1

MATERI UJI BIOKIMIAWI BAKTERI I

1. API 20 E Sistem Identifikasi untuk Enterobacteriaceae dan Batang

Gram-negatif lainnya

Tujuan
Sistem multiuji t API 20 E (tersedia dari bioMérieux, Inc.) merupakan
suatu bahan digunakan secara klinis untuk identifikasi cepat kelompok bakteri
Enterobacteriaceae (lebih dari 5.500 galur) dan kelompok bakteri berbentuk
batang negatif Gram lainnya (lebih dari 2.300 galur).
Prinsip
Sistem API 20 E merupakan suatu strip plastik yang terdiri dari 20
microtubes dan cupules, sebagian diisi dengan substrat/media terdehidrasi
yang berbeda. Suspensi bakteri ditambahkan ke dalam microtubes yang berisi
media terehidrasi dan proses inokulasi dilakukan pada waktu yang
bersamaan. Seperti halnya uji biokimia lainnya, perubahan warna terjadi di
dalam microtube baik selama inkubasi atau setelah penambahan reagen.
Perubahan warna ini menjadi tanda/indikator ada atau tidak adanya reaksi
kimia sehingga nantinya dapat dinilai bahwa uji biokimia tersebut
mendapatkan hasil positif atau negatif (Gambar 7-1).
Setelah inkubasi, reaksi spontan akan terjadi, yaitu reaksi yang tidak
memerlukan penambahan reagen dapat dievaluasi terlebih dahulu, setelah itu
baru uji yang membutuhkan penambahan reagen dilakukan dan dievaluasi.
Akhirnya, hasil pengujian baik positif maupun negative dimasukkan pada
Lembar Hasil pengujian (Gambar 7-2). Khusus untuk uji oksidase dilakukan
secara terpisah dan ini merupakan uji ke-21.
Seperti ditunjukkan pada Gambar 7-2, Lembar Hasil pengujian
membagi uji menjadi tiga kelompok, dengan masing-masing kelompok diberi
nilai numerik 1, 2, atau 4. Angka-angka ini diberikan hanya untuk hasil
positif (+) saja, sedangkan hasil negatif (-) tidak dihitung. Nilai untuk hasil
positif dalam setiap kelompok ditambahkan bersama-sama untuk
menghasilkan angka dari 0 hingga 7, yang dimasukkan/dituliskan ke dalam
lingkaran oval di bagian bawah tiga kelompok uji. Total dari masing-masing
kelompok kemudian digabungkan secara berurutan untuk menghasilkan tujuh
kode digit yang kemudian dapat ditafsirkan pada Indeks Profil Analitik*.
Dalam kasus yang jarang terjadi, informasi dari ke-21 uji (dan kode 7
digit) tidak cukup diskriminatif untuk mengidentifikasi suatu organisme.
Ketika hal ini terjadi, organisme akan ditumbuhkan dan diperiksa pada Agar
MacConkey dan uji tambahan akan dilakukan untuk uji reduksi nitrat,
oksidasi/pengurangan glukosa, dan motilitas. Hasilnya dimasukkan secara
terpisah di ruang tambahan pada Lembar Hasil pengujian dan digunakan
untuk identifikasi akhir.
 
2. Empedu Esculin Uji
Tujuan
Uji Bile Esculin merupakan uji yang paling umum digunakan untuk
identifikasi pendugaan bakteri enterococci dan anggota kelompok
Streptococcus bovis, yang semuanya menunjukkan hasil positif.
 2

Prinsip
Bile Esculin Agar merupakan media yang tidak terdefinisi (diketahui
secara pasti kandungannya), media selektif, dan juga media diferensial yang
mengandung ekstrak daging sapi, gelatin pencernaan, esculin oxgall
(empedu), dan besi sitrat. Esculin, diekstrak dari kulit pohon Chestnut Kuda,
adalah glikosida yang terdiri dari glukosa dan esculetin ekstrak daging sapi
dan gelatin yang menyediakan nutrisi dan energi; empedu adalah agen
selektif yang ditambahkan untuk memisahkan kelompok Streptococcus bovis
dan enterococci dari streptokokus lainnya (lihat Tabel 2-3, halaman 6). Besi
sitrat ditambahkan sebagai sumber zat besi teroksidasi untuk menunjukkan uji
positif.
Banyak kelompok bakteri yang dapat menghidrolisis esculin dalam
kondisi asam (Gambar 7-7), dan banyak bakteri, terutama bakteri enterik
Gram negatif, menunjukkan toleransi terhadap empedu. Namun, di antara
streptokokus, biasanya hanya enterokokus dan anggota kelompok
Streptococcus bovis (S. equinus, S. gallolyticus, S. infantarius, dan S.
alactolyticus) yang mentolerir empedu dan mampu menghidrolisis esculin.
Dalam uji ini, ketika molekul esculin terbelah, esculetin akan
bereaksi dengan Fe3+ dari besi sitrat untuk membentuk endapan berwarna
 

coklat tua (Gambar 7-8). Endapan ini akan menggelapkan media yang

mengelilingi pertumbuhan bakteri. Bakteri yang mampu menggelapkan
medium sekalipun itu hanya sedikit menunjukkan hasil uji bile esculin positif
(Gambar 7-9), sedangkan bakteri yang tidak dapat menggelapkan medium
disebut bile esculine negatif.
 
