1

KATA PENGANTAR

Puji syukur kamipanjatkan kehadirat Allah Swt , karena rahmat dan limpahanNYA,
Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi ini dapat terselesaikan. Buku ini disusun agar dapat
membantu mahasiswa dalam mengikuti praktikum Mikribiologi dan Parasitologi ini.

Buku petunjuk praktikum ini memberi panduan kepada mahasiswa secara singkat
tentang cara kerja pembuatan media dan pengamatan bakteri. Kami berharap mahasiswa
setelah melakukan praktikum dapat mengetahui cara pembuatan media, sterilisasi dan uji
bakteriologi terhadap makanan dan udara serta potensi uji antibiotik.

Penyusun mengucapkan banyak terimakasih kepada semua pihak yanh telah

membantu penyelesaian buku ini. Semoga buku petunjuk praktikum ini dapat memberikan
manfaat terutama bagi mahasiswa. Masukan berupa kritik dan saran yang membangun sangat
kami harapkan untuk menyempurnakan buku ini.

Banjarbaru, 2018

Tim Penyusun

2
 TATA TERTIB PRAKTIKUM

1. Mahasiswa yang boleh mengikuti praktikum Mikrobiologi-Parasitologi adalah

mahasiswa yang telah mengambil atau sedang menempuh mata kuliah Mikrobiologi-
Parasitologi serta telah mengisi KRS untuk mata praktikum Mikrobiologi-Parasitologi
2. Setiap peserta harus hadir tepat waktu pada waktu yang telah ditentukan. Apabila
peserta terlambat 15 menit dari waktu yang ditentukan, maka tidak diperkenankan
mengikuti praktikum.
3. Selama mengikuti praktikum, peserta harus memakai jas praktikum yang bersih dan
dikancingkan dengan rapi dan memakai sepatu tertutup (dilarang mengenakan sandal
atau sepatu sandal)
4. Setiap peserta wajib membuat laporan sementara praktikum yang berisi data
pengamatan selama percobaan dan ditandatangani oleh asisten praktikum. Laporan
resmi praktikum dibuat sesuai dengan format yang sudah ditentukan dan
ditandatangani asisten praktikum, serta melampirkan laporan sementara.
Pengumpulan laporan resmi praktikum sesuai kesepakatan dengan asisten praktikum,
maksimal 1 minggu setelah kegiatan praktikum.
5. Setiap peserta harus memeriksa alat praktikum sebelum dan sesudah praktikum
kemudian mengembalikan alat yang telah dipakai dalam keadaan bersih dan kering.
Botol bahan kimia yang telah selesai digunakan harus ditutup rapat dan dikembalikan
ke tempat semula. Tutup botol harus sesuai (tidak boleh tertukar). Peserta praktikum
yang memecahkan alat gelas wajib mengganti.
6. Peserta praktikum dilarang membawa makanan/minuman ke dalam
laboratorium/ruang praktikum.
7. Setiap peserta harus menjaga kebersihan Laboratorium, bekerja dengan tertib, tenang
dan teratur. Selama praktikum, peserta harus bersikap sopan.
8. Setiap peserta harus melaksanakan semua mata praktikum dan mematuhi budaya
Kesehatan dan Keselamatan Kerja (K3), seperti memakai Alat Pelindung Diri (jas
praktikum, sepatu, sarung tangan, masker) dan membuang limbah praktikum sesuai
dengan kategorinya.
9. Apabila peserta praktikum melanggar hal yang telah diatur pada butir diatas, maka
peserta akan dikeluarkan dari laboratorium dan tidak diperkenankan melanjutkan
praktikum pada hari itu.
10. Hal yang belum disebutkan di atas dan diperlukan untuk kelancaran praktikum akan
diatur kemudian.

Banjarbaru, 2018

Team Penyusun

3
 DAFTAR ISI

TATA TERTIB PRAKTIKUM .................................................................................................3

DAFTAR ISI..............................................................................................................................4
PRAKTIKUM 1.........................................................................................................................5
PENGENALAN ALAT ............................................................................................................5
PEMBUATAN MEDIA DAN STERILISASI .........................................................................5
PRAKTIKUM 2.......................................................................................................................13
TEKNIK DASAR MIKROBIOLOGI .....................................................................................13
PRAKTIKUM 3.......................................................................................................................15
TEKNIK ASEPTIS : PEMINDAHBIAKAN ..........................................................................15
PRAKTIKUM 4.......................................................................................................................18
PEMBUATAN PREPARAT DAN PENGECATAN .............................................................18
PRAKTIKUM 5.......................................................................................................................27
PEMERIKSAAN AIR MINUM ..............................................................................................27
PRAKTIKUM 6.......................................................................................................................34
PERHITUNGAN JUMLAH BAKTERI..................................................................................34
PRAKTIKUM 7.......................................................................................................................36
PEMERIKSAAN POTENSI ANTIBIOTIKA.........................................................................33
PERCOBAAN 8 ......................................................................................................................41
UJI KEPEKAAN KUMAN .....................................................................................................41
PERCOBAAN 9 ......................................................................................................................46
PEMERIKSAAN JAMUR ......................................................................................................46
PERCOBAAN 10 ....................................................................................................................51
MENGHITUNG ANGKA KUMAN.......................................................................................51

DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................................................52

LAMPIRAN ........................................................................................................................53

4
 PRAKTIKUM 1
PENGENALAN ALAT
PEMBUATAN MEDIA DAN STERILISASI

A. Tujuan
Setelah menempuh praktikum ini, mahasiswa diharapkan dapat :
a. Mengetahui nama, gambar dan fungsi alat-alat yang digunakan untuk percobaan
mikrobiologi.
b. Melakukan pembuatan media dan mempersiapkan peralatan kerja mikrobiologi.
c. Melakukan sterilisasi dengan autoklaf.
B. Dasar Teori
MEDIA
Penggunaan media dalam pemeriksaan laboratorium mikrobiologisangat penting
untuk isolasasi, identifikasi, maupun diferensiasi. Media dapat dianggap kumpulan zat-zat
organik maupun anorganik yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri dengan syarat-
syarat tertentu. Untuk memberikan kondisi hidup yang cocok bagi pertumbuhan bakteri,
maka media harus memenuhi dalam : kandungan nutrien, tekanan osmosis, derajat keasaman
(pH), temperatur, dan sterilitas. Kandungan nutrien suatu media yang digunakan untuk
pertumbuhan harus mengandung : air, sumber karbon seperti CO2, CH4, sitrat, tartrat,
alkohol, dan gula (misal glukosa, laktosa, maltosa, dan sebagainya). Komponen lain adalah
sumber nitrogen (NO2, NO3, NH3, asam amino, polopeptida, peptida, atau pepton), mineral
(Na, K , Mg, Zn, P, S, Cl) vitamin, dan gas (O2 dan CO2).
Media yang digunakan harus isotonis, sebab apabila hipertonis maka bakteri akan
mengalami plasmoptysis, sedang bila hipotonis, maka akan terjadi plasmolisis.
Tipe Media
1. Berdasarkan konsistensinya :
a. Media padat , baik datar, miring maupun tegak.
b. Setengah padat, misal : SSS (Semi Solid Sucrose medium), MIC (Motility Indol
Ornithine).

5
 c. Media cair, seperti media gula, media kaldu, kaldu pepton, kaldu darah, dll.
2. Media basal
Digunakan sebagai bahan dasar untuk membuat media lain yang lebih komplek,
misalnya : kaldu agar, kaldu peptin, air pepton.

