PAPER KIMIA ORGANIK BAHAN ALAM

AKTIVITAS ANTIBAKTERI TERPEN DAN TERPENOID HADIR

DALAM MINYAK ATSIRI

DISUSUN OLEH:
BULAN SAFITRI / 2150006
SAFFANA MARYAM / 2150021
PROGRAM STUDI D4
NANOTEKNOLOGI PANGAN

KEMENTERIAN PERINDUSTRIAN REPUBLIK INDONESIA

BADAN PENGEMBANGAN SUMBER DAYA MANUSIA INDUSTRI
POLITEKNIK AKA BOGOR
BOGOR
2022
 KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur penulis panjatkan atas kehadirat Allah SWT yang telah memberikan
rahmat dan karunia-Nya kepada penulis. Sehingga dalam penyusunan tugas paper yang berjudul
“Aktivitas Antibakteri Terpen Dan Terpenoid Hadir Dalam Minyak Atsiri ” ini dapat diselesaikan
dengan baik. Tugas ini disusun untuk memenuhi tugas mata kuliah praktikum kimia organik bahan
alam.

Tim penulis menyadari bahwa laporan presentasi ini tidak dapat terselesaikan tanpa
dukungan dari berbagai pihak baik moril maupun materil. Oleh karena itu, penulis ingin
menyampaikan ucapan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyusunan
tugas ini, terutama kepada Chandra irawan M.Si dan Cysilia Kusuma, M.Farm selaku dosen
pengampu mata kuliah praktikum kimia organik bahan alam.

Penulis menyadari bahwa tugas ini masih jauh dari kata sempurna dikarenakan terbatasnya
pengetahuan yang dimiliki penulis. Oleh karena itu, penulis mengharapkan segala bentuk saran
serta masukan bahkan kritik yang membangun dari berbagai pihak. Semoga tugas ini dapat
bermanfaat bagi para pembaca dan semua pihak khususnya dalam bidang kimia organik bahan
alam.

Bogor, 8 April 2022

Tim Penulis
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ............................................................................................................... 2

DAFTAR ISI.............................................................................................................................. 3

ABSTRAK………………………………………………………………………….. 4

BAB 1

PENDAHULUAN………………………………………………………………….. 5

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA…………………………………………………………… 7

BAB 3

METODE PENELITIAN………………………………………………………….. 8

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN……………………………………………………. 11

BAB 5

KESIMPULAN……………………………………………………………………. 17

DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………………... 18

LAMPIRAN……………………………………………………………………….. 19
 ABSTRAK

Aktivitas antimikroba minyak atsiri telah dilaporkan dalam ratusan penelitian, namun sebagian besar
penelitian ini mengaitkan aktivitas tersebut dengan senyawa yang paling umum tanpa menganalisisnya
secara independen. Oleh karena itu, tujuannya adalah untuk menyelidiki aktivitas antibakteri dari 33
terpen bebas yang biasa ditemukan dalam minyak esensial dan mengevaluasi ultrastruktur seluler
untukmemverifikasi kemungkinan kerusakan pada membran seluler.Metode:Skrining dilakukan untuk
memilih zat dengan aktivitas antimikroba yang mungkin, kemudian konsentrasi penghambatan
minimal, aktivitas bakterisida dan studi kurva waktu-membunuh 24 jam dievaluasi dengan protokol
standar. Selain itu, ultrastruktur bakteri kontrol dan kematian dievaluasi dengan pemindaian mikroskop
elektron. Hasil:Hanya 16 dari 33 senyawa yang memiliki aktivitas antimikroba pada skrining awal.
Eugenol menunjukkan aksi bakterisida yang cepat terhadap Salmonella entericaserovar Typhimurium
(2 jam). Terpineol menunjukkan aktivitas bakterisida yang sangat baik terhadapS. aureusketegangan.
Carveol, citronellol dan geraniol memberikan efek bakterisida yang cepat terhadapE.
coli.Kesimpulan:Aktivitas antimikroba yang lebih tinggi terkait dengan adanya gugus hidroksil
(senyawa fenolik dan alkohol), sedangkan hidrokarbon menghasilkan aktivitas yang lebih sedikit.
Kelompok pertama, seperti carvacrol,lcarveol,eugenol,trans-geraniol, dan timol, menunjukkan aktivitas
yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan sulfanilamide. Gambar yang diperoleh dengan
pemindaian mikroskop elektron menunjukkan bahwa mekanisme yang
menyebabkan kematian sel dari bakteri yang dievaluasi didasarkan pada hilangnya integritas fungsi
membran seluler. Penelitian ini membawa pengetahuan rinci tentang aktivitas antimikroba dari senyawa
individu hadir dalam minyak esensial, yang dapat memberikan pemahaman yang lebih besar untuk
penelitian masa depan
 BAB 1
PENDAHULUAN

Minyak atsiri terdiri dari campuran senyawa kompleks, biasanya dari 20 hingga 60, pada
konsentrasi yang berbeda [1]. Terpen, konstituen utama minyak esensial, berasal dari jalur isoprenoid,
dan diproduksi dan disekresikan dari jaringan tanaman khusus.2]. Mereka terdiri dari unit isoprena (C5),
yang menjadi dasar klasifikasinya, yaitu, dua unit isoprena membentuk monoterpen (C10), tiga unit
membentuk seskuiterpen (C15), empat unit membentuk diterpen (C20), enam unit membentuk triterpen
(C30) dan delapan unit membentuk karotenoid (C40) [3]. Terpen dapat memiliki beberapa fungsi kimia
yang berbeda, termasuk alkohol (linalool, geraniol, carveol, citronellol, terpineol, mentol, borneol, dan
bisabolol), aldehida (sitral dan sitronelal), fenol (timol dan carvacrol), keton (carvone dan
kamper),kelompok eter (eucalyptol) dan hidrokarbon (cymene, pinene, limonene, dan phellandrene).
Evaluasi aktivitas biologis minyak atsiri telah dilakukan selama bertahun-tahun untuk
mengidentifikasi senyawa baru dengan aktivitas antibakteri untuk aplikasi industri.4-6]. Makanan
Industri telah mencari senyawa alami, karena penggunaan aditif antimikroba sintetis menyebabkan
kanker pada beberapa jenis jaringan. Misalnya, paraben menyebabkan kanker payudara [7,8] dan nitrit
menyebabkan kanker pada paru-paru, usus, hati dan perut [9]. Di bidang medis, pencarian senyawa baru
menjadi semakin mendesak, karena munculnya patogen yang resisten mengganggu terapi dan
meningkatkan angka kematian. Staphylococcus aureus, Salmonellasp.,Escherichia colidanBacillus
cereusadalah contoh penting dari bakteri yang mempengaruhi kualitas dan keamanan makanan [10,11].
S. aureusdanB. cereus(Gram-positif) terkait dengan keracunan makanan karena konsumsi
makanan mengandung enterotoksin, misalnya enterotoksin stafilokokus dan enterotoksin non-
hemolitik. Beberapa negara melaporkan kasus keracunan makanan yang disebabkan oleh:S. aureus[12-
15]. Tambahan,
S. aureusbertanggung jawab atas spektrum penyakit yang luas mulai dari infeksi kulit
superfisial hingga infeksi sistemik.B. cereusdikenal untuk kasus keracunan makanan yang serius, juga
terlibat dalam kasus pneumonia,bakteremia dan meningitis pada pasien dengan gangguan sistem
imun.16-18]. Selain itu, karena kemampuannya untuk membentuk spora dan struktur yang tahan
terhadap suhu tinggi, ia menghadirkan risiko yang signifikan terhadap keamanan pangan, karena
bertahan dari teknik pengolahan makanan, seperti pasteurisasi [11].
E. coli(Gram-negatif) menyajikan patotipe yang bertanggung jawab untuk infeksi
ekstraintestinal seperti:infeksi saluran kemih dan penyakit yang berhubungan dengan keracunan
makanan. Ada enamE. Coli patotipe termasuk: enterotoksigenikE. coli(ETEC), enteropatogenikE.
coli(EPEC), enteroagregatifE. coli(EAEC), enterohemoragikE. coli(EHEC), enteroinvasifE.
coli(EIEC), kepatuhan difusE. coli (DAEC) [19].
Salmonella entericaserovar Typhimurium (Gram-negatif) adalah agen lain yang bertanggung
jawab untuk infeksi usus yang terkait dengan konsumsi makanan yang terkontaminasi, terutama melalui
konsumsi unggas dan telur. Kondisi kebersihan yang tidak memadai adalah penyebab utama
dariS.Infeksi Typhimurium, demam tifoid adalah bentuk penyakit yang paling agresif. Dipercaya bahwa
kejadian infeksi diremehkan, karena beberapa kasus salah didiagnosis atau tidak dilaporkan [20].
Risiko terhadap kesehatan manusia yang ditimbulkan oleh kontaminasi makanan, serta
kebutuhan akan senyawa dengan aksi antimikroba, toksisitas rendah, dan biaya rendah, mendorong
pencarian senyawa baru. Perbedaan dari penelitian ini adalah evaluasi aktivitas 33 terpen, termasuk
senyawa minoritas, membantu untuk memahami aktivitas antimikroba minyak esensial. Dalam konteks
ini, tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki aktivitas antibakteri dan bakterisida terpena yang
sering dilaporkan dalam metabolisme sekunder tanaman, serta waktu kematian bakteri yang disebabkan
oleh terpen ini. Selain itu, ultrastruktur dievaluasi untuk mengkonfirmasi perubahan seluler yang
mungkin terjadi.
 BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA

- Terpena merupakan suatu golongan hidrokarbon yang banyak dihasilkan oleh tumbuhan
dan terutama terkandung pada getah dan vakuola selnya. Pada tumbuhan, senyawa-
senyawa golongan terpena dan modifikasinya, terpenoid, merupakan metabolit sekunder.
Terpena dan terpenoid dihasilkan pula oleh sejumlah hewan, terutama serangga dan
beberapa hewan laut. Di samping sebagai metabolit sekunder, terpena merupakan
kerangka penyusun sejumlah senyawa penting bagi makhluk hidup. Sebagai contoh,
senyawa-senyawa steroid adalah turunan skualena, suatu triterpena; juga karoten dan
retinol. Nama "terpena" (terpene) diambil dari produk getah tusam, terpentin (turpentine).
- Terpenoid merupakan produk alami yang strukturnya dibagi menjadi beberapa unit
isoprene, karena itu senyawa ini disebut juga isoprenoid (C5H8). Terpen merupakan
senyawa hidrokarbon yang terdapat pada semua tanaman, hewan, serangga dan hewan
laut (kandungannya sedikit).
- Antimikroba merupakan zat yang memiliki kemampuan untuk menghambat maupun
mematikan pertumbuhan mikroba dengan toksisitas terhadap manusia relatif kecil.
Banyak dari tumbuhan herbal yang dapat berperan sebagai antimikroba.
- The Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI)
- CLSI M07 yaitu standar yang mencakup metode referensi untuk menentukan konsentrasi
penghambatan minimal bakteri aerob dengan pengenceran makro kaldu, pengenceran
mikro kaldu, dan pengenceran agar.
- Aktivitas antimikroba ditandai dengan adanya penghambatan pertumbuhan terlihat sel hidup yang
membuat air menjadi keruh bila transparan menandakan (sel mati tidak berwarna).
- Analisis SEM merupakan suatu metode analisis statistik multivariat. Melakukan olah data
SEM berbeda dengan melakukan olah data regresi atau analisis jalur. Olah data SEM lebih
rumit, karena SEM dibangun oleh model pengukuran dan model struktural. Di dalam
SEM terdapat 3 kegiatan secara bersamaan, yaitu pemeriksaan validitas dan reliabilitas
instrumen (confirmatory factor analysis), pengujian model hubungan antara variabel (path
analysis), dan mendapatkan model yang cocok untuk predeksi (analisis model struktural
dan analisis regresi). Sebuah pemodelan lengkap pada dasamya terdiri dari model
pengukuran (measurement model) dan structural model atau causal model.
 BAB 3
METODE PENELITIAN

3.1 Bahan

Standar terpene diperoleh dari Sigma-Aldrich (St.senyawa ada pada Gambar S1 (Bahan
Pelengkap) : (-) - -bisabolol (95%), (-) - borneol (99%), (+) - borneol (97%), camphene (95%),
(±)kamper (95%), carvacrol (98%), campurancis dantransl-carveol (95%), (+) carvone (98%),l- carvone
(97%), -caryophyllene (80%), citral (95%), (±)sitronelal (95%),-sitronellol (95%),m-cymene
(99%),p-cymene (99%), eucalyptol (99%), eugenol (99%),trans-geraniol (98%), guaine (97%), -
humulene (96%),R- (+) - limonen (99%), (±) -linalool (97%), -myrcene (100%), campuran ocimene
dari isomer (90%), -phellandrene (75%), (+) - -pinene (99%), (+) - -pinene (98%),sabinene (75%), -
terpinene (98%), terpineol, campuran isomer (98%), terpinolene (90%), timol (99%), (+) - valencene
(65% ). Strain bakteriE. coli(ATCC 8739),S. aureus(ATCC 25923),S.Typhimurium (ATCC 14028)
danB. cereus(ATCC 14579) diperoleh dari daftar strain referensi INCQS-FIOCRUZ.
DMSO(dimethylsulfoxide) berasal dari Vetec (Rio de Janeiro, Brazil), dan agar-agar Mueller-Hinton
(MH) dan kaldu (MHB) diperoleh dari Himedia Laboratories PVT (Mumbai, India). Standar trifenil
tetrazolium klorida (TTC), sulfanilamide dan reagen lainnya dibeli dari Sigma-Aldrich

3.2 Penyaringan

Pengujian dilakukan sesuai dengan protokol CLSI M7-A6 [40]. Senyawa disiapkan dalam
DMSO (0,75 mg /mL) dalam Eppendorf steril dan disimpan pada suhu 4◦C untuk meminimalkan
kerugian dengan penguapan.Untuk analisis, larutan stok diencerkan dalam kaldu Mueller-Hinton dan
konsentrasi akhir senyawa dan DMSO di dalam sumur masing-masing adalah 0,25 mg / mL dan
0,25%. Inokulum disesuaikan dengan skala McFarland 0,5 (1,5×108CFU/mL) dengan
spektrofotometer (T80+, PG Instruments, Leicestershire, UK) pada 625 nm hingga mencapai
kerapatan optik 0,08 hingga 0,10 dan selanjutnya disesuaikan dengan kaldu Mueller Hinton sehingga
setiap sumuran pelat mikro memiliki 5×105CFU / mL. Kontrol negatif (kaldu Mueller-Hinton +
DMSO 0,25% + inokulum) dan kontrol sterilitas (kaldu Mueller-Hinton dengan DMSO 0,25% tanpa
inokulum) ditambahkan kesemua pelat, dan analisis dilakukan dalam rangkap tiga. Pengujian
dilakukan secara individual untuk setiap terpene dan mikroorganisme untuk menghindari interaksi
silang antara senyawa dengan penguapan. Pelat dengan tutup diinkubasi pada suhu 35
◦ C selama 24 jam. Setelah 24 jam, 50μL TTC (larutan air 0,5%) ditambahkan dan kemudian diinkubasi
pada 35
◦ C selama 6 jam. Aktivitas antimikroba diverifikasi oleh penghambatan pertumbuhan terlihat sel hidup,
yang dikonfirmasi oleh TTC (sel mati tidak berwarna). Senyawa yang menunjukkan aktivitas positif
dalam hasil ini dipilih untuk menentukan konsentrasi hambat minimum (Minimum Inhibition
Concentration/MICs).

3.3 KonSentrasi Penghambatan Minimum

The MIC determination was performed by the microdilution method according to the method
M7-A6 of the CLSI [40]. Inokulum disesuaikan dengan skala McFarland 0,5 (1,5×108 CFU / mL)
dengan spektrofotometer (T80 +, PG Instruments, Leicestershire, UK) pada 625 nm untuk mencapai
kerapatan optik 0,08 hingga 0,10 dan selanjutnya disesuaikan dengan kaldu Mueller Hinton sehingga
masing-masing well dari microplate memiliki 5x 105 CFU / ml. Konsentrasi akhir terpen berkisar
antara 0,25 hingga 0,002 mg / mL, pengujian dilakukan secara individual untuk setiap terpen dan
mikroorganisme untuk menghindari interaksi silang antara senyawa dengan penguapan. Untuk setiap
pengujian dilakukan kontrol sterilitas (Mueller-Hinton Broth dengan DMSO 0,25% tanpa inokulum),
kontrol negatif (Mueller-Hinton broth dengan DMSO 0,25% dan inokulum) dan kontrol positif
(Mueller-Hinton broth dengan DMSO 0,25%, sulfanilamide dan inokulum) diperiksa. Semua analisis
dilakukan dalam rangkap tiga. Plat diinkubasi pada suhu 35◦C selama 24 jam dan disegel untuk
meminimalkan kerugian penguapan. Setelah 24 jam, 50μL TTC (larutan air 0,5%) ditambahkan dan
kemudian diinkubasi pada 35◦C selama 6 jam inkubasi. KHM senyawa ditentukan sebagai konsentrasi
terendah dari senyawa yang menghambat pertumbuhan sel yang terlihat, yang dikonfirmasi oleh TTC
(sel mati tidak berwarna).

3.4 Konsentrasi Bakterisida Minimal (MBC)

Untuk menentukan konsentrasi bakterisida minimum (MBC), 100μL alikuot dari sumur di
mana tidak ada pertumbuhan yang diamati (MIC, 2×MIC dan 4×MIC) disepuh dalam cawan Petri pada
media agar Mueller-Hinton, yang kemudian diinkubasi dalam oven pada suhu 35◦C selama 24 jam.
MBC didefinisikan sebagai 99,9% (kurangnya pertumbuhan) penurunan sel yang layak [41].

3.5 Studi Kurva Pembunuh Waktu

Studi kurva time-kill 24 jam dilakukan sesuai dengan metodologi yang dijelaskan dalam
dokumenM26-A dari CLSI [42]. Konsentrasi yang dievaluasi adalah MIC, 2xMIC dan 4×MIC dan
kontrol negatif (kaldu Mueller-Hinton dengan DMSO 0,25% dan inokulum) disiapkan. Suspensi
bakteri disiapkan untuk mendapatkan kekeruhan yang sebanding dengan 0,5 McFarland (1,5×108CFU

/ mL) yang disesuaikan dengan sekitar 5×105CFU/mL setelah inkubasi ke dalam tabung berisi
konsentrasi MIC, 2xMIC dan 4×MIC. Sampel uji ini diinkubasi pada 35ºC pada 24 jam. 10μL alikuot
dari ini homogenat ditambahkan ke 990μL saline steril 0,9%, dan 100μL larutan ini kemudian
ditambahkan ke agar Mueller-Hinton. Pelapisan terjadi pada 0, 2, 4, 8, 12 dan 24 jam setelah preparasi.
Pelat diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35◦C. Setelah inkubasi, koloni dihitung secara manual, dan
jumlah yang diperoleh dikalikan 1000 untuk mencari jumlah CFU/mL. Nilai-nilai ini diubah menjadi
skala logaritmik untuk pembuatan grafik waktu kematian. Pengurangan jumlah CFU dari hitungan awal
sebesar≥ 3 log10 didefinisikan sebagai efek bakterisida