3. Uji Agar Darah
Tujuan
Uji menggunakan medium Agar darah merupakan uji yang digunakan
untuk isolasi dan kultur berbagai jenis bakteri yang rewel (sulit
ditumbuhkan). Selain itu, uji ini juga dapat digunakan untuk membedakan
bakteri berdasarkan karakteristik hemolitiknya, terutama bakteri dari genera
Streptococcus, Enterococcus, dan Aerococcus.
Prinsip
Beberapa spesies cocci Gram-positif mampu menghasilkan eksotoksin
yang disebut hemolisin, suatu substansi yang mampu menghancurkan sel
darah merah (RBC) dan hemoglobin. Blood Agar, kadang-kadang disebut
juga Sheep Blood Agar karena mengandung 5% darah domba dalam basis
media Tryptic Soy Agar (TSA) sehingga memungkinkan untuk membedakan
bakteri berdasarkan kemampuannya dalam meng-hemolisis sel darah merah.
Terdapat tiga jenis utama hemolisis yaitu β-hemolisis, α-hemolisis,
dan γ-hemolisis. β-hemolisis, mampu melakukan penghancuran secara
lengkap sel darah merah dan hemoglobin, menghasilkan zona jernih pada
medium sekitar koloni (Gambar 7-10). α-hemolisis hanya mampu melakukan
penghancuran parsial sel darah merah dan menghasilkan warna kehijauan
pada medium di sekitar koloni (Gambar 7-11). γ-hemolisis merupakan
kelompok nonhemolisis dengan pertumbuhan bakteri normal atau sederhana
tanpa adanya perubahan penampakan pada permukaan medium (Gambar 7-
12).
 3

Hemolysin yang diproduksi oleh kelompok bakteri streptococci

disebut streptolysins yang terdiri dari dua bentuk/tipe yaitu tipe O dan tipe S.
Streptolysin O adalah merupakan oksigen-labil yang mengekspresikan
aktivitasnya secara maksimal di bawah kondisi anaerob. Streptolisin S
merupakan oksigen-stabil, tetapi mengekspresikan dirinya secara optimal di
bawah kondisi anaerobik juga. Metode termudah untuk menyediakan
lingkungan yang menguntungkan untuk streptolysin pada Agar Darah adalah
apa yang disebut teknik streak-stab. Dalam prosedur ini, medium Agar
Darah digoreskan untuk isolasi dan kemudian ditusuk menggunakan jarum
ose. Adanya tusukan akan mendorong aktivitas streptolisin karena
mengurangi konsentrasi oksigen dari lingkungan di bawah permukaan
medium (Gambar 7-13).

4. Uji CAMP
Tujuan
Uji CAMP (singkatan dari nama penemu uji ini yaitu Christie,
Atkins, dan Munch-Peterson) digunakan untuk membedakan bakteri Grup B
Streptococcus agalactiae (+) dari spesies Streptococcus lainnya (-).
Prinsip
Grup B Streptococcus agalactiae menghasilkan CAMP factor, suatu
protein hemolitik yang bekerja secara sinergis dengan_β-hemolysin dari
bakteri Staphylococcus aureus subsp. aureus. Ketika bakteri S. aureus subsp.
aureus digoreskan tegak lurus di atas permukaan medium Agar Darah
(Gambar 7-14), akan terbentuk suatu zona/daerah hemolisis yang berbentuk
seperti kepala anak panah yang menunjukkan hasil uji positif (Gambar 7-15).
 
5. Uji Hidrolisis Kasein
Tujuan
Uji Hidrolisis kasein digunakan untuk mengidentifikasi bakteri yang
mampu menghidrolisis kasein dengan menggunakan enzim casease.
Prinsip
Banyak bakteri memerlukan protein sebagai sumber asam amino dan
komponen lain untuk proses sintetik. Beberapa bakteri memiliki kemampuan
untuk memproduksi dan mengeluarkan enzim (exoenzymes) ke dalam
lingkungan yang mengkatalisis hidrolisis (pemecahan) protein besar menjadi
peptida yang lebih kecil atau individu asam amino sehingga memungkinkan
penyerapannya melalui membran. Casease adalah enzim yang dimiliki oleh
beberapa bakteri yang berfungsi untuk menghidrolisis protein pada susu yang
disebut kasein (Gambar 7-16), suatu molekul yang memberi susu berwarna
putih. Ketika dipecah menjadi fragmen yang lebih kecil, kasein putih
biasanya akan kehilangan opacity (kekeruhannya) dan menjadi jernih.
Kehadiran enzim casease dapat dideteksi dengan mudah
menggunakan media uji Milk Agar (Gambar 7-17). Milk Agar adalah media
yang tidak didefinisikan (tidak diketahui secara pasti kandungannya) yang
mengandung kasein dari pancreas pencernaan, ekstrak ragi, dekstrosa, dan
susu bubuk. Saat medium ini diinokulasi dengan bakteri casease positif,
enzim casease yang disekresikan akan berdifusi ke dalam media di sekitar
koloni dan akan terbentuk zona jernih di mana kasein telah dihidrolisis.
 4

Sebaliknya bakteri casease negatif tidak mampu mensekresikan enzim

casease sehingga tidak akan menghasilkan zona jernih di sekitar koloni.
 
