Terpenoid diisolasi dari lumut hati Cina Lepidozia reptans

dan aktivitas anti-inflamasinya

Disusun untuk memenuhi tugas mata kuliah praktikum Kimia Organik Bahan
Alam

Disusun oleh:

1. Ihsan Fauzi N. (1918366)

2. Nabila Amelia Amir (1918433)
3. Nirmala Novian Agustin (1918433)

PROGRAM STUDI ANALISIS KIMIA

POLITEKNIK AKA BOGOR

2021
 KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur penulis panjatkan atas kehadirat Allah SWT
yang telah memberikan rahmat dan karunia-Nya kepada penulis. Sehingga
dalam penyusunan tugas yang berjudul “Terpenoid diisolasi dari lumut hati
China Lepidozia reptans dan aktivitas anti-inflamasi” ini dapat diselesaikan
dengan baik. Tugas ini disusun untuk memenuhi tugas mata kuliah praktikum
kimia organic bahan alam.

Tim penulis menyadari bahwa laporan presentasi ini tidak dapat

terselesaikan tanpa dukungan dari berbagai pihak baik moril maupun materil.
Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih kepada
semua pihak yang telah membantu dalam penyusunan tugas ini, terutama
kepada Kartini Afriani, M.Si selaku dosen pengampu mata kuliah praktikum
kimia organic bahan alam.

Penulis menyadari bahwa tugas ini masih jauh dari kata sempurna
dikarenakan terbatasnya pengetahuan yang dimiliki penulis. Oleh karena itu,
penulis mengharapkan segala bentuk saran serta masukan bahkan kritik yang
membangun dari berbagai pihak. Semoga tugas ini dapat bermanfaat bagi
para pembaca dan semua pihak khususnya dalam bidang kimia organic bahan
alam

Tangerang Selatan, 7 Maret 2021

Tim Penulis
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR .................................................................................ii

DAFTAR ISI ................................................................................................iii
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Masalah............................................................. 1
BAB II PERCOBAAN
A. Metode........................................................................................ 4
B. Cara Kerja....................................................................................4
1. Ekstraksi..................................................................................4
2. Kromatografi Kolom...............................................................4
3. Teknik Pengukuran.................................................................5
BAB III PEMBAHASAN
A. Analisis GPC............................................................................... 7
B. Analisis UV-fluoresensi ............................................................. 8
C. Analisis TG-FTIR....................................................................... 8
D. Analisis PY-GC/MS ................................................................ 14
E. Analisis FTIR ........................................................................... 19
BAB IV PENUTUP
A. Kesimpulan............................................................................... 21
DAFTAR PUSTAKA................................................................................. 21
LAMPIRAN 21
 ABSTRAK

Lima terpenoid baru (1-5) termasuk dua tipe dollellane. Satu diterpenoid tipe
kaurane dan dua seskuiterpenoid diisolasi dari lumut hati Cina Lepidozia reptans
(L.) Dumort bersama dengan sembilan terpenoid yang diketahui (6- 14).
Strukturnya ditentukan berdasarkan analisis data spektroskopi MS dan NMR,
difraksi sinar-X kristal tunggal dan perhitungan dikroisme sirkular elektronik.
Senyawa terpilih 1, 2, 6, 7, 9 dan 14 disaring untuk aktivitas anti-inflamasi dengan
model produksi oksida nitrat (NO) yang diinduksi LPS dengan sel makrofag, dan
mekanisme senyawa aktif 1 dan 2 dieksplorasi lebih lanjut.
 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Peradangan dikenal sebagai silent killer yang bertanggung jawab
atas berbagai penyakit akut atau kronis seperti syok septik, kanker,
diabetes, aterosklerosis, dan obesitas. Lipopolisakarida (LPS) menginduksi
produksi NO dengan sel RAW264.7 sel sering digunakan sebagai
indikator dalam uji anti-inflamasi. Jalur persinyalan NF-kB dikenal
sebagai jalur hilir utama dalam inflamasi yang diinduksi LPS. LPS
memicu aktivasi NF-kB menginduksi ekspresi gen dengan cepat dan
memungkinkan pelepasan sejumlah besar sitokin pro-inflamasi, seperti IL-
6, IL-β, IL-α , TNF- α dan COX-2 untuk menghasilkan berbagai produk
inflamasi. Oleh karena itu, penghambatan faktor kunci dalam jalur
persinyalan NF-kB dan penurunan kadar produksi NO yang dihasilkan
adalah cara untuk mencegah penyakit inflamasi. Untuk alasan ini, banyak
percobaan untuk menemukan agen anti-inflamasi baru yang efektif dan
saat ini sedang dilakukan. Sejumlah terpenoid dilaporkan menunjukkan
aktivitas anti-inflamasi. Lumut hati, biasanya dianggap sebagai bryophytes
bersama dengan lumut dan hornworts, menyediakan sumber yang kaya
terpenoid serta senyawa fenolik.
Penelitian mengenai terpenoid yang sedang berlanjut dari lumut
hati Cina mengarah pada penemuan lima senyawa baru (1-5), bersama
dengan sembilan yang dikenal (6-14) dari lumut hati Cina Lepidozia
reptans (L.) Dumort., dikumpulkan di Cagar Alam Nasional Foping,
Provinsi Shanxi, Republik Rakyat Tiongkok (Lihat Gambar 1). Di sini,
dilaporkan isolasi, penjelasan struktural, dan aktivitas anti-inflamasi dari
senyawa ini
 BAB II

