BIOTRANSFORMASI SENYAWA OBAT ANTALGIN

DENGAN BAKTERI HASIL ISOLASI DARI TANAH

DRAFT SKRIPSI

Oleh:
ILHAMDI SOFNEL
NIM : 1704129

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PERINTIS INDONESIA
2021
 KATA PENGANTAR

Alhamdulillah segala puji dan syukur hanya kepada Allah SWT yang

senantiasa melimpahkan Rahmat dan Karunia-Nya berupa ilmu, kesehatan, dan

kemudahan sehingga penulis dapat menyusun dan menyelesaikan skripsi yang

berjudul “BIOTRANSFORMASI SENYAWA OBAT ANTALGIN DENGAN

BAKTERI HASIL ISOLASI DARI TANAH yang merupakan salah satu syarat

untuk menyelesaikan program pendidikan strata satu Farmasi Universitas Perintis

Indonesia. Salam serta shalawat tidak lupa penulis haturkan kepada Rasulullah

Muhammad saw, keluarga, sahabat, dan pengikutnya yang setia sampai sekarang.

Ungkapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Ayahanda Nelson dan

Ibunda tercinta Sofyati S.Ag, serta kedua saudaraku (Syarif Sofnel dan Syifa

Jumaida) yang selalu memberikan doa, semangat, dukungan, dan kasih sayang tak

terhingga sehingga penulis dapat menyelesaikan studi hingga ke jenjang perguruan

tinggi. Penulisan skripsi ini tidak terlepas dari bantuan, petunjuk, arahan, dan

masukan yang berharga dari berbagai pihak. Untuk itu pada kesempatan ini penulis

mengucapkan terima kasih yang tulus kepada:

1. Bapak Prof. Dr Akmal Djamaan M.S, sebagai Dosen Pembimbing I dan Ibuk Tisa

Mandala Sari M.Si. sebagai Dosen Pembimbing II yang dengan penuh perhatian

dan kesabaran telah meluangkan waktu untuk memberikan petunjuk, arahan dan

nasehat dalam menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi ini.

2. Ibu Dr. apt. Eka Fitrianda, M.Farm selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Perintis Indonesia.

3. Ibu apt. Revi Afrianti, M.Si selaku ketua Prodi S1 Farmasi Universitas Perintis

Indonesia.

4. Ibuk apt. Widyastuti M.Farm selaku pembimbing akademik yang telah

meluangkan waktunya memberikan bimbingan, dukungan, nasehat dan semangat

selama penulis menyelesaikan penulisan skripsi ini.

5. Bapak dan Ibu dosen Program Studi Universitas Perintis Indonesia yang telah

mendidik dan mencurahkan ilmu selama ini sehingga penulis dapat menyelesaikan

studi dan penulisan skripsi ini.

6. Kepala UPT Sumber Daya Hayati Universitas Andalas beserta analis dan seluruh

pihak yang telah membantu sehingga penulis dapat menyelesaikan studi dan

penulisan skripsi ini.

Penulis menyadari sepenuhnya bahwa dalam penulisan skripsi ini masih

banyak terdapat kekurangan disebabkan pengalaman dan kemampuan penulis yang

masih terbatas. Akhirnya penulis mengharapkan agar skripsi ini bermanfaat bagi kita

semua. Atas segala bantuan yang telah diberikan, penulis mendoakan semoga budi

baik bapak dan ibu akan dibalas oleh Allah SWT. Amin Yaa Rabbal Alamin.

Padang, 3 Agustus 2021

 Penulis

ABSTRAK

Telah dilakukan Biotransformasi senyawa obat antalgin dengan bakteri hasil isolasi
tanah. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik umum bakteri dari
tanah dan mengetahui hasil biotransformasi senyawa antalgin dengan bakteri hasil
isolasi tanah yang di ukur menggunakan KCKT. Isolat ditumbuhkan pada media
Nutrient Agar (NA), kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Dilakukan
pengamatan morfologi koloni, pemurnian bakteri, dan peremajaan bakteri. Bakteri ini
digunakan untuk biotransformasi senyawa antalgin dengan variasi konsentrasi
berbeda 0,01 %, 0,1 % dan 1 % v/v yang inkubasi selama 72 jam dengan suhu 37°C
menggunakan shaker dengan kecepatan 150 rpm selanjutnya dilakukan pengujian
KLT dan KCKT. Dari hasil pemeriksaan scrining biokimia sampel bakteri isolasi
tanah didapatkan jenis dari bakteri tersebut yaitu Isolat 5-2 Bacillus sp.1, Isolat 6-6(a)
Bacillus sp.2, Isolat 8-3 Bacillus sp. 4. Berdasarkan pengujian dengan KLT hanya
konsentrasi antalgin 0,1% yang tertransformasi oleh bakteri. Pada konsentrasi 0,01%
noda saat pengujian KLT tidak terdeteksi, pada konsentrasi 1% bakteri tidak mampu
melakukan pertumbuhan secara optimal karna jumlah senyawa antalgin yang cukup
banyak. Dari pengujian KCKT terjadi perubahan profil pada senyawa antalgin hasil
biotransformasi, dengan adanya puncak-puncak kromatogram yang berbeda. Maka
disimpulkan bahwa bakteri hasil isolasi tanah dapat mentransformasi senyawa
antalgin.

Kata Kunci: Antalgin, Biotransformasi, Isolasi bakteri tanah ,KLT, KCKT

 ABSTRACT

Biotransformation of antalgin drug compounds with bacteria isolated from soil has
been carried out. This study aims to determine the general characteristics of bacteria
from the soil and to determine the results of biotransformation of antalgin compounds
with bacteria from soil isolation measured using HPLC. The isolates were grown on
Nutrient Agar (NA) media, then incubated at 37oC for 24 hours. Colony morphology,
bacterial purification, and bacterial rejuvenation were observed. These bacteria were
used for biotransformation of antalgin compounds with different concentrations of
0.01%, 0.1% and 1% v/v which were incubated for 72 hours at 37°C using a shaker at
150 rpm and then TLC and HPLC were tested. From the results of biochemical
screening examination of soil isolate bacterial samples, the types of bacteria obtained
were Isolate 5-2 Bacillus sp.1, Isolate 6-6(a) Bacillus sp.2, Isolate 8-3 Bacillus sp. 4.
Based on the TLC test, only 0.1% antalgin concentration was transformed by
bacteria. At a concentration of 0.01% the stain during the TLC test was not detected,
at a concentration of 1% the bacteria were unable to grow optimally because of the
large number of antalgin compounds. From HPLC testing, there was a change in the
profile of the biotransformed antalgin compound, with different chromatogram peaks.
It was concluded that the bacteria isolated from the soil could transform the antalgin
compound.

Keywords: Antalgin, Biotransformation, Isolation of soil bacteria, TLC, HPLC

 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR.................................................................................... i
ABSTRAK....................................................................................................... iii
ABSTRACT..................................................................................................... iv
DAFTAR ISI................................................................................................... v
BAB I. PENDAHULUAN.............................................................................. 1
1.1 Latar Belakang....................................................................................... 1
1.2 Perumusan Masalah................................................................................ 4
1.3 Tujuan Penelitian.................................................................................... 4
1.4 Manfaat Penelitian.................................................................................. 5
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA................................................................... 6
2.1 Biotransformasi...................................................................................... 6
2.2 Antalgin................................................................................................. 7
2.2.1 Defenisi........................................................................................ 7
2.2.2 Uraian Umum.............................................................................. 8
2.2.3 Farmakologi................................................................................. 9
2.3 Metoda Sterilisasi................................................................................... 9
2.3.1 Pengertian Sterilisasi................................................................... 9
2.4 Bakteri.................................................................................................... 10
2.4.1 Defenisi........................................................................................ 10
2.4.2 Penggolongan Bakteri................................................................. 10
2.4.3 Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Tanah...................................... 11
2.4.4 Pewarnaan Gram Positif dan Negatif.......................................... 11
2.5 Kromatografi Lapis Tipis....................................................................... 13
2.6 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.................................................... 14
BAB III. METODE PENELITIAN............................................................... 16
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian................................................................ 16
3.2 Alat dan Bahan....................................................................................... 16
3.2.1 Alat.............................................................................................. 16
3.2.2 Bahan........................................................................................... 16
3.3 Prosedur Penelitian................................................................................. 17
 3.3.1 Pengambilan Sampel Tanah............................................................. 17
3.3.2 Sterilisasi Alat............................................................................. 17
3.3.3 Pembuatan Media NA................................................................. 17
3.3.4 Isolasi Bakteri Dari Tanah........................................................... 18
3.3.5 Pengamatan Morfologi Koloni dan Pemurnian Bakteri.............. 18
3.3.6 Peremajaan Bakteri...................................................................... 19
3.3.7 Pewarnaan Gram Bakteri............................................................. 19
3.3.8 Biotransformasi Bakteri............................................................... 19
3.3.9 Pengujian Senyawa Hasil Biotransformasi dengan KLT............ 21
3.3.10 Pengujian Senyawa Hasil Biotransformasi Bakteri Dengan KLT
Preparatif................................................................................................... 22
3.3.11 Pengujian Senyawa Hasil Biotransformasi dengan KCKT............ 22
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN....................................................... 23
4.1 HASIL.................................................................................................... 23
4.2 PEMBAHASAN.................................................................................... 26
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN......................................................... 30
5.1 KESIMPULAN...................................................................................... 30
5.2 SARAN.................................................................................................. 30
DAFTAR PUSTAKA...................................................................................... 32
 DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Skema kerja pembuatan Media NA....................................... 34