6. Uji Katalase
Tujuan
Uji katalase merupakan uji biokimia yang digunakan untuk
mengidentifikasi bakteri yang mampu menghasilkan enzim katalase. Hal ini
paling sering digunakan untuk membedakan anggota bakteri katalase positif
Micrococcaceae dari anggota bakteri katalase negatif Streptococcaceae.
Variasi pada uji ini juga dapat digunakan dalam identifikasi spesies
Mycobacterium.
Prinsip
Rantai transpor elektron bakteri aerob dan anaerob fakultatif terdiri
dari molekul yang mampu menerima dan mendonasikan elektron
sebagaimana kondisi yang ditentukan. Dengan demikian, molekul-molekul ini
dapat berganti bentuk dari bentuk teroksidasi ke bentuk tereduksi atau
sebaliknya dengan melewatkan elektron melalui rantai ke akseptor elektron
akhir (FEA). Energi yang hilang oleh elektron dalam transfer berurutan ini
digunakan untuk melakukan fosforilasi oksidatif (yaitu, menghasilkan ATP
dari ADP).
Satu molekul pembawa di ETC disebut flavoprotein dapat memotong
jalan pembawa berikutnya dalam rantai dan mentransfer elektron langsung ke
oksigen (Gambar 7-18). Jalur alternatif ini menghasilkan dua molekul seluler
yang bersifat toksik (beracun) yaitu hidrogen peroksida (H2O2) dan
superoksida radikal (O2-).
Bakteri aerob dan anaerob fakultatif mampu menghasilkan enzim
yang mampu mendetoksifikasi kedua senyawa ini. Superoxide dismutase
mengkatalisis konversi superoksida radikal (yang lebih mematikan dari kedua
senyawa tersebut) menjadi hidrogen peroksida (Gambar 7-18). Enzim
katalase mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen gas (Gambar
7-19).
Bakteri yang menghasilkan enzim katalase dapat dideteksi dengan
mudah menggunakan larutan hidrogen peroksida. Ketika hidrogen peroksida
ditambahkan ke kultur bakteri katalase positif, maka akan segera terbentuk
gelembung gas oksigen (Gambar 7-20 dan 7-21). Jika hasil pengujian tidak
ada gelembung yang muncul, maka bakteri yang diuji bersifat katalase
negatif. Uji katalase ini dapat dilakukan pada gelas objek ataupun dengan
menambahkan hidrogen peroksida langsung ke permukaan koloni bakteri.

7. Uji Penggunaan Sitrat

Tujuan
Uji penggunaan sitrat merupakan uji yang digunakan untuk
menentukan kemampuan suatu bakteri untuk menggunakan sitrat sebagai
satu-satunya sumber karbon. Uji ini merupakan salah satu bagian dari
rangkaian uji disebut sebagai uji IMViC (INdole, Metil Merah, Voges-
Proskauer dan Citrate) yang berguna untuk membedakan antara anggota
kelompok bakteri Enterobacteriaceae dengan kelompok bakteri berbentuk
batang Gram-negatif lainnya.
 5

Prinsip
Pada kebanyakan bakteri, sitrat (asam sitrat) diproduksi sebagai asetil
koenzim A (produk dari oksidasi piruvat atau oksidasi asam lemak) yang
akan bereaksi dengan oksaloasetat di ketika akan masuk ke siklus Krebs.
Sitrat kemudian akan dikonversi melalui serangkaian reaksi kompleks
menjadi oksaloasetat kembali yang akan memulai siklus baru. Lihat Lampiran
(Gambar A-1 dan A-4) dan Gambar 7-51 untuk informasi lebih lanjut tentang
siklus Krebs dan metabolisme asam lemak.
Dalam medium yang mengandung sitrat sebagai sumber karbon yang
tersedia, bakteri yang memiliki enzim citrate-permease dapat mengangkut
molekul ke dalam sel dan secara enzimatis akan mengubahnya menjadi
piruvat. Piruvat kemudian dapat dikonversi ke berbagai produk, tergantung
pada pH lingkungan (Gambar 7-22).
Simmons Citrate Agar merupakan medium terdefinisi (telah diketahui
secara pasti kandungannya) yang mengandung sodium sitrat sebagai satu-
satunya sumber karbon dan ammonium fosfat sebagai satu-satunya sumber
nitrogen. Bromthymol Blue dye, yang berwarna hijau pada pH 6,9 dan biru
pada pH 7,6 berperan sebagai indikator. Bakteri yang dapat bertahan hidup
pada medium ini akan memanfaatkan sitrat dan mengubah amonium fosfat
menjadi amonia (NH3) dan amonium hidroksida (NH4OH) sehingga medium
cenderung bersifat basa (alkali). Seiring dengan naiknya pH, maka medium
akan berubah dari warna hijau menjadi biru (Gambar 7-23) dan hasil ini
disebut dengan uji sitrat positif.
Kadang-kadang bakteri sitrat-positif akan tumbuh pada medium
miring Simmons Citrate tanpa menghasilkan perubahan warna. Pada
kebanyakan kasus, hal ini dapat disebabkan oleh proses inkubasi yang tidak
lengkap. Ketika tidak ada perubahan warna, pertumbuhan bakteri pada
medium miring dapat digunakan untuk menunjukkan bahwa sitrat sedang
digunakan dan dapat digunakan sebagai bukti dari reaksi positif. Untuk
menghindari kebingungan/keraguan antara pertumbuhan yang sebenarnya
dengan inokulum yang banyak yang mungkin muncul seperti pertumbuhan,
maka pada uji ini, proses inokulasi dilakukan menggunakan jarum lurus
(needle) dan bukan menggunakan jarum ose (loop).
 