PERCOBAAN

A. Prosedur percobaan umum

Titik lebur diukur menggunakan peleburan mikro X-6. Rotasi optik
diperoleh menggunakan polarimeter Gyromat-HP. Data UV direkam
menggunakan spektrofotometer madzu UV-2450 dan Spektrum IR diukur
pada spektrometer Nicolet iN 10 Micro FTIR. Spektrum NMR direkam
menggunakan spektrometer Bruker Avance DRX-600 ( 1 H: 600 MHz, 13
C: 150MHz) dan spektrometer Bruker Avance AV-400, TMS digunakan
sebagai standar internal. HRESIMS diperoleh dengan menggunakan
sebuah LTQ-Orbitrap XL. Data RT-PCR diperoleh menggunakan
mastercycler ep realplex. Data Western Blot diperoleh dengan
menggunakan Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra. Data pewarnaan
imunnofluorescence diperoleh dengan menggunakan ZEISS (LSM700).
B. bahan tanaman
Seluruh tanaman Lepidozia reptans (L.) Dumort . dikumpulkan
dari Cagar Nasional Foping, Provinsi Shanxi, People's Republik
Tiongkok, pada Juli 2016, dan diidentifikasi oleh Zhaojie Ren (Museum
Shandong)
C. Ekstraksi dan isolasi
Bahan tanaman yang dikeringkan dan digiling dari L. reptans
(131,1 g) kemudian diekstraksi dengan 95% EtOH (3 x 1,5 L, masing-
masing selama satu minggu) pada suhu kamar dan disaring. Filtrat
kemudian diuapkan untuk mengurangi tekanan pada suhu 40 ° C untuk
menghasilkan residu. Ekstrak kasar yang diperoleh kemudian
disuspensikan dalam air dan dipartisi dengan PE. Hasil dari partisi ini
berupa fraksi PE yang kemudian dimurnikan dengan menggunakan
HPLC, sehingga diperoleh kandungan masing-masing terpenoid murni
dalam sampel, yaitu 1 (8,9 mg), 2 (11,7 mg), 3 (0,9 mg), 4 (1,1 mg), 5
 (1,5mg), 6 (1,3 mg), 7 (1,8 mg), 8 (1,5 mg), 9 (1,6 mg) 10 (1,5 mg), 11
(1,1 mg), 12 (0,8 mg), 13 (1,2 mg), dan 14 (2,3 mg).
D. Analisis kristalografi sinar-X senyawa 1 dan 2
Dua kristal yang cocok dari senyawa 1 dan 2 diperoleh dengan
rekristalisasi dari EtOH dan dilakukan pada difraktometer ventura D8.
Kristal disimpan pada suhu 296⁰K selama pengumpulan data.
Menggunakan ShelXL-2014/7, strukturnya diselesaikan dengan ShelXS
menggunakan Direct Metode dan disempurnakan dengan ShelXL-2014/7
menggunakan minimalisasi kuadrat terkecil. Untuk memperjelas hasil
senyawa dari kristal ini dilakukan analisis lanjutan dengan spektro HNMR,
IR, dan HRESIMS.
E. Kultur dan perawatan sel
Makrofag murine THP-1, HEK293T dan RAW 264,7 diperoleh
dari Tipe Amerika (Manassas, WA). THP-1 dikultur dalam media RPMI-
1640 (Hyclone, USA), RAW 264.7 dibiakkan di Modified Eagle's Medium
Dulbecco (DMEM, Gibco) dan HEK293T dibiakkan di Modified Eagle's
Medium (Gibco, USA) yang mengandung 10% serum janin sapi (Gibco,
USA), 100 µ/mL penisilin dan 100 µg/mL streptomisin. Sel dipertahankan
dalam inkubator dengan kelembaban 5% CO 2 pada suhu 37 °C. Ketika sel
telah tumbuh sekitar 50-70% diujikan dengan LPS atau dengan bahan
kimia lainnya.
F. Pengukuran produksi NO
Penghambatan produksi NO dengan penghilangan RAW 264,7
yang dipicu LPS Makrofag digunakan untuk mengevaluasi fungsi anti-
inflamasi pada komposisi senyawa terpilih. RAW 264,7 sel (8,0 x 104
sel/sumur) ditaruh di 96-well plate dan ditentukan dengan 1 µg/ mL LPS,
dan dilihat ada atau tidaknya senyawa yang diuji selama 24 jam.
Selanjutnya, 100 µL dari supernatan dipindahkan ke cawan lain dan
ditambahkan dengan 100 µL Griess reagent [0.1% N-(1-naphthyl)
ethylenediamine dan 1% sulfanilamide dalam larutan H3PO4 ] pada suhu
ruang selama 15 menit. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 570
nm pada alat pembaca cawan model 680 (Bio-rad). Konsentrasi Nitrit dari
 kurva standard NaNO2. Luteolin (25 µM) digunakan sebagai kontrol
positif.

