 LOO
Radikal peroksilipid
LOO + RH L + LOOH dan seterusnya.
Akibat akhir dari rantai reaksi ini adalah terputusnya
rantai asam lemak menjadi berbagai senyawa yang
bersifat toksik terhadap sel, antara lain berbagai
macam aldehida, seperti malondialdehida, 9-
hidroksinonenal serta bermacam-macam hidrokarbon
seperti etana (C2H6) dan pentana (C5H12). Tahapan
kerusakan lipid peroksidasi hingga membentuk
senyawa toksik ditunjukkan pada Gambar 8.
1
Gambar 8. Tahapan terjadinya kerusakan lipid peroksidasi Dapat
pula terjadi ikatan silang (cross-linking) antara dua
rantai asam lemak atau antara asam lemak dan rantai
peptida (protein) yang timbul karena reaksi dua
radikal :
R1 + R2 R1R2
Semuanya itu menyebabkan kerusakan kerusakan
parah membran sel sehingga membahayakan
kehidupan sel.
1.5.2. Efek Positif Radikal Bebas
1
Oksidan menimbulkan banyak kerugian, tetapi justru
dampak negatif ini dimanfaatkan oleh tubuh untuk
melawan serbuan organisma patogen. Untuk
menghadapi “serangan dari luar ini”, Sang Pencipta
telah menyediakan sel-sel khusus yang disebut sel-sel
radang (inflamatory cells ) seperti granulosit, monosit
dan makrofag, yang dapat menghasilkan oksidan
1
Gambar 9. Efek radikal nitrit oksida untuk tubuh
1
• Senyawa oksigen reaktif secara in vitro bersifat
mitogenik pada berbagai sel.
• Berperan dalam sintesis DNA karena aktivitas
ribonukleotida reduktase sangat tergantung SOR.
• Berperan dalam aktivitas spermatozoa.
Gambar 10. Efek radikal bebas jenis ROS dalam menghambat bakteri
2.1.Pengertian Antioksidan
Indonesia sebagai negara berkembang mempunyai
keterbatasan dalam penanggulangan masalah kesehatan,
dimana penyakit infeksi masih tinggi, tetapi prevalensi
1
penyakit degeneratif makin meningkat. berdasarkan riset
kesehatan dasar oleh Badan Litbangkes tahun 2007,
penyebab kematian utama adalah stroke (15,4%) diikuti
tuberkulosis, hipertensi dan cidera serta diabetes mellitus
dan tumor. Penyakit degenerative seperti kanker, diabetes
mellitus dan komplikasinya, stroke dan aterosklerosis
disebabkan karena stress oksidatif. Antioksidan sangat
diperukan oleh tubuh untuk mengatasi dan mencegah
stress oksidatif.
Senyawa fitokimia adalah zat alami terdapat dalam
tanaman yang dapat memberikan citarasa, aroma dan
warna khas pada tanaman tersebut. Salah satu khasiat
fitokimia dapat digunakan sebagai antioksidan. Adapun
khasiat lainnya yakni dapat meningkatkan sistem
kekebalan, mengatur tekanan darah, menurunkan kadar
kolesterol dan mengatur kadar gula darah.
Senyawa antioksidan menurut pengertian kimiawi
adalah senyawa donor elektron. Namun dalam arti
biologis, pengertian antioksidan lebih luas yaitu senyawa
yang dapat meredam dampak negatif oksidan, termasuk
enzim-enzim dan protein-protein pengikat logam.
Antioksidan bekerja dengan mendonorkan satu
elektronnya kepada senyawa oksidan sehingga ada
aktivitas penghambatan oksidan tersebut (Winarti, 2010).
Tubuh memerlukan antioksidan untuk melindungi dari
serangan radikal bebas. Antioksidan adalah suatu
senyawa pada konsentrasi rendah secara signifikan dapat
1
menghambat atau mencegah oksidasi substrat dalam
reaksi rantai (Halliwell dan Whitemann, 2004; Leong dan
Shui, 2002). Antioksidan dapat melindungi sel-sel dari
kerusakan karena molekul tidak stabil atau radikal bebas.
Antioksidan dapat mendonorkan elektronnya kepada
molekul radikal bebas, sehingga dapat menstabilkan
radikal bebas dan menghentikan reaksi berantai (Sies,
1997). Antioksidan dapat mencegah terbentuknya radikal
bebas dalam tubuh, seperti terlihat pada Gambar 11.
1
dimana antioksidan dapat membantu melindungi tubuh
dari serangan radikal bebas dengan meredam dampak
negatif senyawa radikal bebas tersebut (Karyadi, 1997).
1
Antioksidan alami dapat diisolasi dari bahan alam.
Antioksidan ini memiliki bobot molekul sekitar
200−400. Semua antioksidan alami mudah diserap
oleh usus dan didistribusikan ke seluruh tubuh
(Niwa, 1997). Fungsi dari antioksidan alami antara
lain adalah sebagai reduktor, peredam pembentukan
oksigen singlet, penangkap radikal bebas dan
pengkhelat logam (Sidik, 1997). Antioksidan alami
digolongkan menjadi enzim dan vitamin.
Antioksidan berupa enzim yang dihasilkan oleh
tubuh berupa superoxide dismutase (SOD), glutation
peroxidase, dan katalase. Sedangkan antioksidan
vitamin umumnya beta karoten (vitamin A),
alfatokoferol (vitamin E) dan asam askorbat (vitamin
C) (Zeng dan Wang, 2001). Antioksidan dari tumbuhan adalah
senyawa polifenol atau fenolik, golongan flavonoid, turunan
asam sinamat, kumarin, tokoferol dan asam organik (Madhavi, et
al., 1996).
2.1.1.1.−Tokoferol
−Tokoferol tersimpan terutama dalam
jaringan adiposa, hati dan otot. Senyawa ini berfungsi
sebagai antioksidan utama dan bersifat larut lemak
atau membran (Evans, 1991). −Tokoferol mencegah
proses peroksidasi lipid dimana perannya sebagai
pereduksi memecah reaksi rantai oksidatif atau
menangkap radikal peroksil sebelum dapat merusak
sel. Tokoferol memiliki aktivitas paling tinggi
1
terhadap radikal peroksil. Gugus fenol pada hidroksil
cincin C6 adalah gugus berperan dalam aktivitas
antioksidan dan sistem cincin kromanol untuk
enstabilkan elektron tidak berpasangan (Bagchi,
1998). Struktur kimia −tokoferol dapat dilihat pada
Gambar 13.
1
bebas. Pada sel membrane, −Tokoferol akan
mencegah oksidasi lemak khususnya Poly
2.1.1.2.Asam askorbat
Asam askorbat berperan dalam sintesis kolagen,
membantu menjaga kesehatan pembuluh kapiler, gigi
dan gusi, meningkatkan penyerapan zat besi dalam
tubuh. Asam askorbat juga dapat meningkatkan HDL,
menurunkan kolesterol dalam darah dan mengurangi
peningkatan karsinogen pada DNA serta
memperlambat pembentukan sel tumor pada model
hewan (Evans, 1991).
Asam askorbat merupakan antioksidan larut air
yang utama dalam plasma darah dan sitosol. Aasam
askorbat menangkap oksigen singlet dan bereaksi
secara cepat dengan radikal hidroksil dan hidrogen
peroksida. Aktivitas asam askorbat berada pada gugus
1
2,3−enediol yang daoat teroksidasi maupun tereduksi.
Asam askorbat terdapat dalam 2 bentuk di alam yaitu
L-askorbat dan L-dehidro askorbat (bentuk
teroksidasi). Struktur kimia asam askorbat seperti
dapat dilihat pada Gambar 14.
2.1.1.3.Polifenol
1
Kandungan polifenol dapat dijadikan
karakteristik antioksidan terkandung dalam bahan
makanan. Polifenol merupakan salah satu kelompok
antioksidan paling banyak terdapat dalam tanaman
pangan, dengan lebih dari 8000 struktur fenolik
(Harborne, 1993). Menurut Aulia (2009) senyawa
polifenol bersifat multifungsional dimana beberapa
kegunaannya di antaranya dapat sebagai pereduksi
atau donor elektron, penangkap radikal bebas,
pengkhelat logam dan peredam terbentuknya oksigen
singlet. Turunan polifenol sebagai antioksidan dapat
menstabilkan radikal bebas dengan melengkapi
kekurangan elektron radikal bebas dan menghambat
terjadinya reaksi berantai dari pembentukan radikal
bebas (Hattenschwiller dan Vitousek, 2000).
Senyawa polifenol merupakan salah satu kelas
antioksidan berada dalam tumbuhan. Kandungannya
sering diketahui sebagai terminator radikal bebas dan
pada umumnya kandungan senyawa ini berkorelasi
positif terhadap aktivitas antiradikal (Marinova and
Batcharov, 2001).
2.1.1.4.Flavonoid
Flavonoid merupakan kelompok antioksidan
penting untuk tubuh manusia. Flavonoid dibagi
menjadi 13 kelas dengan lebih dari 4000 senyawa
ditemukan hingga tahun 1990. Flavonoid merupakan
senyawaan fenol pada sebagian besar tumbuhan hijau.
1
Beberapa fungsi flavonoid yang terkandung pada
tumbuhan ialah pengaturan tumbuh, pengaturan
fotosintesis, kerja antimikroba dan antivirus. Efek
flavonoid terhadap berbagai macam organisme sangat
banyak macamnya dan dapat menjelaskan mengapa
tumbuhan yang mengandung flavonoid dipakai dalam
pengobatan tradisional. Flavonoid dapat bekerja
sebagai inhibitor kuat pernapasan, juga sebagai
senyawa pereduksi yang baik, menghambat banyak
reaksi oksidasi, baik secara enzim maupun
non−enzim. Flavonoid bertindak sebagai penampung
yang baik radikal hidroksi dan superoksida dan
melindungi membran lipid terhadap reaksi yang
merusak ( Robinson, 1995).
Flavonoid diketahui berfungsi sebagai
antimutagenik dan antikarsinogenik. Selain itu
memiliki sifat sebagai antioksidan, anti inflamasi, anti
alergi dan menghambat oksidasi LDL (Harborne,
1993).
Senyawa flavonoid yang paling banyak terdapat
di alam adalah flavonol, flavon, flavon−3−ol,
isoflavon, flavanon, antosianidin dan proantosianidin
(Bravo, 1998). Beragam kombinasi dari gugus
hidroksil, gula, oksigen dan metil pada strukturnya
menjadi dasar pembagian golongan flavonoid menjadi
flavonol, flavanon, flavon, flavon−3−ol (katekin),
antosianidin, bioflavonoid dan isoflavon (Markham,
1
1998). Tabel 3 menunjukkan bentuk substitusi
flavonoid dengan aktivitas antioksidan. Kemudian,
struktur kimia dari substitusi dapat ditunjukkan pada
Gambar 15.
1 Quercetin OH OH OH H H OH OH H +
2 Miricetin OH OH OH H H OH OH OH +
3 Kaempferol OH OH OH H H H OH H +
4 Luteolin H OH OH H H OH OH H +
5 Apigenin H OH OH H H H OH H +
1
Gambar 15. Struktur substitusi flavonoid dengan aktivitas antioksidan
Gambar 16. Struktur kimia beberapa jenis flavonoid (Apak, et al., 2007)
1
karbon flavonoid dan dalam hal ini gula tersebut
terikat langsung pada inti benzene dengan suatu
ikatan karbon-karbon yang tahan asam atau disebut
C-glikosida (Markham, 1988).
Kegunaan bagi tumbuhan yaitu untuk menarik
serangga, yang membantu proses penyerbukan, untuk
menarik perhatian binatang yang membantu
penyebaran biji. Bagi manusia dosis kecil, flavon
bekerja sebagai stimulant pada jantung, hisperidin
mempengaruhi pemburuh darah kapiler, flavon
terhidroksilasi bekerja sebagai diuretik dan sebagai
antioksidan pada lemak ( Sirait, 2007).
Flavonoid mempunyai sejumlah fungsi penting
bagi tumbuhan, diantaranya sebagai pigmen warna,
pelindung tanaman dari sinar UV-B, dan antimikroba.
Delfinidin, salah satu jenis flavonoid, memberikan
warna biru pada kelopak bunga. Salah satu resistensi
tanaman dari sinar UV-B di antaranya terletak pada
peranan flavonoid yang diketahui secara umum
terdapat pada daun-daun berwarna hijau. Flavonoid
dapat berperan sebagai penapis sinar UV-B karena
flavonoid dapat menyerap sinar pada panjang
gelombang 280-315 nm. Sebagai antimikroba,
flavonoid mempunyai kemampuan untuk
menghambat pengecambahan spora patogen pada
tanaman (Harborne& Williams, 2000).
1
Selain memegang peran penting pada
tumbuhan, flavonoid juga memiliki beberapa fungsi
medis pada manusia, yaitu aktivitas antioksidan,
antiinflamasi, mengurangi resiko penyakit jantung
koroner, sejumlah aktivitas pada vaskular,
oestrogenik, sitotoksik antitumor, antispasmolitik,
hepatoprotektif, antijamur, antiansietas, dan
pencegahan terhadap malaria (Harborne& Williams,
2000).
Sebagai antioksidan, flavonoid dapat
menangkap sejumlah ion oksidatif, di antaranya anion
superperoksida, radikal hidroksil atau radikal peroksi.
Flavonoid juga dapat memadamkan oksigen singlet.
Berdasarkan penelitian, ada beberapa mekanisme
dalam aktivitas antioksidan oleh flavonoid ini.
Menurut Tournaire dkk. (1993), keberadaan katekol
pada cincin B berperan utama dalam mengontrol
pemadaman 1O2 dan keberadaan gugus hidroksil pada
posisi 3 sebagian besar menentukan efisiensi
reaktivitas kimia flavonoid dengan 1O2. Sedangkan
berdasarkan penelitian Das & Pereira (1990), gugus
karbonil pada C-4 dan ikatan rangkap antara C-2 dan
C-3 pada flavonoid juga berperan pada aktivitas
antioksidan yang tinggi. Kemungkinan mekanisme lain
yaitu kemampuan flavonoid dalam menstabilkan
membran dengan cara mengurangi fluiditas membran
(Arora dkk., 2000).
1
Aktivitas flavonoid sebagai antioksidan
terutama ditentukan oleh posisi dan tingkat
hidrooksilasinya. Gugus orto−dihidroksi dalam cincin
B berkontribusi terhadap aktivitas antioksidan.
Struktur p−quinol pada cincin B memberikan
aktivitas lebih besar dibandingkan dengan struktur
o−quinol. Sementara konfigurasi meta tidak memiliki
efek antioksidan. Semua flavonoid dengan
konfigurasi 3’, 4’−dihidroksilasi memiliki aktivitas
sebagai antioksidan (Amic, et al., 2002). Adapun
struktur flavonoid dengan aktivitas antioksidan tinggi
dapat dilihat pada Gambar 17.