8. Uji  Koagulase
Tujuan
Uji koagulase merupakan uji yang biasanya digunakan untuk
membedakan bakteri Staphylococcus aureus dari kelompok bakteri berbentuk
cocco Gram-positif lainnya.
Prinsip
Bakteri S. aureus adalah bakteri patogen oportunistik yang sangat
resisten terhadap respon imun normal dan agen antimikroba. Daya tahannya
sebagian disebabkan oleh produksi enzim koagulase. Enzim ini akan bekerja
bersama dengan komponen plasma normal untuk membentuk pelindung
fibrin di sekitar sel bakteri atau kelompok sel sehingga mampu melindungi sel
dari mekanisme fagositosis dan jenis serangan lainnya.
Enzim koagulase dapat dibedakan menjadi dua bentuk yaitu enzim
koagulase terikat dan koagulase bebas. Bentuk pertama dikenal sebagai
 6

faktor penggumpalan yang mampu melekat pada dinding sel bakteri dan
bereaksi langsung dengan fibrinogen dalam plasma sehingga fibrinogen
menjadi mengendap dan menyebabkan sel-sel akan menggumpal. Bentuk
kedua koagulase termasuk enzim ekstraseluler (dilepaskan dari sel) yang
mampu bereaksi dengan komponen plasma yang disebut coagulase reacting-
factor (CRF). Reaksi yang dihasilkan mirip dengan konversi protrombin dan
fibrinogen dalam mekanisme pembekuan normal.
Dua bentuk uji koagulase telah dirancang untuk mendeteksi enzim ini
yaitu uji tabung dan uji slide. Uji tabung mampu mendeteksi keberadaan
kedua enzim koagulase baik koagulase terikat atau koagulase bebas,
sedangkan Uji slide hanya mampu mendeteksi enzim koagulase terikat saja.
Kedua uji ini menggunakan plasma kelinci yang diobati dengan antikoagulan
untuk mengganggu mekanisme pembekuan normal.
Uji tabung dilakukan dengan menambahkan bakteri uji ke plasma
kelinci di dalam tabung reaksi. Koagulasi plasma (termasuk penebalan atau
pembentukan benang fibrin) dalam waktu 24 jam menunjukkan reaksi positif
(Gambar 7-24). Plasma biasanya diperiksa untuk pembekuan (tanpa
guncangan) setelah sekitar 4 jam karena mungkin untuk koagulasi terjadi
lebih awal dan kembali menjadi cair dalam waktu 24 jam.
Dalam uji slide, bakteri dipindahkan ke slide yang mengandung
sejumlah kecil plasma. Aglutinasi sel pada slide dalam satu hingga dua menit
menunjukkan adanya koagulase terikat (Gambar 7-25). Hasil uji slide negatif
biasanya akan dikonfirmasi menggunakan uji tabung.

9. Uji Dekarboksilasi
Tujuan
Media dekarboksilase dapat memasukkan salah satu dari beberapa
asam amino dan masing-masing mendeteksi keberadaan enzim
dekarboksilase yang berbeda. Biasanya, media ini digunakan untuk
membedakan bakteri dalam family Enterobacteriaceae dan untuk
membedakannya dari bakteri bentuk batang Gram negatif lainnya.
Prinsip
Decarboxylase Base Medium dari Møller mengandung pepton,
glukosa, indikator pH bromcresol ungu, dan co-enzym pyridoxal phosphate.
Bromcresol ungu berwarna ungu pada pH 6,8 ke atas, dan kuning di bawah
pH 5,2. Medium basa dapat digunakan dengan salah satu dari sejumlah
substrat asam amino spesifik, tergantung pada enzim dekarboksilase
yang akan diidentifikasi.
Setelah inokulasi bakteri pada medium ini, lapisan minyak digunakan
untuk menutup media dari paparan oksigen eksternal dan akan meningkatkan
proses fermentasi. Fermentasi glukosa (semua anggota Enterobacteriaceae
mampu memfermentasi glukosa) pada media anaerob awalnya akan berubah
menjadi kuning karena akumulasi produk akhir yang bersifat asam. pH yang
rendah dan adanya asam amino spesifik akan menginduksi bakteri
dekarboksilase positif untuk menghasilkan enzim ini (pada hal ini, gen
dekarboksilase spesifik akan diaktifkan).
Dekarboksilasi asam amino akan menghasilkan akumulasi produk
akhir yang bersifat basa sehingga akan mengubah media menjadi berwarna
 7

ungu (lihat Gambar 7-28 hingga 7-31). Jika bakteri tersebut mampu
memfermentasi glukosa tetapi tidak menghasilkan enzim dekarboksilase yang
sesuai, maka medianya akan menguning dan tetap demikian (tidak berubah).
Jika bakteri tidak mampu memfermentasi glukosa, media tidak akan
menunjukkan perubahan warna. Warna ungu adalah satu-satunya hasil yang
dianggap positif, sedangkan warna lainnya akan dianggap sebagai hasil
negatif (Gambar 7-32).