3. Enriched Media ( Media diperkaya)

Adalah media basal yang ditambah dengan zat-zat pendukung sehingga kuman yang
sukar tumbuh, dapat tumbuh lebih baik, misal : agar darah, agar serum, agar chocolat,
kaldu serum.
4. Enrichment Media (media pembiakan/penyubur)
Adalah media cair yang digunakan untuk memisahkan organisme dari organisme
yang lain, yang tumbuh lebih subur dalam kultur. Media tersebut berisi zat untuk
menghambat organisme yang tidak diinginkan, atau zat untuk mempersubur spesies
organisme yang diperlukan. Misal : Medium selenit F, kaldu tetrationat, kaldu
brilliant green, media alkali pepton cair.
5. Media selektif
Media padat ini mempunyai susunan sedemikian rupa sehingga kuman yang dicari
akan tumbuh dengan koloni yang khas, sedang kuman yang lain kurang khas. Misal :
Agar McConkery, media Endo, DCLS Agar untuk isolasi kuman perut. Kuman perut
(enterobakter) yang tidak memecah laktosa (Non Lactose Fermented) misalnya :
Samonella, Shigella, Proteus, dan lain-lain akan terlihat jernih/transparan, sedang
yang memecah laktosa akan berwarna merah.
Contoh-contoh Media :
A. Media Transparan
a. BGS (Buffered Glycerol Saline)
b. Carry and Blair transport medium
c. Amies transport medium
d. Alkaline pepton water (air pepton alkalis)
B. Medium untuk isolasi :
a. Kultur umum
1. Agar darah (untuk kultur dan angka kuman)
2. Agar Coklat
3. DCLS (Deoxycholate Citrate Lactotse Sucrose) Agar
4. Media Tellurit

6
 5. Media untuk pertussis (Mordet Gengou Agar)
6. Thayer Martin Medium
7. MC Conkey Agar
b. Penanaman Mycobacterium tuberculosis
Medium Loewenstein-Jensen, Middlebrook)
c. Penanaman bakteri aneorob
1. Brucella Agar Darah
2. Brucella Agar darah dengan kanamycin/antibiotik lain
3. Agar darah
4. Thioglycolat
5. Thioglycolat dengan antibiotik
d. Leptospira:
Fletcher’s medium
e. Jamur:
Saboouraud dan Saboraud dengan chloramphenicol
f. Enterobacteriacea :
1. DCLS
2. DST agar
3. MC Conkey Agar
C. Enriched media (media penyubur):
1. Selenit Cystein Broth
2. Larutan alkali pepton A
3. Kaldu dara
4. Thioglycolat
5. Gal kultur

STERILISASI
Persyaratan penting pada percobaan mikrobiologi adalah proses sterilisasi, yaitu
tindakan membebaskan alat maupun media dari jasad renik. Semua perlengkapan untuk
pembuatan, distribusi, dan penyimpanan media hurus disterilkan terlebih dahulu untuk
mencegah kontaminasi. Apabila pada penanaman material dalam media, dimana petri, ose,
maupun media yang digunakan tidak steril, maka sangatlah sulit untuk membedakan, apakah
kuman yung berhasil diisolasikan tersebut berasal dari penderita ataukah karena kontaminasi
dari alat atau media yang digunakan.

7
 Suatu alat atau bahan dapat dikatakan steril apabila bebas dari mikroba baik bentuk
vegetatif maupun spora. Sekarang sudah banyak peralatan yang dapat dibeli dalam keadaan
steril sehingga bisa langsung digunakan untuk percobaan mikrobiologi.

Cara-cara Sterilisasi
Berbagai cara yang dikenal dan pemilihan cara sterilisasi tergantung dari bahan/alat yang
disterilkan. Secara garis besar dibedakan menjadi :
A. Fisik/Pemanasan ditujukan untuk membunuh atau merusak mikrobia. Dibedakan
menjadi 2 golongan yaitu :
1. Panas kering dengan cara : membakar, menggunakan udara panas (oven).

▪ Flaming (membakar)
Digunakan nyala bunsen untuk sterilisasi ose, sterilisasi mulut tabung
percobaan, dan wadah gelas lainnya pada waktu menginokulasi media. Pada
waktu memanaskan ose, mulailah dari pangkal kawat dan setelah terlihat merah
pijar, secara pelan-pelan pemanasan dilanjutkan ke ujung ose. Hal ini untuk
mencegah terloncatnya sisa kuman akibat pemanasan langsung dan terlalu cepat
pada mata ose.
Oven udara panas (hot air oven)
Digunakan untuk sterilisasi alat-alat laboratorium dari gelas seperti petri,
tabung, dan pipet. Biasanya sterilisasi dikerjakan pada suhu l75°C selama 1,5-2
jam. Sebelum disterilkan, labu dan tabung percobaan harus kering, ditutup
dengan kapas, pipet dibungkus dengan kertas atau ditaruh dalam kaleng pipet.
2. Panas basah dengan cara : rnerebus, uap air panas, uap air panas bertekanan,
pasteurisasi.

▪ Merebus
Digunakan untuk mensterilkan alat-alat yang berupa gunting, pinset, skapel,
jarum, spuit injeksi, dan lain-lain dengan cara direbus dalam keadaan mendidih
selama 30 - 60 menit.

▪ Uap air panas

Terutama untuk mensterilkan media-media yang tidak tahan pada uap air panas
dengan tekanan (autoklaf). Sterilisasi dilakukan dengan pemanasan 100°C

8
 selama 1 jam. Perlu diingat bahwa dengan cara tersebut, spora belum dapat
dimatikan.

▪ Uap air panas bertekanan (Autoklaf) .

Digunakan terutama untuk sterilisasi media yang tahan terhadap panas tinggi.
Sterilisasi dikerjakan pada suhu 120°C selama 10-30 menit, sesuai kebutuhan
(biasanya selama 20 menit). Hal yang harus diperhatikan selama sterilisasi
dengan autoklaf adalah harus ditunggu selama bekerja dan hati-hati pada saat
menurunkan tekanan.

▪ Pasteurisasi
Digunakan untuk sterilisasi suhu dan minuman beralkohol. Panas yang
digunakan 61,70°C selama 30 menit.
B. Filtrasi
Cara ini dipakai untuk sterilisasi cairan yang akan rusak bila disterilisasi dengan cara
lain (pemanasan). Filtrasi lazim digunakan untuk sterilisasi sera, toxin, preparat,
antibiotik, enzim, vitamin, zat-zat labil lainnya.
Kelemahan metode filtrasi, dapal ditembus oleh golongan virus.
C. Penyinaran (Radiasi)
Digunakan untuk sterilisasi ruang, misalnya kamar atau ruang inokulasi. Penyinaran
selama beberapa jam sebelum dan lampu dimatikan bila ruang tersebut akan
digunakan misalnya untuk menyiapkan media. inokulasi bakteri, dan sebagainya.
Jenis radiasi :
a. Sinar UV
b. Sinar X
c. Sinar gamma : untuk material yang tebal
d. Sinar katoda : digunakan setelah pengepakan
D. Khemis yaitu sterilisasi dengan menggunakan bahan kimia.
Bahan kimia yang sering digunakan untuk mencegah /membunuh mikrobia adalah
desinfektan dan antiseptik. Desinfektan biasanya digunakan untuk objek yang tidak
hidup karena akan merusak jaringan. Sedangkan antiseptik biasanya digunakan untuk
tubuh.
Beberapa zat kimia yang bersifat antimikrobia:
a. Fenol dan derivatnya
b. Alkohol (50 - 70%)

9
 c. Formaldehid (formalin)
d. Detergen
e. Halogen beserta gugusannya
f. Logam berat (merkutokrom)
g. Etilen oksid (gas sterilisator) mudah meledak dan toksik

C. ALAT dan BAHAN

1. Alat :
- Tabung reaksi - Pipet
- Labu erlenmeyer - Gelas Ukur
- Bekerglass - Autoklaf
- pH meter - Cawan Petri

2. Bahan
- Nutrien agar - Aquadest
- Nutrien broth - Aluminium Foil
- Kapas

D. CARA KERJA
1. Pembuatan media kaldu nutrien (nutrien agar)
Perintah : buatlah media kaldu nutrienuntuk 2 buah tabung-reaksi @ 5 ml.
a. Timbang kaldu nutrien agar sesuai yang dibutuhkan (13 g/1iter).
b. Larutkan dalam aquades.
c. Bagi dalam tabung rekasi, tutup dengan kapas dan alumunium foil.
d. Sterilkan pada 121°C selama 15 menit.
2. Pembuatan media nutrient agar
Perintah : buatlah media nutrien agar miring untuk 2 petri @25 ml.
a. Timbang media nutrien agar sesuai yang dibutuhkan (13 g/liter).
b. Larutkan dengan aquades dalam erlenmeyer.
c. Tambah agar sebanyak 1,5 %.
d. Tutup tabung dengan kapas dan alumunium foil.
e. Sterilkan pada 121°C selama 15 menit.
f. Setelah disterilisasi dibekukan dengan cara tabung dimiringkan.

