PAPER KROMATOGRAFI LANJUT

Dosen Pengampu : Dr. Riesta Primaharinastiti, S.Si., M.Si., Apt.

Identifikasi Profil Ginsenosida pada Akar, Batang, Daun

dan Bunga dari Panax ginseng dengan menggunakan
UPLC-QTOF/MS

Oleh

Rokhmatul Ummah
NIM 051824153008

PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2019

1
 DAFTAR ISI

Halaman Sampul ......................................................................................... 1

Daftar Isi ..................................................................................................... 2
Pendahuluan ............................................................................................. 3
Bahan dan Metode ................................................................................... 4
Hasil dan Pembahasan ............................................................................... 5
Kesimpulan ................................................................................................ 12
Daftar Pustaka ........................................................................................... 12

2
PENDAHULUAN
Panax ginseng merupakan salah satu jenis tanaman herbal yang sering
digunakan oleh industri herbal dan makanan. Bagian tanaman ini yang sering
digunakan adalah akarnya. Akar P. ginseng mengandung senyawa-senyawa
diantaranya ginsenosida, peptide, asam lemak, minyak atsiri, dan lain-lain.
Senyawa ginsenosida diketahui memiliki berbagai efek farmakologi, seperti
meningkatkan kekebalan tubuh, sebagai anti tumor maupun anti diabetes. Lebih
dari 150 ginsenosida yang telah diisolasi dan diidentifikasi dari tanaman P.
ginseng. Kandungan ginsenosida dapat berbeda-beda tergantung pada bagian
tanaman P. ginseng. Oleh karena itu, diperlukan pembuatan profil berbagai
ginsenosida dari berbagai bagian tanaman P. ginseng yang berbeda.
Penentuan profil dari berbagai ginsenosida ekstrak tanaman P. ginseng
memerlukan sebuah metode analisis yang sensitif. Alat yang biasa digunakan
untuk penentuan profil dari berbagai ginsenosida adalah Liquid Chromatography
(LC) dengan ionisasi elektrospray/spektrometri massa (ESI/MS). Dalam MS,
Quadrupole Time Of Flight (QTOF) merupakan detektor sensitif yang digunakan
untuk mengukur nilai massa yang tepat dari suatu senyawa target dan non target.
Sistem Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) efektif untuk
menganalisis berbagai senyawa dalam campuran kompleks karena sistem ini
menyediakan pemisahan resolusi tinggi dengan menggunakan kolom ukuran
partikel kecil. Berdasarkan latar belakang tersebut, maka identifikasi ginsenosida
dari akar, batang, daun dan bunga tanaman P. ginseng dilakukan dengan
menggunakan UPLC-QTOF/MS.