10. Uji DNase

Tujuan
Uji DNase merupakan uji yang digunakan untuk membedakan bakteri
spesies Serratia (+) dari spesies Enterobacter; Moraxella catarrhalis (+) dari
spesies Neisseria; dan Staphylococcus aureus (+) dari spesies Staphylococcus
lainnya.
Prinsip
Enzim yang mengkatalisis hidrolisis DNA menjadi fragmen kecil
(oligonukleotida) atau nukleotida tunggal disebut enzim deoksiribonuklease
atau enzim DNase (Gambar 7-33). Enzim ini termasuk eksoenzim, yaitu
enzim yang disekresikan oleh sel dan bekerja pada substrat secara
ekstraseluler. Pencernaan ekstraseluler ini memungkinkan pemanfaatan
molekul makro yang terlalu besar untuk diangkut ke dalam sel. Kemampuan
untuk menghasilkan enzim ini dapat ditentukan dengan membiakkan dan
mengamati bakteri yang dicurigai pada medium agar cawan untuk uji DNase,
dan ketahui terdapat tiga versi (formula) dari uji ini.
Formula pertama dari uji ini adalah DNase Agar yang terdiri dari
peptida yang berasal dari kedelai dan kasein yang berfungsi sebagai sumber
karbon dan nitrogen, natrium klorida untuk menjaga keseimbangan osmotik,
dan DNA sebagai substrat. Setelah inkubasi, ke atas permukaan medium
ditambahan beberapa tetes larutan HCl 1 N sehingga DNA utuh akan
membentuk endapan berawan ketika bereaksi dengan larutan HCl ini, tetapi
tidak dengan nukleotida. Oleh karena itu, adanya zona bening di sekitar
pertumbuhan koloni menjadi indikator bahwa aktivitas DNase (hidrolisis
DNA) positif (Gambar 7-34).
Formula kedua dari uji ini adalah modifikasi agar uji DNase
menggunakan toluidine blue yang dapat membentuk kompleks biru dengan
DNA utuh, tetapi tampak merah muda ketika beraksi dengan nukleotida.
Aktivitas DNase positif ditunjukkan oleh warna merah muda di sekitar
pertumbuhan bakteri (Gambar 7-35). Meskipun media ini memiliki
keuntungan karena tidak menggunakan pereaksi HCl 1N, tetapi senyawa
toluidine blue dapat menghambat pertumbuhan beberapa bakteri kokus Gram-
positif sehingga direkomendasikan untuk digunakan untuk kelompok
Enterobacteriaceae.
Formula ketiga dari uji ini adalah modifikasi alternatif dari medium
DNase Agar yang mengandung pewarna metil hijau. Pewarna ini akan
membentuk kompleks hijau-biru dengan DNA yang diamplifikasi pada pH
7,5, tetapi tidak akan membentuk kompleks dengan nukleotida. Koloni
bakteri yang mengeluarkan enzim DNase akan menghasilkan zona bening di
sekitar pertumbuhan koloni bakteri positif DNase (Gambar 7-36).
 8

Keuntungan dari media ini adalah tidak ada penambahan larutan HCl 1 N
dan cocok untuk digunakan untuk kelompok bakteri cocci Gram positif dan
Enterobacteriaceae.

