Isolasi dan Identifikasi

Staphylococcus spp. dan Streptococcus spp

Tujuan

Mengamati ciri-ciri pertumbuhan Staphylococcus spp. dan Streptococcus spp

Prinsip

Bakteri atau sampel ditanam padamedia untuk mendapatkan ciri spesifik dari bakteri
Staphylococcus spp. dan Streptococcus spp

Tinjauan Pustaka

a. Staphylococcus
Staphylococcus pertama kali dikenal oleh Pasteur pada tahun 1880 dan Ogstron
pada tahun 1881 dari pus seorang penderita. Selanjutnya Becker pada tahun 1883
behasil melakukan biakkan biakkan murni, pada tahun 1884 Resonbach untuk pertama
kalinya mengetahui adanya kausal antara timbulnya suatu penyakit osteomillitis dengan
bakteri staphylococcus.
Dalam genus staphylococcus terdapat 3 macam spesies yaitu staphylococcus
aureus, staphylococcus epidermiclis, staphylococcus saprophyticu, bakteri
staphylococcus memiliki bentuk bulat dan tersusun bergerombolseperti buah anggur.
Staphylococcus bersifat anaerob fakultatif, tumbuh dengan respirasi aerob atau
dengan jalur fermentasi karbohidrat yang menghasilkan asam laktat dan gas, suhu
optimal 370C, namun pembentukkan pigmen paling baik pada suhu 20-300C, ph optimal
7,4. Staphylococcus merupakan Gram positif berbentu bola dengan diameter 0,5-1,5
mikron terusun tidak teratur seperti buah anggur, nonmotil, dan tidk membentuk spora.
Bakteri ini hidup bergerombol karena mampu membelah ke arah 3 sumbu diamana sel
anaknya tetap bersinggungan satu sama lain. Struktur uniknya adalah adanya
mikrokapsul dimana lapisan yang tersusun dari polisakarida ini hanya terlihat dengan
mikroskop elektron tidak terlihat pada mikroskop cahaya.
Sebagian besar staphylococcus hidup sebagai komensial pada tubuh manusia
misalnya, pada kulit, tenggorokan, hidung, mulut. Banyak juga dijumpai pada debu-debu
di udara, makanan, dan minuman. Tetapi beberapa jenis staphylococcus dapat
menyebabkan penyakit, terutama menyebabkan infeksi pada luka-luka (pyogenes).
Diantaranya ada juga yang menyebabkan keracunan makanan, karena mengeluarkan
racun. Genus staphylococcus terdiri lebih dari 30 spesies, yang biasanya diklasifikasikan
ke dalam :
1. Staphylococcus yang menghasilkan koagulase, misalnya : staphylococcus
aureus, yang patogen utama pada manusia menjadi penyebab banyak
penyakit infeksi.
 2. Staphylococcus yang tidak menghasilkan koagulase, misalnya :
staphylococcus epidermis, yang biasanya penghuni kulit. Namun sering
menjadi penyebab infeksi saluran kemih (ISK) pada wanita.
3. Staphylococcus yang lain : tidak dibahas mendalam karena terjadi pada
hewan dan menyebabkan infeksi pada hewan.
Staphylococcus masih sensitif untuk beberapa antibiotik yang baru ditemukan
tapi resistensi bisa terjadi sangat cepat. Sebagian besar staphylococcus sudah resisten
terhadap golongan penicillin karena bakteri ini menghasilkan penicillinase atau beta
laktamase.
b. Streptococcus
Streptococcus merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk coccus dan
tersusun seperti rantai. Bakteri ini memfermentasi karbohidrat, nonmotil, tidak
membentuk spora, dan bersifat katalase-negatif. Pada umumnya streptococcus
merupakan bakteri fakultatif anaerob yang membutuhkan medium agar darah untuk
berkembang biak (Patterson, 1996). Berdasarkan derajat patogenisitasnya, terdapat
lebih dari 50 genus streptococcus, yang terdiri dari dari enam kelompok spesies. Salah
satunya adalah kelompok bakteri pyogenik dengan spesies Streptococcus beta-
hemolyticus Group A (Greenwood, et al , 2007). Streptococcus beta-hemolyticus Group A
memiliki kapsul asam hydrolat (Patterson, 1996).
Beberapa galur streptococcus hanya dapat tumbuh dalam keadaan anaerobik.
Kelompok ini agak berbeda dengan streptococcus lainnya yang lazimnya bersifat
anaerobik oleh karena tidak dapat mensitesis senyawa heme. Kelompok streptococcus
anaerobik ini tidak dapat mensintesis sitokrom dan dengan demikian tidak dapat
melakukan fosforilasi oksidatif yang ditengahi oleh sitokrom-ETS. Berdasarkan sifat ini,
maka untuk mengisolasi streptococcus seringkali ditambahkan inhibitor sitokrom yaitu
Na-azide.
Streptococcus digolongkan berdasarkan kombinasi sifatnya, antara lain sifat
pertumbuhan koloni, pola hemilisis pada agar darah (hemolisis alpha, hemolisis betha,
dan tanpa hemolisis), susunan antigen pada zat dinding sel yang spesifik untuk golongan
tertentu dan reaksi-reaksi biokimia. Berdasarkan kombinasi sifat antigen, hemolitik, dan
fisiologinya, genus dari bakteri ini di bagi menjadi grup A, B, C,D,F dan G. Grup A dan D
dapat ditularkan dapat ditularkan pada manusia melalui makanan. Grup A terdiri dari
satu spesies dengan 40 tipe antigen. Spesies dari grup A tersebut adalah S. Pyogenes.
Bakteri ini dapat ditemukan di bagian mulut, usus manusia dan hewan. Ada juga
jenis yang digunakan fermentasi makanan dan minuman. Beberapa jenis ada yang
bersifat patogen. Spesies bakteri streptococcus yang bersifat patogen diantaranya dapat
menyebabkan penyakit seperti pneumoniae, meningitis, necrotizing fasciitis, erisipelas,
radang tenggorokkan, dan endokarditis. Jenis bakteri dari genus ini juga banyak
digunakan dalam produksi keju dan yogrt.
Sampel pemeriksaan :

Staphylococcus : nanah, darah, liquor, hapus mata, hapus hidung, hapus tenggorok.