3.6 Pemindaian Mikroskop Elektron (SEM)

Prosedur untuk analisis SEM dilakukan sesuai dengan penelitian sebelumnya [43] dengan
beberapa modifikasi.E.coli, S.aureusdanS.Mikroorganisme Typhimurium dikultur pada agar Mueller-
Hinton. Kultur bakteri fase log-tengah dipindahkan ke kaldu Mueller-Hinton dan diperlakukan dengan
terpen yang berbeda (terpineol, eugenol, carveol, citronellol dan geraniol) dalam waktu 4 jam pada suhu
4 jam.× konsentrasi MIC. Suspensi sel difiksasi dengan larutan glutaraldehid 2,5% dan buffer
cacodylate 0,1 M semalam. Sampel difiksasi dengan 1% osmium tetroksida selama 40 menit pada suhu
kamar. Sampel dicuci dengan buffer cacodylate 0,1 M dan kemudian didehidrasi dalam serangkaian
larutan alkohol pada konsentrasi yang berbeda, mulai dari 20% dan meningkat menjadi 100% (v/v).
Sampel kemudian dipindahkan ke keranjang sampel dan ditempatkan dalam pengering titik kritis. Slide
dengan sampel kemudian dilapisi dengan emas dalam mesin semprot sebelum visualisasi mereka
dengan SEM.
 BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Penyaringan

Aktivitas antimikroba pertama kali dievaluasi dengan awalnya menyaring senyawa pada
konsentrasi 0,25 mg / mL untuk mengeluarkan senyawa tanpa aktivitas dari penelitian. Dari tiga puluh
tiga senyawa yang dievaluasi, tujuh belas tidak menunjukkan efek positif terhadap salah satu strain
bakteri yang diuji, dan enam belas senyawa menunjukkan aktivitas (Tabel1).

4.2 Konsentrasi Penghambatan Minimum

Hasil penentuan MIC disajikan pada Tabel2. Kontrol negatif dianggap bebas obat, yang
menunjukkan viabilitas strain dan kontrol positif digunakan sulfanilamide. Klasifikasi aksi antimikroba
senyawa murni tidak terkonsolidasi dengan baik dalam literatur. Dengan demikian, perbandingan
dengan hasil sebelumnya sulit, karena banyak variabel dapat mempengaruhi hasil akhir.

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa dari enam belas senyawa dengan aktivitas
antibakteri,timol, carvacrol dan eugenol menunjukkan aksi antimikroba yang kuat terhadap empat strain
yang dievaluasi bahkan lebih tinggi dari sulfanilamide. Sebaliknya, senyawam-cymene, (±) - linalool,
kapur barus, (+) -borneol danR- (+) - limonene menunjukkan aksi paling sedikit terhadap strain yang
dievaluasi ini. Timol dan eugenol dihambat (IC100)S.Typhimurium danS. aureuspertumbuhan, dan
dianggap antimikroba ampuh menurut literatur [21].

4.3 Konsentrasi Bakterisida Minimum

Hanya enam dari enam belas senyawa yang menunjukkan aktivitas antimikroba menunjukkan
aktivitas bakterisida (Tabel3). Tak satu pun dari senyawa yang dievaluasi memiliki aktivitas bakterisida
(tidak adanya pertumbuhan) terhadap B. cereus. UntukS. aureus, hanya timol dan terpineol yang
menunjukkan aktivitas bakterisida pada konsentrasi 0,12 mg/mL. Eugenol menyajikan nilai MBC
terendah terhadapS.Typhimurium (0,06 mg/mL). Timol adalah senyawa yang menunjukkan nilai MIC
terendah terhadap strain yang dievaluasi; Namun, timol tidak memiliki aktivitas bakterisida pada
konsentrasi MIC, 2×MIC dan 4×MIC, tetapi aktivitas bakterisida timol diverifikasi pada 0,12 mg
/ mL, seperti yang ditunjukkan pada Tabel3.
4.4 Studi Kurva Pembunuh Waktu

Analisis kurva time-kill digunakan untuk mengkarakterisasi aksi bakterisida, dengan cara ini
hanya senyawa yang menunjukkan aktivitas bakterisida minimal yang dievaluasi. Angka1menunjukkan
hasil dari lima senyawa yang membunuh strain bakteriS.Typhimurium,S. aureusdanE. colisebagai fungsi
waktu. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kinetika senyawa yang membunuh ketiga strain bakteri
bergantung pada konsentrasi, dengan konsentrasi yang lebih tinggi menyebabkan kematian bakteri lebih
cepat, menunjukkan efek yang bergantung pada dosis.
Terpineol dan eugenol menunjukkan aksi bakterisida terhadapS.Typhimurium, di mana eugenol
menyebabkan kematian bakteri pada semua konsentrasi yang dievaluasi hanya dalam 2 jam. Di sisi lain,
MIC terpineol mengurangi jumlah CFU hanya 2 log10dalam 24 jam, dan terpineol tidak dianggap
bakterisida pada konsentrasi ini; Namun, pada 2×MIC dan 4×MIC, jumlah CFU berkurang 6 log10
hanya dalam 2 jam.S. aureushanya dipengaruhi secara lemah oleh terpineol pada MIC-nya karena nomor
sel mendekati jumlah kontrol. Sebaliknya, pada 2×MIC dan 4×MIC, waktu pembunuhan berkurang
secara signifikan (masing-masing 12 jam dan 8 jam).l-Carveol, -sitronellol dantrans-geraniol tidak
efektif membunuhE. colidi MIC. Di sisi lain, ketiga senyawa ini dengan cepat membunuh bakteri pada
suhu 4×mikrofon; carveol dan geraniol menurunkan jumlah CFU sebanyak 6 log10dalam 2 jam, dan
sitronelol menurunkannya sebanyak 4 log10.

4.5 Pemindaian Mikroskop Elektron

Perubahan morfologi yang dihasilkan dari pengobatan denganl-carveol, -sitronellol dan trans-
geraniol diamati padaE.coli, S.aureusdanS.Typhimurium oleh SEM. ItuE. colisel kontrol (Gambar2)
memiliki bentuk basiler dan permukaan halus, sedangkan sel-sel yang dirawat berukuran tidak teratur
dengan adanya puingpuing,mungkin dengan mengganggu pembelahan sel atau disfungsi membran sel.
Sel yang diberi citronellol dan geraniol berukuran lebih kecil, memiliki permukaan yang sangat
kasar dan menempel satu sama lain. Perawatan dariS. aureus(Angka3) dengan terpineol mengganggu
pembelahan sel dan mengubah morfologi "tandan anggur", bentuk khas dari koloni.
PengobatanS.Typhimurium (Gambar4) dengan eugenol dan terpineol menunjukkan bahwa
mekanisme kematian adalah karena hilangnya integritas atau fungsi membran seluler, di mana membran
sel hancur total, dengan adanya puing-puing sel.
Diskusi