1
mikroorganisme tidak mempunyai kandungan
senyawa ini. Oleh karena itu, tanaman merupakan
sumber utama senyawa isoflavon di alam.
1
Gambar 18. Struktur kimia Genistin, Glistin dan Daidzin (Ariani dan
Hastuti, 2009)
2.1.1.5.Vitamin A
Vitamin A diperlukan untuk pertumbuhan dan
perkembangan fungsi sistem imun serta proses
penglihatan. Fungsi betakaroten sebagai precursor
1
vitamin A. Secara enzimatis, betakaroten akan
berubah menjadi retinol, zat aktif vitamin A dalam
tubuh. Menurut Astawan dan Kasih (2008)
betakaroten mempunyai peran penting dalam
menstabilkan radikal berinti karbon sehingga
mengurangi resiko terjadinya kanker. Salah satu
keunikan sifat antioksidan ini adalah efektif pada
konsentrasi rendan oksigen sehingga mampu
melengkapi sifat antioksidan vitamin E (efektif pada
konsentrasi tinggi oksigen). Betakaroten juga dapat
meningkatkan daya tahan tubuh. Kandungan
betakaroten pada bahan pangan alami dapat
mengurangi resiko terjadiya stroke. Hal tersebut
akibat aktivitas betakaroten sebagai pencegah
terbentuknya plak atau timbunan kolesterol dalam
pembuluh darah. Struktur kimia vitamin A dapat
terlihat pada Gambar 19.
2.1.1.6.Antosianin
Antosianin merupakan glikosida antosianidin
yaitu garam polihidroksiflavillium. Senyawa ini
merupakan turunan garam flavillium atau
1
benzilflavillium. Antosianin memiliki sifat mudah
larut dalam air (Markakis, 1982). Antosianin tersusun
atas gugusan glikon dan aglikon, dimana gugus glikon
jika dihilangkan melalui hidrolisis maka dihasilkan
antosianidin. Gugus gula berikatan dengan
antosianidin pada umumnya adalah glukosa,
galaktosa, xilosa, arabinosa dan rhamnosa.
Antosianidin akan berwarna merah di lingkungan
asam, biru di basa dan warna ungu di lingkungan
netral (Francis, 2000). Kadar antosianin dalam
beberapa bahan pangan dapat dilihat pada Tabel 4.
1
Black raspberry 845
1
Gambar 20. Antosianin dapat mencegah penuaan dini
1
terhadap panas dan sering digunakan untuk stabilisasi
lemak dalam proses pemanggangan dan penggorengan
produk (Hamid, A. et al, 2010). Antioksidan BHA dan
BHT jika digunakan dalam jangka panjang akan
memberikan efek pada tubuh (Fennema, 1996). Menurut
Concon (1988) penggunaan BHT dan BHA sebagai
antioksidan memiliki efek toksik yaitu kandungan 1%
BHT atau BHA dalam makanan menghasilkan penurunan
berat badan dan pembengkakan berat pada organ hati dan
otak. Beberapa antioksidan alami dan sintetik yang
diizinkan untuk digunakan dalam makanan dapat terlihat
pada Tabel 5.
Tabel 5. Antioksidan yang diizinkan digunakan dalam makanan
Antioksidan Sinergis
Tokoferol Asam sitrat dan isopropil sitrat
Gum guacic Asam phosphoric
Propil galat Asam tiodipropionat dan diodesil,
dilauril, dioctadesil ester
BHA Asam askorbat dan askorbil
BHT Palmitat
TBHP Asam tartarat
TBHQ Lecithin
Sumber: Fennema, 1996
1
sebagai stabilisator untuk radikal bebas, sehingga
reaksi radikal bebas selanjutnya dapat dihindari.
Antioksidan sintetik seperti BHA diketahui memiliki
aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibanding-kan
vitamin E (Han, et al., 2004).
BHA memiliki kemampuan antioksidan paling
baik pada lemak hewan dalam sistem makanan
panggang. BHA tidak efektif digunakan untuk
minyak tanaman. BHA bersifat larut lemak dan tidak
larut air, berbentuk padat putih dan dijual dalam
bentuk serpih atau tablet, bersifat volatile sehingga
berguna untuk penambahan ke materi pengemas
(Gordon, et al., 2001).
BHA memiliki dua isomer yaitu
3−tert−butil−4−hidroksianisol (3−BHA) dan
2−tert−butil−4−hidroksianisol (2−BHA). BHA pada
umumnya mengandung tidak kurang dari 90% isomer
3−BHA dimana lebih baik dari 2 BHA (Smith, 1991).
BHA larut dalam metanol, larut baik dalam
kloroform, etanol, propilen glikol, dietil eter, heksan
dan petroleum eter. Titik didih BHA 264oC dan titik
leleh 47oC untuk 3−BHA. Struktur kimia BHA dapat
dilihat pada Gambar 21.
1
2 3 BHA BHA
1
buruk ini tidak terjadi, bahkan efek yang timbul
adalah efek protektif terhadap kanker dari senyawa
kimia (Lam, et al., 1979). Sedangkan pada manusia,
beberapa penelitian telah menemukan bahwa BHA
dapat menyebabkan reaksi alergi dan pada dosis besar
dapat berefek pada fungsi ginjal dan hati
(Botterwerck, 2007).
1
Gambar 22. Struktur kimia BHT
1
BHT juga dapat berfungsi sebagai pemadam
(quencher) bagi oksigen singlet (Fukuzawa, 1998).
BHT cukup tahan pemanasan. Pada proses
fotooksidasi, BHT berperan sebagai penangkap
senyawa radikal dalam menghambat reaksi karena
dalam reaksi fotooksidasi juga terbentuk senyawa
radikal ketika hidroperoksida terurai menjadi radikal
hidroperoksi dan radikal alkoksi (Mariombo, 2002;
Herawati dan Syafsir Akhlus, 2006). Oksigen singlet
bereaksi dengan asam lemak dengan cara berbeda
dengan oksigen triplet. Oksigen singlet bersifat
elektrofil dimana cenderung untuk menangkap
elektron untuk mengisi kekosongan elektron pada
orbital molekulnya. Sedangkan oksigen triplet hanya
bereaksi dengan senyawa radikal (Min and Boff,
2002).
2.2.2.3.4−Hidroksimetil−2−6−di−tert−butilfenoltert
−Butilhidroquinon (TBHQ)
TBHQ merupakan antioksidan sintetis paling
efektif dalam minyak goreng terutama minyak nabati.
TBHQ memiliki ketahanan snagat baik dalam proses
penggorengan. Kombinasi dengan BHA dapat
meningkatkan performanya sebagai antioksidan
dalam proses pemanggangan (Smith, 1991).
TBHQ berbentuk serbuk kristal berwarna putih
atau coklat muda, BM 166,22 dengan titik didih
1
300oC dan titik lebur 126,5−128,5oC. TBHQ praktis
tidak larut dalam air, larut dalam minyak, etanol, etil
asetat dan propilenglikol (Rowe et al., 2003). Struktur
kimia TBHQ ditunjukkan pada Gambar 23.
1
BAB III UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN
1
Gambar 24. Rumus struktur DPPH
1
1 Oxygen Radical Absorbance Capacity Method (ORAC)
2 Lipid Peroxidation Inhibition Capacity Assay (LPIC)
3 Total Radical Trapping Antioxidant Parameter (TRAP) 4
Inhibited Oxygen Uptake (IOC)
5 Crocin bleaching Nitric Oxide Radical Inhibition Assay
6 Hidroxyl radical scavenging activity
by
p−butylsidunethyl aniline
7 Scavenging of H2O2 radical
8 ABTS radical scavenging method
9 Scavenging of Superoxide radical formation by alkaline
SASA
Other assay
1 TOSC (Total Oxidant Scavenging Capacity) 2
Chemiluminescence.
3 Reuscher oscillation reaction
4 Electrochemiluminescence
5 Fluorometric Analysis
6 Enhanced chemiluminescence
7 TLC Bioautography
8 Cellular antioxidant activity (CAA) assay
9 Dye−substrate oxidation method
1
Interaksi antioksidan dengan DPPH baik
secara transfer elektron atau radikal hidrogen pada
DPPH menetralkan sifat radikal bebas DPPH. Radikal
DPPH adalah suatu senyawa organic mengandung
nitrogen tidak stabil dengan absorbansi kuat pada
panjang gelombang (λmax) 517 nm dan berwarna ungu
gelap. Apabila semua elektron pada DPPH
berpasangan maka warna larutan akan berubah dari
ungu tua menjadi kuning terang dan absorbansi pada
panjang gelombang (λmax) 517 nm akan hilang (Gurav,
et al., 2007). Perubahan warna tersebut dapat diukur
dengan spektrofotometer dan diplotkan terhadap
konsentrasi (Reynertson, 2007). Penurunan intensitas
warna disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap
terkonjugasi pada DPPH. Hal ini dapat terjadi apabila
adanya penangkapan elektron oleh zat antioksidan
menyebabkan tidak adannya kesempatan elektron
tersebut untuk beresonansi (Gambar 26). Adapun
reaksi antara radikal DPPH dengan antioksidan dapat
terlihat pada Gambar 25.
1
1,1−diphenyl−pirylhydrazil 1,1−diphenyl−pirylhydrazin
1
kerusakan antioksidan dengan metode DPPH
ditunjukkan pada Tabel 9 berikut.
Tabel 9. Tingkat kerusakan antioksidan dengan metode DPPH
Intensitas Nilai IC50 (bpj)
Sangat aktif <50
Aktif 50−100
Sedang 101−250
Lemah 250−500
Tidak aktif >500
(Blois, 2003)
1
6.1.1.2.Pengukuran bilangan para−anisidin para-
Anisidin adalah senyawa bereaksi dengan aldehid
untuk memberikan hasil serapan pada 350 nm.
Bilangan para-anisidin didefinisikan sebagai serapan
larutan dihasilkan dari 1 g lemak dalam larutan
isoktan 100 mL. Hasil dengan aldehid jenuh (2-
alkana) menyerap lebih kuat pada panjang gelombang
tersebut. Akibatnya, uji ini sangat sensitive terhadap
bahan-bahan yang mengalami oksidasi. Meskipun uji
ini tidak dapat membedakan antara bahan mudah
menguap atau tidak, tetapi uji ini biasanya lebih
sensitif terhadap aldehid tak jenuh mudah menguap.
Jika dibandingkan aldehid jenuh dengan sifat yang
sama, uji ini merupakan metode cocok untuk menilai
adanya oksidasi sekunder. Pengukuran bilangan
anisidin umumnya digunakan secara bersama dengan
pengukuran bilangan peroksida dalam
menggambarkan tingkat oksidasi total (Pokorny, et
al., 2001).
1
kecil etanol sekitar 5% dari massa minyak dan larutan
ini akan dicampurkan ke dalam fase minyak dengan
pengadukan kuat. Perhitungan bilangan peroksida
(meq/ kg minyak) dapat dihitung dengan rumus:
𝑃𝑉 = 0,01 × 𝑁 × 100/𝑚
Dimana N adalah volume sodium tiosulfat
digunakan dalam titrasi sampel (mL) dan m adalah
massa sampel minyak dalam garam. Sedangkan
efisiensi antioksidan dapat dihitung dengan rumus:
1
Prinsip penghambatan radikal hidroksil adalah
pengukuran dengan mereaksikan antara DMPO
(5,5dimetil-1-pirolin-N-oksida) dan radikal OH secara
adisi menghasilkan DMPO-OH. DMPO-OH
terbentuk dapat dideteksi dengan spectrometer ESR
(Helrich, 1990). Spektrum ESR diukur pada suhu
kamar setelah mencampur 0,02 mL H2O2 0,1 mM
dengan 0,01 mL DMPO 0,05 mM ; 0,05 mL ekstrak
dan 0,02 mL Fe2+ 0,05 mM. Pengaturan parameternya
dengan mengukur medan magnet eksternal 337,5 + 5
mT pada frekuensi 100 kHz, gelombang mikro 10
mW pada 9,43 GHz. Asam askorbat dan etanol
digunakan sebagai kontrol (Kosem, et al., 2007).
Perbandingan penghambatan radikal hidroksil ekstrak
diukur menggunakan rumus:
𝑇𝑖𝑛𝑔𝑘𝑎𝑡 𝑝𝑒𝑛𝑔ℎ𝑎𝑚𝑏𝑎𝑡𝑎𝑛 = [(ℎ𝑥 − ℎ0)/ℎ0] × 100%
Dimana hx dan h0 adalah reaksi intensitas
sinnyal ESR pada masing- masing sampel uji maupun
blanko. Aktivitas ini dinyatakan dengan
penghambatan radikal hidroksil (Shivaprasad, 2005).
1
trikloroasetat dan besi (III) klorida. Ketiga senyawa
tersebut ditambahkan ke dalam larutan uji setelah
sentrifugasi kemudian diukur pada panjang
gelombang 700 nm. Peningkatan absorbansi dari
reaksi menunjukkan penurunan kekuatan sampel
(Prieto, et al., 1999).
6.1.1.7.Metode Fosfomolibdenum
Kapasitas antioksidan total dengan pengujian
metode ini didasarkan pada reduksi Mo (IV) menjadi
Mo (V) oleh sampel analit dan
selanjutnya pembentukan kompleks warna
hijau fosfat molybdenum (V) yang mengandung
antioksidan pada pH asam. Fosfomolybdenum adalah
metode kuantitatif untuk aktivitas antioksidan total
dinyatakan sebagai jumlah setara dengan asam
askorbat (Prieto, et al., 1999).
1
6.1.1.8.Metode ABTS (garam 2,2−azinobis
(3−etilbenzotiazolin−6−sulfonikasid)
diazonium)
Metode peredaman radikal kation ABTS
merupakan metode uji untuk mengukur kapasitas
antioksidan dengan langsung bereaksi atau meredam
radikal kation ABTS dari reaksi kimia (Shivaprasad,
2005). ABTS merupakan radikal dengan pusat
nitrogen. Pusat nitrogen tersebut dapat berwarna biru
kehijauan dimana ketika tereduksi oleh antioksidan
menjadi bentuk nonradikal tidak berwarna. Metode
ini berprinsip pada penghambatan pembentukan
kation radikal ABTS dengan absorpsi maksimum
pada panjang gelombang 734 nm pada waktu tertentu
berdasarkan pembacaan spektrofotometer
(Antolovich, et al., 2001).
Metode ini baik digunakan untuk melihat
aktivitas antioksidan senyawa flavonoid dan fenolik.