11. Uji Fermentasi (Kaldu Ungu dan Kaldu Merah Phenol)

Tujuan
Uji menggunakan media ungu cair dan fenol merah cair merupakan
uji yang digunakan untuk membedakan bakteri dari anggota kelompok
Enterobacteriaceae dengan bakteri berbentuk batang Gram-negatif lainnya.
Prinsip
Fermentasi karbohidrat adalah proses metabolisme dimana molekul
organik bertindak sebagai donor elektron dan satu atau lebih produk
organiknya bertindak sebagai akseptor elektron terakhir. Fermentasi glukosa
dimulai dengan produksi asam piruvat. Meskipun beberapa bakteri
menggunakan jalur alternatif, sebagian besar bakteri melakukannya melalui
reaksi glikolisis (Lampiran Gambar A-1). Produk akhir dari fermentasi
piruvat meliputi berbagai asam, alkohol, dan gas H2 atau CO2. Produk akhir
ini bersifat spesifik tergantung pada jenis bakteri dan juga jenis substrat yang
difermentasi (Gambar 7-40 dan Lampiran Gambar A-5).
Prinsip di balik medium ungu cair dan merah fenol cair adalah sama.
Setiap media terdiri dari resep dasar yang ditambahkan satu jenis karbohidrat
yang dapat difermentasi. Kedua media basal ditambahkan dengan pepton dan
indikator pH. Medium ungu cair menggunakan bromcresol ungu sebagai
indikator pH yang akan berwarna kuning apabila pH berada di bawah nilai
6,8 dan akan berwarna ungu apabila berada di atas nilai 6,8; sedangkan
medium merah fenol akan berwarna kuning bila berada di bawah nilai pH 6,8,
dan akan berwarna merah muda apabila berada di atas nilai pH 7,4, dan akan
berwarna merah apabila nilai pHnya antara 6,8-7,4. Berbagai jenis
karbohidrat dapat digunakan untuk uji fermentasi, tetapi jenis glukosa,
laktosa, dan sukrosa merupakan pilihan yang paling umum. Ke dalam
medium fermentasi ini dimasukkan tabung Durham dalam posisi terbalik
pada setiap tabung yang berfungis untuk menangkap gas yang diproduksi.
Produksi asam dari fermentasi karbohidrat akan menurunkan nilai pH
di bawah kisaran netral indikator dan mengubah media menjadi berwarna
kuning (Gambar 7-41 dan 7-42). Proses deaminasi dari asam amino pepton
akan menghasilkan ammonia (NH3) yang akan menaikkan nilai pH dan
mengubah media merah fenol menjadi berwarna merah muda atau, dalam
kasus medium ungu cair, tidak akan menghasilkan perubahan warna.
Produksi gas ditunjukkan oleh gelembung atau kantung yang terperangkap di
dalam tabung Durham.
Kemampuan media ini untuk mendeteksi produksi asam sangat
tergantung pada waktu inkubasi dan kemampuan fermentor untuk
menghasilkan kelebihan asam relatif terhadap amonia yang dihasilkan dari
proses deaminasi. Jika media diperiksa pada jam ke-18 setelah inokulasi,
warna merah muda (medium merah fenol cair) atau warna ungu (medium
ungu cair) mengindikasikan bahwa bakteri belum memfermentasi substrat
dan memiliki kemungkinan berlangsungnya proses deaminasi asam amino
pepton. Pembacaan setelah jam ke-18 sampai ke-24 mungkin tidak dapat
 9

diandalkan. Jika tabung menunjukkan produksi asam, tidak ada masalah.

Namun, tidak ada perubahan warna atau menjadi suatu indikasi bahwa proses
alkalinitas mungkin disebabkan oleh proses pembalikan. Pembalikan adalah
apa yang terjadi dalam medium ketika suatu bakteri hanya melakukan
deaminasi karena konsumsi karbohidrat. Perubahan pH selanjutnya dari asam
ke basa dapat menutupi bukti fermentasi karena begitu medium merah fenol
berubah menjadi merah muda atau medium ungu cair kembali menjadi ungu,
tidak mungkin untuk secara visual membedakan proses pembalikan dari
reaksi nonfermenter sejati.

12. Uji Hidrolisis Gelatin

Tujuan
Uji hidrolisis gelatin merupakan uji yang digunakan untuk
menentukan kemampuan bakteri dalam menghasilkan enzim gelatinase.
Bakteri S. aureus merupakan bakteri gelatinase positif yang dapat dibedakan
dari bakteri S. epidermidis yang bersifat gelatinase negatif. Bakteri spesies
Serratia dan Proteus adalah anggota dari kelompok bakteri
Enterobacteriaceae yang bersifat gelatinase positif, sementara sebagian besar
lainnya bersifat gelatinase negatif. Bakteri B. anthracis, B. cereus, dan
beberapa anggota lain dari genus yang gelatinase positif adalah bakteri
Clostridium tetani dan C. perfringens.
Prinsip
Gelatin adalah protein yang berasal dari kolagen, suatu komponen
jaringan ikat pada vertebrata. Enzim gelatinase merupakan enzim
ekstraseluler yang diproduksi dan disekresikan oleh beberapa bakteri untuk
menghidrolisis gelatin. Selanjutnya, sel dapat mengambil asam amino bebas
dan menggunakannya untuk keperluan metabolisme. Proses hidrolisis gelatin
oleh bakteri dapat terjadi dalam dua rangkaian reaksi, seperti yang
ditunjukkan pada Gambar 7-43.
Kehadiran enzim gelatinase dapat dideteksi menggunakan medium
Nutrient Gelatin, media uji sederhana yang terdiri dari gelatin, pepton, dan
ekstrak daging sapi. Medium Nutrient Gelatin berbeda dari kebanyakan
media padat lainnya karena zat pemadat (gelatin) juga berperan sebagai
substrat untuk aktivitas enzimatik. Akibatnya, ketika medium Nutrient
Gelatin miring diinokulasi dengan bakteri yang mampu menghasilkan enzim
gelatinase, akan menyebabkan medium mencair. Sebaliknya, bakteri yang
termasuk dalam kelompok bakteri gelatinase negatif tidak mampu
mengeluarkan enzim sehingga tidak mampu mencairkan medium (Gambar 7-
44 dan Gambar 7-45). Masa inkubasi 7 hari biasanya cukup untuk melihat
pencairan medium. Namun, aktivitas gelatinase sangat lambat pada beberapa
bakteri. Semua tabung yang masih negatif setelah 7 hari harus diinkubasi 7
hari tambahan.
Kelemahan dari medium Nutrient Gelatin ini adalah dapat meleleh
pada suhu 28 oC (82 oF). Oleh karena itu, medium yang diinokulasi bakteri
secara tusukan biasanya akan diinkubasi pada 25 °C bersama dengan kontrol
yang tidak diinokulasi bakteri untuk memverifikasi bahwa proses pencairan
medium tidak disebabkan oleh suhu inkubasi.
 10