10
3. Pembuatan media nutrien agar miring
Perintah : buatlah media agar untuk 2 petri @ 5 ml.
a. Timbang media nutrien broth sesuai yang dibutuhkan.
b. Larutkan dengan aquades dalam erlenmeyer.
c. Tambah agar sebanyak 1,5 %.
d. Tutup dengan kapas dan alumunium foil.
e. Sterilkan pada 121°C selama 15 menit.
f. Setelah disterilkan, dituang pada petri dish yang sudah disterilkan

PERTANYAAN :
1. Apa yang dimaksud dengan media dan sebutkan Syarat-syarat media?
2. Bagaimana suatu bahan dikatakan steril?
3. Sebutkan macam-macam sterilisasi dan jelaskan dengan singkat?
4. Sebutkan beberapa zat kimia yang bersifat antimikrobia?
5. Bagaimana prinsip anda memilih metode Sterilisasi ?
6. Bagaimana Cara Sterilisasi untuk suatu bahan / alat di bawah ini :
1. ose dan pinset
2. gunting
3. spuit injeksi
4. piring petri
5. Erlemnmeyer
6. Gelas Ukur
7. tabung reaksi berisi nutrien agar
8. tempat bekerja/ruang inokulasi
9. Beaker gelas
10. media yang tidak tahan pada uap air panas bertekanan

11
12
 PRAKTIKUM 2
TEKNIK DASAR MIKROBIOLOGI

A. Tujuan
Setelah menempuh praktikum ini, mahasiswa diharapkan dapat melakukan teknik dasar
mikrobiologi, yaitu cara penggunaan ose dan teknik plating serta pembuatan preparat
B. Cara Kerja
1. Penggunaan ose lurus dan bulat
Ose bulat dipegang pada posisi imbang antara ibu jari dan jari telunjuk dengan jari
tengah. Ose bulat digunakan untuk preparat ulas dari media padat, memindahkan sebuah
koloni atau kultur dari suatu medium ke medium lainnya, serta untuk inokulasi pada pelat
agar dengan menggoreskan.
Ose lurus dipegang dengan cara serupa, digunakan untuk memilih koloni, membuat
ulah tipis dan untuk inokulasi kultur dengan menusukan.Sebelum dan sesudah digunakan, ose
harus disterilkan dengan cara dipanaskan hingga merah pijar pada nyala api dan dibiarkan
dingin sebelum koloni disentuh. Pendinginan ose dapat diperceoat dengan cara menyentuh
ose pada permukaan agar di luar kultur.
Macam-macam bentuk ose :
a. Lurus
b. Spatula
c. Bulat
2. Teknik Plating
Plating adalah inokulasi suatu medium pada cawan petri dengan menggunakan ose.
Tujuannya untuk mendapatkan koloni terpisah, untuk mempelajari morfologi koloni dan
untuk isolasi (membuat) kultur yang murni.
Ada beberapa cara plating yang lazim digunakan :
Cara A :
1. Inokulum digoreskan di tepi pelat.
2. Ose disterilkan, kemudian buatlah dua goresan melintang dari bagian tengah goresan
pertama.
3. Ose disterilkan, dan buatlah goresan-goresan melintang, yang tegak lurus pada kedua
goresan tersebut.
4. Ose disterilkan, dan buatlah goresan-goresan yang tegak lurus dengan goresan
sebelumnya, dan tidak menyentuh goresan-goresan pertama.

13
Cara B :
Prosedur sama dengan cara A, tetapi arah goresan seperti gambar 3 :

Cara C :
Prosedur sama, tetapi cara penggoresan seperti gambar 4 :

Gambar 4. Plating cara C

PERTANYAAN
1. Sebutkan macam-macam ose?
2. Jelaskan bagaimana Cara menggunakan ose?
3. Mengapa ose perlu disterilkan? Bagaimana Cara mensterilkan ose?
4. Mengapa ose harus didinginkan terlebih dahulu sebelum digunakan?
5. Apa yang dimaksud dengan plating dan apa tujuan dari plating?

14
 PRAKTIKUM 3
TEKNIK ASEPTIS : PEMINDAHBIAKAN

A. Tujuan
Setelah menempuh praktikum ini, mahasiswa diharapkan :
a. Dapat memindahkan biakan dari satu media ke media yang lain.
b. Mampu melakukan kerja aseptis.

B. Dasar Teori
Biakan murni (pure culture) sangat diperlukan dalam kegiatan mikrobiologi, misalnya
untuk keperluan diagnostik, karakteristik mikrgoorganisme, industri mikrobiologi, dan lain-
lain. Untuk mendapatkan kultur yang murni selain nutrisi dan lingkungan yang menunjang
pertumbuhan mikroorganisme tersebut juga perlu dicegah adanya kontaminan dalam biakan.
Untuk itu diperlukan suatu teknik aseptis.
Teknik aseptis sangat diperlukan untuk memindahkan biakan dari satu media ke
media lain. Dengan teknik aspetis seorang mikrobiologis berusaha mencegah terjadinya
kontaminan pada biakan. Untuk menyempurnakan kerja aseptis, hal perlu diperhatikan adalah
:
1. Area tempat bekerja disterilkan dengan penyinaran/radiasi.
2. Alat-alat untuk keperluan kerja aseptis disterilisasi terlebih dahulu
3. Pekerjaan dikerjakan secara cepat dan efisien.

C. Alat dan Bahan

1. Alat :
- Lampu spiritus
- Ose
- Kultur dalam
2. Bahan
- Nutrien agar miring
- Kaldu Nutrien agar miring

D. Cara Kerja
1. Pemindahan biakan dari media air ke media padat

15
 Perintah : Pindahkan biakan Escherichia coli/ Staphylococcus aureus dari media
cair dalam tabung reaksi ke media agar miring.
a. Panaskan ose hingga membara.
b. Buka tabung yang berisi kultur yang akan dipindahkan, panasi mulut tabung pada
nyala api.
c. Masukkan ose tersebut dalam biakan dekat dinding tabung dan celupkan dalam
biakan.
d. Keluarkan ose kemudian panasi mulut tabung dan tutup kembali.
e. Buka tabung berisi nutiren agar miring, panasi mulut tabung dengan nyala api.
f. Goreskan ose pada media nutrien agar miring.
g. Panasi kembali mulut tabung, kemudian tutup.
h. Inkubasi 37°C selama semalam.
2. Pemindahan biakan dari media padat ke media padat
Perintah : Pindahkan biakan Escherichia coli / Staphylococcus aureus dari media
padat agar miring ke media padat dalam petri dish.
a. Panaskan ose hingga membara.
b. Buka tabung yang berisi biakan yang akan dipindahkan, panasi mulut tabung pada
nyala api.
c. Masukkan ose steril ke biakan, ambil satu koloni dan tutup tabung kembali.
d. Buka tutup petri dish sebagian dan letakkan mulut petri dish dekat nyala api.
e. Goreskan ose pada medium nutrien agar dekat nyala api.
f. Goreskan ose pada media nutrien agar miring.
g. Inkubasi 37°C selama semalam.
3. Pemindahan biakan dari media padat ke media cair
Perintah : Pindahkan biakan dari media padat agar miring ke media cair dalam
tabung reaksi.
a. Panaskan ose hingga membara.
b. Buka tabung yang berisi kultur yang akan dipindahkan, panasi mulut tabung pada
nyala api.
c. Masukkan ose steril ke biakan, ambil satu koloni dan tutup tabung kembali.
d. Buka tabung berisi kaldu nutrien, panasi mulut tabung dengan nyala api.
e. Masukkan ose pada media kaldu nutrien sambil diaduk.
f. Panasi kembali mulut tabung, kemudian tutup
g. Inkubasi 37°C selama Semalam.