Konstituen utama dari minyak atsiri dapat membentuk hingga 85%, sementara konstituen lain
hadir dalam jumlah kecil.1]. Sebagian besar penelitian yang mengevaluasi aktivitas antimikroba minyak
esensial meninggalkan celah dalam literatur karena mereka melaporkan kesulitan dalam menetapkan
aktivitas senyawa utama atau sinergisme antar senyawa, dengan cara ini ada kemungkinan senyawa
dalam jumlah yang lebih kecil juga berkontribusi terhadap aktivitas tersebut. . Karya ini dengan demikian
membawa data yang relevan yang akan memberikan kontribusi untuk studi lebih lanjut dari aktivitas
antimikroba minyak esensial dan aplikasi di bidang industri, seperti menggunakan senyawa ini sebagai
alternatif aditif dalam industri makanan.
Faktor yang menentukan aktivitas minyak atsiri adalah komposisi, gugus fungsi yang terdapat
dalam komponen aktif, dan interaksi sinergisnya.22]. Studi sebelumnya menyatakan bahwa terpen
oksigen (terpenoid) seperti fenolat menunjukkan aktivitas antimikroba yang lebih baik daripada
hidrokarbon sepertiR- (-) - limonene, terpinene, camphene, dan (+) - -pinene, yang sesuai dengan
penelitian ini, karena senyawa ini menunjukkan aksi antimikroba yang lemah [22-26]. Hasil penelitian
ini setuju bahwa gugus fungsi teroksigenasi dalam senyawa terpen menunjukkan aktivitas antimikroba
yang lebih baik daripada hidrokarbon. Studi sebelumnya melaporkan MIC 0,031 mg / mL untuk timol
dan 0,015 mg / mL carvacrol melawanS. aureus[27]. Dalam penelitian ini nilai serupa ditemukan, MIC
adalah 0,007 mg / mL untuk timol, dan 0,015 mg / mL untuk carvacrol terhadapS. aureus. Menurut
Mazarei et al. [28], MIC untukE. coliregangan danS. Aureusadalah 0,25 dan 0,125 mg / mL, masing-
masing, untuk carvacrol. Seperti disebutkan sebelumnya, klasifikasi aksi antimikroba senyawa murni
tidak terkonsolidasi dengan baik dalam literatur sehingga sulit dibandingkan dengan hasil sebelumnya.
Selain itu, kesulitan ini telah dilaporkan dalam penelitian sebelumnya [29,30].
Poin lain yang relevan dari aktivitas antimikroba adalah mekanisme aksi. Ini dapat bervariasi
dengan jenis minyak esensial atau strain mikroorganisme yang digunakan [22]. Studi sebelumnya telah
mengusulkan bahwa inti aromatik dengan gugus fungsional polar bertanggung jawab atas aktivitas
antimikroba, tetapi mekanismenya tidak dijelaskan dengan baik. Namun, beberapa mekanisme telah
diusulkan. Misalnya, pecahnya membran sel dan perubahan saluran ion (Na+, K+, Ca2+, atau Cl-) di
membran sel dapat meningkatkan permeabilitas dan menyebabkan pelepasan konstituen intraseluler vital
[31], dan penghambatan enzim target [32]. Studi sebelumnya mengkonfirmasi dengan memindai
mikroskop elektron bahwa mekanisme utama kerja timol adalah disfungsi membran, dan menunjukkan
bahwa timol dapat digunakan sebagai obat alami melawanS.Typhimurium tempat obat sintetik [33].
Hasil yang sama diverifikasi untuk eugenol dan terpineol untukS.Typhimurium pada Gambar4. Gugus
hidroksil, seperti yang ditemukan di timol, eugenol, terpineol dan carvacrol, sangat reaktif dan
membentuk ikatan hidrogen dengan situs aktif enzim target, menonaktifkannya.32,34], dan akibatnya,
disfungsi atau pecahnya membran sel. Misalnya, timol, yang menunjukkan aktivitas kuat dalam
penelitian ini, adalah senyawa yang biasa ditemukan di banyak minyak esensial dan menghambat bakteri
Gram-positif dan Gram-negatif, termasukBacillus subtilis,E. coli,Klebsiella pneumoniaedanS.
aureus[3,26,35].
 Friedman dkk. [36], disebutkan bahwa minyak atsiri dan senyawanya dapat dibagi menjadi dua
kelompok: senyawa kerja lambat dan senyawa kerja cepat. Menurut hasil yang disajikan pada Gambar1,
diamati bahwa terpineol, eugenol, geraniol, carveol dan citronellol dianggap senyawa yang bekerja cepat,
karena mereka menonaktifkan organisme sepertiE. colidanS.Typhimurium dalam waktu singkat (2 jam).
Telah dilaporkan bahwa beberapa antimikroba yang dianggap sebagai senyawa yang bekerja cepat adalah
carvacrol, cinnamaldehyde dan geraniol, karena mereka menonaktifkan organisme sepertiE.
colidanS.Typhimurium dalam lima menit, sedangkan senyawa yang bekerja lambat membutuhkan waktu
30-60 menit untuk menunjukkan aktivitas antimikroba yang
efisien.36].
Studi sebelumnya memverifikasi resistensi yang lebih besar dari bakteri Gram-positif dan
menyebutkan bahwa resistensi yang lebih besar dari sel Gram-positif mungkin karena dinding sel mereka
memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal, sehingga sulit untuk melewati agen antimikroba dan dengan
demikian memberikan kekakuan pada sel mereka. [37,38].
Membran luar bakteri Gram-negatif memiliki saluran porin, di mana terjadi pengangkutan zat
dengan berat molekul rendah, dan obat-obatan dengan karakteristik lipofilik mengalami kesulitan
dalam melintasi saluran tersebut.39]. Dalam karya ini, senyawa yang menunjukkan aktivitas terbaik di
kedua MIC dan kinetika membunuh waktu memiliki berat molekul rendah dan gugus fungsi polar.
Karakteristik tersebut dapat meningkatkan kapasitas antimikroba dengan memfasilitasi penetrasi
melalui membran sel luar. Hipotesis ini diverifikasi oleh aksi eugenol, senyawa fenolik dengan berat
molekul rendah yang menghadirkan kinetika membunuh waktu yang cepat, yang menyebabkan
kematianS.Typhimurium pada semua konsentrasi hanya dalam dua jam. Selain itu,
Angka3dan4menunjukkan bahwa terpineol dan eugenol mempengaruhi morfologiS.
aureusdanS.Typhimurium, masing-masing, menunjukkan bahwa mekanisme aksi harus dikaitkan
dengan pecahnya atau disfungsi membran sel.
hidrokarbon sepertiR- (-) - limonene, terpinene, camphene, dan (+) - -pinene, yang sesuai dengan
penelitian ini, karena senyawa ini menunjukkan aksi antimikroba yang lemah [22-26]. Hasil penelitian
ini setuju bahwa gugus fungsi teroksigenasi dalam senyawa terpen menunjukkan aktivitas antimikroba
yang lebih baik daripada hidrokarbon. Studi sebelumnya melaporkan MIC 0,031 mg / mL untuk timol
dan 0,015 mg / mL carvacrol melawanS. aureus[27]. Dalam penelitian ini nilai serupa ditemukan, MIC
adalah 0,007 mg / mL untuk timol, dan 0,015 mg / mL untuk carvacrol terhadapS. aureus. Menurut
Mazarei et al. [28], MIC untukE. coliregangan danS. Aureusadalah 0,25 dan 0,125 mg / mL, masing-
masing, untuk carvacrol. Seperti disebutkan sebelumnya, klasifikasi aksi antimikroba senyawa murni
tidak terkonsolidasi dengan baik dalam literatur sehingga sulit dibandingkan dengan hasil sebelumnya.
Selain itu, kesulitan ini telah dilaporkan dalam penelitian sebelumnya [29,30].

Poin lain yang relevan dari aktivitas antimikroba adalah mekanisme aksi. Ini dapat bervariasi
dengan jenis minyak esensial atau strain mikroorganisme yang digunakan [22]. Studi sebelumnya telah
mengusulkan bahwa inti aromatik dengan gugus fungsional polar bertanggung jawab atas aktivitas
antimikroba, tetapi mekanismenya tidak dijelaskan dengan baik. Namun, beberapa mekanisme telah
diusulkan. Misalnya, pecahnya membran sel dan perubahan saluran ion (Na+, K+, Ca2+, atau Cl-) di
membran sel dapat meningkatkan permeabilitas dan menyebabkan pelepasan konstituen intraseluler
vital [31], dan penghambatan enzim target [32]. Studi sebelumnya mengkonfirmasi dengan memindai
mikroskop elektron bahwa mekanisme utama kerja timol adalah disfungsi membran, dan menunjukkan
bahwa timol dapat digunakan sebagai obat alami melawanS.Typhimurium tempat obat sintetik [33].
Hasil yang sama diverifikasi untuk eugenol dan terpineol untukS.Typhimurium pada Gambar4. Gugus
hidroksil, seperti yang ditemukan di timol, eugenol, terpineol dan carvacrol, sangat reaktif dan
membentuk ikatan hidrogen dengan situs aktif enzim target, menonaktifkannya.32,34], dan akibatnya,
disfungsi atau pecahnya membran sel. Misalnya, timol, yang menunjukkan aktivitas kuat dalam
penelitian ini, adalah senyawa yang biasa ditemukan di banyak minyak esensial dan menghambat
bakteri Gram-positif dan Gram-negatif, termasukBacillus subtilis,E. coli,Klebsiella pneumoniaedanS.
aureus[3,26,35].
Friedman dkk. [36], disebutkan bahwa minyak atsiri dan senyawanya dapat dibagi menjadi dua
kelompok: senyawa kerja lambat dan senyawa kerja cepat. Menurut hasil yang disajikan pada Gambar1,
diamati bahwa terpineol, eugenol, geraniol, carveol dan citronellol dianggap senyawa yang bekerja
cepat, karena mereka menonaktifkan organisme sepertiE. colidanS.Typhimurium dalam waktu singkat
(2 jam). Telah dilaporkan bahwa beberapa antimikroba yang dianggap sebagai senyawa yang bekerja
cepat adalah carvacrol, cinnamaldehyde dan geraniol, karena mereka menonaktifkan organisme
sepertiE. colidanS.Typhimurium dalam lima menit, sedangkan senyawa yang bekerja lambat
membutuhkan waktu 30-60 menit untuk menunjukkan aktivitas antimikroba yang
efisien.36].
 Studi sebelumnya memverifikasi resistensi yang lebih besar dari bakteri Gram-positif dan
menyebutkan bahwa resistensi yang lebih besar dari sel Gram-positif mungkin karena dinding sel
mereka memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal, sehingga sulit untuk melewati agen antimikroba dan
dengan demikian memberikan kekakuan pada sel mereka. [37,38].
Membran luar bakteri Gram-negatif memiliki saluran porin, di mana terjadi pengangkutan zat
dengan berat molekul rendah, dan obat-obatan dengan karakteristik lipofilik mengalami kesulitan dalam
melintasi saluran tersebut.39]. Dalam karya ini, senyawa yang menunjukkan aktivitas terbaik di kedua
MIC dan kinetika membunuh waktu memiliki berat molekul rendah dan gugus fungsi polar.
Karakteristik tersebut dapat meningkatkan kapasitas antimikroba dengan memfasilitasi penetrasi
melalui membran sel luar. Hipotesis ini diverifikasi oleh aksi eugenol, senyawa fenolik dengan berat
molekul rendah yang menghadirkan kinetika membunuh waktu yang cepat, yang menyebabkan
kematianS.Typhimurium pada semua konsentrasi hanya dalam dua jam. Selain itu,
Angka3dan4menunjukkan bahwa terpineol dan eugenol mempengaruhi morfologiS.
aureusdanS.Typhimurium, masing-masing, menunjukkan bahwa mekanisme aksi harus dikaitkan
dengan pecahnya atau disfungsi membran sel.
 BAB 5
KESIMPULAN

Di antara 33 senyawa yang dievaluasi, sebagian besar hanya menunjukkan aktivitas

bakteriostatik. Terpen teroksigenasi menunjukkan aktivitas antibakteri yang kuat terhadap semua
bakteri yang diuji, terutama bakteri Gram-negatif. Senyawa ini menunjukkan efek antimikroba yang
menjanjikan, bahkan lebih tinggi dari sulfanilamide. Gambar yang diperoleh dengan SEM menunjukkan
bahwa mekanisme kematian sel bakteri yang dievaluasi adalah karena hilangnya integritas atau fungsi
membran seluler. Penelitian ini membawa pengetahuan rinci tentang aktivitas antimikroba dari 33
senyawa individu yang umumnya ada dalam minyak atsiri, yang dapat memberikan pemahaman yang
lebih besar untuk penelitian masa depan sinergi, mekanisme aksi dan bioavailabilitas komponen minyak
atsiri yang berbeda.
 DAFTAR PUSTAKA