13. Uji Indole (Media SIM)

Tujuan
Uji indol merupakan uji yang digunakan untuk mengidentifikasi
bakteri yang mampu menghasilkan indole menggunakan enzim
tryptophanase. Uji ini merupakan salah satu komponen dari uji IMViC
(INdole, Metil Merah, Voges-Proskauer, dan Citrate) yang digunakan untuk
membedakan kelompok bakteri Enterobacteriaceae dengan bakteri berbentuk
batang Gram negatif lainnya.
Prinsip
Uji ini dilakukan dengan menggunakan media SIM agar (Sulphite
Indole Motility Agar) yang berfungsi untuk uji indole, uji motilitas dan juga
uji reduksi (penurunan) kandungan sulfur. Media ini berbentuk semi-padat
yang mengandung kasein dan jaringan hewan sebagai sumber asam amino,
senyawa yang mengandung besi, dan belerang dalam bentuk natrium
tiosulfat. Produksi indol pada medium ini disebabkan oleh adanya asam
amino triptofan (terkandung di dalam kasein dan protein hewani). Bakteri
yang memiliki enzim tryptophanase dapat menghidrolisis asam amino
tryptophan menjadi piruvat, amonia (dengan deaminasi), dan indole (Gambar
7-46).
Proses hidrolisis dari asam amino triptofan pada medium SIM agar
dapat dapat dideteksi dengan penambahan reagen Kovacs' setelah medium
yang telah diinokulasi dengan bakteri uji diinkubasi pada waktu tertentu.
Reagen Kovacs' mengandung senyawa dimetil amino benzaldehida
(DMABA) dan larutan HCl dalam amil alkohol. Ketika beberapa tetes
Reagen Kovacs ditambahkan ke medium SIM agar, akan terbentuk lapisan
cair di atas media padat. Senyawa DMABA akan bereaksi dengan indol yang
ada dan menghasilkan senyawa quinoidal yang mengubah lapisan reagen
menjadi berwarna merah (Gambar 7-47 dan 7-48). Pembentukan warna
merah di lapisan reagen menunjukkan adanya enzim tryptophanase dan hasil
uji disebut hasil uji indol positif. Sebaliknya, jika tidak terbentuk warna
merah, maka disebut hasil uji indole negatif.
Cara lain untuk melakukan uji indol adalah dengan menempatkan
sejumlah koloni bakteri di atas permukaan kertas saring yang ditetesi dengan
5% DMABA (Gambar 7-49). Hasil positif akan menunjukkan adanya
pembentukan warna pink (merah muda) pada permukaan kertas saring.

14. Uji Lipase

Tujuan
Uji Lipase merupakan uji yang digunakan untuk mendeteksi dan
menghitung bakteri lipolitik (bakteri pemecah lemak/minyak), terutama
dalam produk susu yang tinggi lemak. Berbagai substrat lipid lainnya dapat
berupa minyak jagung, minyak zaitun, dan minyak kedelai, digunakan untuk
mendeteksi perbedaan karakteristik bakteri anggota Enterobacteriaceae,
Clostridium, Staphylococcus, dan Neisseria. Beberapa spesies jamur juga
dapat menunjukkan kemampuan lipolitik.
Prinsip
Lipid adalah kata yang umumnya digunakan untuk menggambarkan
semua jenis lemak. Enzim yang menghidrolisis lemak disebut lipase. Bakteri
 11

dapat dibedakan berdasarkan kemampuannya untuk memproduksi dan

mengeluarkan enzim lipase. Meskipun berbagai lemak sederhana dapat
digunakan untuk penentuan ini, minyak tributyrin adalah unsur paling umum
digunakan untuk pengujian lipase karena merupakan tributirin merupakan
trigliserida yang paling sederhana yang ditemukan dalam di dalam lemak dan
minyak alami. Lemak sederhana dikenal sebagai trigliserida, atau
triacylglycerols (Gambar 7-51). Trigliserida tersusun dari gliserol dan tiga
asam lemak rantai panjang. Seperti halnya pada kebanyakan uji biokimia,
tributyrin terlalu besar untuk masuk ke dalam sel, sehingga beberapa sel
memiliki kemampuan untuk mengeluarkan enzim lipase untuk memecahnya
sebelum diserap ke dalam sel. Setelah lipolisis (hidrolisis), gliserol dapat
dikonversi menjadi dihidroksi aseton fosfat, zat antara glikolisis (lihat
Lampiran Gambar A-1). Asam lemak akan dikatabolisme oleh proses yang
disebut oksidasi. Dua fragmen karbon dari asam lemak akan dikombinasikan
dengan Koenzim A untuk menghasilkan Asetil-KoA yang kemudian dapat
digunakan dalam siklus Krebs untuk menghasilkan energi. Setiap Asetil KoA
yang dihasilkan oleh proses ini juga mampu menghasilkan satu molekul
NADH dan satu FADH2 (koenzim penting dalam rantai transpor elektron).
Gliserol dan asam lemak dapat digunakan sebagai alternatif dalam jalur
anabolik.
Medium Agar Tributyrin disiapkan sebagai emulsi yang menyebabkan
medium menjadi tampak buram. Ketika ini diinokulasi dengan bakteri lipase
positif, zona bening akan muncul di sekitar pertumbuhan koloni sebagai bukti
adanya aktivitas lipolitik. Jika hasil pengujian menunjukkan tidak adanya
zona bening, maka bakteri yang diuji termasuk bakteri lipase negatif (Gambar
7-52).
Medium Spirit Blue Agar dibuat sebagai emulsi dengan minyak
tributyrin dan juga mengandung zat pewarna biru spirit sebagai indikator
warna. Minyak dan pewarna ini akan membentuk kompleks yang
memberikan medium berwarna biru muda yang buram. Bakteri lipase positif
yang tumbuh pada medium ini akan menghidrolisis minyak dan
menghasilkan lingkaran cahaya yang terang di sekitar pertumbuhan koloni.
Pengecualian, lingkaran cahaya pada media yang diproduksi di sekitar
pertumbuhan bakteri P. mirabilis bukanlah hasil positif (Gambar 7-53).