G. Uji viabilitas sel

Efek anti-proliferatif dari senyawa yang diuji pada sel RAW 264.7
secara bersamaan ditentukan menggunakan 3-(4,5-dimethylthiauji zol-2-
yl)-2,5-difeniltetrazolium bromida (MTT, Sigma). singkatnya, 100 µL
media DMEM yang mengandung 0,4% MTT ditambahkan ke setiap plate,
setelah menghilangkan 100 µL supernatan seperti yang dijelaskan dalam
uji produksi NO.
H. PCR waktu nyata
Setelah isolasi total RNA dari sel THP-1 (2 x 106 sel/plate dalam
6-well plate), DNA komplementer untai pertama (cDNA) dibuat dari 1 µg
dari total RNA menggunakan Maxime RTPreMix Kit (Takara).
I. blotting barat
Sel dikumpulkan dengan buffer RIPA yang mengandung campuran
protease inhibitor segar (50 µg/ml aprotinin, 0.5mM fenilmetanasulfonil
fluorida (PMSF), 1 mM natrium ortovanatanggal, 10 mM natriumfluorida
dan 10 mM gliserolfosfat). konsentrasi protein diukur dengan uji BCA.
protein dengan Jumlah yang sama dipisahkan oleh SDS-PAGE dan
dipindahkan secara elektro pada membran nitroselulosa. Membran
diisolasi dengan 5% susu tanpa lemak dalam buffer TBST (Tris-Buffered
and Saline Tween), kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu ruang
dengan antibodi spesifik.
J. Pewarnaan imunofluoresence
Sel ditaruh pada cawan petri ukuran 6 mm dan ditempatkan di
bagian bawah 24-well plate. Setelah dilakukan perawatan, sel pada kaca
on cover-slip perbaiki dengan metanol/aseton dingin (1:1) untuk 5 menit
sebelum dicuci dengan PBS. DNA diwarnai dengan DAPI selama 15
menit pada suhu ruang. Gambar Fluorescence diambil dengan mikroskop.
K. Analisis statistik
 Hasilnya dinyatakan sebagai mean ± standar (SD). analisis statistik
dilakukan melalui Student's t -test menggunakan perangkat lunak Prism 5
(Perangkat Lunak GraphPad, San Diego, CA, AS). Data dianggap
signifikan secara statistik pada p <0,05.
 BAB III
PEMBAHASAN