ABTS memiliki sensitivitas lebih tinggi daripada
DPPH. Tidak seperti DPPH yang sensitive pada pH
asam, metode ABTS lebih fleksibel yakni dapat
digunakan dalam berbagai level pH. Sehingga,
metode ini baik digunakan untuk melihat efek pH
dalam aktivitas antioksidan berbagai senyawa. ABTS
larut dalam pelarut organik dan non organic. Metode
ini juga lebih cepat jika digunakan pada PBS (pelarut
non organik). Reaksi antara antara radikal ABTS dan
komponen antioksidan ditunjukkan pada Gambar 27.
1
Gambar 27. Reaksi antara radikal ABTS dan antioksidan
1
larutan uji, fluoresensi direkam dan aktivitas
antioksidan dinyatakan sebagai Trolox Ekuivalen
(TE) (Bank and Lenoble,2000).
1
Dimana A0 adalah absorban kontrol
(campuran reaksi tanpa ekstrak), A1
adalah absorbansi sampel dan A2 adalah absorbansi
tanpa penambahan larutan kalium tiosianat. Standar
yang digunakan adalah −tokoferol (Behera, et al.,
2006).
L + O2 → LOO
1
perubahan warna kompleks larutan biru tosca menjadi
kuning. Pereaksi CUPRAC merupakan pereaksi yang
selektif karena memiliki nilai potensial reduksi rendah
yaitu sebesar 0,17 V (Apak, et al., 2007). Hasil
didapat dinyatakan dalam mg Trolox per liter sampel.
Kelebihan dari metode ini adalah pereaksi yang
digunakan cukup cepat bekerja, selektif, lebih stabil,
mudah didapatkan dan mudah diaplikasikan.
1
Gambar 28. Reaksi antara antioksidan dengan reagen FRAP
1
garam dapur dan diukur dengan pereaksi Griess.
Dengan adanya penghambatan tersebut, dapat diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 546 nm.
Sehingga aktivitas tersebut menunjukkan adanya
reduksi dari nitrat oksida (Shivaprassi, et al., 2005).
6.1.1.15. Hidrolisis
Hidrolisis berasal dari kata hidro (air) dan lisis
(pecah/putus), yang berarti pemutusan ikatan oleh air.
Pada flavonoid, hidrolisis dilakukan untuk
memutuskan ikatan glikosida antara flavonoid dengan
gulanya. Aglikon flavonoid mempunyai aktivitas
antioksidan yang lebih baik bila dibandingkan dengan
bentuk glikosidanya. Hal ini dikarenakan keberadaan
gula menurunkan efisiensi antioksidan (Fuhram&
Aviram, 2002). Reaksi hidrolisis ini dapat dilakukan
dengan 3 cara, yaitu hidrolisis asam, hidrolisis basa,
dan hidrolisis enzimatik (Stalikas, 2007).
1
6.1.2. Menggunakan materi biologis
Metode dapat dilakukan dengan mengukur viabilitas
sel (teknik kultur sel), mengukur pembentukan diena
terkojugasi dan mengukur kadar TBARS (Thiobarbituric
Acids Reactive Substances) dari isolate LDL. Pada analisis
pembentukan diena terkonjugasi, sampel plasma
diencerkan dengan larutan NaCl 0,9%-NaHCO3 1 mM
sampai konsentrasi protein 50 µg/ml, kemudian dioksidasi
dengan penambahan 5µM CuSO4 (konsentrasi akhir) pada
suhu 37 °C. Selanjutnya, absorbansi dibaca dengan
spektrofotometer pada λ 234 nm (Zakaria, dkk., 2001).
Diena terkonjugasi adalah produk antara dari lipid yang
teroksidasi. Adanya diena terkonjugasi dalam plasma
mengindikasikan adanya kerusakan lipid. Tujuan analisis
diena terkonjugasi adalah menguji kapasitas antioksidan
dalam menahan oksidasi LDL (low density lipoprotein)
plasma. Diena terkonjugasi menyerap sinar pada panjang
gelombang UV 234 nm, sehingga dapat dibuat kurva
oksidasi antara lamanya waktu oksidasi dengan kadar
diena terkonjugasi yang terbentuk. Sampel yang
mengandung antioksidan biasanya memiliki fase lag
sebelum terjadinya lonjakan diena terkonjugasi. Sehingga
semakin lama fase lag mengindikasikan semakin
tingginya kapasitas antioksidan sampel tersebut (Zakaria,
dkk., 2003).
1
6.2. Uji Aktivitas Antioksidan secara in vivo
Dalam penelitian in vivo, yang termasuk penanda stres
oksidatif adalah peroksidasi lipid, oksidasi protein dan
kerusakan DNA serta antioksidan endogen termasuk asam
askorbat, tokoferol, GSH, GSSH dan GSSG, ubiquinone,
ubiquionol, cysteine, dan cystine (Liu, et al., 2000). Efektivitas
suatu senyawa yang memiliki kemampuan sebagai antioksidan
dapat diketahui melalui aktivitas atau kemampuan
penghambatan proses oksidasi oleh senyawa antioksidan
tersebut (Aryudhani, 2007).
1
dengan baik. Selain itu, glutation peroksidase juga
membutuhkan kadar glutation tereduksi yang konstan
untuk menjalankan fungsinya (Young dan Woodside,
2001).Reaksi di bawah ini adalah salah satu reaksi
dikatalisis oleh Glutation peroksidase.
2GSH + H2O2 → GSSG + 2H2O
Kadar enzim ini tinggi pada ginjal, liver, dan darah,
sedang pada lensa dan eritrosit, dan rendah pada alveoli
dan plasma darah (Cemeli dkk, 2009). Enzim ini
memerlukan glutathione sebagai donor substrat untuk
mengikat H2O2 maupun hidroperoksida organik (ROOH)
untuk menghasilkan glutathione disulphide (GSSG), air
dan bentuk hidroksi dari bahan organik tersebut (ROH).
Pada manusia, saat ini telah dikenal 8 macam Gpx, mulai
dari Gpx1 hingga Gpx8. Sebagian besar merupakan
selenoprotein (Gpx1, Gpx2, Gpx3, Gpx4, dan Gpx6),
sedangkan pada Gpx5, Gpx7 dan Gpx8, tempat aktif
residu selenocysteine diganti dengan cysteine. Fungsi dari
masing-masing Gpx ini belum sepenuhnya diketahui.
(Toppo dkk, 2009).
Menurut Winarsi, dkk. (2006) dan Wood, et al.,
(2003), aktivitas enzim glutathione peroxidase (GSH-PX)
plasma dilakukan dengan cara sebanyak 100 uL plasma
diencerkan dengan 200 uL NaCl fisiologis (larutan 0,85%
NaCl). Diambil 0,1 mL larutan tersebut dan ditambahkan
0,4 mL triton-X 0,5%, dan seterusnya disebut hemolisat.
Ke dalam tabung uji diambil 100 uL hemolisat dan
1
ditambahkan 100 uL larutan Drabkin lalu dikocok,
kemudian ditambahkan 2,6 mL bufer fosfat dan dikocok
perlahan. Berturut-turut ditambahkan 0,1 mL NADPH,
0,01 mL GSSG-R, 0,01 mL NaNO3, 0,1 mL GSH, dan
dikocok.
Sebelum dibaca laju absorbansinya dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 340 nm, ke
dalam kuvet silika yang berisi larutan yang akan dibaca
absorbansinya ditambahkan 1 mL H2O2. Pembacaan
absorbansi dilakukan dengan selang waktu 1 sampai 2
menit. Untuk pembuatan blanko digunakan 100 uL
akuades sebagai pengganti hemolisat.Satu unit aktivitas
GSH-PX didefinisikan sebagai banyaknya GSH-PX yang
diperlukan untuk mengoksidasi 1 umol NADPH per
menit.
1
di hati dan ginjal, sedangkan di otak aktivitasnya rendah.
Enzim katalase mampu mengkatalasis reaksi penguraian
hidrogen peroksida (H2O2) melalui dua mekanisme kerja
yaitu katalitik dan peroksidatik. Mekanisme enzim
katalase sebagai antioksidan melalui proses katalitik
terjadi bila enzim katalase menggunakan molekul H2O2
sebagai substrat atau donor elektron dan molekul H2O2
yang lain sebagai oksidan atau akseptor elektron.
Katalase sebagai salah satu antioksidan endogen
merupakan senyawa hemotetramer dengan Fe sebagai
kofaktor disandi oleh gen kromosom 11; mutasi pada gen
ini dapat menyebabkan akatalasemia. Katalase termasuk
dalam golongan enzim hidroperoksidase karena dapat
mengkatalisis substrat hidrogen peroksida atau peroksida
organik. Enzim ini dapat ditemui dalam darah, sumsum
tulang, membran mukosa, ginjal dan hati (Kumar dkk,
2008). Merupakan hemoprotein yang mengandung empat
gugus heme. Di dalam sel, katalase ditemukan di dalam
peroksisom. Mekanisme aktivitas katalase sebagai
antioksidan dengan cara mengkatalisis pemecahan H2O2
menjadi H2O dan O2, adalah sebagai berikut (Kumar dkk,
2008).
Katalase−Fe(III) + H2O2 →senyawa 1 + H2O tahap 1 senyawa
1 + H2O2 → Katalase−Fe(III) + H2O2 + O2 tahap 2
H2O2 → H2O + O2
1
katalase. Hal ini disebabkan oleh keberadaan senyawa 1
heme dengan suatu atom oksigen dari molekul H 2O2 pada
tahap I ini. Hasil reaksi ini membentuk molekul air pada
tapak aktif enzim yang dekat heme Fe. Kapasitas reduksi
katalase tinggi pada suasana H2O2 konsentrasi tinggi,
sedangkan pada konsentrasi rendah kapasitasnya menurun
(Cemeli dkk, 2009; Miwa dkk, 2008). Hal ini disebabkan
karena katalase memerlukan reaksi dua molekul H2O2
dalam proses reduksinya, sehingga hal ini lebih jarang
ditemukan pada konsentrasi substrat rendah (Cemeli dkk,
2009). Pada konsentrasi H2O2 rendah seperti yang
dihasilkan dari proses metabolisme normal,
peroxiredoksin (PRX) yang berfungsi untuk mengikat
H2O2 dan mengubahnya menjadi oksigen dan air (Miwa
dkk, 2008). Reaksi pemecahan hidrogen peroksida dan
hidroperoksida organik secara enzimatik digambarkan
dalam Gambar 29 (Day, 2009).
1
peroksida dan radikal bebas menjadi oksigen dan air.
Enzim-enzim ini mampu menekan atau menghambat
pembentukan radikal bebas dengan cara memutus reaksi
berantai dan mengubahnya menjadi produk lebih stabil.
Reaksi ini disebut sebagai chain-breaking-antioxidan.
Gambar 30. Kerja enzim dalam menghambat radikal bebas dalam tubuh
1
Tingginya kadar glukosa diduga menghalangi
aktivitas antioksidan endogen. Sebuah penelitian tentang
pengaruh berbagai tingkat kadar glukosa terhadap enzim
katalase, ditemukan penurunan aktivitas enzim pada kadar
glukosa yang tinggi. Pada penelitian lainnya dikemukakan
bahwa aktivitas katalase yang ditingkatkan melaui
manipulasi transgenik–spesifik dapat melindungi jantung
dari progresi penyakit diabetes kardiomiopati .
1
Gambar 31. Sisi aktif Cu−Zn−SOD
1
Gambar 33. Struktur SOD berbentuk tetramer (Borghstal, et al., 1996)
1
Gambar 34. Struktur kimia tipe Fe SOD / Mn SOD domain alpha−hairpin
(Borghstal, et al., 1996)
1
Pada manusia, kadar normal SOD adalah sebesar
242 ± 4 mg/L pada eritrosit, 548 ± 20 µg/L pada
serum, dan 173 ± 11 µg/L pada plasma (Sun
dkk.,1988). Penurunan aktivitas SOD berhubungan
dengan kejadian penyakit seperti reumatoid artritis,
anemia fanconi, katarak, infeksi saluran pernapasan,
infertilitas (Winarsi, 2007). Peningkatan aktivitas SOD
disertai peningkatan radikal bebas pada penderita sindrom
Down menyebabkan peningkatan kadar hidrogen
peroksida. Hidrogen peroksida yang terbentuk kemudian
akan diinaktivasi oleh glutation peroksidase (GPx) dan
katalase (Garcez, et al., 2005).
Prinsip penentuan aktivitas antioksidan SOD yaitu
mengetahui kemampuan SOD mengkatalisasis anion
superoksida ( O2*) ke dalam molekular peroksida
hidrogen dan oksigen (Anonim 2009). Aktivitas SOD
diukur berdasarkan laju autooksidasi keberadaan dan
ketiadaan sampel meng-ekspresikan Mc Cord Fridovich
“sitokrom c” unit. Kemudian dibaca dengan ELISA pada
panjang gelombang 450 nm. Menghitung aktivitas SOD
(% laju penghambatan) menggunakan persamaan sebagai
berikut:
1
kemudian dipersiapkan larutan standar untuk pengukuran
sampel. Dibuat larutan induk dengan melarutkan 10 uL
katalase dalam 50 mL bufer fosfat. Larutan standar dibuat
dengan melarutkan 0,5 mL larutan induk dalam 9,5 mL
bufer fosfat (1/20) dan 0,5 mL larutan induk dalam 19,5
mL bufer fosfat (1/40). Sebanyak 10 uLlisat dicampurkan
dengan 12,5 mL bufer fosfat. Reaksi mulai terjadi setelah
ditambahkan 1 mL H2O2. Seluruh larutan divorteks
perlahan, lalu penurunan absorbansi dibaca dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 240 nm,
dengan selang waktu 15 detik, 30 detik, 45 detik, dan 60
detik.
Enzim SOD memiliki kemampuan mendegradasi
anion superoksida radikal menjadi oksigen dan hidrogen
peroksida. Kemudian perannya dilanjutkan oleh enzim
GPx dan catalase hingga dihasilkan air dan oksigen.
Superoksida dismutase termasuk enzim primer di dalam
tubuh karena mampu melindungi sel-sel dalam tubuh
akibat serangan radikal bebas (Poitout dan Robertson,
2008). Enzim SOD tersebut akan bekerja sempurna
dengan adanya mineral-mineral seperti tembaga (Cu),
seng (Zn) dan mangan (Mn) yang banyak terdapat pada
kacang-kacangan dan olahannya.
Enzim superoksida dismutase (SOD) diketahui
memiliki kemampuan untuk menghambat autooksidasi
spontan dari epineprin menjadi adenokrom. Larutan
epineprin akan stabil dalam keadaan suasana asam, tetapi
1
spontan akan teroksidasi dengan adanya kenaikan pH.