15. Uji Likmus Susu

Tujuan
Uji likmus susu digunakan terutama untuk membedakan anggota
dalam genus Clostridium, membedakan kelompok bakteri
Enterobacteriaceae dari bakteri berbentuk basil Gram-negatif lainnya
berdasarkan kemampuan enteriknya, dan juga digunakan untuk kultivasi dan
pemeliharaan kultur bakteri asam laktat.
Prinsip
Litmus susu merupakan media yang tidak terdefinisi (tidak diketahui
secara pasti kandungannya) yang terdiri dari susu skim dan indikator pH
azolitmin. Susu skim menyediakan nutrisi untuk pertumbuhan, laktosa untuk
fermentasi, dan protein dalam bentuk kasein. Azolitmin (litmus) akan
 12

berwarna merah muda pada pH 4,5 dan biru pada pH 8,3. Di antara kedua
nilai pH tersebut akan berwarna ungu.
Terdapat empat reaksi dasar pada uji litmus susu yaitu uji fermentasi
laktosa, reduksi litmus, koagulasi kasein, dan hidrolisis kasein. Apabila
dikombinasikan menjadi satu, reaksi-reaksi ini akan menghasilkan berbagai
hasil uji, yang masing-masing dapat digunakan untuk membedakan dan
identifikasi bakteri. Beberapa kemungkinan kombinasi tersebut dapat
dijelaskan pada Tabel 7-2.
Fermentasi laktosa akan menyebabkan media menjadi asam dan
mengubah litmus menjadi berwarna merah muda (Gambar 7-54, tabung
kedua dari kanan). Reaksi asam ini biasanya dimulai dengan pemecahan
disakarida menjadi monosakarida berupa glukosa dan galaktosa dengan
bantuan enzim galaktosidase (Gambar 7-40). Asam yang terakumulasi dapat
menyebabkan kandungan kasein menjadi mengendap dan membentuk
bekuan (gumpalan) asam (Gambar 7-56 dan 7-57). Gumpalan asam akan
memicu medium menjadi mengeras dengan tampilan merah muda atau putih
dengan pita merah muda di bagian atas (Gambar 7-54, tabung di paling
kanan) tergantung pada reaksi reduksi-oksidasi dari litmus. Reaksi resuksi
litmus akan berwarna putih, sedangkan oksidasi litmus akan berwarna ungu.
Gumpalan asam dapat dilarutkan dalam kondisi alkali. Celah atau retakan
pada gumpalan asam menunjukkan adanya produksi gas (Gambar 7-54,
tabung ketiga dari kanan). Produksi gas yang tinggi dapat memecah gumpalan
asam tersebut dan disebut fermentasi badai.
Selain menjadi indikator pH, litmus juga berperan sebagai indikator
reduksi-oksidasi (Eh). Seperti telah disebutkan di atas, litmus yang tereduksi
akan berwarna putih. Jika litmus berkurang selama fermentasi laktosa, maka
akan berubah menjadi putih di bagian paling bawah dari tabung di mana
reaksi reduksi terbesar terjadi.
Beberapa bakteri menghasilkan enzim proteolitik (kasease) seperti
rennin, pepsin, atau chymotrypsin yang dapat mengkoagulasi kasein
menghasilkan dadih (Gambar 7-58). Dadih berbeda dari bekuan (gumpalan)
asam dimana dadih tidak akan larut dalam kondisi basa (alkali) dan
cenderung menarik diri dari sisi tabung yang memperlihatkan cairan berwarna
seperti warna jerami yang disebut whey.
Kasease tertentu dapat mencerna bekuan (gumpalan) asam dan dadih.
Suatu reaksi pencernaan hanya menyisakan cairan jernih hingga kecoklatan
(Gambar 7-54, pusat tabung). Bakteri yang hanya mampu mencerna sebagian
kasein biasanya akan menghasilkan amonia (NH3) yang dapat meningkatkan
pH medium dan mengubah litmus menjadi biru. Pembentukan cincin biru
atau ungu di bagian atas cairan bening atau kebiruan dari seluruh media
menunjukkan sebuah reaksi basa (alkali) (Gambar 7-54, tabung di paling
kiri dan ketiga dari kiri).