Strepcoccus : darah, serum, sputum

Cara kerja

1. Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dengan pengecatan Gram dari bahan pemeriksaan.
2. Kultur
a. TSB (trypticase soy broth) : merupakan media penyubur untuk melihat tipe
hemolisa dan pigmen.
b. Agar darah ( blood agar plate ) : untuk melihat tipe hemolisa
c. MSA ( mannitol salt agar ) : untuk membedakan bakteri yang memfermentasi
manitol dengan yang tidak, dapat juga untuk melihat pigmen.
3. Uji biokimia
a. Katalase
Prinsip : katalase memecah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen.
Dilakukan untuk membedakan staphylococcus dengan streptococcus. Memakai
koloni dari media padat. Jangan langsung dilakukan pada BAP karena darah juga
mengandng katalase.
Cara slide
- Satu ose suspensi bakteri pada kaca objek
- Teteskan H2O2 3%
- Adanya gelembug udara berarti positif
Cara tabung
- 2-3ml H2O2 3% ke dalam tabung
- Diambil koloni bakteri dan di masukkan ke dalam tabung tersebut
- Adanya gelembung udara berarti hasil positif
Cara langsung
- Teteskan H2O2 3% langsung ke koloni pada media plate atau miring,
tetapi jangan gunakan BAP
- Adanya gelembung udara berarti hasil positif
b. Koagulase
Prinsip : koagulase menyebabkan plasma menggumpal dengan merubah
fibrinogen menjadi fibrin.
Tes ini digunakan untuk membedakan bakteri yang patogen dengan yang non-
patogen. Plasma yang dipergunakan adalah plasma darah sitrat orang ormal atau
kelinci.
Cara slide
- Satu ose plasma diteteskan pada kaca objek
 - Diambil satu ujung koloni dan dicampur dengan plasma (perbandingan
plasma dengan koloni bakteri hendaknya proporsional)
- Kaca objek digoyang-goyangkan
- Kemudian diperiksa adanya koagulasi
Sebaiknya digunakan kontrol dengan NaCl fisiologis. Jika pada tes ini
didapatkan hasil negatif sebaiknya diulang dengan cara tabung.
Cara tabung
- Sebanyak 1 ml plasma ditambah koloni bakteri
- Kemudian diinkubasi dalam waterbath pada 370C
- Dibaca setelah 1 jam, 2 jam, 3 jam , 4 jam sampai 12 jam
- Untuk kontrol pakai sampel yang positif dan negatif
c. Gula-gula
Koloni bakteri ditanam pada glukosa dan manitol, kemudian dieramkan 37 0C
selama 24-48 jam.
4. Uji sensitivitas
Dibuat suspensi dalam TSB dengan kekeruhan standar bakteri/ml. Kemudian
digoreskan pada perbenihan Mueller-Hinton, lalu diletakkan disc antibiotik
novobiocin. Dieramkan 370C selama 24 jam.

Hasil pengamatan

Media Gambar/Hasil Keterangan

Koloni bulat, diameter 2-4

mm, licin, mengkilat,
smooth, pinggiran rata.
BAP
Hemolisa

Pigmen putih

MSA Media menjadi kuning

Sampel : Hapusan Hidung

Bentuk : coccus

Susunan : bergerombol seperti buah anggur

Warna : ungu

Sifat : Gram Positif

Pembahasan

Staphylococcus pertama kali dikenal oleh Pasteur pada tahun 1880 dan Ogstron
pada tahun 1881 dari pus seorang penderita. Selanjutnya Becker pada tahun 1883
behasil melakukan biakkan biakkan murni, pada tahun 1884 Resonbach untuk
pertama kalinya mengetahui adanya kausal antara timbulnya suatu penyakit
osteomillitis dengan bakteri staphylococcus.
Streptococcus merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk coccus dan
tersusun seperti rantai. Bakteri ini memfermentasi karbohidrat, nonmotil, tidak
membentuk spora, dan bersifat katalase-negatif. Pada umumnya streptococcus
merupakan bakteri fakultatif anaerob yang membutuhkan medium agar darah untuk
berkembang biak (Patterson, 1996). Berdasarkan derajat patogenisitasnya, terdapat
lebih dari 50 genus streptococcus, yang terdiri dari dari enam kelompok spesies.
Salah satunya adalah kelompok bakteri pyogenik dengan spesies Streptococcus beta-
hemolyticus Group A (Greenwood, et al , 2007). Streptococcus beta-hemolyticus
Group A memiliki kapsul asam hydrolat (Patterson, 1996).
Praktikum ini bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri staphylococcus dan
streptococcus yang berada pada suatu sampel yang akan diidentifikasi. Pada hari
pertama sampel yang akan diuji di tanam pada media BAP, dan MSA, kemudian
sampel yang sdah ditanam diinkubasi selama 24 jam dengan suhu ruang. Hari kedua
lihat hasil pada media yang ditanam pada hari pertama, kemudian pilih salah satu
dari media BAP dan MSA untuk ditanam ke media gula-gula seperti Urea, SC, SIM,
TSIA, Manitol, Glukoksa, Fruktosa, Maltosa, VP dan MR kemudian media yang telah
ditanami sampel kembali diinkubasi dengan suhu ruang. Hari ke tiga baca hasil dari
media gula-gula dan dilakukan uji reaksi biokimia yaitu uji katalase dan koagulase,
dan kemudian dilakukan pewarnaan gram untuk melihat bakteri secara mikroskopik.

Kesimpulan

Berdasarkan hasil pengamatan pada praktikum kali ini disimpulkan bahwa kita dapat
melihat hasil pada media BAP dan MSA.
 Isolasi dan Identifikasi Neisseria gonorrhorae
Tujuan :

Mengamati ciri-ciri morfologi dan pertumbuhan Neisseria gonorrhoeae.

Prinsip :

Sampel dilakukan pewarnaan Gram dan ditanam pada media untuk mendapatkan ciri
spesifik dari bakteri Neisseria gonorhoeae.

Klasifikasi :

Kingdom : Bacteria
Phylum : Proteobacteria
Class : Beta Proteobacteria
Ordo : Neisseriales
Familia : Neisseriaceae
Genus : Neisseria
Spesies : Neisseria gonorrhoeae

Tinjauan pustaka :
Gonore adalah salah satu penyakit infeksi tertua yang terutama melibatkan saluran
genitourinaria, walaupun faring, rectum, mata, sendi dan organ lain dapat terkena juga.
Hipokrates mungkin yang pertama menulis secara luas subjek ini pada abad ke empat dan
ke lima sebelum Masehi. Ia menyebut gonore sebagai kencing aneh (strangury) dan
dihubungkannya dengan kesenangan venus (the pleasures of Venus). Istilah clap, yang
masi sering digunakan, pertama muncul dalam cetakan pada tahun 1378 A.D. dan paling
mungkin dirujuk dari distrik Les Clappier Paris, suatu daerah pelacuran pada waktu itu. Pada
mulanya, diduga bahwa gonorea dan sifilis merupakan manifestasi yang benar-benar
berbeda dari penyakit yang sama. Diduga demikian sampai uraian Neisseria gonorrhoeae
pada tahun 1879, ilmuan mulai mengerti penyakit ini yang sebenarnya.

Gonore adalah penyakit infeksi yang disebabkan oleh Neisseria gonorrhea yang pada
umumnya di tularkan melalui hubungan kelamin, tetapi dapat juga secara kontak langsung
dengan eksudat yang infektif.

Neisseria gonorrhoeae adalah diplokokus yang bersifat Gram-negatif dengan ukuran

garis tengahnya lebih kurang 1 mikron. Pada penderita wanita kuman ini harus dibedakan
dengan Nisseria lainnya atau dengan M. polymorpha. Untuk itu perlu dilakukan kultur atau
pemeriksaan secara teknik fluoresen antibody. Kultur sebaiknya menggunakan medium
yang selektif yaitu medium Thaye-Martin yang dihangatkan sesuai dengan suhu kamar.
Koloni berbentuk konveks dengan diameter 1-2 mm, transparan, tidak membentuk pigmen
dan tidak menimbulkan hemolisa. Inkubasi dilakukan pada CO2-incobatur pada suhu 35
derajat sampai 36 derajat Celsius.