Autooksidasi terjadi paling cepat disertai dengan
terbentuknya adenokrom dengan kecepatan linier yaitu
pada pH 10,2 dan suhu 30°C. Di dalam tubuh, dengan
adanya penambahan dapar karbonat dalam analisis enzim
superoksida dismutase (SOD) dapat menaikkan pH dan
menyebabkan suasana menjadi basa, sehingga dapat
mempercepat terbentuknya adenokrom.
Selain itu, SOD merupakan enzim yang
mengkatalisis radikal superoksid menjadi hidrogen
peroksida dan oksigen. Radikal superoksid dapat
mengalami dismutasi secara spontan maupun dengan
bantuan SOD membentuk H2O2. Dengan adanya SOD,
kecepatan dismutasi meningkat lebih dari 1000 kali lipat
dibandingkan dismutasi spontan (Miwa dkk, 2008).
Prinsip penentuan aktivitas enzim ini dapat terlihat pada
Gambar 35.
1
pada total plasma. Aktivitas SOD diukur berdasarkan laju
penghambatan reduksi ferisitokrom c oleh anion
superoksida yang dihasilkan oleh xantin/xantin oksidase.
Xantin teroksidasi menjadi asam urat, sedangkan anion
superoksida yang terbentuk selanjutnya mereduksi
ferisitokrom c. Reduksi ferisitokrom c diamati
berdasarkan kenaikan absorbansi pada panjang gelombang
550 nm. Pengukuran aktivitas ini berlangsung pada suhu
25oC, larutan xantin oksidase harus tetap dalam keadaan
dingin sebelum digunakan. Medium reaksi segera
disiapkan sebelum pengukuran dengan memasukkan 2,9
mL larutan A (campuran larutan 0,76 mg xantin dalam 10
mL 0,001 M NaOH, dengan larutan 1,8 mg sitokrom c.
Ditambahkan 100 mL bufer fosfat pH 7,8 tanpa
EDTA) ke dalam tabung reaksi 3 mL. Selanjutnya
ditambahkan 50 uL larutan baku (kontrol) atau sampel dan
divorteks perlahan. Reaksi dimulai dengan menambahkan
50 uL larutan B (xantin oksidase 2,88 mg/mL dalam bufer
fosfat EDTA) dan divorteks perlahan. Diamati perubahan
absorban yang terjadi pada spektrofotometer. Untuk
blanko digunakan buffer fosfat sebagai pengganti sampel
dan sebagai kontrol digunakan akuabides yang proses
ekstraksinya sama dengan proses ekstraksi untuk sampel.
1
bebas di dalam sel sehingga dijadikan sebagai salah satu
petunjuk terjadinya stress oksidatif akibat radikal bebas.
Stres oksidatif menyebabkan kerusakan oksidatif lipid
yang dapat dideteksi dengan peningkatan kadar
malondialdehid (MDA) dalam sel (Nielsen et al. 2003;
Zainuri & Wanandi 2012). Pengukuran kadar
malondialdehid (MDA) menggunakan baku pembanding
raetoksipropane (TEP) dapat menggambarkan aktivitas
radikal bebas di dalam sel. Malondialdehid ini dapat
dijadikan indikator peningkatan peroksida lipid yang
terbentuk akibat radikal bebas (Cochrane, 1991).
Malonaldehida (MDA) telah digunakan secara luas
sebagai indikator kerusakan oksidatif, terutama dari asam
lemak tidak jenuh (Auroma 1997). Malonaldehida
merupakan produk akhir dari peroksidasi lipid terutama
asam lemak tidak jenuh yang dapat dihasilkan melalui
oksidasi oleh radikal bebas. Metode kimia yang digunakan
untuk mengukur MDA berdasarkan reaksi antara MDA
dengan tiobarbiturat (TBA) membentuk kompleks ikatan
TBA-MDA yang menghasilkan warna merah dan
selanjutnya diukur intensitasnya menggunakan
spektrofotometer.
MDA merupakan produk akhir dari peroksidasi
lemak dan indikator keberadaan radikal bebas dalam
tubuh. Asam lemak tidak jenuh akan mengalami
peroksidasi menghasilkan produk MDA. Produk MDA
dapat diukur sebagai indeks tidak langsung kerusakan
1
oksidatif (Auroma 1997). Selain itu, konsentrasi MDA
dalam plasma dapat digunakan sebagai parameter
kerusakan oksidatif dari lemak tidak jenuh pada mencit
yang dipapar paraquat (Aoki, et al., 2002). Wresdiyati dan
Makita (1995), melaporkan bahwa kondisi stres pada kera
Jepang mengakibatkan kelainan pada organel peroksisom
ginjal, baik kelainan morfologi maupun kenaikan jumlah
yang sangat hebat. Sehingga kondisi stress, yang
meningkatkan jumlah peroksisom, dapat juga
meningkatkan konsentrasi radikal bebas atau oksidan sel
yang dihasilkan oleh oksidasi-oksidasi peroksisom
tersebut. Radikal bebas yang dihasilkan kemudian
menyebabkan terjadinya kerusakan oksidatif dan
peroksidasi lemak pada komponen membran sel dan
mengahasilkan produk akhir MDA.
Kadar MDA pada kelompok tikus yang diberi
perlakuan isoflavon lebih tinggi dibandingkan dengan
kelompok kontrol, tetapi masih lebih rendah dibandingkan
dengan kelompok perlakuan stres. Hal ini menunjukkan
bahwa pemberian isoflavon mampu mencegah peroksidasi
lipid oleh radikal bebas sehingga menurunkan
pembentukan MDA hati. Hal tersebut juga terkait dengan
aktivitas enzim SOD dalam hati. Senyawa bioaktif
isofavon memiliki potensi sebagai antioksidan (Nakajima
et al. 2005). Sebagai antioksidan, senyawa isoflavon dapat
mengeliminasi radikal bebas dan mencegah reaksi berantai
lebih lanjut terhadap komponen membran sel sehingga
1
mengurangi pembentukan MDA sebagai produk akhir
(Lee et al., 2004).
Berdasarkan modifikasi prosedur uji dari Winarsi
(2003) dan Hong, et al., (2000) pengujian ini dilakukan
dengan mengambil sebanyak 75 µl plasma atau standar
dimasukkan dalam tabung sentrifus, lalu ditambahkan 75
µl TCA 20% (dalam 0,6 mol/l HCl). Setelah didinginkan
dalam lemari pendingin bersuhu 5–10 °C selama 20 menit,
campuran tersebut disentrifus pada 4000 rpm selama 20
menit. Kemudian, 100 µl supernatannya ditambah 20 µl
pereaksi TBA. Selanjutnya campuran tersebut didihkan
selama 30 menit. Setelah dingin campuran dimasukkan ke
dalam lempeng mikro 96 sumur dan diukur absorbansinya
menggunakan mikroplate reader pada λ 540 nm. Kadar
MDA plasma dihitung berdasarkan kurva standar dari
larutan tetra etoksipropana.
Dasar pemeriksaan adalah reaksi spektrofotometrik
sederhana, dimana satu molekul MDA akan terpecah
menjadi 2 molekul 2-asam thiobarbiturat. Reaksi ini
berjalan pada pH 2-3. TBA akan memberikan warna
pinkchromogen yang dapat diperiksa secara
spektrofotometrik. Tes TBA selain mengukur kadar MDA
yang terbentuk karena proses peroksidasi lipid juga
mengukur produk aldehid lainnya termasuk produk non-
volatil yang terjadi akibat panas yang ditimbulkan pada
saat pengukuran kadar MDA serum yang sebenarnya.
1
Kadar MDA dapat diperiksa baik di plasma, jaringan
maupun urin. Reaksi MDA dengan diukur pada panjang
gelombang antara 530 nm. Larutan 1,1,3,3-
tetrametoksipropana digunakan sebagai larutan standar
MDA karena larutan baku MDA bersifat tidak stabil dan
tidak tersedia. TMP merupakan prekusor dari senyawa
MDA. Apabila larutan TMP tersebut direaksikan dengan
air akan terhidrolisis membentuk senyawa malondialdehid
(MDA). Reaksi hidrolisis TMP menjadi MDA dapat
dilihat pada Gambar 36.
BAB IV
1
talok memiliki aktivitas antioksidan tertinggi (Preethi,
2010).
1
xantofil, dan lain-lain akan tersari pada n-heksan dan
senyawa lebih polar akan masuk pada pelarut etil asetat
(Markham, 1988). Setiap tahapan fraksinasi dihentikan
setelah penyari tidak berwarna sehingga dapat
diasumsikan bahwa semua senyawa mampu tersari
secara maksimal.
1
pada suasana basa tidak terjadi isomerisasi pada
O,Cgikosida (Litvinenko & Markarov, 1969).
1
% Penangkapan radikal DPPH
80 y = 0,2882x - 0,6488
60
R² = 0,9938
40
20
0
0 100 200 300
Konsentrasi ( μg/mL)
1
% Penangkapan radikal DPPH
60
y = 0,7934x - 2,8696
40 R² = 0,9890
20
0
0 20 40 60 80
Konsentrasi ( μg/mL)
1
IC50 (μg/mL)
200
175,75
180
160
140
120 97,88
100
80 66,64
60
40 25,53 20,55
20 2,27
0
A HB1 HB3 HA1 HA3 kuersetin
1
merupakan aglikon flavonoid sub kelas flavonol yang
telah terbukti poten sebagai antioksidan. Hal ini
dikarenakan kuersetin memiliki ikatan rangkap pada
posisi 2, 3 dan bersebelahan gugus 4-okso pada cincin C,
adanya gugus hidroksil posisi 3 dan 4 pada cincin B,
posisi 3 pada cincin C dan posisi 5 pada cincin A (Bors
dkk., 1990).Flavonoid dengan gugus 3-OH strukturnya
bersifat planar (Howard dkk., 1964) sehingga
memungkinkan adanya konjugasi, delokalisasi elektron
dan dapat menaikkan kestabilan radikal fenoksil
flavonoid (Acker dkk., 1996; Bors dkk., 1990).
Aktivitas antioksidan fraksi air buah talok mungkin
berasal dari efek sinergisme antara vitamin C, vitamin E,
senyawa fenolik, karotenoid, terpenoid dan
fitomikronutrien (Podsedek, 2007).Meskipun demikian
aktivitasnya masih kecil karena kandungan vitaminnya
relatif sedikit sedangkan glikosida flavonoid aktivitasnya
tergolong rendah.
Karakterisasi golongan senyawa aktif dan profil
fitokimia buah talok menggunakan sistem KLT. Fase
gerak yang digunakan untuk melihat profil fitokimia
antar fraksi dan ekstrak etanol adalah kloroform :
metanol : asam formiat (44:3,5:2,5). Sedangkan
karakterisasi golongan senyawa aktif menggunakan
toluen : etil asetat : asam formiat (7:2:1).Pemilihan
sistem KLT ini didasarkan pada hasil optimasi
sebelumnya.
1
Terdapat perbedaan profil fitokimia antara ekstrak
etanol, fraksi heksan, fraksi etil asetat, fraksi air ekstrak
etanolik buah talok dan kuersetin sebagai pembanding.
Hasil ini menunjukkan bahwa proses fraksinasi yang
dilakukan cukup baik karena telah mampu memisahkan
senyawa buah talok berdasarkan kepolarannya. Ekstrak
etanol buah talok mengandung berbagai senyawa dengan
perbedaan tingkat kepolaran tetapi terdapat
kecenderungan senyawa pada ekstrak etanol bersifat
semi polar sampai polar. Hal ini ditunjukkan oleh
adanya perbedaan intensitas fluoresensi, bercak dengan
hRf 80 dan 88pada UV366 intensitas fluoresensinya
sangat lemah sedangkan sepanjang elusi hRf 0 sampai
40 fluoresensinya kuat sampai sedang. Semua bercak
pada ekstrak etanol berfluoresensi kuning pada UV366.
Fraksiheksan memiliki 3 bercak yaitu pada hRf 88; 94
dan 98 dilihat di bawah sinar UV366. Bercak fraksi
heksan berwarna kuning dan merah, bercak warna merah
menunjukkan adanya klorofil (Baby dkk., 2013). Heksan
merupakan pelarut non polar dan dapat menyari senyawa
non polar seperti klorofil.
Pada fraksi etil asetat, pemisahan senyawa sudah terlihat
lebih jelas. Bercak pada fraksi etil asetat berwarna
kuning dan coklat gelap pada UV366. Bercak pada fraksi
etil asetat lebih banyak daripada fraksi
heksan.Banyaknya bercak pada fraksi etil asetat
sebanding dengan aktivitas antioksidannya. Hal ini
1
dibuktikan oleh penelitian Kanistri (2012) bahwa fraksi
etil asetat merupakan fraksi dengan aktivitas antioksidan
terpoten dibandingkan fraksi yang lainnya dengan nilai
IC50 sebesar 14,48 μg/mL. Sedangkan fraksi air tidak
muncul bercak setelah dielusi. Hal ini menunjukkan
bahwa fraksi air mengandung senyawa polar sehingga
lebih tertahan pada fase diam. Profil KLT dapat dilihat
pada Gambar 44.
[fase diam silika gel F254 dan fase gerak kloroform : metanol : asam
formiat (44:3,5:2,5); kromatogram dilihat pada sinar tampak (8.1) di
bawah sinar UV254 (8.2) dan di bawah sinar UV366 (8.3)]
1
menunjukkan fraksi air setelah dihidrolisis terelusi dan
timbul bercak dengan hRf lebih besar daripada fraksi air
sebelum dihidrolisis. Senyawa pada fraksi air
terhidrolisis bersifat lebih non polar daripada fraksi air.
Hal ini menunjukkan bahwa fraksi air terhidrolisis
mengandung aglikon flavonoid. Aglikon flavonoid
terbebaskan antara fraksi air terhidrolisis asam dan basa
berbeda terlihat dari perbedaan hRf diantara keduanya.
Aglikon pada fraksi air terhidrolisis asam cenderung
bersifat lebih polar daripada aglikon pada fraksi air
terhidrolisis basa. Kemungkinan aglikon fraksi air
terhidrolisis asam mengandung lebih banyak gugus
hidroksi atau aglikon pada fraksi air terhidrolisis basa
mengandung gugus asil lebih banyak. Hal ini
ditunjukkan dengan hRf pada fraksi air terhidrolisis
asam 1 dan 3 jam lebih kecil daripada fraksi air
terhidrolisis basa 1 dan 3 jam.
Perbedaan aglikon flavonoid terbebaskan antara
hidrolisis asam dan basa mungkin terletak pada kerangka
utama, jumlah gugus hidroksil ataupun posisi gugus
hidroksil. Semakin banyak gugus hidroksil kemungkinan
aktivitas antioksidannya semakin besar tergantung dari
posisinya pada cincin flavonoid. Sedangkan adanya
gugus asil pada struktur flavonoid akan menurunkan
aktivitas antioksidan karena strukturnya semakin sterik
sehingga radikal DPPH akan semakin sulit mendekati
gugus hidroksil flavonoid. Selain itu, metoksilasi
1
mempengaruhi hidrofobisitas dan keplananaran molekul
(Dugas, dkk. 2000).