Lampiran 2. Skema kerja Skema Isolasi Bakteri Dari Tanah................... 35
Lampiran 3. Skema kerja Pengamatan Morfologi Koloni dan Pemurnian
Bakteri............................................................................................ 36
Lampiran 4. Skema kerja Pewarnaan Gram Bakteri................................. 37
Lampiran 5. Skema kerja Biotransformasi Bakteri.................................... 38
Lampiran 6. Skema kerja Pembuatan Eluen............................................... 39
Lampiran 7. Pengujian dengan KLT............................................................ 40
Lampiran 8. Skema kerja Pengujian Senyawa Hasil Biotransformasi Bakteri
dengan KCKT................................................................................ 41
Lampiran 9. Hasil isolasi yang dimurnikan di cawan petri........................ 42
Lampiran 10. Biotransformasi senyawa obat dengan bakteri................... 43
Lampiran 11. Hasil Dari Pengujian KLT..................................................... 44
Lampiran 12. Hasil dari pengujian KCKT.................................................. 45
Lampiran 13. Rincian kromatogram dari hasil pengujian KCKT............ 46
Lampiran 14. Uji Identifikasi Bakteri.......................................................... 47
Lampiran 15. Tabel Hasil Identifikasi Bakteri................................................. 49
Lampiran 16. Tabel Hasil Uji Biokimia Pada Bakteri...................................... 50
Lampiran 17. Hasil Pewarnaan Gram.......................................................... 51

\
 DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Rumus bangun antalgin.................................................................. 8

Gambar 2. Skematis alat KCKT (kromatografi Cair Kinerja Tinggi)............. 15

Gambar 3. Komponen KCKT (kromatografi Cair Kinerja Tinggi).................. 15

Gambar 4. Skema Pembuatan Media NA (Nutrient Agar)............................... 34
Gambar 5. Skema Isolasi Bakteri Tanah.......................................................... 35
Gambar 6. Pengamatan Morfologi Kolonidan Pemurnian Bakteri.................. 36
Gambar 7. Skema proses Pewarnaan Gram Bakteri......................................... 37
Gambar 8. Skema proses Biotransformasi Bakteri........................................... 38
Gambar 9. Pengujian Senyawa Hasil Biotransformasi Bakteri
dengan KLT.................................................................................... 39
Gambar 10.Pengujian Senyawa Hasil Biotransformasi Bakteri
dengan KCKT............................................................................... 40
Gambar 11. Isolat bakteri 6-6 (a)...................................................................... 41
Gambar 12. Isolat bakteri 8-3........................................................................... 41
Gambar 13. Isolat bakteri 5-2........................................................................... 41
Gambar 14. Proses penyiapan sampel untuk proses biotransformasi............... 42
Gambar 15. Proses Biotransformasi Dishaker incubator selama 72 jam.......... 43
Gambar 16. Hasil KLT Antalgin 0,1% Isolat 8-3............................................. 44
Gambar 17. Hasil KLT Antalgin 0,1% Isolat 5-2............................................. 44
Gambar 18. Hasil KLT Antalgin 0,1% Isolat 6-6 (a)....................................... 44
Gambar 19. Kromatogram Hasil Pengujian KCKT Senyawa Antalgin.......... 45
Gambar 20. Kromatogram Sampel antalgin 0,1% dengan Isolat 6-6(a)........... 45
Gambar 21. Kromatogram Sampel antalgin 0,1% dengan Isolat 5-2............... 46
Gambar 22. Kromatogram Sampel antalgin 0,1% dengan Isolat 8-3............... 46
Gambar 23. Surat Hasil Uji Laboratorium....................................................... 48
Gambar 24. Hasil Pengujian Identifikasi Bakteri............................................. 49
Gambar 25. Hasil Uji Biokimia Pada Bakteri.................................................. 50
Gambar 26. Hasil Pewarnaan Isolat 8-3........................................................... 51
Gambar 27. Hasil Pewarnaan Isolat 5-2........................................................... 51
Gambar 28. Hasil Pewarnaan Isolat 6-6 (a) .................................................. 52
 BAB I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Obat adalah zat yang digunakan untuk diagnosis, mengurangi rasa sakit serta

mengobati atau mencegah penyakit pada manusia dan hewan. Obat harus digunakan

dengan benar untuk mencegah atau mengobati dan mencegah efek yang merugikan

setelah menggunakan obat (Ary Made, 2020). Antalgin merupakan obat analgetik-

antipiretik dan antiinflamasi. (Tan dan Kirana, 2007).

Obat yang sudah kadaluarsa seharusnya di buang dengan terlebih dahulu

melepaskan etiket obat dan menutup botol kemudian dibuang; kapsul, tablet atau

bentuk padat lain, menghancurkan dahulu dan mencampur obat tersebut dengan

memasukkan ke plastik dan membuang ke tempat sampah; cairan dibuang pada

kloset, kecuali antibiotika yang harus dibuang bersama wadahnya dengan

menghilangkan labelnya, dan untuk kemasan boks, dus, dan tube terlebih dahulu

digunting lalu dibuang (Depkes RI, 2008).

Tanah merupakan suatu ekosistem yang mendukung kehidupan flora maupun

fauna. Di antara organisme yang penting dan perlu mendapat perhatian dalam

kaitannya dengan keberadaan zat pencemar dalam tanah dan air tanah adalah

mikroorganisme. Ada kolerasi yang kuat bahwa semakin banyak organik tanah dan

oksigen, maka jumlah dan jenis mikroorganismenya juga semakin tinggi. (degradasi)

zat pencemar organik dalam tanah melalui proses metabolismenya (Notodarmojo,

2005).
 Kondisi tanah menentukan jumlah spesies dan populasi mikroorganisme

pendegradasi sehingga sangat mempengaruhi proses biodegradasi secara keseluruhan.

Tanah sampah memiliki berbagai macam potensi mikroorganisme dalam

mendegradasi limbah yang ada (Kimura et al., 1994). Bakteri merupakan salah satu

golongan mikroorganisme prokariotik (bersel tunggal) yang hidup berkoloni dan

tidak mempunyai selubung inti namun mampu hidup dimana saja (Jawetz et al.,

2004). Secara garis besar pengecatan gram, bakteri dikelompokkan menjadi 2, yaitu

Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif adalah bakteri yang

mempertahankan zat warna yang mengandung kistal violet, sewaktu proses

pewarnaan Gram ( Farida, dkk. 2009).

Mikroorganisme biasa berasal dari air, tanah dan udara yang memberikan

kontribusi besar bagi manusia terutama dalam hal produk pangan dan obat-obatan

( Gunam, dkk, 2011). Pengamatan tentang karakteristik morfologi koloni bakteri

perlu dilakukan, agar mempermudah dalam proses identifikasi jenis bakteri. Bahwa

berdasarkan ciri morfologi koloni bakteri dan biakan murni maka dapat dilakukan

proses identifikasi jenis-jenis mikroorganisme, namun untuk memperoleh hasil

identifikasi yang sempurna maka harus dilanjutkan dengan uji biokimia (Lay,1994).

Di dalam tanah hidup berbagai jasad renik (mikroorganisme) yang melakukan

berbagai kegiatan yang menguntungkan bagi makhluk-makhluk lainnya.

Mikroorganisme penghuni tanah merupakan campuran populasi protozoa, bakteri,

alga (ganggang) dan jamur, Selain mikroba endofit, mikroba tanah juga memiliki

kemungkinan untuk dapat melakukan transformasi metabolit yang dihasilkan oleh

tanaman. Hal ini dikarenakan setiap jenis mikroba mempunyai kemampuan untuk
mengubah satu senyawa menjadi senyawa lain yang bertujuan untuk mendapatkan

energi dan nutrisi untuk kelangsungan hidupnya. Dengan demikian adanya mikroba

dalam tanah menyebabkan terjadinya daur unsur-unsur seperti karbon, nitrogen,

fosfor dan unsur lain di alam (Muslimin, 1996 & Dwidjoseputro, 1990).