3
BAHAN DAN METODE

Bahan yang digunakan adalah Panax ginseng, metanol HPLC (MeOH),

air, dan ACN, dan asam format HPLC. Standar ginsenoside yang digunakan
dalam penelitian ini diisolasi dan dimurnikan dari akar P. ginseng dan ginseng
merah oleh serangkaian prosedur kromatografi, dan telah diperoleh 30
ginsenosida dalam penelitian sebelumnya (Lee dkk, 2017). Selain itu, struktur
ginsenosida lain ditentukan berdasarkan data spektroskopi 1H-NMR dan 13
C-
NMR, yaitu : fKa, nR4, nR2-R, Rh1-R, Ra3, M-Rb1, M-Rc, M-Rb2, M-Rd, CO,
GyL, GyLI, nFt1, Rg3-R, Mc, dan CY. Terdapat beberapa ginsenosida yang dibeli
seperti Rf, Rk1, Ro, Rg2-R, PPD, PPT, Rk3, Rh4, GyXVII, XLIX, Rk2 dan GyA.
Ekstraksi ginsenosida dilakukan dengan cara akar, batang, daun dan buah
P. ginseng dikeringkan pada suhu 40°C dalam oven pengeringan selama 48 jam
setelah dicuci, kemudian ditimbang. Setiap sampel ditumbuk (<0,5 mm)
menggunakan mixer dan dicampur secara merata, dan subsampel dihomogenisasi
lebih lanjut menggunakan mixer Retsch MM400 untuk analisis. Serbuk halus
ditimbang (200 mg), kemudian disuspensikan kedalam 2 mL 70% (v/v) metanol,
dan diekstraksi secara ultrasonik selama 30 menit pada 50°C. Setiap sampel
disentrifugasi pada 13.500 rpm selama 5 menit. Setelah itu disaring melalui
syringe filter (0,22 μm) dan diinjeksikan langsung ke sistem UPLC.
UPLC dilakukan menggunakan Waters ACQUITY H-Class UPLC dengan
kolom ACQUITY BEH C18 (2,1 mm × 100 mm; 1,7 μm). Oven kolom
dipertahankan pada 40°C, dan fase gerak termasuk pelarut A [air dan 0,1% asam
format (v/v)] dan pelarut B [asetonitril dan 0,1% asam format (v/v)]. Gradien elusi
meliputi 0-0,5 menit, B 15%; 0,5–1 mnt, B 15-20%; 1–6 mnt, B 20%; 6–13 menit,
B 20–30%; 13–23 mnt, B 30-35%; 23-24 menit, B 35-38%; 24–27 mnt, B 38–
60%; 27–31 menit, B 60–90%; 31–32 mnt, B 90–15%; dan 32–35 menit, B 15%.
Laju aliran adalah 450 μL/menit, dan volume injeksi adalah 2 μL untuk setiap
putaran.
Analisis MS dilakukan menggunakan MS QTOF Waters Xevo G2-S yang
beroperasi dalam mode ion negatif. Spektrometer massa melakukan pemindaian
bergantian energi tinggi dan rendah, yang dikenal sebagai mode akuisisi MSE.
Parameter : tegangan kerucut 40 V; kapiler 3,0 kV; suhu sumber 120°C; suhu

4
desolvasi 550°C; aliran gas kerucut 30 L/jam; dan aliran gas desolvasi pada 800
L/jam.

HASIL DAN PEMBAHASAN

1. UPLC-QTOF/MS dengan In-House Library untuk Profil Ginsenosida

Untuk karakterisasi terperinci dari P. ginseng, menilai kadar ginsenosida
tinggi dan rendah sangat penting. Dalam penelitian sebelumnya, UPLC-
QTOF/MS digunakan untuk menganalisis 30 ginsenosida. Dalam penelitian ini,
untuk profil komprehensif berbagai ginsenosida, 58 standar ginsenosida
digunakan untuk mengoptimalkan kondisi UPLC-QTOF/MS. Dengan
menggunakan sistem UPLC dengan kolom ACQUITY BEH C18, standar-standar
ini dipisahkan dengan baik setelah 30 menit pada laju aliran 450 μL/mnt.
Kromatogram intensitas puncak pangkal (BPI) dari 58 ginsenosida ditunjukkan
pada Gambar 1. Di antara ginsenosides ini, 16 pasangan isomer yang dipisahkan
dengan baik ditemukan: C36H60O7 (Rk2 or Rh3), C36H60O8 (Rk3, Rh4, fKa, or
Rh6), C36H62O8 (Rh2 or CK), C36H62O9 (Rh1, Rh1-R, or F1), C 41H70O12 (Mc or
CY), C41H70O13 (nR2, F5, nR2-R, or F3), C 42H70O12 (Rg4, F4, Rk1, or Rg5),
C42H72O13 (Rg2, Rg2-R, F2, Rg3, or Rg3-R), C42H72O14 (Rg1, pF11, Rf, GyL, or
GyLI), C47H80O17 (nFe, CO, or nFt1), C 48H82O18 (Re, Rd, or GyXVII), C 48H82O19
(gRf or vR4), C53H90O22 (Rc, Rb2, or Rb3), C 56H92O25 (M-Rc or M-Rb2),
C58H98O26 (Ra1 or Ra2), and C59H100O27 (nR4 or Ra3).
Meskipun beberapa puncak saling tumpang tindih, mengidentifikasi
masing-masing puncak adalah mungkin, berdasarkan nilai massa tepat yang
diperoleh oleh QTOF/MS. Dalam mode ion negatif, ginsenosida dideteksi sebagai
ion [M + COOH] - dan [M - H] - dengan akurasi massa tinggi (<2,5 ppm). Untuk
identifikasi yang tepat dari ginsenosida, peneliti menggunakan in-house library
dengan perangkat lunak UNIFI. Informasi tentang nama senyawa, rumus molekul,
waktu retensi (RT), dan akurasi massa terdaftar di perpustakaan untuk 58
ginsenosida (Tabel 1). Selanjutnya, studi validasi dilakukan untuk membuktikan
kinerja metode UPLC-QTOF/MS untuk profiling ginsenosida. Untuk ini, kurva
standar dari 58 ginsenosida dibuat, dan rentang linearitas dan korelasi (R2)
dihitung. R2 dari masing-masing analisis ginsenosida, minimal di atas 0,9908,