Aline Cristina Guimarsebuahes1, Leandra Martins Meireles1, Mayara Fumiere Lemos1

Marco Cesar Cunegundes Guimarsebuahes2, Perubahan Denise Coutinho1 Rodrigo
Scherer1,(2019) Aktivitas Antibakteri Terpen Dan Terpenoid Hadir Dalam Minyak Atsiri.

www.mdpi.com/journal/molecules
https://id.wikipedia.org/wiki/Terpena
https://onlinelearning.uhamka.ac.id/mod/resource/view.php?id=178540
http://www.uny.ac.id/id/berita/aktifitas-antimikroba-pada-daun-tembelekan-dan-bandotan
https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m07/
LAMPIRAN
 Jurnal Asli

molecules
Article

Antibacterial Activity of Terpenes and Terpenoids Present in

Essential Oils
Aline Cristina Guimarães 1, Leandra Martins Meireles 1 , Mayara
Fumiere Lemos 1 , Marco Cesar Cunegundes Guimarães 2, Denise
Coutinho Endringer 1 , Marcio Fronza 1 and Rodrigo Scherer 1,*
1 Pharmaceutical Sciences Graduate Program, Universidade Vila Velha, Espírito Santo 29102-770, Brazil
2 Department of Morphology, Federal University of Espírito Santo, Espírito Santo 29043-090, Brazil
* Correspondence: rodrigo.scherer@uvv.br; Tel.: 55-27-3421-2198; Fax: 55-27-3421-2049

Received: 3 April 2019; Accepted: 25 May 2019; Published: 5 July 2019

Abstract: Background: The antimicrobial activity of essential oils has been reported in hundreds of
studies, however, the great majority of these studies attribute the activity to the most prevalent
compounds without analyzing them independently. Therefore, the aim was to investigate the
antibacterial activity of 33 free terpenes commonly found in essential oils and evaluate the cellular
ultrastructuretoverifypossibledamagetothecellularmembrane. Methods: Screeningwasperformed to
select substances with possible antimicrobial activity, then the minimal inhibitory concentrations,
bactericidal activity and 24-h time-kill curve studies were evaluated by standard protocols. In addition,
the ultrastructure of control and death bacteria were evaluated by scanning electron microscopy.
Results: Only 16 of the 33 compounds had antimicrobial activity at the initial screening. Eugenol
exhibited rapid bactericidal action against Salmonella enterica serovar Typhimurium (2 h). Terpineol
showed excellent bactericidal activity against S. aureus strains. Carveol, citronellol and geraniol
presented a rapid bactericidal effect against E. coli. Conclusions: The higher antimicrobial activity was
related to the presence of hydroxyl groups (phenolic and alcohol compounds), whereas hydrocarbons
resulted in less activity. The first group, such as carvacrol, l-carveol, eugenol, trans-geraniol, and
thymol, showed higher activity when compared to sulfanilamide. Images obtained by scanning electron
microscopy indicate that the mechanism causing the cell death of the evaluated bacteria is based on the
loss of cellular membrane integrity of function. The present study brings detailed knowledge about the
antimicrobial activity of the individual compounds present in essential oils, that can provide a greater
understanding for the future researches.

Keywords: essential oil; terpenes; bacteria; time kill kinetics; antimicrobial activity; bactericidal

1. Introduction
Essential oils consist of a complex mixture of compounds, usually from 20 to 60, at different
concentrations [1]. Terpenes, the main constituents of essential oils, are derived from the isoprenoid
pathway, and are produced and secreted from specialized plant tissues [2]. They are composed of
isoprene units (C5), which is the basis for their classification, i.e., two isoprene units form monoterpenes
(C10), three units form sesquiterpenes (C15), four units form diterpenes (C20), six units form triterpenes
(C30) and eight units form carotenoids (C40) [3]. Terpenes can have several different chemical
functionalities, including alcohol (linalool, geraniol, carveol, citronellol, terpineol, menthol, borneol,
and bisabolol), aldehyde (citral and citronellal), phenol (thymol and carvacrol), ketone (carvone and
camphor), ether (eucalyptol) and hydrocarbon (cymene, pinene, limonene, and phellandrene) groups.
The evaluation of the biological activity of essential oils has been carried out over the years in order to
identify new compounds with antibacterial activity for industrial applications [4–6]. The food
 Molecules 2019, 24, 2471; doi:10.3390/molecules24132471 www.mdpi.com/journal/molecules
industry has been looking for natural compounds, since the use of synthetic antimicrobial additives
cause cancer in several tissue types. For example, parabens cause breast cancer [7,8] and nitrites cause
cancer in lung, intestine, liver and stomach [9]. In the medical area, the search for new compounds
becomes more and more urgent, as the emergence of resistant pathogens compromises therapy and raises
the mortality rate. Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Escherichia coli and Bacillus cereus are
important example of bacteria that affect the quality and safety of food [10,11].
S. aureus and B. cereus (Gram-positive) are related to food poisoning due to ingestion of food containing
enterotoxins, for example staphylococcal enterotoxin and non-hemolytic enterotoxin, respectively.
Several countries report cases of food poisoning caused by S. aureus [12–15]. In addition, S. aureus is
responsible for a broad spectrum of diseases ranging from superficial skin infections to systemic
infections. B. cereus is recognized for serious cases of food poisoning, it is also involved in cases of
pneumonia, bacteremia and meningitis in immunocompromised patients [16–18]. In addition, due to its
ability to form spores and structure resistant to high temperatures, it presents a significant risk to food
safety, as it survives food processing techniques, such as pasteurization [11].
E. coli (Gram-negative) presents pathotypes responsible for extraintestinal infections such as urinary
tract infections and diseases associated with food poisoning. There are six E. coli pathotypes including:
enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteropathogenic E. coli (EPEC), enteroaggregative E. coli (EAEC),
enterohemoragic E. coli (EHEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), diffusely adherence E. coli (DAEC) [19].
Salmonella enterica serovar Typhimurium (Gram-negative) is another agent responsible for intestinal
infection associated with ingestion of contaminated food, mainly through the consumption of poultry
and eggs. Inadequate hygiene conditions is the main cause of S. Typhimurium infection, typhoid fever is
the most aggressive form of the disease. It is believed that the incidence of infections is underestimated,
since several cases are misdiagnosed or are not reported [20].
The risk to human health generated by food contamination, as well as the need for compounds with
antimicrobial action, low toxicity, and low cost, encourages the search for new compounds. The
differential of the present study is the evaluation the activity of 33 terpenes, including minority
compounds, helping to understand the antimicrobial activity of essential oils. In this context, the
objective of the present study was to investigate antibacterial and bactericidal activities of terpenes
frequently reported in the secondary metabolism of plants, as well as the time of death of bacteria
caused by these terpenes. In addition, the ultrastructure was evaluated to confirm cellular changes that
may have occurred.

2. Results
2.1. Screening
The antimicrobial activity was first evaluated by initially screening the compounds at a concentration of
0.25 mg/mL to exclude compounds without activity from the study. Of the thirty-three compounds
evaluated, seventeen did not exhibit positive effects against any of the bacterial strains tested, and
sixteen compounds showed activity (Table 1).
Table 1. Antibacterial screening of compounds.

Non-oxygenated monoterpenes
Camphene − − − −
m-Cymene + + + +
p-Cymene − − − −
Guaiene − − − −
R-(+)-Limonene + + + +
β -Myrcene − − − −
Ocimene − − − −
α-Phellandrene − − − −
(+)-α-Pinene − − − −
(+)-β-Pinene − − − −
Sabinene − − − −
-Terpinene − − − −
Terpinolene − − − −
Oxygenated
monoterpene
− − − − −
( )-α-Bisabolol
 − + + + +
( )-Borneol
(+)-Borneol + + + +
± + + + +
( )-Camphor
l + + + +
-Carveol
(+)-Carvone − − − −
l + + + +
-Carvone
Citral + + + +
± + + + +
( )-Citronellal
β-Citronellol + + + +
Eucalyptol − − − −
trans-Geraniol + + + +
± + + + +
( )-Linalool
Terpineol + + + +
Phenolic
Carvacrol + + + +
Eugenol + + + +
Thymol + + + +
Sesquiterpene
β-Caryophyllene − − − −
α-Humulene − − − −
(+)-Valencene − − − −

(−) without activity; (+) with activity.

2.2. Minimum Inhibitory Concentrations
The results of the MIC determination are presented in Table 2. The negative control was considering
drug free, which showed the strains viability and to the positive control was used sulfanilamide. The
classification of the antimicrobial actions of pure compounds is not well consolidated in the literature.
Thus, the comparison with previous results is difficult, since many variables can affect the final result.
The results of the present study show that of the sixteen compounds with antibacterial activity, thymol,
carvacrol and eugenol presented strong antimicrobial action against the four strains evaluated even
higher than sulfanilamide. On the other hand, the compounds m-cymene, (±)-linalool, camphor, (+)-
borneol and R-(+)-limonene demonstrated the least action against these evaluated strains. Thymol and
eugenol inhibited (IC100) S. Typhimurium and S. aureus growth, and were considered potent
antimicrobials according to the literature [21].
Table 2. Minimum inhibitory concentrations (mg/mL) of the compounds.
Compound B. cereus S. Typhimurium E. coli S. aureus
− 0.12 0.12 0.25 0.03
( )-Borneol
(+)-Borneol 0.25 800 0.25 0.25
± 0.25 0.25 0.25 0.015
( )-Camphor
Carvacrol 0.03 0.015 0.03 0.015
l 0.12 0.03 0.06 0.015
-Carveol
l 0.25 0.12 0.06 0.03
-Carvone
m-Cymene 0.25 0.25 0.25 0.25
Citral 0.06 0.07 0.06 0.06
Citronellal 0.12 0.12 0.25 0.25
β-Citronellol 0.12 0.12 0.25 0.03
Eugenol 0.07 0.07 0.03 0.003
trans-Geraniol 0.07 0.03 0.06 0.03
R-(+)-Limonene 0.25 0.06 0.25 0.25
Linalool 0.25 0.25 0.25 0.25
Terpineol 0.12 0.12 0.06 0.03
Thymol 0.007 0.003 0.007 0.007
Sulfanilamide R 0.06 0.03 0.06
(R) Resistant.
2.3. Minimum Bactericidal Concentration