Biotransformasi merupakan suatu proses dimana suatu senyawa dapat berubah

menjadi senyawa lainnya. Pada proses ini digunakan mikroorganisme untuk

membantu mengubah senyawa tersebut (Borge, 2007). Biotransformasi dipilih karena

reaksinya bersifat enzimatis sehingga reaksi biotransformasi selektif dan sangat

spesifik dalam mengubah substrat yang ada. Spesifisitas dan selektivitas ini

disebabkan oleh struktur kiral protein enzim. Apabila ada beberapa gugus fungsi

maka hanya posisi spesifik tertentu yang dipengaruhi. Reaksi biotransformasi dapat

digunakan untuk menyerang gugus fungsi yang tidak dapat diaktifkan secara efisien

atau memerlukan beberapa tahap antara sebelum dapat bereaksi secara kimia

(Indrayanto, 1998).

Beberapa penelitian sebelumnya dilakukan penelitian biotransformasi katekin

yang merupakan senyawa metabolit sekunder utama tanaman gambir menggunakan

isolat mikroba endofit dari daun dan mikroba tanah yang diisolasi dari tempat tumbuh

tanaman gambir (Uncaria gambir Roxb.) sehingga dapat dihasilkan senyawa lain atau

senyawa baru yang berkemungkinan mempunyai potensi yang berbeda dari katekin

sebagai senyawa awalnya (Kumala 2011). Maka hasil dari 6 isolat mikroba yang

didapatkan, mikroba yang mampu melakukan transformasi terhadap katekin adalah

jamur Aspergillus sp. dan Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) (Kumala 2011).

 Sejauh ini penelitian biotranformasi senyawa obat menggunakan mikroba atau

bakteri yang sudah diketahui genusnya, oleh karena itu pada penelitian dilakukan

mengeksplorasi bakteri-bakteri Tanah dari TPA. Alasan menggunakan senyawa obat

antalgin karena limbah obat diklasifikasikan sebagai limbah berbahaya. Secara

nasional terdapat 47% rumah tangga menyimpan obat sisa. Pembuangan obat-obat

sisa yang tidak digunakan atau kedaluwarsa secara tidak tepat dapat berisiko pada

kesehatan masyarakat dan lingkungan. Berdasarkan hal itu, peneliti tertarik dilakukan

penelitian terhadap biotransformasi senyawa obat antalgin dengan bantuan mikroba

hasil isolasi dari tanah.

1.2 Perumusan Masalah

1. Bagaimanakah karakteristik umum bakteri hasil isolasi dari tanah?

2. Bagaimana hasil biotransformasi senyawa antalgin dengan bakteri hasil isolasi

tanah yang di ukur menggunakan KCKT?

1.3 Tujuan Penelitian

1. Mengetahui karakteristik umum bakteri hasil isolasi dari tanah.

2. Mengetahui dan memperoleh hasil biotransformasi senyawa antalgin dengan

bakteri hasil isolasi tanah yang di ukur menggunakan KCKT

1.4 Manfaat Penelitian

1. Memberikan informasi kemampuan bakteri sebagai agen pengurai struktur

molekul obat

2. Memberikan kontribusi terhadap perkembangan ilmu pengetahuan struktur

baru pada molekul obat

 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Biotransformasi

Biotransformasi merupakan suatu proses dimana suatu senyawa dapat berubah

menjadi senyawa lainnya. Pada proses ini digunakan mikroorganisme untuk

membantu mengubah senyawa tersebut (Borge, 2007). Biotransformasi adalah bagian

dari bioremediasi. Dimana biotransformasi merupakan suatu proses yang umumnya

mengubah senyawa asal menjadi senyawa metabolitnya. Di dalam kasus tertentu

metabolit dapat bersifat lebih toksik daripada senyawa asalnya. (Frank, 1995).

Biotransformasi dapat dianggap terjadi dalam tiga fase. Oksidasi, reduksi atau

hidrolisis obat merupakan metabolisme fase I. Diantara sistem enzim terpenting yang
terlibat dalam reaksi fase I adalah sitokrom P450 (CYP) dan monooksigenase yang

mengandung flavin (FMO). Pada fase II, obat atau metabolit fase I-nya dapat

mengalami reaksi konjugasi dengan senyawa endogen. UDP-glukuronosiltransferase

(UGT) dan glutathione S-transferase merupakan enzim konjugasi utama.

Pengangkutan substrat, metabolit atau secara umum, substansi induk dan

metabolit atau konjugasi dapat berbeda baik dalam sifat fisika-kimia dan efek

farmakodinamik, serta toksisitas dan perilaku farmakokinetik (Testa, 1995).

Terjadinya dan aktivitas enzim biotransformasi menentukan cara dan sejauh mana

obat kimia atau xenobiotik lainnya dimetabolisme.

Oleh karena itu, enzim biotransformasi pada dasarnya mempengaruhi efek

biologis (baik yang diinginkan maupun yang tidak diinginkan dari obat yang

diberikan. Perbedaan antarspesies yang luas sangat membatasi ekstrapolasi potensial

data metabolik di antara spesies hewan (Boobis et al., 1990; Shimada et al., 1997).

2.2 Antalgin

2.2.1 Defenisi
Obat adalah zat yang digunakan untuk diagnosis, mengurangi rasa sakit serta

mengobati atau mencegah penyakit pada manusia dan hewan. Obat harus digunakan

dengan benar untuk mencegah atau mengobati dan mencegah efek yang merugikan

setelah menggunakan obat (Ary Made, 2020). Dari obat-obat yang di berikan melalui

mulut sediaan padat merupakan bentuk yang paling disenangi (Lachman dkk, 1994).
 Antalgin merupakan obat analgetik-antipiretik dan antiinflamasi. Analgesik

adalah obat untuk menghilangkan rasa nyeri dengan cara meningkatkan nilai ambang

nyeri di sistem syaraf pusat tanpa menekan kesadaran, sedangkan antipiretik

merupakan obat yang menurunkan suhu tubuh yang tinggi. Jadi analgetik-antipiretik

adalah obat yang mengurangi rasa nyeri dan serentak menurunkan suhu tubuh yang

tinggi. Sedangkan antiinflamasi adalah mengatasi inflamasi atau peradangan (Tan dan

Kirana, 2007)

2.2.2 Uraian Umum

Rumus Bangun :

Gambar 1. Rumus bangun antalgin (Martindale 36, 2009)

Rumus Struktur : C13H16N3NaO4S.H2O

Nama Kimia :Natrium2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolon-4-

metilaminometanasulfonat

Berat Molekul : 351,37

Pemerian : Serbuk hablur, putih atau putih kekuningan.

Susut Pengeringan : Tidak lebih dari 5,5%; lakukan pengeringan pada suhu

105o hingga bobot tetap menggunakan 250 mg zat. Syarat

Kadar : Metampiron mengandung tidak kurang dari 99,0% dan

tidak lebih dari 101,0% C13H16N3NaO4S, dihitung

terhadap zat yang telah dikeringkan.

Indikasi : Merupakan Obat Anti Inflamasi Non Steroid (AINS) yang

digunakan untuk menghilangkan rasa sakit dan nyeri.

Efek samping :Gangguan saluran cerna, seperti mual,pendarahan

lambung,rasa terbakar serta gangguan sistem saraf, seperti

gangguan darah, gangguan ginjal, syok, kematian dan

lainlain.
Sinonim : Metampiron, Metamizole, Dypirone (Ditjen POM, 1995).

2.2.3 Farmakologi

Antalgin termasuk derivat metan sulfonat dari amidopyrin yang mudah larut

dalam air dan cepat diserap ke dalam tubuh. Bekerja secara sentral di otak dalam

menghilangkan nyeri, menurunkan demam dan menyembuhkan rheumatik.

(Damanik, 2016)

2.3 Metoda Sterilisasi

2.3.1 Pengertian Sterilisasi

Sterilisasi dalam mikrobiologi adalah proses penghilangan semua jenis

organisme hidup, dalam hal ini adalah mikroorganisme (protozoa, fungi, bakteri,

mycoplasma, virus) yang terdapat di dalam suatu benda. Proses ini melibatkan

aplikasi biocidal agent atau proses fisik dengan tujuan untuk membunuh atau

menghilangkan mikroorganisme (Pratiwi, 2008: 136).

Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara

mekanik, fisik dan kimiawi:

a. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori

sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan

tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang tahan panas, misalnya

larutan enzim dan antibiotik.

b. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan dan penyinaran:

Pemanasan, Pemijaran (dengan api langsung), Panas kering, Uap air panas, Uap air

panas bertekanan, Penyinaran dengan UV.

c. Sterilisaisi secara kimiawi Biasanya menggunakan senyawa antiseptik dan

desinfektan contohnya antara lain alkohol dan formalin ( Djide, 2008: 190-194)

2.4 Bakteri

2.4.1 Defenisi

Bakteri berasal dari kata “bakterion” dalam bahasa Yunani berarti tongkat

atau batang. Bakteri kini digunakan untuk menyebut sekelompok mikroorganisme

yang bersel satu, tidak berklorofil (meskipun ada pengecualian pada spesies tertentu),

berkembangbiak dengan membelah diri, dan tidak dapat dilihat tanpa bantuan alat

pembesar (mikroskop)(Dwidjoseputro, 1982).