A. Identifikasi Senyawa
Senyawa 1 diperoleh sebagai jarum putih dengan rumus molekul
C20H32O2, berdasarkan HRESIMS-nya (m/z 305.2477 [M + H]+, hitung
305.2475) dan 13Data C NMR, menunjukkan lima derajat ketidakjenuhan.
Spektrum inframerah (Gambar. S8) pada serapan 3490 dan 1690 cm -1
menunjukkan masing-masing memiliki gugus hidroksil dan karbonil.
Analisis spektrum 1D dan 2D NMR menunjukkan adanya lima metil,
enam metilen, empat metana (dua sp2 metana di dC 124.3 dan 128.8), dan
lima karbon kuaterner lainnya (termasuk satu oksigen di dC 87.3, dua sp2
karbon olefin pada dC 133.3 dan 149,9, dan satu keton karbonil at dC
201.7) (Tabel 1). Lalu dibandingkan 1H dan 13C NMR data spektroskopi
senyawa 1 dengan data dari senyawa yang telah diketahui yaitu senyawa 6
yang mengindikasikan senyawa 1 dan 6 adalah congener kecuali 6-
hidroksi dari 6 teroksidasi menjadi keton di 1, yang didukung adanya C-6
pada dC 201,7 dalam 13C NMR dan juga korelasi H-7 (dH 6.43) dan H ab-5
ke C-6 di HMBC. Oleh karena itu, senyawa 1 diidentifikasi sebagai
dolabellane tipe diterpenoid. Konfigurasi relatifnya ditentukan oleh
NOESY (Gambar 3). Korelasi H-11/H3-19 di NOESY dikonfirmasi H-11
dan isopropil-12 adalah coplanar, dan ditugaskan sebagai α-orientasi,
sedangkan hidroksi pada C-12 adalah β-orientasi. Korelasi antara H-3 dan
H-5b (dH 3.19), serta antara H-7 dan H-9b (dH 2.43) menunjukkan E-
geometri untuk dua ikatan rangkap C-3/4 dan C-7/8. Tidak adanya korelasi
NOE antara H3-15 dengan H-11 serta adanya korelasi NOE dari H3-15
dengan H-13b (dH 1.66) mengkonfirmasi trans-konjungsi kedua cincin.
Berdasarkan analisis difraksi sinar-X kristal tunggal dengan radiasi Cu Kα
(Gambar 4), senyawa 1 ditentukan menjadi (1S,3E,7E,11S,12S)-12-
hidroksi-dolabella-3,7-dien-6-satu.
 Senyawa 2 juga diperoleh sebagai jarum putih dan memiliki rumus
molekul yang identik dengan senyawa 1. Berdasarkan data HRESIMS (m/z
305.2477 [M + H] +, hitung 305.2475). Analisis terperinci dari spektrum senyawa
2D NMR senyawa 1 dan 2 menghasilkan pembentukan struktur planar yang
sangat mirip. Hal ini menunjukkan bahwa keduanya adalah stereoisomer.
Dibandingkan dengan 1, satu-satunya perbedaan adalah bahwa geometri ikatan
rangkap C-7/8 dari 2 ditentukan sebagai 7Z atas dasar interaksi NOE dari H3-17
(dH 1.75) dan H-7 (dH 5.90). Struktur relatif lebih lanjut didukung oleh analisis
Struktur relatif ini selanjutnya didukung oleh analisis difraksi sinar-X kristal
tunggal dengan radiasi Mo Kα(Gambar 4). Selanjutnya, spektrum ECD (Gambar.
S20) dari senyawa 2 menunjukkan efek Kapas yang sama dengan senyawa 1
(Gambar S10). Dengan demikian, konfigurasi absolut senyawa 2 ditetapkan
menjadi (1S,3E,7Z,11S,12S)-12-hidroksi- dolabella-3,7dien-6-satu.
Senyawa 3 diisolasi sebagai bubuk putih amorf. Rumus molekul dari 3
ditetapkan oleh HRESIMS (m/z 321.2424 [M + H]+, hitung 321.2424) menjadi
C20H32O3, dengan lima derajat ketidakjenuhan. spektrum inframerah (Gambar.
S28) menunjukkan pita serapan hidroksil (3383 cm -1) dan karbonil (1731 cm-1).
Analisis komprehensif dari spektrum 1D dan 2D NMR menunjukkan adanya dua
puluh karbon, termasuk empat metil, tujuh metilen, empat metana (satu
teroksigenasi pada dC 75,8), dan enam karbon kuaterner lainnya (termasuk satu
teroksigenasi pada dC 76.6 dan satu keton karbonil at dC 219.4) (Tabel 1). Data
spektral yang disebutkan di atas memungkinkan penetapan kerangka
diterpenoid kaurane. Pola spektroskopi NMR dari 3 menunjukkan kesamaan
dengan senyawa yang diketahui pada senyawa 7, kecuali bahwa satu gugus
karbonil ditugaskan ke C-3 di 7 digantikan oleh gugus hidroksil, yang
dikonfirmasi oleh korelasi HMBC (Gambar 2.) dari H3-18 (dH 0,96) dan H3-19
(dH 0,84 ke C-3 (dC 75,8), C-4 (dC 37.5), dan C-5 (dC 48.0). Bukti-bukti ini
mendukung struktur planar senyawa 3. Korelasi NOESY (Gambar 3) dari H-5 (dH
1,40)/ H-9 (dH 1.19), H-14b (dH 2.25)/Me-20 (dH 1.07) dan H-14a (dH 1.51)/H-16
(dH 2.25) dikonfirmasi H-5, H-9 dan Me-17 adalah coplanar dan ditugaskan
sebagai ̫β-orientasi, sementara Me-20 adalah α-orientasi. Substituen OH-3
ditentukan untuk β-orientasi sesuai pemisahan sinyal dan konstanta konektor
kecil yang sama.
 Atas dasar biogenesis bersama dengan empat kaurane tipe ent (7-10)
diisolasi pada tumbuhan yang sama, sehingga struktur 3 ditetapkan sebagai
(3S,5S,8R,10R,13S,16R)-3,13- dihidroksi-ent-kauran-15-satu.