Only six of the sixteen compounds that showed antimicrobial activity showed bactericidal activity
(Table 3). None of the evaluated compounds had bactericidal activity (absence of growth) against B.
cereus. For S. aureus, only thymol and terpineol showed bactericidal activity at the concentration of
0.12 mg/mL. Eugenol presented the lowest MBC value against S. Typhimurium (0.06 mg/mL). Thymol
was the compound that exhibited the lowest MIC values against the strains evaluated; however, thymol
did not have bactericidal activity at concentrations of MIC, 2× MIC and 4× MIC, but the bactericidal
activity of thymol was verified at 0.12 mg/mL, as shown in Table 3.
Table 3. Minimum bactericidal concentrations (mg/mL) of the compounds.
Compound B. cereus S. Typhimurium E. coli S. aureus
l - - 0.25 -
-Carveol
β-Citronellol - - 0.25 -
Eugenol - 0.06 - -
trans-Geraniol - - 0.25 -
Terpineol - 0.25 - 0.12
Thymol - 0.12 0.12 0.12
(-) bacterial growth.

2.4. Time-kill Curve Studies

The time-Kill curve analysis was used to characterize the bactericidal action, in this way only
compounds that showed minimal bactericidal activity were evaluated. Figure 1 shows the results of five
compounds killing bacterial strains S. Typhimurium, S. aureus and E. coli as a function of time. The
results showed that the kinetics of the compounds killing the three bacterial strains were concentration
dependent, with higher concentrations leading to faster bacterial death, revealing a dose-dependent
effect.
Terpineol and eugenol presented bactericidal action against S. Typhimurium, where eugenol caused the
death of the bacteria at all the evaluated concentrations in only 2 h. On the other hand, the MIC of
terpineol reduced the number of CFUs by only 2 log10 in 24 h, and terpineol was not considered
bactericidal at this concentration; however, at 2× MIC and 4× MIC, the number of CFUs was reduced by
6 log10 in only 2 h. S. aureus was only weakly influenced by terpineol at its MIC since the number of
cells was close to the control count. On the other hand, at 2× MIC and 4× MIC, the killing time was
significantly reduced (12 h and 8 h, respectively). l-Carveol, β-citronellol and trans-geraniol were not
effective at killing E. coli at the MIC. On the other hand, these three compounds rapidly killed bacteria at
4× MIC; carveol and geraniol decreased the number of CFUs by 6 log10 in 2 h, and citronellol decreased
them by 4 log10.
 Figure 1. Time-kill curves for the bacteria S. Typhimurium, S. aureus and E. coli. Control: bacteria untreated; MIC:
minimum inhibitory concentration obtained by the MIC assay to each terpene.

2.5. Scanning Electron Microscopy

The morphological changes resulting from treatment with l-carveol, β-citronellol and trans-geraniol
were observed in E. coli, S. aureus and S. Typhimurium by SEM. The E. coli control cells (Figure 2) had
bacillary forms and smooth surfaces, whereas the treated cells were irregularly sized with the presence
of debris, possibly by disrupting cell division or dysfunction of cellular membrane.
 Figure 2. Scanning Electron Microscopy of untreated E. coli (A) and E. coli treated with carveol (B), citronellol (C)
and geraniol (D). A: SEM of untreated E. coli strains; B: E. coli strains treated with 4× MIC of carveol; C: E. coli
strains treated with 4× MIC of citronellol; D: E. coli strains treated with 4× MIC of geraniol.

Cells treated with citronellol and geraniol were smaller, had significantly rough surfaces and adhered to
each other. The treatment of S. aureus (Figure 3) with terpineol interrupted cell division and altered the
“grape bunch” morphology, a typical form of the colonies.

A B

Figure 3. Scanning Electron Microscopy of untreated S. aureus (A) and S. aureus treated with terpineol (B). A: SEM of
untreated S. aureus strains; B: S. aureus strains treated with 4× MIC of terpineol.

Treatment of S. Typhimurium (Figure 4) with eugenol and terpineol indicate that the mechanism of
the death is due to loss of cellular membrane integrity or function, where the cell membrane were
completely destroyed, with presence of cell debris.
 Figure 4. Scanning Electron Microscopy of untreated S. Typhimurium (A) and S. Typhimurium treated with eugenol (B)
and terpineol (C). A: SEM of untreated S. Typhimurium strains; B: S. Typhimurium
strains treated with 4× MIC of eugenol; C: S. Typhimurium strains treated with 4× MIC of terpineol.

3. Discussion
The major constituents of the essential oils may constitute up to 85%, while other constituents are
present in trace amounts [1]. The great majority of studies that evaluate the antimicrobial activity of
essential oils leave a gap in the literature since they report difficulty in assigning activity to major
compounds or synergism between compounds, in this way it is possible that compounds in smaller
amounts also contribute to the activity. The present work thus brings relevant data that will contribute to
further studies of the antimicrobial activity of essential oils and to applications in industrial fields, such
using these compounds as alternatives to additives in the food industries.
Factors determining the activity of essential oils are composition, functional groups present in active
components, and their synergistic interactions [22]. Previous studies state that oxygenated terpenes
(terpenoids) such as phenolics exhibit better antimicrobial activity than hydrocarbons such as R-(–)-
limonene, terpinene, camphene, and (+)-α-pinene, which agree with the present work, since these
compounds presented weak antimicrobial action [22–26]. The results of the present study agree that
oxygenated functional groups in terpenes compounds exhibited better antimicrobial activity than
hydrocarbons. Previous study reported MIC of 0.031 mg/mL for thymol and 0.015 mg/mL carvacrol
against S. aureus [27]. In the present study similar values were found, the MIC was 0.007 mg/mL for
thymol, and 0.015 mg/mL for carvacrol against S. aureus. According to Mazarei et al. [28], the MICs
for E. coli strain and S. aureus were 0.25 and 0.125 mg/mL, respectively, for carvacrol. As mentioned
before, the classification of the antimicrobial actions of pure compounds is not well consolidated in the
literature making difficult the comparison with previous results. In addition, this difficulty has been
reported in previous studies [29,30].
Another relevant point of the antimicrobial activity is the mechanism of action. It can vary with the type
of the essential oil or the strain of the microorganism used [22]. Previous studies have proposed that
aromatic nuclei with a polar functional group are responsible for antimicrobial activity, but the
mechanism is not very well elucidated. However, some mechanisms have been proposed. For example,
the rupturing of the cell membrane and changes in the ion channels (Na+, K+, Ca2+, or Cl−) in the cell
membrane might increase the permeability and cause the release of vital intracellular constituents [31],
and inhibition of target enzymes [32]. Previous study confirm by scanning electron microscopy that the
main mechanism of action of thymol is the membrane dysfunction, and suggests that thymol can be used
as a naturally occurring drug against S. Typhimurium place of synthetic drugs [33]. The same result
were verified for eugenol and terpineol for S. Typhimurium in Figure 4. Hydroxyl groups, such as those
 found in thymol, eugenol, terpineol and carvacrol, are highly reactive and form hydrogen bonds with
active sites of target enzymes, inactivating them [32,34], and consequently, a dysfunction or rupture of
the cell membrane. For example, thymol, which showed strong activity in the present work, is a
compound commonly found in many essential oils and inhibits Gram-positive and Gram-negative
bacteria, including Bacillus subtilis, E. coli, Klebsiella pneumoniae and S. aureus [3,26,35].
Friedman et al. [36], mentioned that essential oils and their compounds can be divided into two groups:
slow acting compounds and fast-acting compounds. According to the results presented in Figure 1, it
was observed that terpineol, eugenol, geraniol, carveol and citronellol were considered fast-acting
compounds, since they inactivated organisms such as E. coli and S. Typhimurium in a short period (2 h).
It has been reported that some antimicrobials considered fast-acting compounds are carvacrol,
cinnamaldehyde and geraniol, since they inactivate organisms like E. coli and S. Typhimurium in five
minutes, while compounds that act slowly requires 30–60 min to show efficient antimicrobial activity
[36].
Previous studies verified the greater resistance of Gram-positive bacteria and mentioned that the greater
resistance of Gram-positive cells may be due to their cell walls having a thick layer of peptidoglycan,
making it difficult to pass antimicrobial agents and thus imparting rigidity to their cells [37,38].
The outer membrane of Gram-negative bacteria has porin channels, where the transport of low-
molecular-weight substances occurs, and drugs with lipophilic characteristics have difficulty in crossing
these channels [39]. In the present work, the compounds that showed the best activity in both MIC and
time-kill kinetics have low molecular weights and polar functional groups. Such characteristics can
increase antimicrobial capacity by facilitating penetration through the outer cell membrane. This
hypothesis was verified by the action of eugenol, a phenolic compound of low molecular weight that
presented fast time-kill kinetics, which led to the death of S. Typhimurium at all concentrations in only
two h. In addition, Figures 3 and 4 show that terpineol and eugenol affected the morphology of S. aureus
and S. Typhimurium, respectively, indicating that the mechanism of action should be related by the
rupture or dysfunction of the cell membrane.