16
PERTANYAAN :
1. Apa yang dimaksud dengan :
a. Biakan murni
b. Kontaminan
c. Teknik aseptis
2. Apa yang terjadi jika media segar yang telah dibuat tidak disterilisasi'?
3. Jelaskan hal-hal yang perlu diperhatikan dalam kerja aseptis?

17
 PRAKTIKUM 4
PEMBUATAN PREPARAT DAN PENGECATAN

A. Tujuan
Setelah menempuh praktikum ini, mahasiswa diharapkan :
- Dapat melakukan pembuatan preparat dari bahan yang berasal dari penderit baik itu
media cair maupun media padat
- Dapat melakukan pengecatan bakteri khususnya dapat membedakan bakteri Gram positif
dan negatif.
B. Dasar Teori
Pemeriksaan mikroskopik terhadap bakteri dapat dilakukan dalam keadaan hidup
maupun mati. Pemeriksaan bakteri dalam keadaan hidup dapat dikerjakan dengan membuat
preparat tetesan gantung atau dengan melihat bakteri dalam mikroskop medan gelap. Dalam
keadaan mati, bakteri dapat dibuat preparat dan di cat.
Untuk mendapatkan hasil pemeriksaan mikroskopik yang baik, diperlukan :
 Preparat dapat dilihat dengan baik yaitu tidak terlalu tebal dan tidak terlalu tipis.
 Pengecatan preparat yang baik.
Pada umumnya pemeriksaan langsung kurang memberikan hasil yang memuaskan
karena kontras antara sel bakteri dengan latar belakangnya kurang jelas. Untuk meningkatkan
kontras biasAnya dilakukan pengecatan. Dalam hal ini perlu diperhatikan :
1. Bentuk bakteri
2. Susunan bakteri atas kedudukan satu dengan yang lain
3. Sifat pengecatan dari bakteri tersebut
4. Alat-alat tambahan yang dipunyai bakteri
Untuk melakukan pengecatan haruslah terlebih dahulu dibuat suatu preparat yang
baik, tidak tertalu tebal dan difiksasi dengan baik.
1. Jenis-jenis cat
a. Mordan
Mordan adalah bahan kimia atau proses fisik yang memfiksasi cat primer yang diserap
mikroorganisme target. Contoh : kompleks iodin yang digunakan untuk pengecatan
Gram, campuran asam dan alkohol untuk pengecatan tahan asam.
b. Cat sekunder kontras

18
 Sebagian besar sistem pengecatan menggunakan cat sekunder atau kontras
untukmemberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai
Spektrum warna yang berbeda dengan cat primer.
Contoh : Safranin pada pengecatan Gram memberikan warna merah, Metilan biru pada
pengecatan tahan asam memberikan warna biru.
2. Klasifikasi pengecatan
a. Pengecatan sederhana
Yaitu pengecatan yang hanya menggunakan 1 macam cat. Biasanya baik bakteri
maupun sekitarnya akan mempunyai warna yang sama tetapi dengan intensitas yang
berbeda. Contoh : Karbol fuschin, Gentian violet, Metylen biru.
b. Pengecatan differensial/majemuk
Yaitu pengecatan yang menggunakan lebih dari satu macam cat. Pengecatan ini dapat
digunakan untuk identifikasi karena masing-masing bakteri mempunyai reaksitertentu.
Contoh : Pengecatan gram, ZN.
c. Pengecatan khusus
Yaitu pengecatan yang secara khusus digunakan untuk melihat alat tambahan pada
bakteri. Contoh :
 Pengecatan Burri untuk melihat kapsul
Kapsul akan terlihat jernih dengan badan bakteri dan sekitarnya terlihat hitam.
 Pengecatan Gray untuk melihat Flagella.
 Pengecatan Neisser untuk melihat granula (Corynebachterium diphteriae). C.
diphtheriae akan terlihat berbentuk batang dengan kedua ujungnya membulat
(bentuk halter) yang berisi granula. Badan bakteri terlihat berwarna kuning, sedang
granula berwarna biru kehitaman.
 Pengecatan Much Weiss untuk melihat granula Mycobacerium tuberculusa.
Bakteri tahan asam akan terlihat berwarna merah dengan granula yang berwarna
ungu. Dasar preparat dan Sel-Sel lain akan terlihat berwarna biru.
d. Pengecatan Gram
Metode pengecatan ini ditemukan Glen Christian Gram pada tahun 1884. Dari
sifat bakteri terhadap cat Gram, bakteri dapat digolongkan menjadi Gram positif dan
Gram negatif.
Bakteri Gram positif adalah bakteri yang pada pengecatan Gram tahan terhadap
alkohol sehingga tetap mengikat cat pertama dan tidak mengikat cat kontras sehingga

19
bakteri akan berwarna ungu.Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang pada pengecatan
Gram tidak tahan terhadap alkohol sehingga warna cat yang pertama dilunturkan dan
bakteri akan mengikat warna kontras tampak merah.
Ada beberapa teori tentang dasar perbedaan kedua golongan tersebut :
1. Teori Salton
Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi (20%) di dalam dinding Sel bakteri
Gram negatif. Zat lipid ini larut selama pencucian dengan alkohol. Pori-pori pada
dinding sel membesar, sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan
bakteri menjadi tidak berwarna.
Bakteri Gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding selnya oleh
pencucian dengan alkohol. Protein menjadi keras dan beku, pori-pori mengecil
sehingga komplek ungu kristal iodium dipertahankan dan bakteri tetap berwarna ungu.
2. Teori Permeabilitas Dinding Sel
Teori ini berdasarkan tebal tipisnya lapisan peptidoglikan dalam dinding Sel.
Bakteri gram positif mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan
peptidoglikan yang trediri dari 30 lapisan. Permeabilitas dinding Sel kurang, dan
komplek ungu kristal iodium tidak dapat keluar.
Bakteri gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis, hanya 1-2
lapisan dan susunan dinding sel tidak kompak. Permeabilitas dinding sel lebih besar
sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks ungu kristal iodium,

20
 Komposisi cat Gram

Cara pengecatan Gram

 Preparat yang telah siap dicat digenangi dengan cat Graun A selama l - 3 menit. Disini
semua kuman yang pada pengecatan Gram dibedakan menjadi Gram positif dan negatif
akan berwama ungu sesuai dengan warna cat Gram A. Setelah l - 3 menit cat dibuang,
tanpa dicuci dengan air.
 Preparat kemudian digenangi dengan cat Gram B selama 1/2 - 1 menit. Akibat
pemberian Gram B maka pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih baik. Setelah itu
cat dibuang dan preparat dicuci dan preparat dicuci dengan air (leding).
 Preparat kemudian ditetesi cat Gram C sampai warna cat tepat dilunturkan. Setelah
pemberian cat Gram C maka akan terjadi :

❖ Bakteri Gram positif : tahan terhadap alkohol (ikatan antara cacat dengan bakteri
tidak dilunturkan oleh alkohol) sehingga bakteri tetap berwarna ungu.