Gonore disebabkan oleh gonokok yang dimasukkan ke dalam kelompok Neisseria,

sebagai Neisseria Gonorrhoeae. Gonokok termasuk golongan diplokok berbentuk biji kopi
dengan lebar 0,8 u, panjang 1,6 u, dan bersifat tahan asam. Kuman ini juga bersifat negatif-
Gram, tampak di luar dan di dalam leukosit, tidak tahan lama di udara bebas, cepat mati
pada keadaan kering, tidak tahan suhu di atas 39 derajat C, dan tidak tahan zat desinfektan.
Daerah yang paling mudah terinfeksi adalah dengan mukosa epitel kuboid atau lapis gepeng
yang belum berkembang (imatur), yakni pada vagina wanita sebelum pubertas.

Diagnosis Gonoreae ditegakkan berdasarkan hasil pemeriksaan mikroskopik terhadap

nanah dimana ditemukan bakteri penyebab gonore. Jika pada pemeriksaan mikroskopik
tidak ditemukan bakteri, maka dilakukan pembiakan di laboratorium.

Gambaran klinik dan perjalanan penyakit pada perempuan berbeda dari pria.Hal ini
disebabkan perbedaan anatomi dan fisiologis alat kelamin pria dan perempuan.pada laki-
laki Masa inkubasi penyakit gonore adalah 3-5 hari.sedangkan gonore pada perempuan
kebanyakan asimptomatik sehingga sulit untuk menentukan masa inkubasinya.

Penularan bakteri Neisseria gonorhoeae pada orang dewasa yang paling utama adalah
melalui kontak seksual. Resiko tertular penyakit yang disebabkan oleh bakteri ini meningkat
pada orang yang sering berganti-ganti pasangan seksual. Sedangkan penularan melalui
kontak langsung dengan mukosa jalan lahir biasa terjadi pada bayi yang lahir dari ibu yang
terinfeksi

Bahan pemeriksaan berasal dari cairan vagina, cairan urethra, nanah/ pus dari mata,
hapus anus, rektal, urin, orofaringeal, konjungtiva, dan cairan tubuh.

Cara kerja :

1. Mikroskopis
- Pewarnaan Gram harus segera dikerjakan setelah sampel didapat dari uretra, servis,
vagina, atau rektum
- Preparat uretra dari pria yang menunjukkan gejala biasanya didapat diplococcus
Gram-negatif bentuk biji kopi di dalam sel PMN (intrasel)
- Bila ditemukan ekstrasel saja berarti harus dipastikan dengan kultur atau tes asam
nukleat
- Preparat dari pasien perempuan lebih sulit diinterpretasi karena adanya Gram-negatif
coccobacilli, seperti Moraxella osloensis, Moraxella phenylpyruvica, Kingella
denitrificans dan Acinetobacter
- Sensitifitas dan spesifisitas preparat uretra adalah 90 95%. Pada preparat
endoserviks sensitifitasnya 50 70% dan spesifisitasnya 90%
 - Reliabilitas pemeriksaan mikroskopis tergantung kualitas sampel dan pengalaman
pemeriksa
2. Kultur
- Sampel primer diinokulasikan ke media non selektif cokelat agar dan media selektif
Thayer-Martin, Martin Lewis, dan New York City
- Inkubasi pada suhu 35 - 37C pada kondisi CO2 3 7% selama 18 24
- Plate jangan diinkubasi lebih dari 48 jam karena biakan tua tidak dapat bertahan
3. Tes biokimia

Acid from Nitrate Polysaccharide

Species
Gluc Malt Sucr Fruc Lact Reduction from sucrose
most most
Neisseria gonorrhoeae strains strains
positive negative
Neisseria meningitidis + +
Kingella denitrificans + +
Neisseria cinerea
Neisseria
+ +
subflava biovar subflava
Neisseria
+ + +
subflava biovar flava
Neisseria
+ + + + +
subflava biovar perflava
Neisseria sicca + + + + +
Neisseria mucosa + + + + + +
Neisseria flavescens +

Hasil Pengamatan :

Media Gambar/Hasil Keterangan

Koloni kecil-kecil, tepian

Thayer-Martin rata, smooth

Pigmen cokelat
 Fruktosa : (+)

Maltosa : (+)

Glukosa : (-)

Sukrosa : (-)

Bentuk : Diplococcus

Susunan : menyebar satu-satu/bergerombol

Warna : ungu

Sifat : Gram Negatif

Pembahasan :

Dari praktikum yang telah dilakukan selama dua hari berturut-turut. Dimana hari
pertama dilakukan penanaman suspensi bakteri pada media Muller Hinton dan media
biokim dan kemudian diinkubasi pada suasana CO2 selama 16 jam. Pada hari kedua dilihat
adanya perubahan pada media plate Muller Hinton dan media biokim, lalu dari media kultur
dibuat preparat kemudian dilakukan pewarnaan Gram. Setelah itu diamati pada mikroskop
dengan perbesaran obyektif 100x. Neisseria membutuhkan suplementasi nutrisi untuk
tumbuh di dalam kultur laboratorium. Secara khusus, neisseria tumbuh pada agar-agar
cokelat dengan CO2. Pada praktikum ini pengecatan yang digunakan adalah pengecatan
negatif. Pengecatan negatif bertujuan untuk melihat bakteri dengan latar belakang yang
gelap dan dapat dipakai untuk mengukur bentuk dan besarnya bakteri. Selain itu
pengecatan negatif merupakan metode yang cepat untuk melihat bakteri. Berhasilnya
metode pewarnaan yang dilakukan dengan pengecatan negatif perlu diperhatikan terutama
adalah dalam hal ketika sterilisasi alat. Pada sterilisasi jangan sampai terabaikan karena
dalam hal sterilisasi jangan sampai terjadi hal-hal yang tidak diiginkan. Di mana sterilisasi
dapat mempengaruhi hasil praktikum yaitu dengan sterilisasi tidak terjadi atau tidak
berlangsung dengan baik, maka akan tumbuh makhluk hidup/mikroorganisme yang tidak
diinginkan. Dan hal tersebut akan mempengaruhi hasil praktikum. Pada laki-laki, dengan
menemukan diplococcus Gram-negatif seperti biji kopi di dalam sel PMN dari sampel uretra
sudah cukup untuk diagnosa. Pada perempuan juga harus dilakukan kultur. Pewarnaan
Gram terhadap sampel dari serviks bisa saja potitif palsu karena bisa ditemukan diplococcus
Gram-negatif pada flora normal, atau ngatif palsu karena pengamatan mikroskopis dengan
obyektif 100x tidak dapat melihat bakteri gonococcus yang jumlahnya sedikit.

Kesimpulan

Berdasarkan hasil pengamatan pada praktikkum kali ini disimpulkan bahwa Neisseria
gonorrhoeae merupakan gram negatif diplococcus
 Pemeriksaan Mycobacterium Leprae
Tujuan :

Mengetahui cara pengambilan sampel dan ciri mikroskopis bakteri Mycobacterium Leprae

Prinsip :

Dilakukan pengambilan sampel pada bagian tertentu pada tubuh penderita dan dilakukan
pemeriksaan mikroskopis untuk menegakkan diagnosa Mycobacterium leprae.