Gambar 45. Kromatogram fraksi air dan fraksi air terhidrolisis buah talok
[setelah disemprot DPPH dengan fase diam silika gel F254 dan fase
gerak toluen : etil asetat : asam formiat (7:2:1) dilihat pada
sinar tampak]
1
bercak dengan hRf 0, 45, 57 dan 91. Fraksi air dan fraksi
air terhidrolisis basa hanya memiliki 1 bercak pada hRf
0.Plat KLT dengan indikator berfluoresensi, senyawa
akan mereduksi emisi energi dengan mengabsorbsi sinar
UV sehingga akan terlihat meredam pada latar belakang
berfluoresensi (Jork dkk., 1990). Meskipun demikian
tidak semua bercak merupakan senyawa flavonoid
sehingga perlu dideteksi pada UV366 dengan atau tanpa
diuapi amonia dan disemprot AlCl3. Profil KLT dapat
dilihat pada Gambar 46.
Gambar 46. Kromatogram fraksi air sebelum dan sesudah hidrolisis buah talok
[fase diam silika gel F254 dan fase gerak toluen : etil asetat : asam formiat
(7:2:1)kromatogram dilihat pada sinar tampak (10.1) kromatogram
dilihat pada sinar UV254 (10.2)]
1
kuningbiru, fraksi air terhidrolisis asam coklat-kuning
dan fraksi air terhidrolisis basa kuning dengan intensitas
yang berbeda-beda. Karakterisasi golongan senyawa
pada fraksi air dan fraksi air terhidrolisis didapatkan dari
pengamatan perubahan warna kromatogram sebelum dan
setelah diuapi amonia pada UV366. Proses pemberian uap
amonia pada kromatogram umumnya akan
meningkatkan kepekaan deteksi dan menghasilkan
perubahan warna sesuai dengan struktur senyawa
tersebut (Markham, 1988). Hasil KLT menunjukkan
bahwa semyawa yang terdapat pada fraksi air sebelum
dan sesudah dihidrolisis berasal dari golongan flavonoid
terbukti setelah diuapi amonia intensitas warnanya
terlihat lebih jelas dilihat pada UV366. Profil KLT dapat
dilihat pada Gambar 47.
Gambar 47. Kromatogram fraksi air sebelum dan sesudah hidrolisis buah
talok
[fase diam silika gel F254 dan fase gerak toluen : etil asetat : asam formiat
(7:2:1) kromatogram dilihat pada sinar UV366; sebelum diuapi amonia dan
disemprot AlCl3 (11.1) setelah diuapi amonia (11.2) setelah disemprot AlCl3
(11.3)]
1
2 : fraksi air sebelum dihidrolisis
3 : fraksi air terhidrolisis asam 1 jam
4 : fraksi air terhidrolisis asam 3 jam
5 : fraksi air terhidrolisis basa 1 jam
6: fraksi air terhidrolisis basa 3 jam
Kemudian dilakukan pengujian KLT dengan DPPH.
Karakterisasi bercak aktif antioksidan dengan
mengamati warna yang muncul setelah bereaksi dengan
DPPH, senyawa antioksidan akan menghasilkan warna
kuning dengan latar belakang ungu.Aktivitas antioksidan
fraksi air terhirolisis asam 3 jam lebih kecil daripada
fraksi air terhidrolisis asam 1 jam, hal ini diperkuat
dengan hasil KLT. Kromatogram pada fraksi air
terhidrolisis asam 1 dan 3 jam memiliki hRf tidak
terlalu berbeda. Meskipun demikian pada kromatogram
dengan pereaksi semprot DPPH dapat dilihat perbedaan
intensitas warna kuning yang timbul (gambar 44), fraksi
air terhidrolisis asam 1 jam warnanya lebih kuning dan
luas areanya lebih besar daripada yang terhidrolisis 3
jam.
1
fraksi air terhidrolisis asam 1 jam dilihat pada UV254 (14.1) fraksi
air terhidrolisis asam 1 jam sesudah disemprot DPPH dilihat pada
sinar tampak (14.2);
fraksi air terhidrolisis asam 3 jam dilihat pada UV254 (14.3); fraksi
air terhidrolisis asam 3 jam sesudah disemprot DPPH dilihat pada
sinar tampak (14.4)
Sehingga, aktivitas antioksidan fraksi air terhidrolisis asam 1
jam dan 3 jam berturut-turut 9,5 dan 1,5 kali lebih poten dari
fraksi air, sedangkan pada basa 1 jam dan 3 jam sebesar 2,5
Nilai IC50 fraksi air terhidrolisis asam 1 jam dan 3 jam sebesar
1
ekstrak etanolik terpurifikasi batang brotowali. Morfologi
batang brotowali seperti terlihat pada Gambar 49.
1
Teknik fraksinasi merupakan salah satu metode untuk
meningkatkan potensi antioksidan dalam ekstrak yaitu
pengelompokan senyawa berdasarkan kepolarannya.
Pada penelitian terdahulu diketahui bahwa fraksi larut etil
asetat dari ekstrak etanolik batang brotowali memiliki
aktivitas penangkapan radikal DPPH tertinggi
dibandingkan fraksi air, fraksi heksana dan dalam bentuk
ekstraknya (Anonim, 2011).
Flavonoid tergolong senyawa polar karena mempunyai
sejumlah gugus hidroksil atau suatu gula. Flavonoid
umumnya berada dalam bentuk glikosida (Markham,
1988)sehingga flavonoid cenderung lebih larut dalam
pelarut polar-semi polar seperti air dan etanol.
Di dalam ekstrak etanol tidak hanya terkandung
flavonoid, namun juga senyawa golongan lain. Hal ini
dikarenakan etanol merupakan pelarut semi polar
sehingga dapat menarik berbagai macam senyawa. Untuk
memisahkan senyawa-senyawa di dalam sampel
dilakukan tahapan lebih lanjut yaitu dengan fraksinasi.
Fraksinasi memisahkan senyawa berdasarkan tingkat
kepolaran. Senyawa-senyawa akan tertarik ke
masingmasing penyari berdasarkan sifat kepolarannya
yaitu non polar, semi polar, dan polar.
Ekstrak etanolik batang brotowali awalnya difraksinasi
dengan n-heksan. Fraksinasi ini dilakukan dengan
metode padat-cair. Normal heksan menarik senyawa
dengan kepolaran rendah seperti lipid, terpen, klorofil,
1
xantofil, dan lain-lain (Markham, 1988). Selanjutnya fase
tak larut n-heksan difraksinasi dengan etil asetat. Etil
asetat menyari senyawa yang lebih polar. Fraksinasi
dengan n-heksan dan etil asetat dilakukan berulang
hingga didapat fase n-heksan dan etil asetat yang jernih
dan tidak berwarna. Filtrat sari n-heksan dan etil asetat
diuapkan dengan dibiarkan di udara terbuka tanpa
pemanasan hingga diperoleh ekstrak kental.
Fraksi n-heksan batang brotowali pada penelitian ini
berwarna hijau muda dan kental berair. Sementara fraksi
etil asetat dan fraksi air berwarna coklat kental.
Setelah dilakukan fraksinasi dengan mendapat rendemen
etanol 96% adalah 10,33% b/b sedangkan rendemen
fraksi n−heksana, etil asetat dan air berturut−turut
15,45% b/b; 18,11% b/b dan 19,09% b/b. hal tersebut
menunjukkan bahwa senyawa dalam batang brotowali
cenderung polar. Kemudian dilakukan KLT penapisan
dan menunjukkan profil dimana fraksi heksana tersari
senyawa bersifat non polar seperti klorofil, resin dan
kemungkinan beberapa senyawa turunan fenol. Profil
kromatogram dapat dilihat pada Gambar 50.
1
Gambar 50. Kromatogram pemisahan senyawa ekstrak batang brotowali
[fase diam silica gel F254 fase gerak toluene: etil asetat: asam format
(4:6:1 v/v/v)) diamati di bawah sinar UV 254 nm (kiri) dan sinar UV 366
nm (kanan). Keterangan (a) ekstrak etanolik (b) fraksi heksan (c) fraksi
etil asetat (d) fraksi air]
1
rutin disubsitusi oleh gula rutinose dengan ikatan
Oglikosidik.
Kemampuan senyawa menangkap radikal umumnya
diekspresikan dengan parameter konsentrasi efisiensi
(EC50) atau konsentrasi penghambatan (IC50) . Nilai IC50
merupakan nilai konsentrasi senyawa antioksidan yang
mampu mereduksi 50% dari konsentrasi awal radikal
DPPH (Litescu dkk., 2010). Digunakan uji DPPH karena
sederhana dan dapat dilakukan dengan cepat, serta
instrumen dan bahan mudah tersedia. DPPH mudah
rusak oleh cahaya sehingga uji ini dilakukan di ruang
gelap.
Semua fraksi diukur aktivitasnya pada 5 konsentrasi
bertingkat dengan perlakuan yang sama yaitu pada
panjang gelombang 514,5 nm dan operating time 45
menit. Sebagai pembanding digunakan
kuersetin.Kuersetin merupakan flavonoid dengan
aktivitas antioksidan poten karena memiliki 3 macam
gugus dalam strukturnya, yaitu separuh katekol pada
cincin B, ikatan rangkap pada posisi 2,3 konjugasi dengan
gugus karbonil pada cincin C, dan adanya gugus hidroksi
pada posisi 3 dan 5 (Gulcin, 2012). Adanya gugus
hidroksil pada posisi 5′ di cincin B meningkatkan potensi
antioksidan secara signifikan (Gulcin, 2012). Nilai IC50
dari ekstrak etanolik, fraksi heksana, fraksi etil asetat dan
fraksi air berturut turut adalah 132,27+5,7 ; 398,80+89,80
; 51,97+10,97 dan 354,99+34,10 µg/mL.
1
Aktivitas penangkapan radikal DPPH oleh ekstrak
etanolik batang brotowali, fraksi air dan heksan lebih
rendah dibandingkan fraksi etil asetat. Hal tersebut dapat
disebabkan masih adanya zat pengotor sehingga
interaksi antar senyawa masih dominan.
Fraksi etil asetat mengandung golongan senyawa
flavonoid dan kumarin dengan pendeteksi berupa
penyemprotan AlCl3. Setelah disemprot dengan pereaksi
AlCl3, senyawa flavonoid akan berpendar kuning di UV
366 nm karena senyawa flavonoid jika bereaksi dengan
AlCl3 menimbulkan fluoresensi. Dari perbandingan pola
profil kromatogam, bercak flavonoid dan kumarin
berwarna kuning pada latar belakang ungu setelah
disemprot DPPH. Sedangkan bercak aglikon kumarin
dan alkaloid tidak menunjukkan aktivitaas penangkapan
radikal. Aglikon kumarin terdapat dalam ekstrak
etanolik batang brotowali kemungkinan memiliki
aktivitas penangkapan radikal, sedangkan alkaloid yang
terdeteksi bukan merupakan N−cis feruloyltyramine atau
N−trans feruloyltyramine.
1
jelas dibanding bercak dengan hRf sama pada fraksi air
terhidrolisis 1 jam (nomor 5) dan 3 jam (nomor 6), hal
ini menandakan pada fraksi air mengandung jenis
senyawa polar dan mengalami perubahan selama proses
hidrolisis.
[fase diam silika gel F254 dan fase gerak kloroform:metanol:asam format
(44:3,5:2,5 v/v)sebelum disemprot diamati pada sinar tampak]
1
Gambar 52 menunjukkan kromatogram pada
pengamatan di bawah sinar UV366. Kuersetin terlihat
berpendar dengan warna kuning kecoklatan pada hRf 22,
sementara pada semua fraksi batang brotowali nampak
bercak-bercak pada hRf 5, 15, 22, 25, 29, 35, 38, 49, 65,
80, dan 93 dengan kesamaan warna namun intensitas
berbeda. Perbedaan warna ini disebabkan oleh struktur
senyawa yang berbeda, sementara perbedaan intensitas
dikarenakan perbedaan konsentrasi senyawa dalam
masing-masing fraksi. Harborne (1987) menyatakan
bahwa kesempurnaan pemisahan suatu hasil fraksinasi
jarang dicapai dan hanya berbeda dalam intensitas
senyawa.Perbedaan hRf dikarenakan perbedaan tingkat
kepolaran. Semakin besar hRf menandakan senyawa
tersebut semakin kurang polar, karena sistem KLT ini
menggunakan fase gerak non polar dan fase diam polar.
Pada fraksi air (nomor 4) pada titik awal penotolan (hRf
0) terlihat bercak yang tidak nampak pada fraksi air
terhidrolisis 1 jam (nomor 5) dan 3 jam (nomor 6), hal
ini menandakan pada fraksi air mengandung jenis
senyawa polar yaitu glikosida flavonoid dan mengalami
perubahan selama proses hidrolisis.
1
Gambar 52. Kromatogram ekstrak etanolik batang brotowali dan
fraksinya
[fase diam silika gel F254 dan fase gerak kloroform:metanol:asam format
(44:3,5:2,5 v/v)sebelum disemprot diamati pada sinar UV254 dan UV366]
Keterangan
1: pembanding kuersetin, 2: Ekstrak etanolik, 3: fraksi etil
asetat, 4: fraksi air, 5: fraksi air terhidrolisis 1 jam, 6: fraksi air
terhidrolisis 3 jam
1
Gambar 53. Profil kromatogram ekstrak batang brotowali setelah
disemprot pereaksi DPPH
Keterangan:
K: pembanding kuersetin, E: Ekstrak etanolik, EA: fraksi etil asetat, A:
fraksi air, A1: fraksi air terhidrolisis 1 jam, A3: fraksi air terhidrolisis 3
jam
Adapun golongan senyawa dengan aktivitas
penangkapan radikal dalam fraksi etanol batang
brotowali dan fraksi terpurifikasinya adalah flavonoid
dan kumarin. Fraksi air terhidrolisis 3 jam batang
brotowali memiliki aktivitas penangkapan radikal paling
besar yaitu dengan IC50 18,26 µg/mL. Kemudian diikuti
dengan fraksi etil asetat sebesar 30,05µg/mL, fraksi air
terhidrolisis 1 jam sebesar 31,12 µg/mL, fraksi air
sebesar 33,75 µg/mL, dan ekstrak etanolik sebesar 52,29
µg/mL. Hidrolisis selama 3 jam pada fraksi air ekstrak
etanolik batang brotowali mampu meningkatkan
aktivitas penangkapan radikal DPPH dibandingkan
fraksi airnya.