❖ Bakteri Gram negatif 3 tahan terhadap alkohol, sehingga warna ungu dari cat
dilunturkan dan bakteri menjadi tidak berwarna lagi.
 Preparat digenangi dengan cat Gram D selama 1 - 2 menit Gram D bertindak sebagai
warna kontras. Akibat dari pemberian Gram D maka :

❖ Bakteri Gram positif oleh karena telah jenuh mengikat cat Gram A maka bakteri tidak
mampu lagi untuk mengikat Gram D sehingga bakteri akan tetap berwarna ungu.

21
 ❖ Bakteri Gram negatif oleh karena warna cat sebelumnya telah dilunturkarr oleh cat
Gram C sehingga bakteri tidak berwarna lagi maka ia akan mengikat warna cat Gram
D sehingga bakteri akan berwama merah. i
Setelah itu preparat dicuci dan dikeringkan dalam udara kamar (dengan preparat dalam
posisi miring) dan setelah itu diperiksa di bawah mikroskop dengan menggunakan
pembesaran kuat.
Contoh bakteri Gram Positif :
Bentuk kokus : Streptococcus, Staphylococus, Pncumococcus, Peptococcus,
Peptostreptococcus.
Bentuk batang: Corynebacterium diphtherae. Nycobacteria Bacillus, Clostirida.
Contoh bakteri Gram Negatif :
Bentukkokus : Neisseria, Veillonella.
Bentuk batang : E. Coli, Shigella, Salmonella, Klebsiella, Hemphillus,
Pasteiurella, Bacteroides, Fusobacterium, Brusella.
Pengecatan Ziehl Nellsen (ZN)
Pengecatan ini Sering disebut dengan pengecatan acid fast atau tahan asam.
Dengan pengecatan ZN, bakteri terbagi menjadi 2 golongan yaitu bakteri tahan asam dan
bakteri yang tidak tahan asam.
Bakteri tahan asam setelah diberi cat pertama akan tahan terhadap pencucian
dengan asam dan alkohol sehingga tidak mengikat cat kedua dan tampak berwarna merah.
Sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan tampak berwarna biru karena cat pertama
dilunturkan oleh asam dan alkohol, dan kemudian mengikat cat kedua.
Sifat lahan asam ini disebabkan karena terdapatnya asam mikolat yang terikat
pada dinding sel. Dinding sel bakteri yang tahan asam dan alkohol terdiri dari
pepridoglikan, arabinogalaktan dan lipid. Lima puluh persen dari lipid ini adalah asam
mikolat.
Komposisi cat ZN :

22
Cara Pengecatan Ziehl Neelsen :
a. Preparat yang telah siap di cat digenangi dengan ZN-A.
Kemudian dipanasi dengan lampu spiritus sampai menguap, tetapi tidak mendidih. Baik
bakteri yang tahan asam dan alkohol maupun yang tidak, keduanya akan berwarna merah.
Tunggu selama 5 menit, setelah itu cuci dengan air.
b. Kemudian preparat ditetesi dengan cat ZN-B atau dimasukkan dalam ZN-B sampai tepat
warna cat dilunturkan. Bakteri yang tahan asam dan alkohol, warna cat ZN-A tidak
dilunturkan sehingga tetap berwarna merah. Sedang bakteri yang tidak tahan terhadap
asam dan alkohol, maka warna cat ZN-A akan dilunturkan sehingga bakteri menjadi tidak
berwarna. Setelah itu preparat segera diangkat dan dicuci dengan air.
c. Setelah itu preparat digenangi dengan cat ZN-C selama 2 menit. Bakteri yang tahan asam
dan alkohol, tidak mampu lagi mengikat warna ZN-C oleh karena sudah jenuh, sehingga
bakteri akan tetap berwarna mcrah. Sedangkan bakteri yang tidak tahan asam dan alkohol
warna cat ZN-A akan dilunturkan, sehingga bakteri akan mengikat warna cat kedua (ZN-
C) sehingga akan berwarna biru. Setelah itu preparat dicuci dengan air dan dikeringkan
dalam temperatur kamar.
Contoh bakteri ZN positif :
 Mycobacterium tubercolosis
 Mycobacterium lepra
 Mycobacterium yang saprophyl

C. Cara Kerja
1. Pembuatan preparat untuk pengecatan :
Pembuatan preparat dari bahan berasal langsung dari penderita

23
 Bahan dapat berupa : sputum, pus, discharge telinga, discharge hidung, urine (perlu
disentrifuge terlebih dahulu, endapan dibuat preparat).
Cara :
Bahan diamabil dengan ose steril atau kapas lidi steril dan digoreskan pada objek
gelas setipis mungkin. Panaskan objek gelas di atas nyala api spiritus sambil
digoncangkan (jarak preparat sampai api spiritus kira-kira 20 cm) sampai preparat
tersebut kering. Setelah kering, tetesi formalin 1 %, tunggu 5 menit dan keringkan
sekali lagi dan preparat siap dicat.

Pembuatan preparat dari biakan cair

Cara :
Ambil objek gelas yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan
diatas nyala api spiritus. Ambil kuman dari cat sekunder/tanaman cair (yang
sebelumnya telah diaduk secara steril) dengan menggunakan ose steril, diratakan pada
objek gelassehingga membentuk diameter kira-kira 1-2 cm. Ose yang sudah dipakai
mengambil kuman harus di sterilkan kembali dengan membakar ose di atas nyala api
spiritus. Jika akan dipakai lagi, harus disterilkan dengan cara yang sama.
Perhatian :
 Jangan memegang mata ose dengan menggunakan tangan.
 Jangan meletakkan ose di atas meja, letakkan ose pada tempat yang telah
disediakan.
 Jangan lupa mensterilkan ose pada saat akan dipakai dan sesudah pemakaian.
Pembuatan preparat dari pertumbuhan media padat
Cara :
Teteskan satu ose kaldu pada objek gelas yang telah dibersihkan dan dibebaskan dari
lemak. Dengan ose steril ambil sedikit dari satu koloni kuman, campurkan dengan
kaldu tersebut, buatlah menjadi homogeny, tipiskan. Preparat kemudian dikeringkan
di atas nyala api spiritus dan selanjutnya dikerjakan sebagai membuat preparat dengan
bahan berasal dari material langsung.
2. Cara melakukan pengecatan gram
a. Preparat yang telah siap dicat digenangi dengan cat Gram A selama l – 3 menit.
Kemudian cat dibuang dan tanpa dicuci. Semua bakteri pada pengecatan Gram A
akan berwarna ungu scsuai wama cat Gram A.

24
 b. Preparat digenangi dengan cat Gram B selama 1/2 - l menit. Akibat pemberian
Gram B maka pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih baik. Setelah itu cat
dibuang dan preparat dicuci dengan air (leding).
c. Preparat ditetesi cat Gram C sampai warna cat tepat dilunturkan. Setelah
pemberian cat Gram C maka akan terjadi :

▪ Bakteri Gram positif : tahan terhadap alkohol (ikatan antara cat dengan bakteri
tidak dilunturkan oleh alkohol) sehingga bakteri akan tetap berwarna ungu.