2.4.2 Penggolongan Bakteri

Identifikasi dan determinasi suatu biakan murni bakteri diperoleh dari hasil

isolasi yang dapat dilakukan dengan cara pengamatan bentuk sel dari koloni bakteri

yang tumbuh dari sebuah sel tunggal dan terdiri dari jutaan sel. Kelompok bakteri

anaerob Gram-negatif berpigmen hitam memiliki ciri warna koloni pigmen hitam

dengan bentuk bulat dan cembung . Bakteri adalah sekelompok mikroorganisme yang

bersel satu, tidak berklorofil, berkembang biak dengan pembelahan diri, dan sangat

kecil hingga hanya terlihat dengan bantuan mikroskop (Dwidjoseputro, 1994).

Beberapa bentuk dasar bakteri yaitu bulat (coccus atau cocci), batang atau silinder

(bacillus atau bacilli), spiral (Pratiwi, 2008). Berdasarkan komposisi dinding selnya,

bakteri dibagi menjadi dua golongan, yaitu Gram positif dan Gram negatif. Bakteri

Gram negatif mengandung lipid lemak atau substansi seperti lemak dalam persentase

lebih tinggi daripada yang dikandung bakteri Gram positif. Dinding sel bakteri Gram

negatif juga lebih tipis daripada sel bakteri Gram positif (Pelczar & Chan, 2008).

Penggolongan bakteri dapat didasarkan pada sifat patogenitas, genetika, ekspresi

fenotipe, bentuk sel, sifat pewarnaan, sifat pertumbuhan dan metabolisme.(Hiaranya

dkk, 2017)

2.4.3 Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Tanah

Isolasi adalah suatu cara untuk memisahkan mikroorganisme tertentu dari

lingkungan, sehingga diperoleh biakan yang tidak tercampur dengan jenis yang lain

atau biakan murni (Ganjar et al., 1992, 20) Tujuan mengisolasi bakteri adalah untuk

mendapatkan bakteri yang diinginkan dengan cara mengambil sampel mikroba dari

lingkungan yang ingin diteliti. Dari sampel tersebut kemudian dikultur/ dibiakkan

dengan menggunakan media universal atau media selektif, tergantung tujuan yang

ingin dicapai (Tortora, 2010) dalam (Bambang 2012, 41-42).

2.4.4 Pewarnaan Gram Positif dan Negatif

Pewarnaan gram adalah suatu metoda untuk membedakan spesies bakteri

menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negatif. Penentuan gram

positif dan gram negatif ini didasarkan pada sifat fisika dan kimia dinding sel mereka
(Karmana, 2008). Hasil pewarnaan gram positif dan negatif berasal dari reaksi

dinding sel terhadap tinta safranin atau kristal violet. Beberapa bakteri tidak terwarnai

dengan pewarnaan gram karena dinding selnya mengandung banyak lipid (James,

2002).

Prinsip pewarnaan gram adalah kemampuan dinding sel terhadap zat warna

dasar(kristal violet) setelah pencucian alkohol 96%. Bakteri gram positif terlihat lebih

berwarna ungu karena dinding selnya mengikat krystal violet lebih kuat, sedangkan

bakteri gram negatif mengandung lebih banyak lipid sehingga pori-pori mudah

membesar kemudian krystal violet mudah larut saat pencucian alkohol

(Dwidjoseputro, 2005). Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang lebih

sederhana, dengan jumlah peptidoglikan yang relatif banyak. Dinding sel bakteri

gram negatif memiliki peptidoglikan yang lebih sedikit dan strukturalnya lebih

kompleks (campbell, 2003)

Edwin (2011) menjelaskan banyak spesies bakteri gram negatif yang bersifat

patogen, ini berati bebahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini berhubungan

dengan komponen pada dinding sel gram negatif, terutama lapisan lipopolisakarida.

Lipopolisakarida yang terdapat pada sel dinding bakteri gram negatif sering bersifat

toksik atau racun. Bakteri gram negatif umumnya lebih resisten dibandingkan gram

positif karena membran bagian luar itu mengahalangi masuknya obat-obatan

(Campbell, 2003).
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu:

1. Zat warna utama (violet kristal)

2. Mordan (larutan iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan

warna utama.

3. Pencuci/ peluntur warna (alkohol/ aseton) yaitu solven organic yang

digunakan untuk melunturkan zat warna utama

4. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali

sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alcohol.

2.5 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis adalah salah satu metode pemisahan kromatografi

yang fleksibel dan banyak digunakan. Metode analisis kromatografi lapis tipis (KLT)

telah menjadi bagian dari teknik analisis rutin pada laboratorium analisis dan

pengembangan produk karena memiliki beberapa keuntungan. Keuntungan utama

metode analisis kromatografi lapis tipis dibandingkan metode analisis kromatografi

cair kinerja tinggi adalah analisis beberapa sampel dapat dilakukan secara simultan

dengan menggunakan fase gerak dalam jumlah kecil sehingga lebih hemat waktu dan

biaya analisis serta lebih ramah lingkungan. Teknik pemisahannya sederhana dengan

peralatan yang minimal (Wulandari Lestyo, 2011).

2.6 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun

1960 dan 1970. Saat ini, sudah sangat luas digunakan sebagai teknik pemisahan baik

untuk analisis sampel dan pemurnian dalam variasi sampel baik dalam bidang

farmasi, bioteknologi, lingkungan, polimer dan industri makanan (Settle, 1997).

Pada KCKT , fase diam berupa kolom modern dengan partikel yang sangat kecil

(ditempatkan dalam kolom tertutup), sedangkan fase gerak berupa cairan yang

dialirkan ke kolom menggunakan bantuan pompa dan terdapat detektor yang sensitif

(McMaster,2007). Kromatografi adsorpsi, terjadi interaksi antara solut pada

permukaan fase diam, dimana fase diam berupa adsorben polar padat (silika,

alumina). Kromatografi partisi berdasarkan partisi analit dalam fase gerak cair dan

fase diam cair yang tidak saling bercampur dan terikat pada penyangga kolom karena

adanya perbedaan kelarutan komponen sampel dalam kedua fase ( Moffat, 2005).

KCKT adalah sebagai berikut, Reservoir untuk fase gerak, Pompa, Injektor,

Kolom, Detektor, Sistem pengolah data (Recorder / Integrator / PC-Based Software),

Termostat untuk kolom dan detektor apabila diperlukan. (Kantasubrata, 2004)

Gambar 2. Skematis alat KCKT (kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

Gambar 3. Komponen KCKT (kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

 BAB III. METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan Bulan April-Juni 2021 bertempat di Laboratorium

Mikrobiologi dan Bioteknologi Universitas Andalas.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Cawan petri, Jarum ose,

coverglass, Labu Erlemeyer, Bunsen, Lumpang,Stamper, Sudip, Laminar air flow,

Mikro Pipet, Gunting, Pisau, Sentrifus, autoclave, Sendok stainlees steel, oven,

Neraca Analitik, Gelas Ukur, Labu Ukur, Pipet Tetes, vortex, KLT (Kromatografi

Lapis Tipis), KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi), hot plate, mikroskop,

aluminium foil, cawan porselin, Lemari asam, magnetic stirrer, inkubator, vial,

corong kaca, batang pengaduk, spiritus,swab steril, kapas, benang, tabung reaksi dan

rak, spatel, pinset, labu takar, adapun peralatan yang digunakan adalah Kromatograf

(Hitachi Seri 7000), kolom ODSHypersil, 5 μm, panjang 200 × 4,6 mm (Hewlett

Packard), alat ultrasonikasi, pH meter (Beckman), pompa vakum.

3.2.2 Bahan

Antalgin powder, air bersih, alkohol 70%, etanol, aquadest steril, tanah, NaCl,

media NA (Nutrient Agar), Violet Kristal, Mordan (Lar. Iodin), Lar. Safranin, Asam
fosfat, Aquabidest, KOH, Asetonitril, MgSO4.7H2O, (NH4)2HPO4, KHPO4, K2HPO4,

FeSO4.7H2O, MgSO4.7H2O, CaCl.2H2O, CuCl2, ZnSO4.7H2O, HCl 0,1N

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Pengambilan Sampel Tanah

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah tanah pada tumpukan

sampah. Diambil sebanyak 10 gram diperoleh dari 10 titik daerah Kecamatan Koto

Tangah, Padang, Sumatra Barat.