1
4.3. Aktivitas Penangkapan Radikal DPPH Ekstrak
Etanolik Daun Mengkudu (Morinda citrifolia L.) ,
Fraksi Air dan Fraksi Air Terhidrolisis
Daun Mengkudu berpotensi sebagai antioksidan alami.
Beberapa ekstrak non air daun mengkudu mempunyai
nilai IC50 sebesar 0,20−0,35 mg/mL (Thani, et al., 2010).
Fraksinasi dapat meningkatkan aktivitas antioksidan.
Fraksinasi yang dimaksud jika dengan fraksinasi air.
Penelitian terdahulu menyebutkan bahwa fraksi air lebih
tinggi aktivitas antioksidannya dibanding fraksi heksana
dan etil asetat. Fraksi tidak larut etil asetat (fraksi air)
mengandung banyak glikosida flavonoid dengan aktivitas
penangkapan radikal DPPH. Morfologi daun mengkudu
ditunjukkan pada Gambar 54.
1
dibandingkan ekstrak kasar. Diawali dengan ekstraksi
heksana dengan tujuan memisahkan senyawa polar dan
non polar seperti klorofil. Kromatogram ekstrak etanolik
dapat dilihat pada Gambar 55. Kromatogram ini
menunjukkan bahwa proses fraksinasi mampu
memisahkan senyawa berdasarkan kelarutan relative
solven.
1
masing−masing fraksi dilakukan KLT dan profil
kromatogramnya dapat dilihat pada Gambar 56.
1
Gambar 57. Profil kromatogram ekstrak daun mengkudu dengan
penyemprotan DPPH
1
Gambar 58. Perbandingan aktivitas penangkapan radikal oleh ekstrak
daun mengkudu
1
fenolik pada tanaman dapat beraksi sebagai antioksidan
sehingga mampu menunda kerusakan oksidatif tubuh
manusia (Kahkonen, et al., 1999). Menurut Javanmardi
et al. (2002) menyatakan bahwa senyawa fenolik dapat
mengadsorpsi radikal bebas, meredam oksigen single dan
mendekomposisi peroksida. Buah mahkota dewa
mengandung flavonoid dan polifenol yang memiliki sifat
antioksidan sehingga diharapkan ekstrak air buah
mahkota dewa dapat menghambat fotodegradasi tirosin
dan digunakan sebagai fotoprotektor. Gambar 59
menujukkan morfologi buah mahkota dewa.
1
dewa pada kadar 0,15% b/v dapat menginhibisi
fotodegradasi tirosin 0,05% b/v terinduksi ketoprofen.
Tabel 10. Pengaruh ekstrak air buah mahkota dewa dibandingkan
dengan vitamin C terhadap fotodegradasi tirosin
1
buah kecombrang yaitu flavonoid, terpenoid, saponin dan
tanin (Lachumy, et al., 2010). Morfologi bunga
kecombrang dapat dilihat pada Gambar 60.
1
Gambar 61. Morfologi buah talok
1
Gambar 62. Kromatogram fraksi etil asetat dari ekstrak etanolik bunga
kecombrang
1
DAFTAR PUSTAKA
BAB I
1
Herawati dan Syafsir, A., 2006, Kinerja BHT sebagai Antioksidan
Minyak Sawit pada Perlindungan terhadap Oksidasi Oksigen
Singlet, Akta Kimindo, 2(1): 1-8.
Kikuzaki, H., Hisamoto, M., Hirose,K.,Akiyama, K., and
Taniguchi, H, 2002, Antioxidant Properties of Ferulic
Acid and Its Related Compounds. Food Chem, 50 (7):
2161-2168.
Kumar, E.K., Ramesh, A. and Kasiviswanath, R., 2005,
Hypoglicemic and Antihyperglicemic Effect of Gmelina
asiatica Linn. In normal and in alloxan Induced Diabetic
Rats, Andhra Pradesh, India.
Lampe, J.W., 1999, Health Effect of Vegetables and Fruit
Assesing Mechanism Of Action In Human Experimental
Studies, The American Journal Of Clinical Nutrition, 70
Suppl: 475 S- 490 S.
Langseth, L., 1995, Oxidant, Antioxidant, and Desease
Prevention, International Life Science Institute press,
Belgium.
Lestariana, W., 2003, Peran Antioksidan pada Proses Penuaan,
Berkala Neurosains, 5, 1-5.
Liedias, F. and Hansberg, W., 2000, Catalase Modification as a
Marker for Singlet Oxygen Methods Enzymol, Academic
Press,New York.
Meydani, S.N., Wu, D., Santos, M.S. and Hayek, M.G., 1995,
Antioxidants and Immune Response in Aged Persons
Overview of Present Evidence, American Journal of
Clinical Nutrition, 62, 1462 -1476.
Min D.B., and Boff J.M., 2002, Lipid Oxidation of Edible Oil,
Marcel Dekker. Inc., New York.
Mohammed Y.Q., Hamad M. W., and Mohammed K. E., 2009,
Spectrophotometric Determination of Total Vitamin C in
Some Fruits and Vegetables at koya Area – Kurdistan
Region/ Iraq, Journal of Kirkuk University.
1
Muchtadi, D., 2013, Antioksidan dan Kiat Sehat di Usia
Produktif, Alfabeta, Bandung.
Pangkahila, W., 2007, Anti-Angin Medicine : Memperlambat
Penuaan, Meningkatkan Kualitas Hidup, Jakarta, PT,
Kompas Media Nusantara Wijaya, A., 1996, Radikal
Bebas dan Parameter Status Antioksidan, Forum
Diagnosticum, I, 1-4.
Raharjo, S., 2006, Kerusakan Oksidatif Pada Makanan, Gadjah
Mada University Press. Yogyakarta.
Reynertson, K. A., 2007, Phytochemical Analysis of Bioactive
Constituens from Edible Myrtaceae Fruit, Dissertation,
The City University of New York, New York.
Rice-Evans, C.A., N.J. Miller, G. and Paganga., 1997,
Antioxsidant Properties of Phenolic Compounds. J. Trends
in Plant Science, Vol 2 No. 4.
Rohman, A., 2006, Pelacak Antioksidan Serta Penentuan
Kandungan Fenolik dan Flavonoid Total Buah Mengkudu
(Morinda citrifolia L.), Tesis, Fakultas Farmasi
Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Sies, H. & Stahl, W., 1995, Vitamins E and C, a-carotene, and
other carotenoids as antioxidants, American Journal
Clinical Nutrition 62 (supp), 1315S- 21S.
Siswono, M., 2005. Jagung. http :// www.food science.org,
diakses 24 Desember 2009.
Soleas, G. J., Linda, G. P., Josephy, D., Goldberg, D. M., and
Diamandis, E. P., 2002, Clin. Biochem. 35,119-24.
Wijaya, A., 1996, Radikal bebas dan parameter status antioksidan,
Forum diagnosticum. Prodia diagnostics educational
services, No. 1. 1-11.
Winarsi,H., 2007, Antioksidan Alami dan Radikal Bebas,
Kanisius,Yogyakarta.
1
Wolf, G., 2008, Role of Fatty Acids In the Development of Insulin
Resistance and Type 2 Diabetes Mellitus, Nutrition Reviews,
66, 10: 597–600.
Wolf, G., 2002, The effect of β-carotene on lung and skin
carcinogenesis, Carcinogenesis 23: 1263-1265.
1
BAB II
Ariani, S.R.D. dan Hastuti, W., 2009, Analisis Isoflavon dan Uji
Aktivitas Antioksidan Pada Tempe dengan Variasi Lama
Waktu Fermentasi dan Metode Ekstraksi. Prosiding
Kimia Organik, Bahan Alam, dan Biokimia, FKIP UNS
Surakarta.
Arora, A., Byrem, T.M., Nair, M.G. & Strasburg, G.M., 2000,
Modulation of Liposomal Membrane
Fluidity by Flavonoids and Isoflavonoids,Arch.
Biochem.
Biophys.,373, 102-109.
1
Genestein and Deidzein and their ß−Glicoside Conjugates
anti-Tumor Isoflavones in Soybeans Foods from American and
asian Diets, J. Agric.Food. Chem.41: 1961-1967.
Das, N.P. & Pereira, T.A., 1990, Effects of Flavonoids on
Thermal Autoxidation of Palm Oil: Structure Activity
Relationships,J. Am. Oil Chem. Soc.,67, 255-258.
Dyer, L., 2016, Antioxidants Inside and Out, Some Amazing
Benefits,
http://mindpowerglobal.com.au/antioxidantsinside-and-
outsome-amazing-benefits/, diakses 12 Juli 2017
Evans, W.J. 2000. Vitamin E, Vitamin C, and Exercise. American
Journal of Clinical Nutrition. (72): 647S-652S
Fennema, O. R. 1996. Principles of Food Science. Marcel
Dekker, Inc.New York- Brussel-Hongkong.
Francis, F.J., 2000. Anthocyanins and Betalains: Composition and
Application. Cereal Foods World 45 (5): 208-213.
Giacco F, Brownlee M. Oxidative Stress and Diabetic
Complications. Circ Res [serial online]. 2010 [disitasi
tanggal 29 July 2013];107:1058-70.
Gordon, M.H. 2001. Measuring Antioxidant Activity. Dalam: Jan
Pokorny, Nedyalka, Yanishlieva-Malarova, and Michael
Gordon (ed.). Antioxidant in Food Practical Application.
Woodhead Publishing Ltd. London.
Halliwell, B. & Whiteman, M. (2004) Measuring reactive species
and oxidative damage in vivo and in cell culture: how
should you do it and what do the results mean; Br J
Pharmacol, 142,55-231
Hamid A.A., Aiyelaagbe O.O., Usman L. A., Ameen O. M.,
Lawal A., 2010, “Antioxidants: Its medicinal and
pharmacological applications”, African Journal of Pure
and Applied Chemistry Vol. 4(8), pp. 142-151, Nigeria
Han SS, Lo SC, Choi YW, Kim JH, Beck SH. Antioxidant
activity of crude extract and pure compounds of
1
Acerginnala max. Bull. Ko-rean. Chem Soc. 2004; 25(3):
389-391
Han, K.H., et al., 2006, Anthocyanin-Rich Purple Potato Flake
Extract Has Antioxidant Capacity and
Improves
Antioxidant Potential in Rats, British Journal of Nutrition
(6), 1125–1133 DOI: 10.1017/BJN20061928.
Harborne, J.B. & Williams, C.A., 2000, Advances in Flavonoid
Research Since 1992,Phytochemistry, 55, 481-504.
Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia. Penerbit ITB. Bandung.
Hattenschwiller, S dan Vitousek, P. M. 2000. The role of
polyphenols interrestrial ecosystem nutrient cycling.
Review PII: S0169-5347(00)01861-9 TREE vol. 15, no. 6
June 2000.
Hurrell, F. R. dan Reddy, M. B. 2003. Degdration of phytic acid
in cereal porridges improves iron absorption by human
subjects. The American J. Of Clinical Nutrition. 77(5):
1213-1219.
Karyadi, 1997, Antioksidan: Resep Awet Muda dan Umur
Panjang (Online),
(http://www.kmpas.com/kompascetak/fokus.htm , diakses
17 Maret 2006)
Koswara, S., 2006, Isoflavon SenyawaMulti-Manfaat Dalam
Kedelai, Ebook Pangan, Bogor.
Kumalaningsih, S. dan Suprayogi, 2006. Tamarillo (Terung
Belanda). Trubus Agrisarana, Surabaya.
Kuncahyo, I., Sunardi. (2007).Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak
Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi, L.) terhadap
1,1diphenyl-2-picrylhidrazyl (DPPH). Seminar Nasional
Teknologi 2007. Hal. 1-9.
Lam LK, Pai RP. Wattenberg, LW. Synthesis and chemical
carcinogen inhibitory activity of 2-tert-
butyl-4hydroxyanisole. J Med Chem. 1979; 22 (5): 569–71.
1
Lamid, A., 1995, Vitamin E Sebagai Antioksidan, Media
Litbangkes (5):1.
Leong L.P., and Shui. 2002. An investigation of antioxidant
capacity of fruits in Singapore markets, Food Chemistry.
102:732-737.
Madhavi DL, Deshpande SS, Salunkhe DK. Butylated
hydroxyanisole (BHA; tert-butyl-4-hydroxyanisole) and
butylated hydroxytoluene (BHT; 2,6-di-tert-butyl-pcresol)
in food anti-oxidants: Technological,
Toxicological, and health perspectives.1996.
Madhavi, DL, Deshpande SS, Salunkhe DK. Food antioxidants:
technologycal: toxi-cological and health perspectives.
1996. New York. Marcel Dekker.
Markakis, P., 1982. Anthocyanins as Food Additives. Di dalam P.
Markakis (ed). Anthocyanins as Food Colors. Academic
Press, New York
Markham, K.R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid,
diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 15, Penerbit
ITB, Bandung.
Muchtadi, Deddy. 2013. Antioksidan dan Kiat Sehat di Usia
Produktif. Alfabeta.Bandung
Niwa Y. 1997. Radikal Bebas Mengundang Kematian. Tokyo:
NTV. Hal.30-42
Pawiroharsono, S., 2001, Prospek dan Manfaat Isoflavon untuk
Kesehatan, Direktorat Teknologi Bioindustri, Badan
Pengkajian dan Penerapan Teknologi.
Prakash, A., 2001, Antioxidant Activity, Medallion
LaboratoriesAnalytical Progress, 19(2): 2.
Sadikin, M. 2001. Pelacakan Dampak Radikal Bebas terhadap
Makromolekul. Kumpulan Makalah Pelatihan:Radikal
Bebas dan Antioksidan dalam Kesehatan. Fakultas
Kedokteran UI. Jakarta
1
Sen, S., Chakraborty, R., Sridhar, C., Reddy, Y.S.R., and Pe, B.,
2010, Free Radical Antioxidants, Disease and
Phytomedicines: Current Status and Future Prospect,
International Journal of Pharmaceutical Sciences Review
and Research. 21(3): 91-100.
Setiati S. Radikal bebas, antioksidan, dan proses menua. Tinjauan
Pustaka. Medika 2003; 6:366-9.
Shihabi A, Li WG, Miller Jr FG, Weintraub NL. Antioxidant
therapy for atherosclerotic vascular disease: the promise
and the pitfalls. Am J Physiol Heart Circ Physiol [serial
online]. 2002 [disitasi bulan Maret 2009]; 282 (3):
797802.
Sidik. 1997. Antioksidan Alami Asal Tumbuhan. Seminar
Nasional Tumbuhan Obat Indonesia XII 26 s/d 27 Juni
1997
Sies, H. & Stahl, W., 1995, Vitamins E and C, a-carotene, and
other carotenoids as antioxidants, American Journal
Clinical Nutrition 62 (supp), 1315S-21S.
