a.

Prosedur Kerja

Hidupkan alat KCKT dan lakukan pencucian terhadap kolom, selanjutnya atur

volume injeksi. Setelah itu, lakukan cek baseline terlebih dahulu dengan menggunakan fase

gerak yang akan digunakan. Selanjutnya sampel dimasukkan kedalam autosampel KCKT,

diinjeksikan dan dipilih kombinasi fase gerak dan laju alir yang akan memberikan pemisahan

terbaik, berdasarkan puncak yang simetris, tinggi puncak, luas area dan waktu retensi.

c. Optimasi Fase Gerak

Siapkan larutan fase gerak dengan berbagai perbandingan metanol : air (95:5,v/v),

asetonitril : aquabidest (10:90, v/v), metanol : asetonitril : aquabidest (90:5:5,v/v/v).

Kemudian alirkan fase gerak konsenrasi standar antosianin (100 µg/mL ) dengan variasi laju

alir 1,5 mL/menit dan 1mL/menit ke dalam kolom yang berisi fase diam dengan volume

penyuntikan 20µL. Selanjutnya dipilih kombnasi fase gerak dan laju alir yang memberikan

pemisahan terbaik, berdasarkan puncak yang simetri, tinggi puncak, luas area dan waktu

retensi yang sangat singkat (Sarikaya & Kalayar,2011).

d. Pembuatan Kurva Kalibrasi Tokoferol

Sebanyak 50 mg antosianin ditambahkan methanol HPLC secukupnya, kemudian

volume akhir dicukupkan dengan methanol HPLC : air (95:5) hingga 100 mL (100 µg/ mL).

larutkan standar tokoferol 100 µg/mL kemudian dibuat seri konsentrasi dengan pengenceran

4; 6; 8; 10 dan 12 µg/mL. Masing-masing larutan uji dipipet sebanyak 0,4 mL, 0,6 mL, 0,8

mL,1 mL, dan 1,2 mL, dimasukkan dalam labu ukur 10 mL dan ditambahkan metanol p.a

sampai tanda batas. Kemudian masing masing konsentrasi disaring dengan kertas saring

whatman 0,45 µm. Masukkan kedalam botol vial KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

melalui membran filter kemudian diinjeksi sebanyak 20 µl kealat KCKT dan luas area
dibawah kurva yang diperoleh dihitung dan buat kurva kalibrasi untuk menentukan

persamaan garis regresi linier.

e. Penetapan Kadar Antosianin

Sampel ditimbang sebanyak 250 mg dan dilarutkan dengan methanol ; air (95: 5)

sebanyak 10 mL kemudian kocok homogen. Kemudian saring dengan kertas saring whatman

0,45 µm. Masukkan kedalam botol vial melalui membran filter kemudian diinjeksi sebanyak

20 µl kealat KCKT pengukuran dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan. Kadar antosianin

dihitung menggunakan persamaan regresi (Amelia et al., 2014).