5
membuktikan keandalan yang tinggi dari analisis kuantitatif ginsenosida. LOD
juga menunjukkan sensitivitas tinggi metode ini untuk mendeteksi ginsenosida.
Sebagai contoh, dalam kasus Ra3, Ro, M-Rb2, Rd, GyL, GyLI, Rg3, Mc, dan Cy,
dua pikogram (pg) dari senyawa-senyawa ini dideteksi oleh UPLC-QTOF/MS.

Gambar 1. Kromatogram intensitas puncak pangkal (BPI) dari 58 standar

ginsenosida. Puncak (1) - (58) sejajar dengan 58 ginsenosida yang tercantum
dalam Tabel 1.

Tabel 1. In-house library untuk analisis 58 ginsenosida menggunakan Ultra

Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time Of Flight/Mass
Spectrometry (UPLC-QTOF/MS).

6
2. Profiling Berbagai Ginsenosida dari Akar, Batang, Daun, dan Buah dari
Panax ginseng
Jumlah sampel individu yaitu akar ginseng (GR) (n = 10), batang dan daun
(GS) (n = 10), dan buah (GB) (n = 10). Untuk mengekstraksi berbagai ginsenosida
dari masing-masing sampel, digunakan metanol 70% (v/v). Ekstrak dianalisis
menggunakan UPLC-QTOF/MS; setiap bagian data kemudian diproses
menggunakan perangkat lunak UNIFI. Gambar 2 menunjukkan kromatogram BPI
representatif dari ekstrak ginsenosida baik pada GR (akar ginseng), GS (batang
dan daun ginseng), dan GB (buah ginseng). UPLC mampu memisahkan
ginsenosida dan metabolit lainnya dalam 30 menit. Intensitas beberapa puncak
berbeda tergantung pada sampel. Sebagai contoh, secara keseluruhan, sampel GR
memiliki puncak intensitas yang lebih rendah dibandingkan dengan sampel

7
lainnya. Sampel GS memiliki puncak intensitas yang lebih tinggi daripada sampel
GB, dielusi selama 5-10 menit dan 18-26 menit. Namun, sampel GB memiliki
puncak intensitas yang lebih tinggi daripada sampel GS, dielusi selama 5-10
menit. Ini menunjukkan bahwa GR, GS, dan GB memiliki komposisi metabolit
yang berbeda, termasuk ginsenosida.

Gambar 2. Kromatogram BPI ekstrak ginsenoside dari tiga sampel (A) akar
ginseng (GR), (B) batang dan daun (GS), dan (C) buah (GB).

8
Gambar 3. (A) score plot analisis komponen utama (PCA) dan (B) loading plot
ekstrak ginsenosida dari akar ginseng (GR) (n = 10), batang dan daun (GS) (n =
10), dan buah ( GB) (n = 10). Dalam loading plot PCA, setiap titik diidentifikasi
sebagai berikut : ginsenoside (a) Ro (b) Rb1, (c) M-Rb1, (d) M-Rc, (e) M-Rb2, (f)
M-Rd , (g) Re, (h) F3, (i) tidak diketahui, dan (j) Rd.