Tournaire, C., Croux, S., Maurette, M.T., Beck, I., Hocquaux, M.,
Braun, A.M., & Oliveros, E., 1993, Antioxidant Activity
of Flavonoids: Efficiency of Singlet Oxygen (1Δg)
Quenching,J. Photochem. Photobiol., 19, 205-215.
Winarsi, Hery. 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas.
Kanisius.Yogyakarta.
Winarti, Sri. 2010. Makanan Fungsional. Yogyakarta: Graha
Ilmu
Zheng W, Wang SY. Antioxidant activity and phenolic compounds
in selected herbs. J. Agric. Food Chem. 2001; 49(11):
5165–5170.
1
BAB III
1
tissues:fluorescencemicroscopy image analysis, Histochm J,
28:63-71.
Auroma, O.I., 1997, Assessment of potential prooxidant and
antioxidant actions. American oil chemists society,73:1717-
1625.
Badarinath, A.V., Rao, K.M., Chetty, C.M.S., Ramkanth, S.,
Rajan, T.V.S., and Gnanaprakash, K., 2010, A Review on
In-vitro Antioxidant Methods: Comparisions, Correlations
and Considerations, International Journal of PharmTech
Research, 2 (2) : 1276-1285.
Bank, G., and Lenoble, R., 2002, Oxygen Radical Absorbency
Capacity, Standardizing the Way We Look at Antioxidants,
J. Nutraceutical World, 42-45.
Behera BC, Verna N, Sonone A., Makhija U., 2006,
Determination of Antioxidative Potential of Usnea
ghattensis L. In Vitro, LWT-Food Sci Tech., 36: 80-5
Blois, 2003, Comparison of Antioxidant Activities of Isoflavones
from Kudzu Root, JFS, 68(6):1.
Blois, MS., 1958, Antioxidant Determination by The Use of A
Stable Free Radical, Nature 181, 1199-1299, cit: Hanani,
E., Mun’im, A., Sekarini, R., 2005, Identifikasi Senyawa
Antioksidan Dalam Spons Callyspongia sp. Dari Kepulauan
Seribu, Majalah Ilmu Kefarmasian, vol. II, No.3, 127-133
Borgstahl GE, Parge HE, Hickey MJ, Johnson MJ, Boissinot M,
Hallewell RA, Lepock JR, Cabelli DE, and Tainer JA,
1996, Human mitochondrial manganese superoxide
1
dismutase polymorphic variant Ile58Thr reduces activity by
destabilizing the tetrameric interface, Biochemistry 35
(14): 4287–97.
Cemelli, E., Baumgartner, A., and Anderson, D, 2009,
Antioxidant and The Commet Assay, Mutation Research,
681:51-67.
Chang W. C., S.C. Kim., S.S. Hwang., B.K. Choi., H.J. Ahn.,
M.Y. Lee., S.H. Park., and S.K. Kim., 2002. Antioxidant
activity and free radical scavenging capacity between
Korean medicinal plants and flavonoids by assay-guided
comparison. Plant Science. 163: 1161-1168
Cochrane, G. C., 1991, Cellular injury by oxydant, Am.J.Med.
Day, B.J., 2009, Catalase and Glutathione Peroxidase Mimics,
Biochemical Pharmacology, 77:285-296.
Dobashi K, Asayama K,KatoK, Kobayashi M, and Kawaoi A.,
1989, Immuo-histochemical localization and quantitative
analysis of superoxide dismutase in rattissue, Acta
Histochem Cytochem, 22:351-365.
Endrini S, Marsiati H, Suherman J, Fauziah O, dan Asmah R.,
2009, Aktivitas antioksidan dan efek sitotoksik ekstrak kola
(Cola nitida) pada kulter sel kanker hati (HepG-2). Jurnal
Kedokteran Yarsi, 17(1):43.
Fridovich, I.,1975, Superoxide dismutases, Ann Rev Biochem,
44:147-159.
Fuhram, B. & Aviram, M., 2002, Polyphenols and Flavonoids
Protect LDL Against Atherogenic Modifications, dalam
1
Cadenas, E., Packer, L., (Eds.), Handbook of Antioxidants,
Marcel Dekker Inc., New York.
Garcez, M, Bordin D, Peres W, and Salvador M., 2004, Free
Radicals and Reactive Species. In: Ulbra, editor. Free
Radicals and The Cellular Response To The Oxidative
Stress, Canoas: Porto Alegre,13 – 34.
Garcez, ME, Peres W, and Salvador M., 2005, Oxidative stress
and hematologic and biochemical pa-rameters in individual
with Down syndrome, Mayo Clin Proc., 80(12): 1607-11.
Gurav, S., N. Deskhar., V. Gulkari., N. Durangkar., dan A. Patil.,
2007, Free Radical Scavengeng Activity of Polygala
chinensis Linn, Pharmacology online. 2:245-253.
Halliwell, B. and Guttridge, J.M.C., 1989, Free radicals
inbiology and medicine, Clarendon Press Oxford. London.
Helrich, K., 1990, AOCS Official Methods of Analysis 1st Ed.,
AOAC, Arlingyton.
Hong, Y.L., Yeh, S.l., Chang, C.Y., and Hu, M.L., 2000, Total
plasma malonaldehyde level in 16 Taiwanese College
Studens determined by various thiobarbituric acid test and
improved high performance liquid chromatography based
method, Clinical Biochemistry, 33: 619-625.
Keller, G.A.,Warner TG, Steimer KS, and Halliwell, RA., 1991,
Cu, Zn-superoxide dismutase is a peroxi-somal enzymein
humanfibroblasts and hepatomacells, ProNatl Acad Sci
USA, 88:7381-7385.
Koleva, I.I., van Beek, T.A., Linssen, J.P.H., de Groot, A.,and
Evstatieva, L.N., 2001, Screening of plant extracts for
1
antioxidant activity: a comparative study on three testing
methods, J. Phytochem. Anal., 13, 2001, 8-17.=
Kosem, N., Han, Y. H., dan Moongkarndi, P., 2007, Antioxidant
and Cytoprotective Activities of Methanolic Extract from
Garcinia mangostana Hulls., J. Science Asia, 33: 283-92.
Kumar, V., Abbas, A.K., Fausto, N., Aster, J.C., and Hauth, J,C.,
2008, Robbins and Cotran Pathologic Basic of Disease.
Eight edition, J. Cellular Adaptations Cell Injury, and Cell
Death, 1:16-18.
Lah, MS., Dixon, M.M., Pattridge, K.A., Stallings, W.C.,
Fee, J.A., and Ludwig, M.L. 1995, Structure–function in
Escherichia coli iron superoxide dismutase: comparisons
with the manganese enzyme from Thermus
thermophilus, Biochemistry, 34:1646–1660.
Lah, MS., Dixon, M.M., Pattridge, K.A., Stallings, W.C., Fee,
J.A., Ludwig, M.L. ,1995 Structure–function in Escherichia
coli iron superoxide dismutase: comparisons with the
manganese enzyme from Thermus thermophilus, J.
Biochemistry 34:1646–1660.
Lee, J., Renita M, Fioritto RJ, ST.Martin SK, Schwartz SJ,
Vodovotz Y., 2004, Isoflavone characterization and
antioxidant activity of Ohio soybeans, J. Agric FoodChem,
52:2647-1651.
Liu YW, Shang HF, Wang CK, Hsu FL, HOu WC., 2007,
Immunomodulatory activity of dioscorin, the Sorage
Protein of yam (Dioscorea alata cv.Tainong no.1) tuber,
Journal of Food and Chem Toxico, 45:2312-2318.
1
Marklund, S.L., 1984, Extracellular superoxidedismutase and
other superoxidedismutase isoenzymesin tissues from nine
mammalian species, Biochem J., 222:649-655.
Mates JM, Gomez CP, and Castro, I.N., 1999,
Antioxidantenzymes and human diseases, Clin Biochem,
32(8):595-603.
McDonald, M.S., Hughes, M., Burns, J., Lean, M.E.J., Matthews,
D. & Crozier, A., 1998, Survey of The Free and
Conjugated Myricetin and Quercetin Content of Red
Wines of Different Geographical Origins, J. Agric. Food
Chem., 46, 368-375.
Miwa, S., Muller, F.L., and Beckman, K.B., 2008, The Basics of
Oxidative Biochemistry, Oxidative Stress in Aging From
Model Systems to Human Diseases. Humana Press,
Singapore
Molyneux, P., 2004, The Use Of The Stable Free Radical
Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) For Estimating
Antioxidant Activity,J. Sci. Technol., 26 (2) : 211-219.
Nakajima, N., Nozki N, Ishihara K., 2005, Analysis isoflavone
content in tempeh, a fermented soybean and preparation of
a new isoflavone-enriched tempeh, J. Bioscience
Bioengineering, 100:685-687.
Nielsen, S. S., 2003, Food Analysis 3rd edition. Kluwer
Academic/Plenum Publisher, New York.
Pavani, B.Ch., Kumar S.V., Ramarao J., Rau B.R., dan Mohanty
S., 2012, Role of Biochemical Marker for Evaluation of Oxidative
Stress in Cataract, Int Jharm Bio Sci, 2(2): 178184.
1
Poitout, V. and Robertson, R.P., 2008, Glucotoxicity: fuel excess
and beta cell dysfunction, Endocrine Reviews, 29(3):
351366.
Pokorny, J., Yanishlieva, N., and Gordon, M., 2001, Antioxidant
in Food, Practical Aplications, Wood Publishing Limited,
Cambridge, England.
Prakash., A.,(2001), Antioxidant Activity, Heart of Giant
Recource Vol 19, No.2
Prieto P, M Pineda and M Aguilar, 1999, Spectrophotometric
quantitation of antioxidant capacity through the formation
of a phosphomolybdenum complex : specific application to
the determination of vitamin E, J. Analytical Biochemistry,
269 (2), 337–341.
Prior RL, Wu X,and Schaich K., 2005, Standarized method for
the determination of antioxidant capacity and phenolics in
foods and dietary supplements, Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 53:4290-4302.
Rahman, I. and Macnee, W., 2000, Regulation of redox
glutathione levels and gene transcription in lung
inflammation: therapeutic approaches, Free Radic Biol
Med., 1;28(9):1405-20.
Reynertson, K. A., 2007, Phytochemical Analysis of Bioactive
Constituens from Edible Myrtaceae Fruit, Dissertation, The
City University of New York, New York.
Sabattier S., Amiot M.J., Tacchini M., Aubert S.,
1992, Identification of Flavonoids in Sunflower Honey, J.
Food Sci., 57,773 – 777.
1
Shivaprasad, H.N., Mohan, S., and Karya, M.D., 2005, In vitro
Models for Antioxidant Activity Evaluation, A Review,
www.pharmainfo.net, diakses 13 Juli 2017.
Stalikas, C.D., 2007, Extraction, Separation, and Detection
Methods for Phenolic Acids and Flavonoids, J. Sep. Sci.,
30, 3268-3295.
Sun, H.N., Mu, T.H., Xi, L.S., Zhang, M., and Chen, J.W., 2014,
Sweet Potato (Ipomoea batatas L.) Leaves as Nutritional
and Functional Foods, J. FoodChem., 156, 380–389.
Sun, Y., Oberley, L.W., and Li, Y., 1988, A Simple Method
For Clinical Assay of Superoxide Dismutase, Clinical
Chemistry, Vol 34 (3): 497 – 500.
Toppo, S., Flohe, L., Ursini, F., Vanin, S., and Maiorino, M.,
2009, Catalytic Mechanism and Spesificities Of Glutathione
Peroxidases : Variation of A Basic Scheme, Biochimica et
Bioplysica Acta, 1790:1486-1500.
Ulbert, F., and Roubicek, D., 1993, Evaluation of a Static
Headspace Gas Chromatographic Method for
Determination of Lipid Peroxides, J. Food Chem., 46: 137
−141.
Utami, W., Da’i, M., Sofiana, Y.R., 2005, Uji Aktifitas
Penangkap Radikal dengan Metode DPPH serta Penetapan
Kandungan Fenol dan Flavonoid dalam Ekstrak Etanol,
Etil Asetat dan Kloroform Daun Dewandaru (Eugenia
uniflora L.), J. Pharmacon, 6(1), 5-9.
Winarsi, H., 2003, Respon imunitas dan hormonal wanita
premenopause terhadap minuman susu fungsional yang
1
disuplementasi dengan isoflavon kedelai dan difortifikasi
dengan seng, Desertasi, Program Pascasarjana, Institut
Pertanian Bogor, Bogor.
Winarsi, H., 2007, Antioksidan Alami dan Radikal Bebas, Potensi
dan Aplikasinya dalam Kesehatan, Kansus, Jakarta.
Windono, T., Soediman, S., Yudawati, U., Ermawati, E., Srielita,
A., dan Erowati, T. L., 2001, Uji Peredam Radikal Bebas
Terhadap 1,1- Diphenyl-2-Picrylhydrazil (DPPH) dari
Ekstrak Kulit Buah dan Biji Anggur ( Vitisvinifera L. )
Probolinggo Biru dan Bali, J.Artocarpus, Vol.1, No.1.
Wood, R., Ronnenberg A.G., Iron, In, Shils M.E., Shike M., Ross
A.C.,Caballero B., and Cousins R.J., 2006, Modern
Nutrition in Health and Disease, Lippincott William and
Wilkins, New York.
Wresdiyati T, Makita T., 1997, Immunocyto-chemical
localization of Cu, Zn-SOD (Cooper,zinc-
superoxidedismutase) in the renal tubules and glomerulus
of rat kidney, J. Mol Biol of Cell8:342.
Wresdiyati T, Mamba K, Adnyane IKM, dan Aisyah US., 2002,
The effect of stress condition on the intracellular
antioxidantcopper, zinc-superoxide dismutase in the rat
kidney: an immunohistochemical study, J.Hayati 9: 85-88.
Wresdiyati, T, Lelana RPA, Adnyane IKM dan Noor K., 2003,
Immunohistoche-mical study of superoxide dismutase
(SOD) in the liver of diabetic experiment Macaca
fascicularis , J. Hayati10:61-65.
1
Wresdiyati, T., Astawan, M.dan Hastanti, L.Y., 2006, Profil
imunohistokimia anti-oksidan superoksida dismutase
(SOD) pada jaringan hati tikus di bawah kondisi
hiperkolesterolemia, Hayati (in press), Bandung.
Wresdiyati, T., Makita T. ,1995, Remarkable increase of
peroxisomes in the renal tubule cells of Japanese monkeys
under fasting stress, J. Pathophysiology, 2:177-182.
Young, I.S. and Woodside, J.V. , 2001, Antioxidants in health
and disease, Journal of Clinical Pathology, 54:176-186.