Senyawa 4 diperoleh sebagai bubuk putih amorf dan diberikan

rumus molekul C15H24O2, berdasarkan HRESIMS-nya (m/z 237.1851 [M +
H]+, hitung 237.1849) dan 13Data C NMR, indi mengkategorikan empat
derajat ketidakjenuhan. Spektrum IR menunjukkan adanya hidroksil (3339
cm-1) dan keton terkonjugasi (1649 cm-1). Spektrum UV (Gambar S38)
menunjukkan serapan maksimum pada 231 nm yang mendukung α, β-
keton tak jenuh. Spektrum 1H HNMR (Meja 2) menunjukkan satu metil
tersier pada dH 2,19 (s), tiga metil sekunder pada dH 0,94 (d, J = 6,6Hz),
0,96 (d, J = 6,6 Hz) dan 0,97 (d, J = 7,2 Hz), dua proton metin di dH 1,71
dan 2,07, serta proton aldehida di dH 10.00 (s). 13C NMR (Meja 2) dan
spektrum HSQC (Gambar. S31) menunjukkan lima belas karbon termasuk
empat metil, empat metilen, tiga metin (satu aldehida karbonil at dC
189.4), dan empat karbon kuartener (termasuk satu karbon teroksigenasi
pada dC 85.5, dua karbon alkena di dC 135,9 dan 169.0, dan satu karbon
spiro di dC 62.5). Empat sistem putaran, H-4/H3- 12, Hab-8/Hab-9, H-13/H3-
14 dan H-13/H3-15 ditunjukkan pada Gambar 2. Korelasi HMBC pada
(Gambar 2.) dari H3-10 (dH 2.19) ke C-1 (dC 169.0), C-2 (dC 135,9) dan C-
5; dari H-11 (dH 10.00, s) ke C-2 dan C-3 menegaskan bahwa CH3-10
terhubung ke salah satu karbon alkena (C-1), dan gugus aldehida
terhubung ke karbon alkena lainnya (C-2), sedangkan korelasi dari H3-12
(dH 0,94) ke C-3, C-4 (dC 42.7) dan C-5 (dC 62.5), menyarankan adanya
cincin beranggota lima. Selain itu, korelasi HMBC dari H-13 (dH 1.71) ke
C-6, C-7 (dC 85.5), dan C-8; dari Hab-8 dan Hab-6 ke C-5; dan dari Hab-9
hingga C-6 menunjukkan adanya cincin beranggota lima lainnya.
Selanjutnya, korelasi HMBC dari Hab-9 ke C-1 dan dari Hab-6 sampai C-4
menegaskan struktur spiro tidak diragukan lagi. Gugus isopropil terletak di
C-7 dari Korelasi HMBC dari H3-14 (dH 0,96) dan H3-15 (dH 0,97) ke C-
7 dan C-13 (dC 37.4). Jadi, struktur planar dari 4 bisa didirikan
 Korelasi dari NOESY (gambar 3) H3-12/H-6α(dH 1.99) dan H3-
12/H-13 mengindikasikan bahwa CH3-4, H-6α dan isopropil-7 memiliki
kedekatan. Dengan demikian, berdasarkan perbandingan dan perhitungan
electronic circular dichroism (EDC) (gambar 5) struktur senyawa 4 dapat
diketahui. Berdasarkan bukti di atas, maka senyawa 4 dikonfirmasi
sebagai aldehida sesquiterpenoid, yang bernama (4R,5R,7S)-7-hydroxy-7-
isopropyl-1,4-dimethylspiro [4.4]non-1-ene-2-carbaldehyde.