▪ Bakteri Gram negatif : tahan terhadap alkohol, sehingga warna ungu dari cat
dilunturkan dan bakteri menjadi tidak berwarna lagi.
d. Preparat digenangi dengan cat Gram D selama 1 - 2 menit Gram D bertindak
sebagai warna kontras. Akibat dari pemberian Gram D maka :

▪ Bakteri Gram positif oleh karena telah jenuh mengikat cat Gram A maka bakteri
tidak mampu lagi untuk mengikat Gram D sehingga bakteri akan tetap berwarna
ungu.

▪ Bakteri Gram negatif oleh karena warna cat Sebelumnya telah dilunturkan oleh
cat Gram C sehingga bakteri tidak berwarna lagi maka ia akan mengikat warna
cat Gram D sehingga bakteri akan berwarna merah.
Setelah itu preparat dicuci dan dikeringkan dalam udara kamar (dengan preparat
dalam posisi miring) dan setelah itu diperiksa di bawah mikroskop dengan
menggunakan pembesaran kuat.
3. Cara melakukan pengecatan Ziehl Neelsen :
a. Preparat yang telah siap di cat digenangi dengan ZN-A. Kemudian dipanasi dengan
lampu spiritus sampai menguap, tetapi tidak mendidih. Baik bakteri yang tahan
asam dan alkohol maupun yang tidak, keduanya akan berwarna merah. Tunggu
selama 5 menit, setelah itu cuci dengan air.
b. Preparat ditetesi dengan cat ZN-B atau dimasukkan dalam ZN-B sampai tepat
warna cat dilunturkan, maka akan terjadi :

▪ Bakteri yang tahan asam dan alkohol, warna cat ZN-A tidak dilunturkan
sehingga tetap berwarna merah.

▪ Bakteri yang tidak tahan terhadap asam dan alkohol, maka warna cat ZN-A
akan dilunturkan sehingga bakteri menjadi tidak berwarna.
Setelah itu preparat segera diangkat dan dicuci dengan air.

25
 c. Preparat digenangi dengan cat ZN-C selama 2 menit, akan terjadi :

▪ Bakteri yang tahan asam dan alkohol, tidak mampu lagi mengikat warna ZN-C
oleh karena sudah jenuh, sehingga bakteri akan tetap berwarna merah.

▪ Bakteri yang tidak tahan asam dan alkohol warna cat ZN-A akan dilunturkan,
sehingga bakteri akan mengikat warna cat kedua (ZN-C) sehingga akan
berwama biru.
Setelah itu preparat dicuci dengan air dan dikeringkan dalam temperatur kamar.
Contoh bakteri ZN positif :
 Mycobacterium tubercolosis
 Mycobacterium lepra
 Mycobacterium yang saprophyt

PERTANYAAN :
1. Apa manfaat mengetahui golongan Gram positif dan negatif pada terapi?
2. Apa kegunaan dari pengecatan Ziehl Neelsen?
3. Sebutkan Contoh bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif Serta contoh
bakteri Ziehl neelsen positif?
4. Jelaskan Cara pengecatan Gram?
5. Jelaskan Cara pemakaian mikroskop medan terang?
Sebutkan klasifikasi pengecatan, dan jelaskan beserta contohnya?

26
 PRAKTIKUM 5
PEMERIKSAAN AIR MINUM

A. TUJUAN
Melakukan uji bakteriologik terhadap air minum dengan metode plate count.

B. Dasar Teori
Macam-macam standar dan tes yang digunakan untuk pemeriksaan air tergantung ada
penggunaan air untuk minum, renang, produksi/pengolahan ikan, industri. Flora bakteri di
dalam air minum sangat bermacam-macam dan pemeriksaan yang teratur terhadap air
minum. Bila ada pemeriksaan suatu laboratorium dinyatakan baik (pemeriksaan tunggal),
belum tentu air tersebut baik sebagai air minum. Pada prinsipnya tujuan pengujian air mium
adalah untuk mengetahui ada tidaknya mikroorganisme pathogen.
Standar yang dipakai adalah WHO. Semua sampel tidak boleh mengandung E.coli
dan sebaiknya juga bebas dari bakteri coliform.
Standar WHO tersebut ialah :
1. Dalam setiap tahun, 95% dari sampel-sampel tidak boleh mengandung coliform dalam
100 ml.
2. Tidak ada sampel yang mengandung E.co1i dalam 100 ml.
3. Tidak ada sampel yang mengandung coliform lebih dari 10 dalam 100 ml.
4. Tidak boleh ada coliform dalam 100 ml dari dua sampel yang berturutan.
Yang baik adalah sering mengambil sampel dan diperiksa dengan cara yang
sederhana, daripada jarang mengambil sampel walaupun cara pemeriksaannya lebih lengkap.
Pengambilan sampel perlu ditingkatkan bila/pada keadaan :
1. Hujan deras terus-menerus
2. Sangat panas
3. Kecepatan aliran berkurang
4. Angin kencang
5. Angin berdebu
Pada waktu sampling harus selalu dijaga agar tidak terjadi kontaminasi. Untuk itu
digunakan botol steril yang tertutup (screw cup) yang dibalut dengan celophan sebelum
diautoclav. Bila yang akan diambil air yang telah diklorinasi, botol diberi sedikit larutan
Na2S2O3, misalnya 0,1 ml dari 3% dari Na2S2O3 tiap 100 ml sebelum disterilkan.

27
Petunjuk untuk sampling adalah sebagai berikut :
1. Botol steril tidak boleh dibuka sebelum akan digunakan untuk mengambil sampel dan
tidak boleh dicuci dulu diisi sampel.
2. Perekat pada tutup dibuka.
3. Tutup dibuka, dijaga agar jari-jari tidak menyentuh mulut botol atau permukaan tutup
botol bagian dalam.
4. Botol segera diisi dengan air dan ditutup kembali seperti semula. Harus diberi ruang
udara dalam botol agar populasi bakteri dalam udara juga ikut campur dengan air.
5. Sampel dari kran : Buka penutup kran (kalau ada) bersihkan bagian luar dan dalam dari
kran. A1irkan air selama 2 - 3 menit sebelum mengisi botol pengampung.
6. Sampel dari sungai, mata air, danau, bak persediaan atau sumur : Harus dilakukan agar
mendapatkan sampel yang refresentatif dari air yang digunakan konsumen. Oleh karena
itu tidak tepat bila pengambilan sampel sangat dekat dengan sumber/tempat persediaan
air atau tempat keluarnya. Aliran/arus pada daerah stagnasi harus dihindari dan dihindari
pula perusakan tempat persediaan air. Bila mengambil air dalam volume yang besar
digunakan sampling stick. Botol diikat pada ujung tongkat yang panjangnya 4 - 8 kaki
dan tutupnya dibuka. Botol dimasukkan secara cepat Sedalam satu kaki dari permukaan
dengan menghadap ke bawah botol, botol akan segera bergerak dengan mulut botol. Jika
sudah penuh, botol segera diangkat dari air dan segera ditutup. Jika tidak digunakan
“sampling stick”, masukkan botol dekat dasar dcengan tangan. Tenggelamkan botol
dalam air sedalam 3 cm gerakkan botol dalam air menentang arus.
7. Sampel dari pompa tangan : Pompa digerakkan 5 menit diambil sampelnya. Permukaan
pompa dibakar dulu. Sampel ditampung langsung dari pompa ke botol.
Besar sampel
Volume minimum yang diperlukan untuk analisa dari semua jenis air adalah 100 ml.
Jikaakan diperiksa adanya patogen misalnya Salmonella, volume sampelnya 500 ml.
Pengiriman sampel
Sampel segera dimasukkan ke dalam portable ice box pada central cannister. Di
sekitarcannister diletakkan es yang dipotong-potong atau dry ice. Bila lama pengiriman
(daripengambilan sampai laboralorium) kurang dari 4 jam, tidak perlu temperatur
sepertirefrigator, tapi cukup dijaga dalam keadaan dingin selama perjalanan. Laboratorium
harusmenerima kabar waktu pengiriman dan harus disertai form yang lengkap pada sampel.