3.3.2 Sterilisasi Alat

Alat-alat yang diperlukan dicuci bersih, wadah mulut lebar dibersihkan. Alat-

alat dikeringkan dengan posisi terbalik diudara terbuka setelah kering dibungkus

dengan kertas perkamen. Tabung reaksi dan gelas erlemeyer terlebih dahulu disumbat

dengan kapas bersih. Alat-alat dari kaca disterilkan di oven pada suhu 180 selama 2

jam. Alat-alat suntik dan alat-alat plastik lainnya (tidak tahan pemanasan tinggi)

disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 selama 15 menit dengan tekanan 2 atm.

Jarum ose disterilkan dengan pemanasan langsung hingga memijar.

3.3.3 Pembuatan Media NA

Ditimbang sebanyak 20 g media nutrient agar dimasukkan kedalam labu yang

sudah berisi 1 liter aquades. Kemudian dipanaskan diatas hot plate hingga mendidih

sambil dihomogenkan menggunakan magnetic stitter. Lalu dilakukan sterilisasi

menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 sampai memadat (Maryanti,

2015).

3.3.4 Isolasi Bakteri Dari Tanah

Ambil sampel tanah 1 g dan dilarutkan dalam 9 ml NaCl 0,85% fisiologis,

lalu divorteks (pengenceran 10-1). Hasil dari suspensi tanah 10-1 dibuat pengenceran

bertingkat hingga 10-10 menggunakan NaCl fisiologis. Hasil pengenceran 10-4 hingga

10-10 kemudian dikultur pada media Nutrient Agar (NA), lalu Kemudian diinkubasi

pada suhu 37OC selama 24 jam. Penumbuhan bakteri dilakukan dengan menggunakan

teknik pour plate. Koloni yang tumbuh pada rentang 25-250 koloni dihitung dan nilai

TPC (Total Plate Count).

3.3.5 Pengamatan Morfologi Koloni dan Pemurnian Bakteri

Pengamatan morfologi secara makroskopis dilakukan dengan cara mengamati

morfologi koloni yang terbentuk dari bakteri, meliputi jumlah koloni, warna, bentuk

koloni dan tepi koloni.

Pemurnian bakteri dilakukan dengan mengambil koloni yang tumbuh terpisah

dan menunjukkan karakter morfologi yang berbeda dengan cara menginokulasikan

isolat pada media NA baru dengan metode streak kuadran sehingga diperoleh koloni

tunggal. Inkubasi dilakukan pada suhu selama 48 jam. Koloni tunggal pada

cawan pet ri kemudian diinokulasikan ke media agar NA miring sebagai stok bakteri

menggunakan loop ose. Inkubasi dilakukan pada suhu 370C selama 48 jam.
3.3.6 Peremajaan Bakteri
Peremajaan isolat bakteri dilakukan pada bakteri yang telah di murnikan.

Peremajaan isolat dilakukan dengan mengambil 1 ose isolat dari stok agar miring

media NA. Peremajaan ini bertujuan untuk membuat isolat tetap hidup dengan cara

dipindahkan ke media lain. Proses inokulasi isolat menggoreskan di agar miring

menggunakan ose dilakukan di laminar air flow. Isolat bakteri disimpan dan

diinkubasi dalam suhu ruang selama 24 jam.

3.3.7 Pewarnaan Gram Bakteri

Jarum ose koloni bakteri dioleskan diatas permukaan kaca objek. Fiksasi

bakteri di lakukan dengan cara melewatkan kaca objek diatas nyala bunsen sebanyak

2-3 kali. Kemudian ditambahkan larutan kristal violet selama 1 menit, lalu dicuci

dengan air. Beri larutan lugol selama 1 menit, lalu dicuci dengan air. Beri larutan

pemucat (alkohol) selama 10-20 detik. Beri larutan safranin selama 15 detik, lalu

dicuci dengan air. Kemudian dikeringkan dengan kertas saring. Periksa dengan

mikroskop 100 kali dan diamati warna bakteri yang terlihat pada mikroskop,warna

merah menunjukan bakteri gram negatif dan warna ungu menunjukan gram positif.

3.3.8 Biotransformasi Bakteri

3.3.8.1 Pembuatan Media Cair Bakteri

Sumber karbon menggunakan glukosa sebanyak 15 g dilarutkan kedalam 1

liter air suling. Disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 oC dan tekanan 15 lbs

selama 15 menit.
Sumber nitrogen dibuat dengan melarutkan 1,1 g (NH)2HPO4 dalam 1 liter air

suling. Disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 15 lbs selama 15

menit. Larutan MgSO4.7H20 I M dibuat dengan melarutkan 61,5 g MgSO.7H20 IM

kedalam 250 ml aquadest. Lalu sterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121 ° C

dengan tekanan 15 Ibs selama 15 menit.

Larutan dapar fosfat PH-7 dibuat dengan cara melarutkan 3,7 g KH PO 4 dan

5,8 g K2HPO4 kedalam 1 liter air suling. PH larutan 7. Jika PH kurang dari 7

dinaikkan dengan menambahkan NaOH 0,1 M. kemudian disterilkan dengan autoklaf

pada suhu 121 ° C dengan tekanan 15 Ibs selama 15 menit.

Pembuatan larutan mikroelemen dilakukan dengan cara melarutkan sebanyak

2,78 g FESO4.7H20: 1,98 g MNC12 4H; O: 2,81 g CuSO, 7H20: 1,67 g CaCl. 2H2O:

0,17 g CuC12: dan 0,29 g ZnSO4. 7H; 0 kedalam 1 liter HCI 0,1N. larutan

mikroelemen disterilkan dengan autoklaf dengan suhu 121 °C dan tekanan 15 lbs

selama 15 menit. Pertumbuhan media yaitu bakteri spesifik spesifik dengan

komposisi untuk 100 ml medium adalah sebagai berikut: sumber karbon dengan

kadar glukosa 15 g/L, sumber nitrogen (NH)HPO, 0,11g, MgSO 4.7H2O 1M 10Ml,

larutan miroelemen 1 mL dan larutan dapar fosfat ad 100 mL.

3.3.8.2 Proses Biotransformasi Bakteri

Proses biotransformasi dilakukan didalam labu erlemeyer volume 500 ml

yang diisi dengan 100 ml media pertumbuhan bakteri. Dalam penelitian ini dibuat

kultur bakteri pada media cair terlebih dahulu. Setelah itu diinkubasi selama 24 jam

dan ditambahkan larutan Antalgin dengan variasi konsentrasi berbeda 0,01 %, 0,1 %
dan 1 % v/v lalu inkubasi sampai terbentuk koloni selama 72 jam dengan

menggunakan stirrer suhu 30°C dengan kecepatan 150 rpm selanjutnya larutan

disentrifigus dengan kecepatan 6.000 rpm untuk memisahkan massa bakteri dan

filtratnya, fitratnya tersebut dilaruttkan dengan larutan methanol.

3.3.9 Pengujian Senyawa Hasil Biotransformasi dengan KLT

Plat KLT, chamber dan bahan yang akan digunakan disiapkan. Eluen dibuat

dengan campuran etil asetat dengan asam asetat glasial (24:1) dengan total volume

100 mL dengan mencampur larutan etil asetat sebanyak 96 ml dan larutan asam asetat

glasial sebanyak 4 ml kemudian dimasukkan dalam chamber. Chamber dijenuhkan

menggunakan kertas saring, jika kertas saring sudah basah menandakan chamber

sudah terjenuhkan oleh pelarut. Senyawa hasil Biotransformasi bakteri dan standar

pembanding antalgin ditotolkan dengan tabung mikrokapiler pada plat KLT dengan

jarak 1,5 cm dari bagian bawah plat dan jarak antar noda 1,5 cm biarkan hingga

kering. Plat KLT dimasukkan ke dalam chamber dan diamati. Pelarut dibiarkan

merambat dengan jarak rambat elusi 8 cm dari totolan. Setelah mencapai jarak elusi,

plat KLT dikeluarkan dan dikeringkan. Kromatogram dilihat di bawah sinar

ultraviolet kemudian tandai bercak menggunakan pensil.

Nilai faktor retensi (Rf) dihitung:

Rf = Jarak yang ditempuh substansi/Jarak yang ditempuh oleh pelarut

3.3.10 Pengujian Senyawa Hasil Biotransformasi Bakteri Dengan KLT

Preparatif

Kromatografi lapis tipis preparative menggunakan plat kaca berukuran 20 x

20 cm. Serbuk TLC-Kieselgel 60 GF254 dilarutkan dengan aquadest dengan

perbandingan (30 gram: 60mL) larutkan hingga homogen lalu tuangkan ke plat kaca

selanjutnya dengan memanaskan selama 30 menit pada suhu 170 oC. Apabila plat

telah kering lalu totolkan sampel memanjang membentuk pita pada plat kaca dan

dielusi dengan fase gerak Etil Asetat : Asam Asetat Grasial (48 : 2, v/v). Plat kaca

dikeringkan dan diamati dengan sinar UV dengan panjang gelombang 254 nm dan

366 nm. Pengambilan senyawa hasil KLT preparatif dengan cara dikerok dan

hasilnya dilarutkan dengan pelarut Asam Fosfat 4% kemudian di saring dan di

masukkan ke wadah (vial).