Pertama, semua data yang diproses diekspor ke perangkat lunak EZinfo

untuk analisis komponen utama (PCA). PCA membantu memvisualisasikan tren
pengelompokan umum di antara masing-masing sampel, dan penyebaran poin
menunjukkan persamaan atau perbedaan antara data metabolit sampel. Dalam plot
skor, GR, GS, dan GB dibedakan dengan baik (Gambar 3A). Selain itu, dalam
loading plot, kami mengidentifikasi variabel utama yang membedakan tiga
kelompok dalam plot skor. Setiap titik mewakili pasangan molekul m/z-RT.
Berdasarkan in-house library, sembilan variabel plot pemuatan diidentifikasi
sebagai beberapa ginsenosides (Gambar 3B). Selanjutnya, dalam pemrosesan
data, terdapat 39 ginsenosida yang teridentifikasi dari tiga sampel. Menggunakan
in-house library, jumlah ginsenosida yang diidentifikasi dari tiga sampel adalah
sebagai berikut: 27 dalam GR, 32 dalam GS, dan 29 dalam GB. Dataset
ginsenosida kemudian menjadi sasaran hierarchical clustering anal (HCA).
Akibatnya, ketiga kelompok itu jelas dibedakan. Tingkat 39 ginsenosida yang
berbeda dalam akar ginseng, batang, daun, dan buah dijelaskan pada Gambar 4.

9
Gambar 4. Analisis pengelompokan hierarki dari 39 dataset ginsenosida dari akar
ginseng (GR) (n = 10), batang dan daun (GS) (n = 10), dan buah (GB) (n = 10).

3. Kuantifikasi Ginsenosida dari Akar, Batang dan Daun, dan Buah dari
Panax ginseng
Kurva standar masing-masing ginsenosida diaplikasikan untuk
menentukan jumlah aktualnya dalam sampel ginseng. Kuantifikasi didasarkan
pada 10 analisis replikasi biologis dari masing-masing sampel ginseng (n = 10),
dan jumlahnya digambarkan sebagai rata-rata ± SD pada Tabel 2. Ini
menampilkan konten ginsenosida kualitatif dan kuantitatif di bagian P. ginseng
yang berbeda. Sebelumnya, Wang et al. telah melaporkan kuantifikasi berbasis
HPLC-UV dari 12 ginsenosides dari akar ginseng, rootlet, daun, dan buah. Dari
lima bagian seperti akar, rambut akar, rimpang, batang, dan daun, Shi et al.
dikuantifikasi tujuh ginsenosida oleh HPLC-UV, dan Qu et al. diukur 12
ginsenosida oleh HPLC-ELSD.
Berdasarkan hasil penelitian, ginsenosida seperti nR4, Ra2, Ra3, dan Ra1,
secara unik ditemukan di GR. Selain itu, GS secara unik mengandung Rb3, Mc,