Senyawa 5 berwujud bubuk putih amorf dan rumus molekulnya

yaitu C15H24O3, berdasarkan HRESIMS-nya( m / z 253,1798 [M + H] + ,
kalkd 253.1798) dan data 13
C NMR, mengidentifikasikan empat derajat
ketidakjenuhan. Spektrum IR menunjukkan penyerapan pada 3364 dan
1646 cm-1 , menunjukkan masing-masing gugus hidroksil bebas dan gugus
karbonil. Analisis dari data 1H dan C NMR (Tabel 2), 5 senyawa
13

mengungkapkan bahwa merupakan golongan sesterpenoid dengan

kerangka yang mirip dari 1 senyawa yang diketahui. Satu-satunya
perbedaan adalah posisi α, bagia β- keton tak jenuh. Lokasi α (C-3), β (C-
5)-kelompok keton tak jenuh dikonfirmasi oleh korelasi HMBC dari H3-15
(dH 1,89) ke C-3 (dC 199,8), C-4 (dC 133,5), dan C-5 (dC159.3). Korelasi
NOESY (Gambar. S47) dari H-6 (dH 4.36)/OH-7(d H 3,72) dan OH-6(d H
4,97)/H 3 -14 menunjukkan OH-6, CH 3 -10 dan iso-propil-7 menjadi CO.
Berdasarkan data tersebut senyawa 5 diidentifikasi sebagai (6R,7S,10R)-
6,7-dihydroxy-3-oxo-eudesma-4E-ene.

Berikut adalah nama dari senyawa 6 sampai 14, yaitu:

 (1R,6R,11R,12R)-6,12-dihydroxydolabella-3E,7E-diene) (6)
 13α-hydroxy-ent-kaur-16-ene-3,15-dione (7)
 ent-kaurane-3,15-dione (8)
 15-oxo-ent-(16S)-kaurane (9)
 ent-3β-hydroxykaurene-15-one (10)
 (5S,6R,7S,10R)-6,7-dihydroxy-2-oxo-eudesma-3Z-ene (11)
 6,7-epoxy-3-methenyl-11,11,7-trimethyl-[8.1.0]-2-hendecene (12)
  6,7-dimethylmethylene-4-aldehyde-1β-hydroxy-10(15)-ene-(4Z)-
dicyclodecylene (13)
 vitamin E quinone (14)

B. Efek anti-inflamasi

Kadar Nitrit Oksida (NO) sangat berhubungan erat dengan

penyakit inflamasi. Pada jurnal ini mendeteksi kadar NO dalam LPS-
stimulated RAW264.7 untuk mengevaluasi fungsi anti-flamasi dari 6
senyawa terpilih (1, 2, 6, 7, 9 dan 14). Konsentrasi yang dibutuhkan untuk
efek penghambatan 50% (IC 50 ) produksi NO yang ada pada tabel 3.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa 2 (IC 50 : 34,9 µM),

yang memiliki geometri Z dari ikatan rangkap C-7/8, diperlihatkan
aktivitas penghambatan yang lebih tinggi daripada 1 (IC 50 : 46,8 µM),
yang memiliki geometri E dari ikatan rangkap C-7/8, menunjukkan bahwa
geometri ikatan rangkap C-7/8 pada tipe kerangka dolabellane dapat
mempengaruhi aktivitas anti-inflamasi.