3.3.11 Pengujian Senyawa Hasil Biotransformasi dengan KCKT

Larutan hasil Biotransformasi bakteri yang sudah dilakukan KLT preparatif

dengan konsentrasi 100 ppm diinjeksikan sejumlah 20 µL melalui injector ke dalam

KCKT, digunakan kecepatan alir hasil optimasi dan detektor PDA diatur pada λ

270nm. Eluen yang digunakan yaitu Asetonitril dan Dapar fosfat pH 3,72. Diperoleh

kromatogram untuk tiap injeksi yang akan digunakan untuk menentukan kadar

penyuntikan larutan baku, yang dinyatakan dalam waktu retensi, luas puncak, tinggi

puncak, faktor kapasitas, selektivitas, efisien kolom.

 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 HASIL

Telah dilakukan penelitian tentang Biotransformasi Senyawa Obat Antalgin

Dengan Bakteri Hasil Isolasi Dari Tanah Maka yang didapatkan sebagai berikut:

1. Dilakukan isolasi bakteri tanah di dapatkan hasil dari pengenceran 10 -4-10-10

yang di dapat yaitu jumlah koloni bakteri 227 dan jumlah bakteri yang

berbeda ada 20 isolat pada tabel Hasil Isolasi Bakteri Dari Tanah;

Tabel 1. Hasil Isolasi Bakteri Dari Tanah

Pengenceran Jumlah Koloni Bakteri Jumlah Isolat
10 -4
93 4
10-5 61 1
10-6 50 8
10 -7 19 2
4
10 -8
3
-
10 -9
-
-
10-10
-
Jumlah 227 20

2. Pengujian KLT hasil yang di dapat ada 3 larutan hasil biotransformasi dengan

noda yang berbeda, nilai Rf pada hasil pengujian KLT menunjukkan noda-

noda yang berbeda yaitu;

a. Antalgin murni (baku standar) memiliki 1 noda yang nilai Rf 0,562 cm

b. Antalgin 0,1% Isolat 5-2 memiliki 2 noda yang berbeda yaitu nilai Rf

0,862 cm dan 0,55 cm

 c. Antalgin 0,1% Isolat 6-6(a) memiliki 3 noda yang berbeda yaitu nilai

Rf 0,825 cm, 0,775 cm dan 0,575 cm

d. Antalgin 0,1% Isolat 8-3 memiliki noda yang berbeda yaitu nilai Rf

0,837 cm, 0,587 cm dan 0,537 cm

Pengujian KLT Hasil Biotransformasi Bakteri;

Tabel 2. Pengujian KLT Hasil Biotransformasi Bakteri

Sampel Nilai Rf (cm)

Antalgin murni (Baku Satandar)

Antalgin 0,1 % Isolat 5-2

Antalgin 0,1 % Isolat 6-6 (a)

Antalgin 0,1 % Isolat 8-3

3. Dari hasil pemeriksaan scrining biokimia sampel bakteri isolasi tanah lalu

didapatkan jenis dari bakteri tersebut yaitu Isolat 5-2 Bacillus Sp.1, Isolat 6-

6(a) Bacillus Sp.2, Isolat 8-3 Bacillus Sp. 4 (Tabel.4)

 Tabel 4. Pemeriksaan Scrining Biokimia

Koloni Yang diproses

NO. Perlakuan Isolat 5-2 Isolat 6-6(a) Isolat 8-
3
1 Blood Agar (BA) NP + + +
2 Mac Conkey Agar
3 Koloni (Warna, bentuk, Putih Putih Putih
sifat)
4 Hemolysis
5 Gram (Morfologi, Spora + bac + bac + bac
dll)
6 Aerob/Anaerob Aerob Aerob Aerob
7 TSIA + - +
8 Gas - - -
9 H2S - - -
10 Catalase
11 Oxidase
12 Mortilitas + + +
13 Indol - - -
14 Urea + + +
15 Citrat - - -
16 Laktosa - - -
17 Sukrosa -
18 Mannitol
19 MR (Methyl Red) - + -
20 VP (Voges Proskauer) - - +
21 OF (Oksidasi Fermentasi) - - -
22 Gelatin + + +
4.2 PEMBAHASAN

Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba

tertentu dari lingkungan, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Sampel

yang digunakan merupakan tanah disekitar sampah organik yang terletak di

kecamatan Koto Tangah, Padang.

Pengamatan morfologi dilakukan pada semua isolat yang berhasil diisolasi,

yaitu berasal dari pengenceran 10-4-10-8. Pengamatan tersebut meliputi jumlah koloni,

warna dan tepi koloni. Tujuan dari pengamatan morfologi ini adalah untuk

mengetahui karakter morfologi dari suatu isolat. Dari hasil pengamatan morfologi

yang di seluruh petri tersebut didapatkan hasil bahwa isolat terbanyak memiliki tepi

yang licin, selain itu warna dari koloni yang didapat warna putih.

Setiap koloni tunggal yang memiliki morfologi berbeda pada hasil isolasi,

ditumbuhkan pada media NA. Hal ini bertujuan untuk mendapatkan isolat yang murni

atau berupa koloni tunggal. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya

berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal. Pada tahap ini, isolat bakteri yang

berwarna putih dilakukan pemurnian dengan streak kuadran, lalu didapatkan adanya

single koloni. Tahap berikutnya adalah mengambil isolat dari hasil streak kuadran

dan dibuat stok pada media NA agar miring, kemudian diberi nama masing-masing

isolat.

Identifikasi Bakteri dimana bakteri ditumbuhkan pada medium tumbuh untuk

mengetahui jenisnya. Bakteri diidentifikasi melalui uji morfologi secara langsung

dengan mikroskop dan dengan pewarnaan gram serta uji fisiologis dan uji biokimia.
 Dalam penelitian ini tujuan Biotransformasi yaitu melakukan modifikasi

struktural dalam suatu bahan kimia senyawa oleh organisme / sistem enzim yang

mengarah ke pembentukan molekul dengan polaritas yang relatif lebih besar, Metode

ini dapat mengubah struktur ratai karbon tanpa mengubah karakteristik dasar suatu

senyawa (Singh, R. 2017).

Biotransformasi menggunakan kultur bakteri dari isolat tanah merupakan

salah satu sarana untuk memodifikasi struktur senyawa obat agar diperoleh senyawa

dengan sifat fisiko kimia. Beberapa kultur bakteri dari isolat tanah mampu melakukan

berbagai jenis reaksi biotransformasi terhadap beberapa senyawa obat yang

ditambahkan ke dalamnya, dibutuhkan waktu adaptasi yang lebih lama. Walaupun

mempunyai waktu adaptasi yang cukup lama, bakteri ini tetap mampu memanfaatkan

campuran antalgin sebagai satu-satunya sumber karbon, nitrogen, dan energi untuk

pertumbuhannya.

Dari hasil biotransformasi menggunakan konsentrasi antalgin yang berbeda-

beda yaitu 0,01%, 0,1%, 1% dengan 20 isolat bakteri selama 72 jam di shaker.

Berdasarkan pengujian dengan KLT hanya konsentrasi antalgin 0,1% yang

tertransformasi oleh bakteri. Pada konsentrasi 0,01% noda saat pengujian klt tidak

terdeteksi, pada konsentrasi 1% bakteri tidak mampu melakukan pertumbuhan secara

optimal karna jumlah senyawa antalgin yang cukup banyak.

Pengujian KLT hasil yang di dapat ada 3 larutan hasil biotransformasi dengan

noda yang berbeda, nilai Rf pada hasil pengujian KLT menunjukkan noda-noda yang

memiliki kemampuan laju paling baik diantara noda-noda lainnya, dan dimungkinan
senyawa aktifnya. Lalu dilakukan KLT Preparatif noda yang di dapat lalu dikerok dan

dilarutkan dengan As. Fosfat 4% dilanjutkan ke pengujian KCKT.

Telah dilakukan penelitian dengan pengujian KCKT yang bertujuan untuk

memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya pisah tinggi, dan

metode ini cepat, peka, akurat, tepat, reproducible dan preparatif. Kromatografi

merupakan teknik pemisahan yang melibatkan transfer massa antara fase diam dan

fase gerak (Ramjith et al, 2013). Dapat dianalisis dengan menggunakan kromatografi

cai kinerja tinggi (KCKT).