Diambil risa serum atau bagian lesi yang aktif dari pasien terduga lepra kemudian dilakukan
pewarnaan tahan asam untuk melihat adanya bakteri tahan asam bentuk solid, globus,
fragmented, granular, atau clump.

Klasifikasi :

Klasifikasi ilmiah Mycobacterium Leprae :

Kingdom : Bacteria

Filum : Actinobacteria

Ordo : Actinomycetales

Sub Ordo : Corynebacterneae

Genus : Mycobacterium

Spesies : Mycobacterium Leprae

Tinjuan pustaka :

Mycobacterium leprae juga disebut Basillus Hansen, adalah bakteri yang

menyebabkan penyakit kusta (penyakit Hansen). Bakteri ini merupakan bakteri intraselular.
M. leprae merupakan gram-positif berbentuk tongkat. Mycobacterium leprae merupakan
pathogen intrasel obligat sehingga belum dapat dibiakkan invitro (media tak hidup). Bakteri
sering ditemukan pada sel endothelial pembuluh darah atau sel mononuclear (makrofag)
sebagai lingkungan yang baik untuk bertahan hidup dan perkembangbiakan. Perkiraan
waktu bagi bakteri ini bereplikasi adalah 10-12 hari (Martiny, 2006).

Basil lepra ini tahan terhadap degradasi intraseluler oleh makrofag, mungkin karena
kemampuannya keluar dari fagosom ke sitoplasma makrofag dan berakumulasi hingga
mencapai 1010 basil/gram jaringan pada kasus lepratype lepromatus. Kerusakan syaraf
perifer yang terjadi merupakan sebuah respon dari system imun Karena adanya basil ini
sebagai antigen. Pada lepra type tuberkuloid, terjadi granuloma yang sembuh dengan
sendirinya bersifar berisi sedikit basil tahan asam (Martiny, 2006).
 Bakteri Mycobacterium leprae berbentuk batang, langsing atau sedikit membengkok
dengan kedua ujung bakteri tumpul, tidak bergerak, tidak memiliki spora dan tidak
berselubung. Sel-sel panjang, ada kecenderungan untuk bercabang. Berukuran 1-7 x 0,2-
0,5m, bersifat gram positif, tahan asam, letak susunan bakteri tunggal atau sering
bergerombol serupa tumpukan cerutu sehingga sering disebut packed of cigarette, atau
merupakan kelompok padat sehingga tidak dapat dibedakan antara bakteri yang satu
dengan yang lainnya, kadang-kadang terdapat granulaBentuk-bentuk M. leprae yang dapat
ditemukan dalam pemeriksaan mikroskopis adalah : (Martiny, 2006).

1. Bentuk utuh (solid) : dinding sel bakteri tidak terputus, mengambil zat warna secara
sempurna. Jika terdapat daerah kosong/transparan ditengahnya juga dapat
dikatakan solid

2. Bentuk globus : bentuk solid yang membentuk kelompok dapat dibagi 2 yaitu :

a. Globus besar terdiri dari 200-300 bakteri

b. Globus kecil terdiri dari 40-60 bakteri

3. Bentuk pecah (fragmented) : dinding bakteri biasanya terputus sebagian atau

seluruhnya, tidak menyerap zat warna secara merata.

4. Bentuk berbutir-butir (granuler) : tampak seperti titik-titik yang tersusun

5. Bentuk clump adalah bentuk granuler yang membentuk kelompok tersendiri,

biasanya lebih dari 500 bakteri.

Cara Kerja :

1. Lokasi pengambilan sampel

a. Risa serum (cairan jaringan), dapat diambil dari cuping telinga, punggung, dan
jari tangan, paha, atau bagian kulit yang terdapat kelainan.
b. Cairan hidung
c. Cairan telinga
d. Darah
e. Sputum
2. Cara pengambilan dan preparasi sampel
a. Risa serum dari cuping telinga
1) Bersihkan cuping telinga dengan kapas alkohol 70% atau 96%, biarkan
kering. Jepit dengan jari telunjuk dan ibu jari keras-keras.
2) Lakukan insisi dengan skapel sepanjang kira-kira 5 mm dan dalamnya
2 mm. Bila ada perdarahan sebaiknya dibersihkan.
3) Putar skapel 900 dengan posisi melintang, skalpel ditarik ke arah
sehingga didapat cairan jaringan
4) Bahan ini dioleskan merata pada kaca objek
 5) Luka bekas insisi dibersihkan dan ditutup plaster, skalpel dimasukkan
ke dalam desinfektan
b. Cairan hidung dan cairan telinga
1) Ambil selaput lendir dengan swab steril dengan cara memasukkannya
kedalam hidung atau telinga lalu diputar dan ditarik lagi
2) Oleskan ke kaca objek
3) Swab bekas sampling dibakar
c. Darah
1) Dilakukan pengambilan darah kapiler
2) Teteskan darah pada kaca objek, ratakan, lalu dikeringkan
d. Sputum
1) Pasien disuruh berdahak kemudian ditampung dalam wadah bermulut
lebar
2) Sputum diambil dengan ose atau swab lalu dioleskan ke kaca objek
3) Ose dibakar dan disimpan dalam larutan desinfektan, swab langsung
dibakar
3. Pemeriksaan mikroskopis
Bahan pemeriksaan dibuat preparat kemudian diwarnai dengan metode Ziehl-
Nelseen atau Kinyount-Gabbet

Hasil Pengamatan

Mycobacterium Turbecolusis

BTA (+)

Bentuk : Basil

Susunan : Menyebar satu-satu

Warna : Merah

Sifat : Gram Positif

KUSTA
Pembahasan

Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri yaitu berantai
karbon (C) yang panjangnya 8-95 dan memiliki dinding sel yang tebal yang terdiri dari
lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60% dari berat dinding
sel. Kuman bakteri tahan asam (BTA), dikenal ada 41 spesies yang telah diakui oleh ICSB
(International Committee on Systematic Bacteriology). Sebagaian besar sudah saprofit dan
sebagaian kecil lainnya pathogen untuk manusia diantaranya Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium leparae dan lain-lainnya yang dapat menyebabkan infeksi kronik. Golongan
sapropit dikenal juga dengan nama atipik (Syahrurachman, 1994).

Mycobacterium adalah salah satu bakteri yang banyak ditemukan di masyarakat.

Salah satu spesiesnya adalah Mycobacterium tuberculosis yang dapat menularkan kuman
tuberculosis melalui udara, percikan dahak, atau ludah yang terinfeksi oleh kuman
tuberculosis (Girsang, 2013).