C. Senyawa 1 dan 2 menekan LPS-induced dari IL-6, IL-β, IL-α dan

TNF-α
Sitokin pro-inflamasi IL-6, IL-β, IL-α dan TNF-α, serta enzim
cyclooxygenase-2 (COX-2) yang diinduksi merupakan mediator inflamasi
yang penting yang berkontribusi terhadap inflamasi akut dengan
menginduksi vasodilatasi, peningkatan permeabilitas vaskular,
apoptosissis, edema dan demam. Untuk memastikan efek penghambatan
dari senyawa 1 dan 2 pada respon inflamasi, perubahan dalam IL-6, IL-β,
IL-α dan TNF-α, dianalisis dalam sel THP-1 dengan uji PCR kuantitatif.
Seperti ditunjukkan pada Gambar. 6, dengan treatment LPS, peningkatan
 IL-6, IL-β, IL-α dan TNF-α terlihat jelas dalam sel. Setelah ditambahkan
dengan senyawa 1 atau 2, dan ibandingkan dengan Luteolin, senyawa 1
dan 2 menunjukkan efek penghambat yang lebih kuat dalam transkrip
TNF-α. Selain itu, tingkat COX-2 yang diinduksi LPS, yaitu perantara
utama untuk inflamasi yang ditargetkan oleh obat antiinflamasi nonsteroid,
sangat terhambat oleh 1 dan 2 (gambar. 7). Sesuai dengan hasil dalam
tabel 3, senyawa 2 menunjukkan hambatan yang lebih tinggi terhadap
respon inflamasi yang disebabkan LPS daripadasenyawa 1 di tingkat
mRNA dari IL-6 dan IL- β.

D. Senyawa 1 dan 2 menghambat LPS-induced NF-KB dan TFE3

NF-KB adalah faktor transkripsi yang paling penting yang
mengontrol respon mediator inflamasi. Peraturan aktivitas NF-KB
bergantung pada sequestrasi cytoplasmic yang berhubungan dengan
molekul penghambat IkBα. Rangsangan yang mendorong inflamasi IkBα
fosforilasi, melepaskan NF-KB karenanya disebut "aktivasi" NF-KB. TFEB
dan TFE3 baru-baru ini dilaporkan bekerja sama dalam pengaturan respon
imun bawaan dalam makrofagus. Oleh karena itu, diselidiki pengaruh
senyawa 1 dan 2 pada inti sel LPS-induced yang translokasi p-p65,
STAT1, STAT3, TFEB dan TFE3 di THP-1 sel dengan metode blot
wastern. Sebagaimana diperlihatkan dalam (gambar 7), stimulasi LPS
menghasilkan peningkatan p-p65 dalam sitoplasma dan nukleus,
sedangkan efek senyawa 1 dan 2 dapat meringankan fosfor-p65 dalam
sitoplasma (gambar 7A), dan translokasinya (gambar 7B). Kami juga
menentukan perubahan di STAT1, STAT3, TFEB, dan TFE3, yang
merupakan faktor transkripsi yang diaktifkan oleh LPS , sebagai respons
terhadap perawatan 1 dan 2 . Hasilnya menunjukkan bahwa tidak ada
perubahan yang terdeteksi dalam migrasi STAT1, STAT3, dan TFEB ke
dalam nukleus yang terpapar ke 1 dan 2. Namun, kedua senyawa tersebut
mampu merusak kelebihan TFE3 dalam nukleus dan memiliki efek yang
lebih baik daripada luteolin, yang mengarah pada penghapusan
aktivitasnya. Kesimpulannya, lima terpenoid baru ( 1 – 5 ), bersama
 dengan Sembilan senyawa ( 6 - 14 ) diisolasi dari L. reptans, dan aktivitas
anti-inflamasi dari senyawa yang dipilih dievaluasi menggunakan produksi
NO yang diukur dengan sel RAW 264,7 dan diaktifkan LPS. Senyawa 1
dan 2 cukup menekan produksi NO sesuai dengan dosisnya. Selain itu,
juga secara efektif mengurangi kadar mRNA IL-6, IL-β, IL- α dan TNF- α
dan ekspresi protein komposisi COX-2.

Gambar 6. Efek senyawa 1 dan 2 pada tingkat mRNA yang diinduksi LPS dari
mediator inflamasi IL-6, IL-b, IL- a dan TNF- a dalam sel THP-1. Sel
diperlakukan dengan 1 dan 2 konsentrasi yang telah diatur ditunjukkan selama 1
jam sebelum pengobatan LPS (1l g/mL) selama 12 jam.
(Gambar7) efek senyawa 1 dan 2 dapat meringankan fosfor-p65 dalam sitoplasma
LAMPIRAN