Prinsip kerja KCKT adalah pemisahan komponen analit berdasarkan

kepolarannya, setiap campuran yang keluar akan terdeteksi dengan detektor dan

direkam dalam bentuk kromatogram. Dimana jumlah peak menyatakan jumlah

komponen, sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran

(Hendayana, 2006)

Berdasarkan tingkat kepolaran pada fase gerak dan fase diam yang digunakan,

maka sistem kromatografi yang diterapkan adalah sistem kromatografi fase terbalik

dimana fase gerak yang digunakan lebih polar dibandingkan fase diamnya yaitu

kolom C18. Penambahan acetonitril sebagai fase geraknya adalah untuk menambah

eluen strength dari fase gerak yang digunakan, dimana acetronitril memiliki eluen

strength yang lebih kuat dibandingkan dengan larutan sejenisnya seperti methanol

yaitu 1,0 (Sadek, 2002).

 Fase gerak yang digunakan mengandung larutan buffer dimana larutan buffer

tersebut digunakan dalam sistem KCKT apabila analit merupakan senyawa yang

mudah terionisasi dengan adanya pengaruh pH. Fungsi dari larutan buffer tersebut

adalah untuk mempertahankan pH sistem, sehingga analit akan berada pada satu

bentuk ionisasi (Ayesa 2011).

Pembuatan Baku Induk Antalgin ditimbang secara saksama lebih kurang 5 mg

baku antalgin, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 5,0 mL dan dilarutkan

dengan asam fosfat 4% sampai tanda batas labu ukur. Diperoleh konsentrasi lebih

kurang 1 mg/mL = 1000 µg/ml = 1000 ppm.

Dalam penelitian ini untuk pengujian KCKT fase gerak yang digunakan yaitu

Asetonitril dan Dapar fosfat pH 3,72, Kecepatan alir yang digunakan adalah 1,0

mL/menit dan dideteksi pada panjang gelombang λ 270nm dengan detektor PDA.

Kemudian dicatat waktu retensi (tR), dihtung faktor ikutan (Tf), jumlah lempeng

teoritis (N), dan HETP. Didapatkan hasil dari pengujian KCKT di sampel Antalgin

0,1% isolat (5-2, 6-6(a), 8-3) dengan senyawa antalgin (zat pembanding) dan didapat

waktu retensi yang berbeda. Hal ini dapat dilihat dari adanya puncak-puncak

kromatogram yang berbeda-beda teridentifikasi dari hasil analisis KCKT.

Hasil pemeriksaan scrining biokimia sampel bakteri isolasi tanah lalu

didapatkan jenis dari bakteri tersebut yaitu Isolat 5-2 Bacillus Sp.1, Isolat 6-6(a)

Bacillus Sp.2, Isolat 8-3 Bacillus Sp. 4 untuk pewarnaan gram didapatkan Gram

positif
 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN

.1 KESIMPULAN

1. Dari isolasi sampel bakteri isolasi tanah lalu didapatkan karakteristik bakteri

Isolat 5-2 Jenis bakteri Bacillus Sp.1,Isolat 6-6(a) jenis bakteri Bacillus Sp.2, 8-3

Bacillus Sp. 4 untuk pewarnaan gram didapatkan gram positif

2. Dari hasil analisa KCKT didapatkan puncak baru yaitu hasil biotransformasi

senyawa antalgin diperoleh.

.2 SARAN

1. Disarankan kepada peneliti selanjutnya agar dilakukan pengujian FT-IR, MS

(Mass Spectrometer) dan spektrometri Nuclear Magnetic Resonance (NMR)

untuk menentukan struktur kimianya terhadap senyawa hasil biotransformasi.

 DAFTAR PUSTAKA

Binar Alkes. 2015. Hak Pasien Memilih Obat Generik. Departemen Kesehatan RI,
Jakarta: 26
Crueger, W dan Crueger, A. 1984. Biotechnology A textbook of Industrial
Microbiology Brock, 54 – 55, Science Tech, Inc, Madison.
Damanik, L.S. 2016. Analisis Kadar Metampiron Dalam Tablet Antalgin 500 mg di
PT. Kimia Farma (Persero) Tbk Plant Medan Secara Titrasi Iodimetri.
Medan: Universitas Sumatera Utara. Halaman 12-1
Ditjen POM. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta: Departemen Kesehatan.
Halaman 4-5, 649-650.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (1995). Farmakope Indonesia,Edisi
Keempat. Jakarta : Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 210,537.
Dwidjoseputro, 1982.Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan. Farida
Juliantina R, Citra Dewa Ayu, Bunga Nirwani, Titis Nurmasitoh, Endrawati
Tri Bowo, 2009
Fatmawati, D.A., Widjaja, B., Setyawan, B. 2017. Optimasi Tablet Levofloksasin
yang Mengandung Bahan Pengikat PVP K-30 dan Disintegran Vivasol.
Jurnal Sains Farmasi & Klinis. 4(2): 10.
Fink-Gremmels, J., van Miert, A.S.J.P.A.M. 1994. Veterinary drugs: disposition,
biotransfomation and risk evaluation. Analyst 119, 2521–2528.
Frank, C, L. 1995. Toksikologi Dasar Asas, Organ Sasaran, dan Penilaian Resiko.
Jakarta: UI- Press.
Gandjar, I. G. dan Rohman, A. 2007.Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar,
Yogyakarta.
Gu JD. 2003. “Microbial deterioration and degradation of syntheticpolymeric
materials: recent reserach advances”, International Biodeterioration
Biodegradation 52: 69-91.
Hajar, Dachniar. 2012. Isolasi, Identifikasi, Dan Analisis Kemampuan Degradasi
Hirokarbon Bakteri Tanah Sampel B, Cilegon, Banten. Skripsi. Depok:
Universitas Indonesia.
Harmita. 2006. Analisis Kuantitatif Bahan Baku dan Sediaan Farmasi.
Depok : Departemen Farmasi FMIPA Universitas Indonesia. 157-
165.
Hartanti. 2010.Isolasi dan Seleksi Bakteri Selulolitik Termofilik dari Kawah Air
Panas Gunung Pancar. Bogor: IPB.
Harayama, S.K, Biodegradation of Crude Oil. Program and Abstracts in the First
Asia-Pasific Marine Biotechnology Conference. Shimizu, Shizuoka, Japan,
1995.
Healty.2012. Percobaan Pemanfaatan Kromatografi Lapis Tipis Dalam Analisis
Identifikasi Jamu Palsu.Ghalib, Jakarta: 37-38.
Harvey, D. 2000. Modern Analytical Chemistry, New York: McGraw Hill. 576-586
Huang JC, Shetty AS, Wang MS. 1990. “Biodegradable plastics: A review.”,
Advances in Polymer Technology 10:23-30.
Indah Nur, Sari. 2014. Isolasi Dan Karakterisasi Bakteri Tanah Di Kecamatan
Pattallassang Kabupaten Gowa. Uin Alauddin Makassar: Makassar.
Lucas, N., Bienaime, Ch., Belloy, Ch., Queneudec, M., Silvestre, F., Nava-Saucedo,
J.E., 2008. “Polymer biodegradation: mechanisms and estimation
techniques: review”, Chemosphere 73: 429-442
Lachman, L. 1994. Teori dan Praktek Farmasi Industri. Jakarta: Universitas
Indonesia Press. Halaman 645-646..
McMaster, M.C. 2007. HPLC A Parctical User’s Guide 2 th Ed. USA : John
Willey & Sons. 3-13.
Moffat, A.C., et al. 2005. Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons Pharmaceutical
Press. Harvey, D. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York:McGraw
Hill. 578- 586.
Nanda, S & Smiti Sbigdha Sahu. 2010. Biodegradability of polyethylene by
Brevibacillus, Pseudomonas, and Rhodococcus spp. New York Science
Journal 3: 95-98
Pelczar, Michael J. Ecs. Chan. 2008. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta. Ui Press.
Pratiwi, T. Sylvia. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga.
Ramjith, US, DK Sunith, Smrithi R., PA Sammer. 2013. HPLC Study of Aspirin and
Aspirin Derivatives. IRJPRC. 3(1). p1-5.
Reanida, Pramita Putri, Agus Supriyanto dan Salamun. 2012. Eksplorasi Bakteri
Selulolitik Dari Tanah Mangrove Wonorejo Surabaya. Universitas Airlangga:
Surabaya.
Rohman, A. 2014. Spektroskopi inframerah dan kemometrika untuk analisis farmasi.
Yogyakarta: Pustaka pelajar. Halaman 1-2, 48-61, 66-67, 79-84.
Salim, E., Fatimah, C., Fanny, D.Y. 2017. Analgetic Activity of Cep-cepan
(Sauraulia Cauliflora DC.) Leaves Extract. Medan: Universitas Cut Nyak
Dhien. Halaman 31-32.
Tan, H.T., Rahardja, K. 2007. Obat-Obat Penting Kasiat, Penggunaan dan Efek-efek
Sampingnya. Edisi Keenam. Cetakan Pertama. Jakarta: Penerbit PT. Elex
Media Komputindo. Halaman 192.
Wellings, D.A. 2006. A Practical Handbook of Preparative HPLC. UK:
Elsevier Ltd. 1-5.
Wulandari, L. 2011. Kromatografi Lapis Tipis. Universitas Jember: Jember
Lampiran 1. Skema kerja pembuatan Media NA