Tipikal organism dalam jaringan, basil tuberkel adalah bakteri batang, lurus dengan
ukuran sekitar 0,4 3 m. Pada media buatan, bentuk kokoid dan filamentous tampak
bervariasi dari satu spesies ke spesies lain. Mikrobakteria tidak dapat dikelompokan sebagai
gram positif. Segera setelah diwarnai dengan pencelupan dasar mereka tidak dapat
didekolorisasi oleh alcohol, tanpa memperhatikan pengobatan dengan iodine. Basil tuberkel
yang benar ditandai dengan pencepat asam-misalnya 95% etil alcohol yang berisi 3% asam
hidroklorat (asam alcohol) mendekolorisasi semua bakteri dengan cepat kecuali
mikobacteria. Pencepat asam tergantung pada integritas lilin pembungkus. Pewarnaan
teknik Ziehl-Neelsen digunakan untuk identifikasi bakteri cepat asam (Brooks, 2005).

Mycobacterium leprae tidak dapat dibiakkan pada media buatan. Organism ini
menyerang saraf perifer, menyebabkan anesthesia. Destruksi jari dan deformitas terjadi
kemudian, mengakibatkan pasien mengalami cacat berat. Hasil akhir dari infeksi tergantung
dari respon imun setiap individu, membentuk spectrum dari tuberkuloid yang didominasi
oleh respons TH1, borderline sampai lepromatosa yang didominasi oleh respons Th2.
Pasien dengan penyakit tuberkuloid memiliki respons imun yang diperantarai-sel yang kuat,
memiliki banyak granuloma, dan pausitas bakteri pada jaringan berhubungan dengan
kerusakan saraf tropic, sedangkan pasien dengan penyakit lepromatosa memiliki imunitas
yang diperantarai-sel(cell-mediated immunity, CMI) yang buruk, tidak terdapat granuloma,
dan merupakan penyakit generalisata (Gillespie, 2007).

Sputum dari pasien penderita TB diekstrak dengan mengunakan teknik Ziehl Neelsen
dan asam cepat terdapat noda merah dengan latar biru yang merupakan basil positif. BTA
mudah dikenali dalam Negara yang memiliki tingkat insiden TB MDR yang rendah dan
Negara yang memiliki tingkat insiden TB MDR yang tinggi. Data perubahan dalam gen rpoB
dari M. tuberculosis menyebabkan resistensi rifampisin (Zanden, 2003).
Sputum yang digunakan dalam praktikum BTA setelah diekstrak dengan menggunakan
teknik Zeehl Neelsen tidak menghasilkan noda warna merah dengan latar biru. Hal ini
menunjukan bahwa dalam sputum tersebut resusnya negative ( tidak mengandung bakteri
Mycobacterium tuberkulose).

Pada pemeriksaan lepra atau kusta di Rs. Alverno, Singkawang, praktikan hanya
melakukan pengambilan sampel pada cuping telinga dan jari tangan untuk mendapatkan
risa serum yang akan diperiksa.

Kesimpulan

Berdasarkan hasil pengamatan pada praktikum kali ini disimpulkan bahwa kita dapat
melakukan pengambilan sampel pada pasien dan memeriksa sifat bakteri Mycobacterium.
 Antimicrobial Susceptibility Testing (AST)

Pemeriksaan Pengaruh Antimikroba Metode Difusi Kirby-Bauer

Tujuan :

Mengetahui cara persiapan dan prosedur pemeriksan AST metode difusi

Prinsip :

Sejumlah bakteri denan konsentrasi tertentu ditanamkan pada media agar plate dimana
terdapat disc yang mengandung antimikroba dengan kadar tertentu. Selama inkubasi, bahan
antimikroba akan berdifusi ke dalam agar dan membentuk gradien konsentrasi. Dengan
mengukur zona hambatannya maka diketahui sifat kerentanan dari bakteri
(resisten/intermediat/senditif)

Tinjauan Pustaka :

Sensitifitas menyatakan bahwa uji sentifitas bakteri merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri dan untuk mengetahui
senyawa murni yang memiliki aktivitas antibakteri. Metode Uji sensitivitas bakteri adalah
metode cara bagaimana mengetahui dan mendapatkan produk alam yang berpotensi
sebagai bahan anti bakteri serta mempunyai kemampuan untuk menghambat pertumbuhan
atau mematikan bakteri pada konsentrasi yang rendah. uji sentivitas bakteri merupakan
suatu metode untuk menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri dan
untuk mengetahui senyawa murni yang memiliki aktivitas antibakteri. Seorang ilmuan dari
perancis menyatakan bahwa metode difusi agar dari prosedur Kirby-Bauer, sering digunakan
untuk mengetahui sensitivitas bakteri. Prinsip dari metode ini adalah penghambatan
terhadap pertumbuhan mikroorganisme, yaitu zona hambatan akan terlihat sebagai daerah
jernih di sekitar cakram kertas yang mengandung zat antibakteri. Diameter zona hambatan
pertumbuhan bakteri menunjukkan sensitivitas bakteri terhadap zat antibakteri. Selanjutnya
dikatakan bahwa semakin lebar diameter zona hambatan yang terbentuk bakteri tersebut
semakin sensitif (Gaman, dkk. 1992).

Pada umumnya metode yang dipergunakan dalam uji sensitivitas bakteri adalah
metode Difusi Agar yaitu dengan cara mengamati daya hambat pertumbuhan
mikroorganisme oleh ekstrak yang diketahui dari daerah di sekitar kertas cakram (paper
disk) yang tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme. Zona hambatan pertumbuhan inilah yang
menunjukkan sensitivitas bakteri terhadap bahan anti bakteri (Jawelz, 1995).

Tujuan dari proses uji sensisitivitas ini adalah untuk mengetahui obat-obat yang
paling cocok (paling poten) untuk kuman penyebab penyakit terutama pada kasus-kasus
penyakit yang kronis dan untuk mengetahui adanya resistensi terhadap berbagai macam
antibiotik. Penyebab kuman resisten terhadap antibiotik yakni memang kuman tersebut
resisten terhadap antibiotik yang diberikan, akibat pemberian dosis dibawah dosis
pengobatan dan akibat penghentian obat sebelum kuman tersebut betul-betul terbunuh
oleh antibiotic (Dwidjoseputro, 1998).

Antibiotik adalah zat-zat kimia yang dihasilkan oleh fungi dan bakteri yang memiliki
khasiat mematikan atau menghambat pertumbuhan kuman-kuman sedangkan toksisitasnya
bagi manusia relatif kecil. Para peneliti diseluruh dunia memperoleh banyak zat lain dengan
khasiat antibiotik namun berhubung dengan adanya sifat toksis bagi manusia, hanya
sebagian kecil saja yang dapat digunakan sebagai obat diantaranya adalah streptomycin vial
injeksi, Tetrasiklin kapsul, Kanamicin kapsul, Erytromicin kapsul, Colistin tablet, Cefadroxil
tablet dan Rifampisin kapsul (Djide, 2003).

Kegiatan antibiotika untuk pertama kalinya ditemukan oleh sarjana Inggris dr.
Alexander Flemming pada tahun 1928 (penisilin). Penemuan ini baru dikembangkan dan
dipergunakan dalam terapi di tahun 1941 oleh dr.Florey (Oxford) yang kemudian banyak zat
lain dengan khasiat antibiotik diisolir oleh penyelidik-penyelidik di seluruh dunia, akan tetapi
berhubung dengan sifat toksisnya hanya beberapa saja yang dapat digunakan sebagai obat
(Djide, 2003).