4. Materials and Methods

4.1. Materials
Terpene standards were obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). The structure of
compounds are in Figure S1 (Supplementary Materials): (−)-α-bisabolol (95%), (−)-borneol (99%), (+)-
borneol (97%), camphene (95%), (±) camphor (95%), carvacrol (98%), mixture of cis and trans l-
carveol (95%), (+) carvone (98%), l-carvone (97%), β-caryophyllene (80%), citral (95%), (±) citronellal
(95%), β-citronellol (95%), m-cymene (99%), p-cymene (99%), eucalyptol (99%), eugenol (99%),
trans-geraniol (98%), guaiene (97%), α-humulene (96%), R-(+)-limonene (99%), (±)-linalool
(97%), β-myrcene (100%), ocimene mixture of isomers (90%), α-phellandrene (75%), (+)-α-pinene
(99%),
(+)-β-pinene (98%), sabinene (75%), γ-terpinene (98%), terpineol, mixture of isomers (98%),
terpinolene (90%), thymol (99%), (+)-valencene (65%). The bacterial strains E. coli (ATCC 8739), S.
aureus (ATCC 25923), S. Typhimurium (ATCC 14028) and B. cereus (ATCC 14579) were obtained
from the list of reference strains of INCQS-FIOCRUZ. DMSO (dimethylsulfoxide) was from Vetec (Rio
de Janeiro, Brazil), and Mueller-Hinton agar (MH) and broth (MHB) were obtained from Himedia
Laboratories PVT (Mumbai, India). The standard triphenyl tetrazolium chloride (TTC), sulfanilamide
and the other reagents were purchased from Sigma-Aldrich.

4.2. Screening
The assay was performed according to the CLSI M7-A6 protocol [40]. The compounds were prepared in
DMSO (0.75 mg/mL) in sterile Eppendorf and stored at 4 ◦C to minimize losses by volatilization. For
the analyses, stock solutions were diluted in Mueller-Hinton broth and the final concentration of the
compounds and DMSO in the well were 0.25 mg/mL and 0.25%, respectively. The inoculum was
adjusted to there McFarland scale 0.5 (1.5 × 108 CFU/mL) with a spectrophotometer (T80 +, PG
Instruments, Leicestershire, UK) at 625 nm to reach an optical density of 0.08 to 0.10 and thereafter
adjusted with Mueller Hinton broth so that each well of the microplate had 5 × 105 CFU/mL. Negative
control (Mueller-Hinton broth + DMSO 0.25% + inoculum) and sterility control (Mueller-Hinton broth
with DMSO 0.25% without inoculum) were added to all plates, and the analyses were performed in
triplicate. The assays were performed individually for each terpene and microorganism in order to avoid
cross-interaction between the compounds by volatilization. Plates with lids were incubated at 35 ◦C for
 24 h. After 24 h, 50 µL of TTC (0.5% aqueous solution) was added and then incubated at 35 ◦C for 6 h.
The antimicrobial activity was verified by the inhibition of the visible growth of live cells, which was
confirmed by TTC (dead cells are not colored). The compounds that presented positive
activity in these results were selected for determining the minimum inhibitory concentrations (MICs).
4.3. Minimum Inhibitory Concentrations
The MIC determination was performed by the microdilution method according to the method M7-A6 of
the CLSI [40]. The inoculum was adjusted to there McFarland scale 0.5 (1.5 × 108 CFU/mL) with a
spectrophotometer (T80 +, PG Instruments, Leicestershire, UK) at 625 nm to reach an optical density of
0.08 to 0.10 and thereafter adjusted with Mueller Hinton broth so that each well of the microplate had 5
x 105 CFU/mL. The final concentration of the terpenes ranged from 0.25 to 0.002 mg/mL, the assays
were performed individually for each terpene and microorganism to avoid cross-interaction between the
compounds by volatilization. For every assay, the sterility control (Mueller-Hinton Broth
with DMSO 0.25% without inoculum), the negative control (Mueller-Hinton broth with DMSO 0.25%
and inoculum) and positive control (Mueller-Hinton broth with DMSO 0.25%, sulfanilamide and
inoculum) were checked. All analyses were performed in triplicate. The plates were incubated at 35 ◦C
for 24 h and sealed to minimize volatilization losses. After 24 h, 50 µL of TTC (0.5% aqueous solution)
was added and then incubated at 35 ◦C for 6 h of incubation. The MIC of the compound was determined
as being the lowest concentration of that compound that inhibited the visible growth of cells, which was
confirmed by TTC (dead cells are not colored).
4.4. Minimal Bactericidal Concentration (MBC)

To determine minimum bactericidal concentrations (MBC), 100 µL aliquots from wells where no
growth was observed (MIC, 2× MIC and 4× MIC) were plated in Petri dishes on Mueller-Hinton agar
medium, which were then incubated in an oven at 35 ◦C for 24 h. MBC was defined as 99.9% (lack of
growth) decrease in viable cells [41].
4.5. Time-kill Curve Studies
The 24-hour time-kill curve study was performed according to the methodology described in document
M26-A of the CLSI [42]. The concentrations evaluated were MIC, 2xMIC and 4× MIC and negative
control (Mueller-Hinton broth with DMSO 0.25% and inoculum) were prepared. Bacterial suspension
was prepared to obtain a turbidity comparable to 0.5 McFarland (1.5 × 108 CFU/mL) that was adjusted
to approximately 5 × 105 CFU/mL after incubation into tube contains concentration MIC, 2xMIC and 4×
MIC. These assay samples were incubated at 35ºC at 24h. A 10 µL aliquot of this homogenate was
added to 990 µL of 0.9% sterile saline, and 100 µL of this solution was then added to Mueller-Hinton
agar. The plating occurred at 0, 2, 4, 8, 12 and 24 h after preparation. The plates were incubated for 24 h
at 35 ◦C. After incubation, the colonies were counted manually, and the obtained numbers were
multiplied by 1000 to find the number of CFU/mL. These values were transformed to a logarithmic
scale for the creation of time-of-death graphs. A reduction in the number of CFUs from the initial count
by ≥ 3 log10 was defined as a bactericidal effect.

4.6. Scanning Electron Microscopy (SEM)

The procedure for SEM analysis was performed according previous study [43] with some modifications.
E. coli, S. aureus and S. Typhimurium microorganisms were cultured on Mueller-Hinton agar. Mid-log-
phase bacterial cultures were transferred to Mueller-Hinton broth and treated with different terpenes
(terpineol, eugenol, carveol, citronellol and geraniol) within 4 h at a 4× MIC concentration. Suspensions
of cells were fixed with a 2.5% glutaraldehyde solution and 0.1 M cacodylate buffer overnight. The
samples were post-fixed with 1% osmium tetroxide for 40 minutes at room temperature. Samples were
washed with 0.1 M cacodylate buffer and then dehydrated in a series of alcohol solutions at different
concentrations, starting at 20% and increasing to 100% (v/v). The samples were then transferred to a
sample basket and placed in a critical point dryer. The slides with samples were then coated with gold in
a spray machine prior to their visualization with SEM.

5. Conclusions
Among the 33 evaluated compounds, the majority presented only bacteriostatic activity. The oxygenated
terpenes showed strong antibacterial activity against all tested bacteria, especially Gram-negative
bacteria. These compounds showed promising antimicrobials effects, even higher than sulfanilamide.
The images obtained by SEM indicate that the mechanism of the cell death of the evaluated bacteria is
due to loss of cellular membrane integrity or function. The present study brings detailed knowledge
about the antimicrobial activity of the 33 individual compounds commonly present in essential oils, that
can provide a greater understanding for the future researches of synergism, mechanism of action and
bioavailability of different essential oils components.
Supplementary Materials: The supplementary materials are available online.
Author Contributions: Project design, experiment and data analysis: A.C.G., L.M.M., M.F.L. Project orientation, coordination
and review: M.C.C.G., D.C.E., M.F., R.S.
Funding: This work was supported by the Foundation for Support to Research and Innovation of Espírito
Santo-FAPES. This study was financed in part by the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil
(CAPES) - Finance Code 001. National Council for Scientific Technological Research-CNPq is acknowledged for their
financial support.
Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest.