Zainuri, M., dan Septelia, I.W., 2012, Aktivitas Spesifik
Manganese Superoxide Dismutase (Mnsod) Dan Katalase
Pada Hati Tikus Yang Diinduksi Hipoksia Sistemik:
Hubungannya Dengan Kerusakan Oksidatif, Jurnal Media
Penelitian dan Pengembangan Kesehatan LIPI,
Vol.22;No.2.
Zakaria, F.R., Nurrahman, Prangdimurti, E., & Tejasari, 2003,
Antioxidant and immunoenhancement activities of ginger
(Zingeber offcinale Roscoe) extracts and compounds in
vitro and in vivo mouse and human system, J.
Nutraceuticals and Food, 8 (1);96-104.
Zakaria, R.F, Septiana, A.T., and Sulistiyani., 2001, Ginger
(Zingiber officinale Roescoe) extracts increase human LDL
resistance to oxidation and prevent cholesterol accumul
ation in macrophage, Abstract presented at the Second Intl
Symp on Natural Antioxidant: Molecular Mechanism and
Health Affects, Beijing, China.
1
1
BAB IV
Acker, S.A.B.E. Van, Groot, M.J. De, Berg, D.J. van den, Tromp,
M.N.J.L., Kelder, G.D.O den, Vijgh, W.J.F. van der, Bast,
A., 1996, A Quantum Chemical Explanation of the
Antioxidant Activity of Flavonoid, Chem. Res. Toxicol., 9,
1305-1312.
Bors, W., Heller, W., Michel, C., Saran, M., 1990, Flanonoid as
Antioxidants: Determination of Radical Scavenging
Efficiencies, Methd. Enzym., 186, 343-355.
Cao, G., Sofic, E., Prior, R.L., 1997, Antioxidant and Prooxidant
Behavior of Flavonoids: Structure-Activity Relationships,
Free Rad. Biol. Med., 22, 749-760.
Dai J., Mumper, R.J., 2010, Plant Phenolics: Extraction, Analysis
and Their Antioxidant and Anticancer Properties., Mol., 15,
7313-7352.
Dugas Jr., A.J., Castaneda-Acosta, J., Bonin, G.C., Price, K.L.,
Fischer, N.H., Winston, G.W., 2000, Evaluation of The
Total Peroxyl Radical-Scavenging Capacity of Flavonoids:
Structure-Activity Relationship, J. Nat. Products., 63,
327331.
Haleagrahara, N., Jackie, T., Chakravarthi, S., Rao, M., and
Kulur, A., 2010, Protective Effect of Etlingera elatior
(Torch ginger) Extract on Lead Acetate induced
Hepatotoxicity in Rats, Food Chem. Toxicology, 35 (5):
663−671.
Harbone, J.B., 1987, Metode Fitokimia: Penemuan Cara Modern
Menganalisis Tumbuhan, diterjemahkan oleh Kosasih
Padmawinata dan Iwan Soediro, Cetakan IV, 6-14, 76-77,
Penerbit ITB, Bandung.
Howard, J.J., Taylor, P.J.A., Ingold, K.U., 1964, Inhibited
Autoxidation of Styrene. IV. Solvent Effects, Can. J.
Chem., 42, 1044-1056.
Irianti, T., Puspitasari, A., dan Suryani, E., 2011, Aktivitas
Penangkapan Radikal 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil oleh
Ekstrak Etanolik Batang Brotowali (Tinospora crispa (L.)
miers) dan Fraksi- fraksinya, Majalah Obat Tradisional, 16,
3: 138–144.
1
Irianti, T., 2008, Perbandingan Inhibisi Ekstrak Air Buah
Mahkota Dewa (Phaleria macrocrpa) Dan Vitamin C
Terhadap Fotodegradasi Tirosin, Jurnal Berkala Ilmiah
Biologi, Volume 7-Nomor 2 : 75-81.
Irianti T., Puspasari A., dan Choironi NA., 2013, Aktivitas
Penangkapan Radikal 2,2-Difenil- pikrilhidrazil (DPPH)
Oleh Ekstrak etanolik daun Mengkudu (Morinda citrifolia
L.), Fraksi air dan fraksi air terhidrolisis, Jurnal Bahan
Alam Indonesia, Vol. 8 (5): 302-309.
Jackie, T., Haleagrahara, N., and Chakravarthi, S., 2011,
Antioxidant Effects of Etlingera elatior Flower Extract
Against Lead Acetate Induced Perturbations in Free
Radical Scavenging Enzymes and Lipid Peroxidation in
Rats, BMC Research Notes, 4:67.
Javanmardi et al. (2002), Antioxidant Activity and Total Phenolic
Content of Iranian ocimum accessions, Food Chemistry, 83,
547 – 550.
Jork, H., Funk, W., Fischer, W., Wimmer, H.,1990, Thin-Layer
Chromatography: Reagents and Detection Methods,
Volume 1a, VCH Publishing, Germany.
Kahkonen MP, Hopia AL, Vourela HJ, Rauha JP, Pihlajak,
Kujala TS. Heinonen M. 1999. Antioxidant Activity of
Extract Containing Phenolic Compounds. J Agric Food
Chem. (47): 3954-62
Kanistri, D.N. 2012. Penangkapan Radikal 2,2-Difenil-
1Pikrilhidrazil (DPPH) oleh Ekstrak Etanolik Buah Talok
(Muntingia calabura L.) dan Fraksinya. Skripsi, Fakultas
Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Kolar, F. R., Kamble, V. S., Dixit, G. B., 2011, Phytochemical
Constituents and Antioxidant Potential of Some Underused
Fruits, African J.Pharm.Pharmacol., 5(18), 2067-2072.
Lachumy, S.J.T., Sasidharan, S., Sumathy, V., and Zuraini, Z.,
2010, Pharmacological Activity, Phytochemical Analysis
and Toxicity of Methanol Extract of Etlingera elatior
(Torch ginger) Flowers, Asian Pacific Journal of Tropical
Medicine, 3(10): 769−774.
Litvinenko, V.L., Makarov, V.A., 1969, The Alkaline Hydrolysis
of Flavonoid Glycosides, Khim. Prorodn. Soedin., 5(5),
366-369.
1
Lusiana, 2006, Formulasi Tablet Effervesen Ekstrak Buah
Mahkota Dewa, Tesis, ITB, Bandung.
Markham, K.R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid,
diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB,
Bandung.
Nollet, L.M.L., Toldra, F., 2012, Handbook of Analysis of Active
Compounds in Functional Foods, CRC Press Taylor &
Francis Group, FL.
Pannala, A.S., Chan, T.S., O’Brien, P.J., Rice-Evans, C.A., 2001,
Flavonoid B-Ring Chemistry and Antioxidant Activity: Fast
Reaction Kinetics, Biochem. Biophys. Res. Commun, 282,
1161-1168.
Plazonic, A., Bucar, F., Males, Z., Mornar, A., Nigovic, B., &
Kujundzic, N. 2009, Identification and Quantification of
Flavonoids and Phenolic Acids in Burr Parsley (Caucalis
platycarpos L.), Using High-Performance Liquid
Chromatography with Diode Array Detection and
Electrospray Ionization Mass Spectrometry, Mol., 14(7),
2466–2490.
Podsedek, A., 2007, Natural Antioxidants and Antioxidant
Activity of Brassica Vegetables : A Review, LWT-Food
Sci. Technol., 40, 1-11.
Preethi, K., Premasudha, P., Keerthana, K., 2012,
AntiInflammatory Activity of Muntingia calabura Fruits,
Phcog. J., 4(30), 51-56.
Preethi, K., Vijayalakshmi, N., Shamna, R., Sasikumar, J.M.,
2010, In Vitro Antioxidant Activity of Extracts from Fruits
of Muntingia calabura Linn. From India, Phcog. J., 2 (14),
11-18.
Sani, I. M., Iqbal, S., Chan, K. W., Ismail, M., 2012, Effect of
Acid and Base Catalyzed Hydrolysis on the Yield of
Phenolics and Antioxidant Activity of Extracts from
Germinated Brown Rice (GBR), Mol., 17, 7584-7594.
1
BIODATA PENULIS
1
Terhadap Aktivitas Penangkapan Radikal 2-2’ Difenil-1-Pikril
Hidrazil (DPPH) Ekstrak Etanolik Buah Talok (Muntingia
calabura L.) (2016) dan Penangkapan Radikal 2-2’ Difenil-
1Pikril Hidrazil (DPPH) Ekstrak Etanolik Daun Mengkudu
(Morinda citrifolia L.), dan Batang Brotowali (Tinospora crispa,
L), Fraksi Air serta Fraksi Air Terhidrolisis (2015).
Buku-bukunya yang telah diterbitkan antara lain: 1) Anti
Tuberkulosis (Grafika Indah, 2016); 2) Logam Berat dan
Kesehatan (Grafika Indah, 2017) serta 3)
Toksikologi Lingkungan (Grafika Indah, 2017).
1
Dr. Ir. Sindu Nuranto, M. Eng. lahir di Kebumen pada
tanggal 13 Juli 1962. Saat ini penulis menjabat sebagai dosen
dalam bidang Teknik Sipil di Sekolah Vokasi Universitas Gadjah
Mada. Pendidikan S1 beliau dari Teknik Sipil bidang Hidor.
Selanjutnya penulis melanjutkan pendidikan S2 di Pasca Sarjana
UGM Fakultas Teknik yakni Teknik Sipil Hidor dan pendidikan
S3 di Ilmu Lingkungan Fakultas Geografi UGM.
Selain aktif mengajar di program Diploma Teknik Sipil
UGM, beliau pada tahun 2017 diangkat menjadi Kaprodi D3
Teknik Sipil. Beliau pernah mengikuti Seminar Nasional
”Sinergisitas Pedidikan Vokasi dan Industri” yang
diselenggarakan oleh UGM dan aktif dalam kegiatan ilmiah di
bidang sipil dan lingkungan. Beliau juga aktif dalam penelitian
mengenai lingkungan di antaranya berjudul “Model Pertukaran
Ion Untuk Perbaikan Mutu Air dengan Menggunakan Pasir dari
Daerah Muara Sungai Opak, Kabupaten Bantul, DIY” pada tahun
2011 dan “Desain Sistem Pengelolaan Limbah Cair Wisma MM
UGM” pada tahun 2008 sebagai kepala projek yang dijalankan
oleh UGM.
Pengalaman pengabdian kepada masyarakat beliau tidak
kalah banyak dengan pengalaman penelitiannya di antaranya pada
tahun 2011 beliau mengikuti program “Perbaikan Sarana
Penyediaan Air Bersih di Dusun Ngepring, Purwobinangun,
Pakem, Sleman, DIY. Kemudian pada tahun 2012 mengadakan
program Pengadaan Mesin Pencacah Sampah dan Pembuatan
Sarana Penyediaan Air Bersih di Dusun Kemput, Candi
Binangun, Pakem, Sleman, DIY. Selain itu, beliau juga sudah
menerbitkan sebuah buku bersama istrinya, Dr. rer.nat. Tanti T.
152
BIODATA PENULIS
153
Prof. Drs. Sugiyanto, PhD., Apt. saat ini penulis menjabat
sebagai dosen di bagian Farmakologi dan Farmasi Klinik di
Fakultas Farmasi UGM. Pendidikan S1 beliau dari Fakultas
Farmasi Universitas Gadjah Mada. Selanjutnya penulis
melanjutkan pendidikan S2 di Biokimia Medis Fakultas
Kedokteran Univeristas Gadjah Mada dan Doktor di University
of Sydney, Australia.
Selain aktif menjadi dosen di Fakultas Farmasi UGM
sejak 1979 hingga sekarang, beliau juga pernah menjabat sebagai
dekan di Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan pada tahun
1996-1999 dan menjadi rektor di Fakultas Farmasi Universitas
Ahmad Dahlan pada tahun 1999-2007.
Penulis juga tidak kalah aktif dalam keikutsertaan
berorganisasi dan asosiasi. Beliau pernah bergabung dalam
Asosiasi Perguruan Tinggi Swasta Indonesia (APTISI) Wilayah
V DIY pada tahun 2003, Ikatan Sarjana Farmasi Indonesia pada
tahun 1979, Ikatan Ahli Farmakologi Indonesia (IKAFI) pada
tahun 1980, Himpunan Kimia Indonesia (HKI) pada tahun 1980,
Perhimpunan Biokimia Indonesia (PERHIBI sekarang PBBMI)
pada tahun 1979- 1981, dan Perhimpunan Biokimia dan Biologi
Molekuler Indonesia (PBBMI) pada tahun 1994.
Prestasi penulis juga terlihat pada pencapaian Hak Paten
beliau yaitu : US 6,777,4, Derivatives of benzylidene
cyclohexanone, benzylidene cyclopentanone, and benzylidene
154
BIODATA PENULIS
155
Prof. Dr. H. M. Kuswandi, Apt., SU., M.Phil, lahir di
Purwokerto pada tanggal 8 Februari 1951. Saat ini penulis
menjabat sebagai guru besar dalam bidang Kimia Medisinal di
Fakultas Farmasi UGM. Pendidikan S1 dan S2 diambil di
Farmasi UGM dalam bidang kimia Medisinal. Kemudian penulis
mengambil studi S2 kembali di Leicester University, Inggris dan
mendalami bidang genetika. Setelah itu, studi S3 dilanjutkan di
Aston University, Inggris dengan mendalami bidang biologi
molekuler.
Penulis memiliki pengalaman mengajar pada beberapa
program studi dan beberapa tempat. Di Fakultas Farmasi UGM,
penulis mengajar bidang kimia medisinal, radiofarmasi, rekayasa
genetika, dan biologi molekuler. Selain itu, penulis juga menjadi
pengajar di UAD, USB, UMP, UMS, UMY, UNSOED, dan
STIKES Siti Khodijah Palembang. Penulis juga pernah menjabat
sebagai Dekan Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah
Surakarta, Direktur LPOM-MUI Surakarta, Kaprodi Farmasi
Universitas Muhammadiyah Yogyakarta, dan sampai saat ini
menjabat sebagai Anggota Senat Fakultas Farmasi UGM.
Di samping mengajar, penulis juga aktif melakukan
penelitian diantaranya, Analisis sekuen seluruh DNA dari gen
salah satu mutan K. Pneumoniae yang resisten terhadap BRL
41897A (mutan KSL 19), Uji aktivitas antiviral ekstrak
kloroform rimpang temu mangga (Curcuma mangga Val) dan
ekstrak etanol daun cangkring (Erythrina fusca Laur) terhadap
infeksi TMV dan profil KLT-nya, Kloning gen dari mutan-mutan
K. Pneumoniae yang resisten terhadap BRL 41897A (mutan
156
BIODATA PENULIS
157