10
CY, Rh2, dan Rh1-R. F1 dan Rg4 hanya terdeteksi dalam GB. Meskipun sebagian
besar ginsenosida unik memiliki kelimpahan rendah, profil mereka berharga untuk
mengkarakterisasi kandungan ginsenosida dari setiap bagian ginseng. Dalam
kuantifikasi, GR memiliki jumlah tertinggi Rf, Rb1, dan Ro, dibandingkan dengan
sampel lain. GS memiliki jumlah tertinggi Rg1, vR4, F5, Rh1, F3, Rc, Rb2, Rd,
CO, F2, Rg3, CK, dan Rk1. GB memiliki jumlah gRf, nR1, Re, nR2, Rg2, Rg2-R,
M-Rb1, M-Rb, M-Rb2, M-Rd, F4, dan Rg5 tertinggi. Pada penelitian sebelumnya,
telah dilaporkan bahwa GR memiliki jumlah Rb1 tertinggi, GB memiliki jumlah
Rg2 tertinggi, dan GS memiliki jumlah tertinggi Rg1, Rh1, Rd, dan Rg3.
Menariknya, hasil tersebut cocok dengan hasil penelitian ini. Rb3 dan Rh1-R juga
sama-sama dianalisis dari GS. Kuantifikasi beberapa ginsenosida dapat berbeda
tergantung pada kultivar ginseng dan kondisi pertumbuhan.
Setiap ginsenosida memiliki aktivitas spesifik, dan kemanjuran GR, GS,
dan GB ditentukan oleh kandungan ginsenoside. Di sini, peneliti fokus pada
aktivitas farmakologis dari ginsenosides yang sebagian besar atau uniknya
terdapat di setiap bagian ginseng. Tiga ginsenosida (Rf, Rb1, Ro) yang terdapat
dalam GR menunjukkan efek anti-inflamasi dan kapasitas proliferasi limfosit.
Selain itu, 10 ginsenosida (Rg1, Rc, Rb2, Rd, F2, Rg3, CK, Rb3, Rh2, Rh1-R)
yang terdapat dalam GS menunjukkan enam aktivitas (anti-kanker, anti-diabetes,
anti-peradangan, kapasitas proliferasi limfosit, imunomodulasi, dan efek
kemopreventif). Terakhir, empat ginsenosida (Re, Rg2, Rg2-R, F1) yang terdapat
dalam GB menunjukkan empat aktivitas (anti-kanker, anti-diabetes, anti-
inflamasi, dan kapasitas proliferasi limfosit). Hasil ini menunjukkan bahwa tidak
hanya GR, tetapi juga GS dan GB adalah sumber yang baik untuk mendapatkan
ginsenosida yang memiliki aktivitas farmakologis. Dengan rincian profil berbagai
ginsenosida, maka dapat diketahui khasiat dari akar, batang, daun, dan buah
ginseng (P. ginseng).

11
Tabel 2. Kuantifikasi 39 ginsenosida dari akar, batang dan daun, dan beri P.
ginseng. Nilai dinyatakan sebagai mg/g.

KESIMPULAN

Hasil menunjukkan bahwa tidak hanya akar ginseng, tetapi juga batang,
daun, dan buah ginseng adalah sumber yang baik untuk ginsenosida. Setiap
ginsenosida memiliki aktivitas yang spesifik. Dengan demikian, berdasarkan
profil dan kuantifikasi ginsenosida, dapat dilihat efek farmakologis dari bagian-
bagian ginseng yang berbeda. Selain itu, kandungan ginsenosida berbeda-beda,
tergantung pada kultivar ginseng, tahun pertumbuhan, daerah yang tumbuh, dll.

DAFTAR PUSTAKA

Lee, J.W., Ji, S.-H., Lee, Y.-S., Choi, D.J., Choi, B.-R., Kim, G.-S., Baek, N.-I.,
Lee, D.Y. 2017. Mass Spectrometry Based Profiling and Imaging of
Various Ginsenosides from Panax ginseng Roots at Different Ages. Int. J.
Mol. Sci. Vol. 18: 1114.
Lee, J. W., Choi, B.R., Kim, Y. C., Choi, D. J., Lee, Y. S., Kim, G. S., Baek, N.
I., Kim, S. Y., Lee, D. Y. 2017. Comprehensive Profiling and
Quantification of Ginsenosides in the Root, Stem, Leaf, and Berry of
Panax ginseng by UPLC-QTOF/M. Molecules. Vol. 22: 2147.
Xie, G., Plumb, R., Su, M., Xu, Z., Zhao, A., Qiu, M., Long, X., Liu, Z., Jial, W.
2008. Ultra-Performance LC/TOFMS Analysis of Medicinal Panax Herbs
for Metabolomic Research. J. Sep. Sci. Vol. 31: 1015-1026.

12