Antibiotik digunakan untuk membasmi mikroba penyebab terjadinya infeksi. Gejala

infeksi terjadi akibat gangguan langsung oleh mikroba dan berbagai zat toksik yang
dihasilkan mikroba. Pada dasarnya suatu infeksi dapat ditangani oleh sistem pertahanan
tubuh, namun adakalanya sistem ini perlu ditunjang oleh penggunaan antibiotik. Antibiotik
yang digunakan untuk membasni mikroba penyebab infeksi pada manusia, harus memiliki
sifat toksisitas selektif. Artinya antibiotik harus bersifat toksik untuk mikroba, tetapi relatif
tidak toksik untuk hospes. Toksisitas selektif tergantung kepada struktur yang dimiliki sel
bakteri dan manusia misalnya dinding sel bakteri yang tidak dimiliki oleh sel manusia,
sehingga antibiotik dengan mekanisme kegiatan pada dinding sel bakteri mempunyai
toksisitas selektif relatif tinggi (Ganiswarna, 1995).

Sensitivitas bakteri terhadap antibiotik tergantung kapada kemampuan antibiotik

tersebut untuk menembus dinding sel bakteri. Antibiotik lebih banyak yang efektif bekerja
terhadap bakteri Gram positif karena permeabilitas dinding selnya lebih tinggi dibandingkan
bakteri Gram negatif. Jadi suatu antibiotik dikatakan mempunyai spektrum sempit apabila
mampu menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif, sedangkan antibiotik berspektrum
luas jika pertumbuhan bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif dapat dihambat oleh
antibiotik tersebut (Sumadio, dkk. 1994).

Berdasarkan sasaran tindakan antibiotik terhadap mikroba maka antibiotik dapat

dikelompokkan menjadi lima golongan yaitu antibiotik penghambat sintesis dinding sel
mikroba, antibiotik yang termasuk kelompok ini ialah penisilin, sefalosporin, basitrasin, dan
vankomisin. Yang kedua yaitu antibiotik penghambat sintesis protein sel mikroba, antibiotik
yang termasuk kelompok ini ialah golongan aminoglikosida, makrolida, kloramfenikol,
linkomisin dan tetrasilin. Yang ketiga yaitu antibiotik penghambat sintesis asam nukleat sel
mikroba, antibiotik yang termasuk kelompok ini ialah rifampisin dan golongan kuinolon.
Keempat yaitu antibiotik pengganggu fungsi membran sel mikroba, antibiotik yang termasuk
kelompok ini ialah golongan polien. Dan yang kelima yaitu antibiotik penghambat
metabolisme mikroba, antibiotik yang termasuk kelompok ini ialah sulfonamida, trimetoprin
dan asam p-amino salisilat (Ganiswarna, 1995).

Zona Hambat merupakan tempat dimana bakteri terhamabat pertumbuhannya

akibat antibakteri atau antimikroba. Zona hambat adalah daerah untuk menghambat
pertumbuhan mikroorrganisme pada media agar oleh antibiotik. Contohnya: tetracycline,
erytromycin, dan streptomycin. Tetracycline merupakan antibiotik yang memiliki spektrum
yang luas sehingga dapat menghambat pertumbuhan bakteri secara luas (Pelczar, 1986).

Cara Kerja :

1. Pembuatan media Mueller-Hinton

a. Ditimbang agar Mueller-Hinton dan dilarutkan dengan aquadest di dalam
erlenmeyer atau gelas piala sambil dipanaskan
b. Sterilisasi dengan autoclave
c. Setelah steril didinginkan 45-50oC
d. Isikan media ke dalam plate dengan ketebalan agar sekitar 4 mm. Untuk
mendapatkan ketebalan 4 mm diisikan 60-70 ml media untuk plate berdiameter
150 mm atau 25-30 ml media untuk plate berdiameter 100 mm
e. Dinginkan pada suhu ruang dan disimpan pada suhu 2-8oC
f. Media harus digunakan dalam 7 hari kecuali diberikan kecuali diberikan
perlakuan khusus misalnya dibungkus rapat di dalam plastik untuk mencegah
pengeringan agar. Bila akan digunakan keringkan dahulu didalam inkubator 37 oC
selama 30 menit
2. Pembuatan standar kekeruhan
a. 0.5 ml 1,175% barium klorida dihidrat (BaCl2.2H2O) ke dalam gelas piala
b. Ditambah 99,5 ml asam sulfat 1%, kocok
c. Standard kekeruhan ini dimasukkan ke dalam tabung bertutup sebanyak 4-6 ml
d. Kekeruhan ini setara dengan kira-kira 1,5 x 108 sel/ml
e. Dapat disimpan di ruang gelap suhu kamar selama 6 bulan. Jika akan digunakan
harus dikocok dahulu
3. Pembuatan suspensi bakteri
a. Masukkan 1 ml NaCl ke dalam tabung reaksi
b. Masukkan koloni bakteri dengan ose
c. Campur, kocok lalu bandingkan dengan standart kekeruhan sampai
kekeruhannya sama
 d. Cara lain adalah dengan memasukkan 5l kultur kaldu yang dieramkan
semalaman ke dalam 5 ml kaldu atau air pepton
4. Penanaman pada mediasecara Mueller-Hinton (MH) atau nutrient agar
a. Penanaman dilakukan paling lambat 15 menit setelah suspensi dibuat
b. Dengan swab steril diambil suspensi bakteri, swab ini harus diputar-putar
beberapa kali dan ditekan pada dinding bagian dalam tabung suspensi
c. Inokulasikan ke permukaan media secara merata sehingga semua permukaan
media tertutupi
d. Biarkan plate dalam keadaan terbuka sedikit selama 3-5 menit untuk mengurangi
kelembaban di dalamnya
e. Lakukan penempelan disc antibiotik:
1) Pinset disterilkan pada lampu spirtus
2) Ambil disc antibiotik
3) Tempelkan pada permukaan media, jarak disc terhadap pinggir plate 2 cm
dan jarak antar disc 3 cm. Plate berdiameter 150 mm tidak boleh diisi lebih
dari 12 disc dan plate berdiameter 100 tidak boleh lebih dari 5 disc
4) Jangan menekan disc ke dalam agar dan jangan memindahkan disc yang
sudah menempel
f. Inkubasi pada 35oC selama 16-24 jam dengan osisi agar dibawah (jangan dibalik)
g. Ukur diameter zona hambaatan pertumbuhan dan cocokan dengan tabel,
dengan aturan sebagai berikut:
1) Pembacaan/pengukuran diameter zona hambatan dengan beralaskan kertas
berwarna gelap atau dengan latar belakang sedikit gelap, diukur diameter
zona hambatan. Cara lain yang lebih tepat yaitu menggunakan zone reader
2) Kalau media ditambah darah, hemoglobin, atau serum (media tidak tembus
cahaya), pengukuran diameter zona hambatan dilakukan dengan membuka
tutup late, diukur pada permukaan agar-agar
3) Diameter zona hambatan yang diukur yaitu daerah jernih sekitar disc obat
(tidak ada pertumbuhan bakteri), diukur dari ujung yang satu ke ujung yang
lain melalui tengah-tengah disc obat, dengan beberapa catatan sebagai
berikut:
a) Sulfonamide dan cotrimoxazole, pertumbuhan tipis diatas zona hambatan
tidak perlu diperhatikan
b) Pertumbuhan Proteus yang menjalar di daerah zona hambatan juga tidak
perlu diperhatikan
c) Pada Staphylococcus yang memproduksi beta lactamase terhadap
penicillin akan timbul zona hambatan bertingkat, berapapun ukuran
diameter zona hambatan itu, harus selalu dilaporkan resisten. Seperti
halnya Srratia maracescens terhadap colistin/polimixin B
Hasil Pengamatan :

Amficilin : Resisten

Cipofloxacin : Sensitif

Diameter 30 mm

Pembahasan :

Pada praktikum kali ini dilakukan uji antibiotik, antibiotik adalah bahan yang
dihasilkan oleh mikroorganisme atau sintetis yang dalam jumlah kecil mampu menekan
menghambat atau membunuh mikroorganisme lainnya.