28
Pengujian bakteriologik dari air minum
Pengujian bakteriologik ini terutama berhubungan dengan kesehatan lingkungan
dalam usaha membasmi bakteri patogen dalam air minum. Karena kuman patogen biasanya
ada dalam jumlah kecil, maka tidak sesuai bila digunakan sebagai standar untuk pengujian,
sehingga bakteri yang berasal dari faeses dipakai sebagai indikator adanya bakteri patogen
yang berasal dari perut.
Kuman patogen dapat berasal dari manusia, binatang (piaraan dan liar) dan burung,
walaupun demikian tidak dapat diasumsikan bahwa air dari persediaan yang tertutup untuk
pabrik (diisolasi) dan distok akan bebas dari kuman perut, walaupun biasanya derajat
kontaminasinya jauh berkurang. Yang biasa digunakan sebagai indikator dari populasi faeses
adalah E. Coli, juga Streptococcus fasealis, , Clestridium perfingens dan virus perut.
Ada beberapa cara pemeriksaan air minum, diantaranya ialah :
1. Metode Most Probable Number
Golongan coliform termasuk bakteri batang gram negatif yang tidak membentuk
spora dan fakultatif anaerob, yang tumbuh dengan adanya garam empedu dan
memferrmentasi, laktosa dengan menghasilkan asam dan 370C, oksidase negatif. Yang
dimaksud E.coli adalah Salah satu grup coliform yang dapat memfermentasi laktosa
dengan membentuk asam dan gas pada 44°C, indol positif, tidak dapat menggunakan
citrat. Menghasilkan asam dari manitol pada 370C, MR positif VP negatif.
Media yang dipergunakan :
a. LB (Lactose Broth, Gibco) b. BGL (Brilliant Green Lactose)
Beef ectract 3,5 g Pepton
Pepton 5,0 g Lactose
Lactose 5,0 g Ox gall
Distilled water 1000 ml Brilliant green
Distilled water I
Catatan :
Untuk memudahkan pembacaan, tabung II yang sudah diberi I tetes cairan dari
tabung I yang menghasilkan gas diletakkan tepat di belakang tabung tahap I tersebut,
serta seluruh tabung tahap I ikut dieramkan lagi bersama tabung tahap II. Hal ini sangat
perlu untuk menentukan jumlah Coliform.
Jumlah Coliform dapat dilihat dengan tabel dari buku :
Standar Method for The Examination od water ad Wte Water. Edition, 1971,
Mechael J. Taras. MPN INDEX AND 95% comperence limits for various combination

29
 of positive and geatif result when three 100 ml portions, three I ml portions and three 0,1
ml portions are used.
Number of tube giving positive
Reaction out of
INDEX
3 of 10 m each 3 of 1 m each
0 0
0 0
0 1
1 0
1 0
1 1
1 1
1 2
2 0
2 0
2 1
2 1
2 2
2 2
3 0
3 0
3 0
3 1
3 1
3 1
3 2
3 2
3 2
3 3
3 3
3 3
3 3
2. Filtrasi Membran
Sebagian besar laboratorium menggunakan metoda ini jika kekeruhan air memerlukan
filtrasi. Sejumlah volume air yang cocok difiltrasi melalui membran steril. Volume aliquot
MPN
3 of 0,1 m each Per 100 ml
0 3
1 3
0 3
0 4
1 7
0 7
1 11
0 11
0 9
1 14
0 15
1 20
0 21
1 28
0 23
1 33
2 64
0 43
1 755
2 120
0 93
1 150
2 210
0 240
1 160
2 1100
3 2400
30
untuk air kwalitas tinggi adalah sedang untuk kwalitas rendah dan air terkontaminasi
yang telah diencerkan ialah l0 ml. Jumlah koloni pada membran yang baik untuk dihitung
ialah 10 - 80 koloni. Keuntungan dari metode membran ialah dapat dikerjakan dengan
cepat sebab lebih baik memeriksa dengan frekuensi yang lebih banyak dengan metoda
sederhana dari pada dengan metode yang lebih rumit seperti metoda MPN.
a. Prosedur Umum
Simpan air dalam almari pending in sampai siap diperiksa. Di gunakan
membran asetat (0,45) pada filter stainles steel. Cuci tangan dengan akuades steril
setiap ganti air yang difiltrasi dan harus diganti sesudah dipakai 6 Sampel.
1. Saring sejumlah volume tertentu yang sesuai melalui membran Steril.
2. Gunakan pompa vakum. Dengan tang steril, ambil membran dan letakkan pada
media dengan menempelkan bagian yang mengandung bakteri pada agar, hati-hati
agar tidak terjadi gelembung udara antara membran dan agar.
3. Inkubasikan dan hitung koloni. Hitung jumlah koloni per l00 ml sampel, dengan
anggapan bahwa l koloni berasal dari membran.
4. B ii" ` A' i
b. Konfirmasi koloni & Perhitungan kuman
Sebagian besar koloni adalah khas, 5 - 100% adalah tetap tergantung pada
jumlah seluruh koloni. Bila ada koloni yang jelas berbeda morfologinya, tiap grup
dihitung dan ditetapkan terpisah (ditetapkan sendiri-sendiri). Bila koloni dianggap
campuran, gunakan metode seperti pada The Bacteriological examination of Water
suply sample.
Menghitung golongan Coliform
Untuk air yang tidak diobati diambil 50 dan/atau l0 ml disaring. Filter
diletakkan pada agar M-ENDO-LES atau agar tepol. Inkubasikan pada 30°C, ll9 jam.
Semua koloni yang berwarna metalik pada M-ENDO-LES, atau kuning pada agar
Tepol termasuk coliform. Yang mengkilap dapat terdapat dibagian tepi koloni.
Untuk air yang tidak diobati, diambil l00 ml dan difiltrasi Filter diletakkan pada
agar Tapol dan diinkubasikan seperti di atas. Hitung koloni yang kuning, juga yang
orange atau kuning muda. Untuk menegaskan, dilakukan subkultur pada Brilliant
Green Lactose Bile Broth dan diinkubasikan pada 36°C, catat adanya gas pada 24 + 2
jam dan pada 48 + 2 jam.
Menghitung E. Coli

31
 Untuk air yang tidak diobati : ambil 50 dan/atau 10 difiltrasi dan membran
diletakkan pada agar M-ENDO-LES atau agar Tepol, diinkubasikan pada 30°C
selama 1,5 - 2 jam, kemudian pada 44,4°C, 18 + 32 jam. Hitung koloni yang
mengkilat pada Endo dan kuning pada Tepol. Koloni E.coli ada yang tidak spesifik
baik ukuran maupun warnanya (kuning-coklat tua).
Untuk air yang diobati : biasanya yang difiltrasi adalah l00 ml. Filter letakkan
pada agar Tepol, inkubasikan pada 36°C selama 2 - 4 jam dan kemudian pada 44,4°C,
18 - 20 jam. Hitung koloni yang datar cembung atau cembung berwarna kuning.
Untuk menegaskan inkubasikan pada media Fennels, pada 44,4°C selama 24 jam.
Catat tabung-tabung yang mengeluarkan gas dan indol.
Menghitung Faecal Streptococci
Faecal Streptococci terdapat pada usus binatang dan manusia dan termasuk
spesies streptococcus faecalis dan S. faecium Adanya organisme tersebut dalam air
yang bebas E. coli tapi dengan jumlah coliform yang tunggal, menandakan adanya
pencemaran faeces.
Faecal streptococci lebih resisten chlorin dan oleh karena itu penggunaan indeks
dari pengobatan yang efisien adalah dapat mencapai nol setelah chlorinasi. Teknik
yang digunakan tergantung pada penggunaan sodium azide sebagai inhibitor yang
selektif dan tumbuh pada 44°C. Volume air yang sesuai difiltrasi (untuk air yang
diobati dipakai 100 ml). Kemudian membran diletakkan pada media datar kuning dari
sinetz dan Bartley’s glucosa azide. Untuk air yangdiobati, diinkubasikan pada 360C 4
jam kemudian pada 44,4°C Selma 44 jam.