References
1. Chouhan:, S.; Sharma, K.; Guleria, S. Antimicrobial Activity of Some Essential Oils—Present Status and Future
Perspectives. Medicines 2017, 4, 58. [CrossRef] [PubMed]
2. Iriti, M.; Colnaghi, G.; Chemat, F.; Smadja, J.; Faoro, F.; Visinoni, F.A. Histo-cytochemistry and scanning electron
microscopy of lavander glandular trichomes following conventional and microwave-assisted hydrodistillation of essential
oils: A comparative study. Flavour Fragr. J. 2006, 21, 704–712. [CrossRef]
3. IUPAC Compendium of Chemical Terminology-Gold Book: Version 2.3.3 2014-02-24. Available online:
https://goldbook.iupac.org/src/src_PAC1995671307.html (accessed on 2 December 2019).
4. Tripathi, N.N.; Kumar, N. Putranjiva roxburghii oil-A potential herbal preservative for peanuts during storage. J. Stored
Prod. Res. 2007, 43, 435–442. [CrossRef]
5. Pandey, A.K.; Mohan, M.; Singh, P.; Palni, U.T.; Tripathi, N.N. Chemical composition, antibacterial and antioxidant
activity of essential oil of Eupatorium adenophorum Spreng. from Eastern Uttar Pradesh, India.
Food Biosci. 2014, 7, 80–87. [CrossRef]
6. Sonker, N.; Pandey, A.K.; Singh, P. Efficiency of Artemisia nilagirica (Clarke) Pamp. essential oil as a mycotoxicant against
postharvest mycobiota of table grapes. J. Sci. Food Agric. 2015, 95, 1932–1939. [CrossRef] [PubMed]
7. Darbre, P.D.; Harvey, P.W. Parabens can enable hallmarks and characteristics of cancer in human breast epithelial cells: A
review of the literature with reference to new exposure data and regulatory status. J. Appl. Toxicol. 2014, 34, 925–938.
[CrossRef] [PubMed]
8. Wróbel, A.M.; Gregoraszczuk, E.Ł. Actions of methyl-, propyl- and butylparaben on estrogen receptor-α and
-β and the progesterone receptor in MCF-7 cancer cells and non-cancerous MCF-10A cells. Toxicol. Lett. 2014, 230, 375–
381. [CrossRef]
9. Song, P.; Wu, L.; Guan, W. Dietary nitrates, nitrites, and nitrosamines intake and the risk of gastric cancer: A meta-analysis.
Nutrients 2015, 7, 9872–9895. [CrossRef]
10. Puah, S.M.; Chua, K.H.; Mary Anne Tan, J.A. Virulence factors and antibiotic susceptibility of Staphylococcus aureus
isolates in ready-to-eat foods: Detection of S. aureus contamination and a high prevalence of virulence genes. Int. J. Environ.
Res. Public Health 2016, 13. [CrossRef]
11. Walker-York-Moore, L.; Moore, S.C.; Fox, E.M. Characterization of Enterotoxigenic Bacillus cereus sensu lato and
Staphylococcus aureus Isolates and Associated Enterotoxin Production Dynamics in Milk or Meat-Based Broth. Toxins
(Basel) 2017, 9, 225. [CrossRef]
12. Adams, A.M.; Leja, L.L.; Jinneman, K.; Beeh, J.; Yuen, G.A.; Wekell, M.M. Anisakid Parasites, Staphylococcus aureus
and Bacillus cereus in Sushi and Sashimi from Seattle Area Restaurants. J. Food Prot. 2016, 57, 311–317. 13.
Atanassova, V.; Reich, F.; Klein, G. Microbiological Quality of Sushi from Sushi Bars and Retailers. J. Food Prot.
2016, 71, 860–864.
14. Muscolino, D.; Giarratana, F.; Beninati, C.; Tornambene, A.; Panebianco, A.; Ziino, G. Hygienic-sanitary evaluation of
sushi and sashimi sold in Messina and Catania, Italy. Ital. J. Food Saf. 2014, 3, 134–136. [CrossRef] [PubMed]
15. Hammad, A.M.; Watanabe, W.; Fujii, T.; Shimamoto, T. Occurrence and characteristics of methicillin-resistant and -
susceptible Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci from Japanese retail ready-
to-eat raw fish. Int. J. Food Microbiol. 2012, 156, 286–289. [CrossRef] [PubMed]
16. Gaur, A.H.; Patrick, C.C.; McCullers, J.A.; Flynn, P.M.; Pearson, T.A.; Razzouk, B.I.; Thompson, S.J.; Shenep, J.L. Bacillus
cereus Bacteremia and Meningitis in Immunocompromised Children. Clin. Infect. Dis. 2002, 32, 1456–1462. [CrossRef]
[PubMed]
17. Dabscheck, G.; Silverman, L.; Ullrich, N.J. Bacillus cereus cerebral abscess during induction chemotherapy for childhood
acute leukemia. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 2015, 37, 568–569. [CrossRef] [PubMed]
18. Hansford, J.R.; Phillips, M.; Cole, C.; Francis, J.; Blyth, C.C.; Gottardo, N.G. Bacillus cereus bacteremia and multiple brain
abscesses during acute lymphoblastic leukemia induction therapy. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 2014, 36, 197–201.
[CrossRef] [PubMed]
19. Manges, A.R. Escherichia coli and urinary tract infections: The role of poultry-meat. Clin. Microbiol. Infect. 2016, 22, 122–
129. [CrossRef]
20. Tarabees, R.; Elsayed, M.S.A.; Shawish, R.; Basiouni, S.; Shehata, A.A. Isolation and characterization of Salmonella
Enteritidis and Salmonella Typhimurium from chicken meat in Egypt. J. Infect. Dev. Ctries. 2017, 11, 314–319. [CrossRef]
21. Cos, P.; Vlietinck, A.J.; Berghe, D.V.; Maes, L. Anti-infective potential of natural products: How to develop a stronger in
vitro “proof-of-concept.”. J. Ethnopharmacol. 2006, 106, 290–302. [CrossRef]
22. Dorman, H.J.D.; Deans, S.G. Antimicrobial agents from plants: Antibacterial activity of plant volatile oils. J. Appl.
Microbiol. 2000, 88, 308–316. [CrossRef] [PubMed]
23. Campos-Requena, V.H.; Rivas, B.L.; Pérez, M.A.; Figueroa, C.R.; Sanfuentes, E.A. The synergistic antimicrobial effect of
carvacrol and thymol in clay/polymer nanocomposite films over strawberry gray mold. LWT Food Sci. Technol. 2015, 64,
390–396. [CrossRef]
24. Guarda, A.; Rubilar, J.F.; Miltz, J.; Galotto, M.J. The antimicrobial activity of microencapsulated thymol and carvacrol.
Int. J. Food Microbiol. 2011, 146, 144–150. [CrossRef] [PubMed]
25. Scherer, R.; Wagner, R.; Duarte, M.C.T.; Godoy, H.T. Composição e atividades antioxidante e antimicrobiana dos óleos
essenciais de cravo-da-índia, citronela e palmarosa. Rev. Bras. Plantas Med. 2009, 11, 442–449.
[CrossRef]
26. Wattanasatcha, A.; Rengpipat, S.; Wanichwecharungruang, S. Thymol nanospheres as an effective anti-bacterial agent. Int.
J. Pharm. 2012, 434, 360–365. [CrossRef] [PubMed]
27. Nostro, A.; Roccaro, A.S.; Bisignano, G.; Marino, A.; Cannatelli, M.A.; Pizzimenti, F.C.; Cioni, P.L.; Procopio, F.; Blanco,
A.R. Effects of oregano, carvacrol and thymol on Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis biofilms. J. Med.
Microbiol. 2007, 56, 519–523. [CrossRef] [PubMed]
28. Mazarei, Z.; Rafati, H. Nanoemulsification of Satureja khuzestanica essential oil and pure carvacrol; comparison of
physicochemical properties and antimicrobial activity against food pathogens. LWT 2019, 100, 328–334. [CrossRef]
29. Reyes-Jurado,F.; Franco-Vega,A.; Ramírez-Corona,N.; Palou,E.; López-Malo,A.EssentialOils: Antimicrobial Activities,
Extraction Methods, and Their Modeling. Food Eng. Rev. 2014, 7, 275–297.
30. Neta, M.C.S.; Vittorazzi, C.; Guimarães, A.C.; Martins, J.D.L.; Fronza, M.; Endringer, D.C.; Scherer, R. Effects of β-
caryophyllene and Murraya paniculata essential oil in the murine hepatoma cells and in the bacteria and fungi 24-h time-
kill curve studies. Pharm. Biol. 2017, 55, 190–197. [CrossRef]
31. Oz, M.; Lozon, Y.; Sultan, A.; Yang, K.H.S.; Galadari, S. Effects of monoterpenes on ion channels of excitable cells.
Pharmacol. Ther. 2015, 152, 83–97. [CrossRef]
32. Ouattara, B.; Simard, R.E.; Holley, R.A.; Piette, G.J.P.; Bégin, A. Antibacterial activity of selected fatty acids and essential
oils against six meat spoilage organisms. Int. J. Food Microbiol. 1997, 37, 155–162. [CrossRef]
33. Chauhan, A.K.; Kang, S.C. Thymol disrupts the membrane integrity of Salmonella ser. Typhimurium in vitro and recovers
infected macrophages from oxidative stress in an ex vivo model. Res. Microbiol. 2014, 165, 559–565. [CrossRef] [PubMed]
34. Kim, J.; Marshall, M.R.; Wei, C. Antibacterial activity of some essential oil components against five foodborne pathogens.
J. Agric. Food Chem. 1995, 43, 2839–2845. [CrossRef]
35. Bhatti, H.N.; Khan, S.S.; Khan, A.; Rani, M.; Ahmad, V.U.; Choudhary, M.I. Biotransformation of monoterpenoids and
their antimicrobial activities. Phytomedicine 2014, 21, 1597–1626. [CrossRef] [PubMed]
36. Friedman, M.; Henika, P.R.; Levin, C.E.; Mandrell, R.E. Antibacterial activities of plant essential oils and their components
against Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica in apple juice. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 6042–6048.
[CrossRef] [PubMed]
37. Magiatis, P.; Skaltsounis, A.L.; Chinou, I.; Haroutounian, S.A. Chemical composition and in-vitro antimicrobial activity of
the essential oils of three Greek Achillea species. Zeitschrift fur Naturforsch. C 2002, 57, 287–290. [CrossRef]
38. Lopez-Romero, J.C.; González-Ríos, H.; Borges, A.; Simões, M. Antibacterial Effects and Mode of Action of
Selected Essential Oils Components against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Evid.-Based Complement. Altern.
Med. 2015, 2015. [CrossRef]
39. Nikaido, H. Preventing drug access to targets: Cell surface permeability barriers and active efflux in bacteria. Semin. Cell
Dev. Biol. 2001, 12, 215–223. [CrossRef]
40. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard—Sixth
Edition. Available online: http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/clsi/clsi_ opasm7_a6.pdf (accessed on 28 May
2019).
41. Moreira, M.R.; Ponce, A.G.; Del Valle, C.E.; Roura, S.I. Inhibitory parameters of essential oils to reduce a foodborne
pathogen. LWT Food Sci. Technol. 2005, 38, 565–570. [CrossRef]
42. Methods for Determining Bactericidal Activity of Antimicrobial Agents; Approved Guideline. Available online:
https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m26/ (accessed on 28 May 2019).
43. Sajali, N.; Mohd Desa, M.N.; Thian Lung, L.T.; Pei, C.P. Anti-hyphal formation property of allicin in suppression of
Aspergillus fumigatus growth. Malays. J. Microbiol. 2013, 9, 245–252. [CrossRef]

Sample Availability: Not available.

© 2019 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access article
distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY) license
(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).