Prinsip dari percobaan ini adalah penghambatan terhadap pertumbuhan

mikroorganisme, yaitu zona hambatan akan terlihat sebagai daerah jernih di sekitar daerah
yang mengandung zat antibakteri. Diameter zona hambatan pertumbuhan bakteri
menunjukkan sensitivitas bakteri terhadap zat antibakteri. Selanjutnya dikatakan bahwa
semakin lebar diameter zona hambatan yang terbentuk bakteri tersebut semakin sensitif.

Pada percobaan ini digunakan dua jenis antibiotik yaitu Ciprofolaxin dan
Sulfamethoxazole yang memiliki kerentanan dan sifat antibakteri yang berbeda. Uji
resistensi dengan ciprofolaxin pada disc 1 memiliki diameter 13 mm dan pada disc 2
memiliki diameter 11 mm dan rata-rata diameternya adalah 12 mm. Sedangkan pada uji
resistensi antibiotik sulfamethoxazole pada disc 1 memiliki diameter 20 mm dan pada disc 2
memiliki diameter 14 mm dan rata-rata diameternya adalah 17 mm. Berdasarkan hasil
pengamatan tersebut, dapat dikatakan bahwa kedua antibiotik ini dapat menghambat
pertumbuhan bakteri.

Kesimpulan :

Berdasarkan praktikum uji sensitifitas antibiotic yang telah diklakukan dapat disimpulkan
bahwa :

1. Antibiotik adalah zat-zat kimia yang dihasilkan oleh fungi dan bakteri yang memiliki
khasiat mematikan atau menghambat pertumbuhan kuman-kuman
2. Sensitivitas bakteri terhadap antibiotik tergantung kapada kemampuan antibiotik
tersebut untuk menembus dinding sel bakteri
3. Zona Hambat merupakan tempat dimana bakteri terhamabat pertumbuhannya
akibat antibakteri atau antimikroba
4. Antibiotik Ciprofolaxin dan Sulfamethoxazole memiliki sifat yang sama yaitu dapat
menghambat pertumbuhan bakteri
 Antimicrobial Susceptibility Testing (AST)

Pemeriksaan Pengaruh Antimikroba Metode Dilusi

Tujuan :

Melakukan persiapan, penanaman, dan interpretasi hasil dari pemeriksaan hasil dari
pemeriksaan AST metode dilusi

Prinsip :

Dilusi Kaldu

Bahan antimikroba dengan konsentrasi tertentu dilarutkan ke dalam media kaldu kemudian
ditanami bakteri. Dengan melihat kekeruhan yang terjadi dan dibandingkan dengan kontrol
maka didapat nilai Minimum Inhibitory Concentration (MIC)

Dilusi Agar

Bahan antimikroba dengan konsentrasi tertentu dilarutkan ke dalam media agar plate
kemudian ditanami bakteri. Dengan membandingkannya terhadap jumlah koloni kontrol
maka diketahui presentase hambatan oleh bahan antimikroba dan didapat nilai Minimum
Inhibitory Concentration (MIC)

Tinjauan Pustaka :

Sensitivitas bakteri terhadap antibiotik tergantung kapada kemampuan antibiotik

tersebut untuk menembus dinding sel bakteri. Antibiotik lebih banyak yang efektif bekerja
terhadap bakteri Gram positif karena permeabilitas dinding selnya lebih tinggi dibandingkan
bakteri Gram negatif. Jadi suatu antibiotik dikatakan mempunyai spektrum sempit apabila
mampu menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif, sedangkan antibiotik berspektrum
luas jika pertumbuhan bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif dapat dihambat oleh
antibiotik tersebut (Sumadio, dkk. 1994).

Berdasarkan sasaran tindakan antibiotik terhadap mikroba maka antibiotik dapat

dikelompokkan menjadi lima golongan yaitu antibiotik penghambat sintesis dinding sel
mikroba, antibiotik yang termasuk kelompok ini ialah penisilin, sefalosporin, basitrasin, dan
vankomisin. Yang kedua yaitu antibiotik penghambat sintesis protein sel mikroba, antibiotik
yang termasuk kelompok ini ialah golongan aminoglikosida, makrolida, kloramfenikol,
linkomisin dan tetrasilin. Yang ketiga yaitu antibiotik penghambat sintesis asam nukleat sel
mikroba, antibiotik yang termasuk kelompok ini ialah rifampisin dan golongan kuinolon.
Keempat yaitu antibiotik pengganggu fungsi membran sel mikroba, antibiotik yang termasuk
kelompok ini ialah golongan polien. Dan yang kelima yaitu antibiotik penghambat
metabolisme mikroba, antibiotik yang termasuk kelompok ini ialah sulfonamida, trimetoprin
dan asam p-amino salisilat (Ganiswarna, 1995).
 Zona Hambat merupakan tempat dimana bakteri terhamabat pertumbuhannya
akibat antibakteri atau antimikroba. Zona hambat adalah daerah untuk menghambat
pertumbuhan mikroorrganisme pada media agar oleh antibiotik. Contohnya: tetracycline,
erytromycin, dan streptomycin. Tetracycline merupakan antibiotik yang memiliki spektrum
yang luas sehingga dapat menghambat pertumbuhan bakteri secara luas (Pelczar, 1986).

Metode dilusi terdiri dari dua teknik pengerjaan yaitu teknik dilusi perbenihan cair dan
teknik dilusi agar. Yang bertujuan untuk penentuan aktifitas antimikroba secara kuantitatif,
antimikroba dilarutkan kedalam media agar atau kaldu, yang kemudian ditanami bakteri
yang akan dites. Setelah diinkubasi semalam, konsentrasi terendah yang dapat menghambat
pertumbuhan bakteri di sebut dengan MIC (minimal inhibitory concentration). Nilai MIC
dapat pula dibandingkan dengan konsentrasi obat yang didapat di serum dan cairan tubuh
lainnya untuk mendapatkan perkiraan respon klinik.
Dilusi perbenihan cair terdiri dari makrodilusi dan mikrodilusi. Pada prinsipnya
pengerjaannya sama hanya berbeda dalam volume. Untuk makrodilusi volume yang
digunakan lebih dari 1 ml, sedangkan mikrodilusi volume yang digunakan 0,05 ml sampai
0,1 ml. Antimikroba yang digunakan disediakan pada berbagai macam pengenceran
biasanya dalam satuan g/ml, konsentrasi bervariasi tergantung jenis dan sifat antibiotik.
(misalnya cefotaxime untuk uji kepekaan terhadap Streptococcus pneumonia, pengenceran
tidak melebihi 2 g/ml, sedangkan untuk Escherichia coli pengenceran dilakukan pada 16
g/ml atau lebih).