Ditimbang
sebanyak 20 g
media nutrient
agar

Labu (yang sudah berisi 1 L

Aquadest)

Dipanaskan diatas hot plate

hingga mendidih sambil
dihomogenkan menggunakan
magnetic stitter

Sterilisasi menggunakan autoklaf

Biarkan ± 15
menit suhu
121 sampai
memadat

Gambar 4. Skema Pembuatan Media NA (Nutrient Agar)

Lampiran 2. Skema kerja Skema Isolasi Bakteri Dari Tanah

Ambil sampel tanah 1 g yang telah di

campurkan dari 10 titik tempat yang berbeda

Dilarutkan dalam 9 mL NaCl

0,85% b/v Fisiologis
Lalu dibuat pengenceran bertingkat

Pengenceran 10-2 samapi

Pengenceran 10-10

Hasil pengenceran 10-4 hingga

10-10 kemudian dikultur pada
media Nutrient Agar (NA)

Diinkubasi pada suhu 37OC

selama 24jam

Penumbuhanbakteridilakukan
dengan menggunakan teknik
pour plate

Gambar 5. Skema Isolasi Bakteri Tanah

Lampiran 3. Skema kerja Pengamatan Morfologi Koloni dan Pemurnian
Bakteri

Koloni tunggal pada cawan petri kemudian

diinokulasikan ke media agar NA
miringmenggunakan loop ose

Inkubasi dilakukan pada suhu

370C selama 48 jam

Diperoleh koloni tunggal

Gambar 6. Skema Pengamatan Morfologi Koloni dan Pemurnian Bakteri

37
Lampiran 4. Skema kerja Pewarnaan Gram Bakteri

Dibersihkan preparat glass

dengan alkohol 70%

Difiksasi di atas bunsen

Jarum ose koloni

bakteridioleskandiataspreparat glass

Difiksasi di atas bunsen 2-3

kali
Ditambahkan larutan kristal
violet selama 1 menit

Dicuci dengan air

Berilarutan lugol selama 1
menit

Dicuci dengan air

Beri lar. Alkohol selama 10-

20 detik
Lalu Beri larutan safranin
selama 15 detik

Dicuci dengan air

Dikeringkan dengan kertas

saring

Periksa dengan mikroskop100 kali dan

diamati warna bakteri yang terlihat

Gambar 7. Skema Proses Pewarnaan Gram Bakteri

38
Lampiran 5. Skema kerja Biotransformasi Bakteri

Dibuat kultur bakteri pada

media cair terlebih dahulu

100 ml media pertumbuhan

bakteri di dalam labu
erlemeyer volume 500mL

Diinkubasi selama 24 jam

ditambahkan larutan Antalgin konsentrasi (,01

%, 0,1 %, 1 % v/v)

Di shaker dan Inkubasi

selama 72 jam suhu 30°C
dengan kecepatan 150 rpm
Disentrifigus dilakukan terhadap cairan kultur
bakteri dengan kecepatan 6.000 rpm

Biomassa yang terdapat pada endapan dibawah

di larutkan dengan pelarut (Metanol)

Gambar 8.Skema Proses Biotransformasi Bakteri

39
Lampiran 6. Skema kerja Pembuatan Eluen

Etil asetat(96 ml) + Asetat Chamber Chamber dijenuhkan

glasial (4 ml) menggunakan kertas saring

Jika kertas saring sudah

basah (chambe sudah
terjenuh oleh pelarut)

40
Lampiran 7. Pengujian dengan KLT
Hasil Biotransformasi Bakteri dan pembanding
(antalgin) ditotolkan dengan tabung mikrokapiler

‘
Pada plat KLT dengan jarak 1,5 cm
biarkan hingga kering
Plat KLT dimasukkan ke
dalam chamber dan diamati

Pelarut dibiarkan merambat

denganjarak rambat elusi 8 cm dari
totolan
Setelah mencapai jarak elusi, plat KLT
dikeluarkan dan dikeringkan

Kromatogram dilihat di
bawah sinar Ultraviolettandai
bercak menggunakan pensil

Hitung Nilai Rf

Gambar 9. Skema Pengujian Senyawa Hasil Biotransformasi Bakteri dengan

KLT

41
Lampiran 8. Skema kerja Pengujian Senyawa Hasil Biotransformasi Bakteri
dengan KCKT

Larutan Biotransformasi Bakteri(100

ppm)

Diinjeksikan sejumlah 20 µL

Detektor PDA diatur pada λ 270nm

Diperoleh kromatogram
untuk tiap injeksi

Digunakan untuk
menentukan kadar
penyuntikan larutan baku

Gambar 10. Skema Pengujian Senyawa Hasil Biotransformasi Bakteri

dengan KCKT

42
Lampiran 9. Hasil isolasi yang dimurnikan di cawan petri

Pemurnian Pertama Pemurnian Ke-2

Gambar 11. Isolat bakteri 6-6 (a)

Pemurnian Pertama Pemurnian Ke-2

Gambar 12. Isolat bakteri 8-3

Pemurnian Pertama Pemurnian Ke-2

Gambar 13. Isolat bakteri 5-2

43
Lampiran 10. Biotransformasi senyawa obat dengan bakteri

Gambar 14. Proses penyiapan sampel untuk proses biotransformasi

Gambar 15. Proses Biotransformasi Dishaker inkubator selama 72 jam

44
Lampiran 11. Hasil Dari Pengujian KLT

KET:
1. Pembanding
(Antalgin murni)
2. Sampel Hasil
Biotransformasi

1 2
1 2

Gambar 16. Hasil KLT Antalgin 0,1% Isolat 8-3

1 2
1 2

Gambar 17. Hasil KLT Antalgin 0,1% Isolat 5-2

1 2

Gambar 18. Hasil KLT Antalgin 0,1% Isolat 6-6 (a)

45
Lampiran 12. Hasil dari pengujian KCKT

Gambar 19. Kromatogram Hasil Pengujian KCKT Senyawa Antalgin

Gambar 20. Kromatogram Antalgin dengan Isolat 6-6 (a) Antalgin 0,1%

46
Gambar 21. Kromatogram Antalgin dengan Isolat 5-2Antalgin 0,1%

Gambar 22. Kromatogram Antalgin dengan Isolat 8-3 Antalgin 0,1%

47
Lampiran 13. Rincian kromatogram dari hasil pengujian KCKT

Peak Tabel Antalgin / 270nm :

Peak# Ret. Time Area Height Area% Height%
1 2.249 555482 54609 2.244 2.398
2 2.446 1296052 176337 5.237 7.742
3 4.971 21190327 1957970 85.620 85.967

Peak Tabel Antalgin 8-3 0,1% / 270nm :

Peak# Ret. Time Area Height Area% Height%
1 2.286 211999 20334 3.848 8.060
2 2.455 554847 75982 10.070 30.117
3 3.696 278157 23460 5.048 9.299
4 4.948 685730 49608 12.446 19.663

Peak Tabel Antalgin 6-6 (a) 0,1% / 270nm:

Peak# Ret. Time Area Height Area% Height%
1 2.287 216704 21267 3.919 5.373
2 2.445 575023 82492 10.398 20.842
3 3.431 167530 4875 3.030 1.232
4 4.845 1931525 193692 34.929 48.937

Peak Tabel Antalgin 5-2 0,1% / 270nm:

Peak# Ret. Time Area Height Area% Height%
1 2.451 528824 78101 7.518 27.103
2 3.699 302475 30939 4.300 10.373
3 4.960 1644814 117524 23.382 40.785
Tabel 3. Rincian kromatogram dari hasil pengujian KCKT

48
Lampiran 14. Uji Identifikasi Bakteri

Gambar 23. Surat Hasil Uji Laboratorium

49
Lmpiran 15. Tabel Hasil Identifikasi Bakteri

Gambar 24. Hasil Pengujian Identifikasi Bakteri

50
Lampiran 16. Tabel Hasil Uji Biokimia Pada Bakteri

Gambar 25. Hasil Uji Biokimia Pada Bakteri

51
Lampiran 17. Hasil Pewarnaan Gram

Gambar 26. Hasil Pewarnaan Isolat 8-3

Gambar 27. Pewarnaan Isolat 5-2

52
Gambar 28. Hasil Pewarnaan Isolat 6-6 (a)

53