Pada teknik dilusi agar, antibiotik sesuai dengan pengenceran akan ditambahkan kedalam
agar, sehingga akan memerlukan perbenihan agar sesuai jumlah pengeceran ditambah satu
perbenihan agar untuk kontrol tanpa penambahan antibiotik , konsentrasi terendah
antibiotik yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri merupakan MIC antibiotik yang
di uji. Kondisi untuk uji kepekaan teknik agar dilusi terdapat pada lampiran 2. Salah satu
kelebihan metode agar dilusi untuk penentuan MIC Neisseria gonorrhoeae yang tidak dapat
tumbuh pada teknik dilusi perbenihan cair.

Secara umum untuk penentuan MIC pengenceran antimikroba dilakukan penurunan

konsentrasi setengahnya misalnya mulai dari 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, 0,25 g/ml) konsentrasi
terendah yang menunjukkan hambatan pertumbuhan dengan jelas baik dilihat secara
visual atau alat semiotomats dan otomatis, disebut dengan konsentrasi daya hambat
minimum/ MIC (minimal inhibitory concentration).

Cara Kerja :

1. Persiapan sampel
Bahan antimikroba dibuat pengenceran dengan konsentrasi tertentu didalam tabung
2. Pembuatan standart kekeruhan
a. 0,5 ml 1,175% barium klorida dihidrat (BaCl2.2H2O) kedalam gelas piala
 b.
Ditambah 99,5 ml asam sulfat 1%, kocok
c.
Standart kekeruhan ini dimasukkan ke dalam tabung bertutup sebanyak 4-6 ml
Kekeruhan ini setara dengan kira-kira 1,5 x 108 sel/ml
d.
e.
Dapat disimpan diruang gelap suhu kamar selama 6 bulan. Jika akan digunakan
harus dikocok terlebih dahulu
3. Pembuatan suspensi bakteri
a. Masukkan 1 ml NaCl ke tabung reaksi
b. Masukkan koloni bakteri dengan ose
c. Campur, kocok lalu bandingkan dengan standart kekeruhan sampai
kekeruhannya sama dalam 5 ml kaldu atau air pepton

Mikrodilusi

1. Penanaman pada media kaldu

a. Dengan pipet ukur steril diambil 1 ml bahan antimikroba ke dalam tabung
b. Tambahkan 8 ml media kaldu steril
c. Diambil 1 ml suspensi bakteri dengan pipet ukur steril dan ditambahkan kedalam
media kaldu
d. Homogenkan dengan cara menggoyang-gayongkan tabung secara perlahan
selama 15 menit
e. Inkubasi selama 18-24 jam pada 35-37oC
f. Baca hasil berupa kekeruhan yang terjadi
2. Pembuatan Kontrol
Karena suspensi bakteri dapat juga menimbulkan kekeruhan dari awal, maka harus
dibuat kontrol. Kontrol ini digunakan untuk mengetahui apakah kekeruhan
ditimbulkan oleh suspensi itu sendiri atau karena adanya pertumbuhan meskipun
telah ditambah bahan antimikroba
a. Dengan pipet ukur steril diambil 1 ml bahan antimikroba ke dalam tabung
b. Tambahkan 8 ml media kaldu steril
c. Tambahkan 1 ml suspensi bakteri
d. Inkubasi pada suhu 4oC selama 24 jam
e. Gunakan sebagai pembanding kekeruhan yang terjadi pada tabung uji

Catatan : Buat satu tabung kontrol untuk setiap satu konsentrasi bahan antimikroba

Mikrodilusi

a. Siapkan media Mueller-Hinton double-strength

b. Siapkan pada larutkan antibiotik 4x-strength kelipatan dua
c. Dibuat suspensi bakteri dengan konsentrasi 2x106/ml
d. Dipipet 100 l kaldu Mueller-Hinton ke dalam tiap lubang tray
e. Masing-masing dimasukkan juga 50l larutan antibiotik dan suspensi bakteri,
kemudian dicampur
 f. Inkubasi 35-37oC selama 18-24 jam
g. Dinilai MIC-nya dengan melihat hambatan pertumbuhan yang terjadi

Dilusi Agar

1. Pencampuran bahan antimikroba dengan media Mueller-Hinton atau nutrient agar

a. 0,5 ml bahan antimikroba di cawan petri
b. Ditambah 9,5 ml agar Mueller-Hinton atau nutrient agar steril yang masih
mencair dan dicampur baik-baik
c. Biarkan sampai membeku
d. Keringkn dari air dengan cara menyimpannya terbalik pada 37 oC selama 20-30
menit di dalam inkubator
2. Penanaman bakteri pada media
a. Gunakan ose bulat yang telah dikalibrasi
b. Sebarkan/goreskan ke atas permukaan media
c. Inkubasi pada 35-37oC selama 18-24 jam
3. Pembuatan kontrol
4. Kontrol harus dibauat untuk mengetahui jumlah maksimal koloni yang dapat tumbuh
diatas media agar. Cara pembuatannya sama dengan perlakuan bahan antimikroba,
hanya saja diganti dengan NaCl 0,9% steril sebanyak 0,5 ml dan ditambahkan 9,5 ml
agar Mueller-Hinton atau nutrient agar

Hasil pengamatan :

Bentuk : Basil

Susunan : Menyebar satu-satu

Warna : Merah

Sifat : Gram Negatif

Pembahasan :

Tujuan praktikum ini adalah praktikan dapat melakukan penentuan MIC suatu antibiotik
menggunakan teknik dilusi. MIC (Minimum Inhibitory Cincentration) adalah konsentrasi
terendah dari antibiotik yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme.

MIC biasanya dapat dilihat pada tabung reaksi bening terakhir dan tabung reaksi sebelum
keruh pertama. Antibiotik yang digunakan dalam praktikum ini adalah Cefadroxile.

Praktikum kali ini digunakan kontrol positif (+) serta kontrol (-). Kontrol positif berisi bakteri
yang bertujuan untuk mengamati pertumbuhan bakteri. Untuk kontrol negatif hanya berisi
media antibiotik yang digunakan sebagai pembanding tingkat parameter kejernihan. Setelah
diinkubasi 16 jam pada 35-37oC dapat dilihat kekeruhan pada beberapa media dan
membandingkannya dengan kontrol positif (+) dan kontrol negatif (-). Hal ini menunjukkan
bahwa antibiotik Cefadroxile tidak dapat menghambat dan membunuh bakteri.

Kesimpulan :

Berdasarkan hasil pengamatan pada praktikkum kali ini disimpulkan bahwa antibiotik
Cefadroxile yang di gunakan resisten terhadap bakteri.