3. Metode Plate Count

Perhitungan bakteri secara umum dalam air, menggunakan petunjuk untuk mengelola
pengadaan air. Dapat dilihat bahwa kontaminasi pada air yang telah diklorinasi jumlahnya
sedikit. Di USA jumlahnya kurang dari 300 per ml. Bakteri yang dapat tumbuh di air, dapat
tumbuh lebih baik pada suhu 22°C, daripada temperatur yang lebih tinggi. Bakteri yang
tumbuh paling baik pada suhu 37°C, biasanya dalam air dapat tumbuh dengan baik dan lebih
banyak karena pencemaran dari sumber eksternal. Jika dua grup dari bakteri berbeda secara
nyata, diperlukan perhitungan yang berbeda (sendiri-sendiri).

C. Alat dan Bahan

1. Alat :

32
 - Tabung reaksi dan rak - Tabung petri
- Mikropipet - Labu takar

2. Bahan
- Sampel air minum
- Media nutrien agar

D. CARA KERJA
1. Tambahkan 1 ml pada 2 petri.
2. Campur air sampel dengan 15 ml Nutrient agar yang cair dan biarkan beku.
3. Inkubasikan pada 20 - 22°C, 3 hari dan yang lain pada 37°C, 1 hari.
4. Hasil dinyatakan sebagai jumlah koloni yang tumbuh per ml dari sampel asli.

33
 PRAKTIKUM 6
PERHITUNGAN JUMLAH BAKTERI

A. Tujuan
Mahasiswa mampu menghitung jumlah bakteri.

B. Dasar Teori
Perhitungan jumlah bakteri dengan teknik plate count didasarkan pada asumsibahwa
setiap sel mikroorganisme dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah
diinkubasikan dalam media biakan dan lingkungan yang sesuai. Koloni yang tumbuh tidak
selalu berasal dari datu sel mikroorganisme karena mikroorganisme cenderung akan
berkelompok dan berantai. Setelah masa inkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan
perkiraan jumlah mikroorganisme pada suspensi tersebut. Berdasarkan hal tersebut maka
digunakan istilah Colony Forming Unit (CFU/ml) untuk perhitungan jumlah
mikroorganisme.

C. Alat dan Bahan

Alat: Bahan:
Alat-alat gelas l. Sampel
2. Media Mc. Conkey

D. CARA KERJA
Perintah : Hitunglah jumlah bakteri pada sampel yang diberikan
1. Buatlah pengenceran l0-1 - l0-4 dari sampel. Tandai masing-masing pengenceran dengan
label.
2. Encerkan 4 media Mc. Conkey @ 20 ml dalam labu erlenmeyer.
3. Dinginkan media sampai hangat sekitar 50°C
4. Pipet 1 ml cairan dari masing-masing pengenceran dan masukkan cairan ke dalam cawan
petri yang sesuai.
5. Tuangkan agar (media) ke dalam cawan dan goyang cawan dengan gerakan searah jarum
jam 5 x dan gerakan berlawanan arah jarum jam 5 x.
6. Biarkan lempengan agar membeku (10 menit). Setelah membeku, balik lempengan agar
dan masukkan lemari pengering (35°C) selama. 24 - 48 jam.

34
7. Pada hari kedua, hitung jumlah koloni lempengan agar. Gunakan lempengan agar yang
mempunyai 30-300 koloni. Bila tidak ada lempengan yang mempunyai kisaran jumlah
koloni tersebut gunakan lempengan agar yang mempunyai koloni sekitar 300 koloni.
8. Tentukan jumlah mikroorganisme hidup dengan cara mengalikan jumlah koloni dengan
faktor pengenceran. Laporkan hasil perhitungan!

Pengenceran Vol. yang

Jumlah koloni CFU/ml
sampel digunakan

9.

35
 PRAKTIKUM 7
PEMERIKSAAN POTENSI ANTIBIOTIK

A. Tujuan
Setelah praktikum selesai, mahasiswa diharapkan dapat menentukan kadar antibiotik.

B. Dasar Teori
Pemeriksaan ini bertujuan untuk mengetahui daya anti bakteri dari suatu antibiotik terhadap
bakteri standar. Dikenal ada beberapa cara :
1. Agar difusi
Digunakan pada industri obat-obatan dan rumah sakit untuk menetapkan potensi obat
dalam bentuk bahannya.
2. Turbidimetri
a. Dibuat seri pengenceran bahan pcmeriksaan atau larutan obat, kemudian ditambah
dengan suspensi dengan konsentrasi l04CFU per ml. Suspensi kuman ini diperoleh
dengan mengencerkan pertumbuhan kuman dalam kaldu yang telah diinkubasi
semalam.
Campuran tersebut kemudian diinkubasi 18 - 24 jam
Hitung MIC (Minimal Inhibitory Concentration) yaitu konsentrasi terkecil yang
masih mampu menghambat pertumbuhan kuman.
b. Cara yang lebih teliti adalah dengan menggunakan kurva hubungan antara
kekeruhan pertumbuhan dengan log berbagai konsentrasi antibiotika.
3. Penghambatan perubahan pH
Cara hampir sama dengan 2b, tetapi kurva standarnya merupakan hubungan
antara konsentrasi antibiotik dengan perubahan media.
4. Metode enzimatik
Antibiotik merupakan subtrat suatu enzim dan dihasilkan reaksinya diukur.
5. Radio immuneassay
Pemeriksaan didasarkan pada adanya hambatan terhadap ikatan kompleks antara
antibodi dan antibiotik yang radioaktif (berlabel) oleh antibiotika dalam sampel.
6. Cara kimia
Cara ini kurang sensitif untuk kadar antibiotik kurang dari l µg.

36
Metode difusi agar
1. Persiapan kuman yang dipakai
Spora Bacillus suptilis ATCC 6633 ditanam pada Heart Infusion Agar (HI agar),
dieramkan 36°C sclama l minggu. Sebelum dipakai, spora dipanaskan 65°C selama 30
menit kemudian dicuci dengan akuades steril, kemudian dibuat suspensi dengan kadar
1010CFU (Colony Forming Unit). Simpan pada suhu 4°C dan dapat dipakai sebelum 6
bulan.
2. Menyiapkan kultur padat data
Setiap 100 ml media diberikan 0,1 ml suspensi spora di atas pada tcmperatur 48 -
65°C, dan dituang dalam petri plastik dengan diameter 10 cm masing-masing 5 ml.
Biarkan membeku pada suhu kamar. Kultur ini dapat disimpan pada suhu 40C.
3. Pemeriksaan
Pemeriksaan ini membutuhkan 2 petri dan l6 disk, jadi masing-masing plat
diletakkan 8 disk, terdiri 6 disk antibiotik dan 2 disk mengandung sampel yang diperiksa.
Ukuran disk yang dipakai 0,6 cm. Antibiotik standar dimasukkan dalam serum
manusia untuk pengencerannya, dengan konsentrasi sebagai berikut :

No Antibiotik Konsentrasi (µg /ml)

1. Gentamycin 12 6 1,5

2. Steptomycin 25 12,5 3,1

3. Vancomycin 40 20 10

4. Kenamycin 27 9 3

5. Neomycin 12 6 1,5

6. Vibramycin 12 6 1,5

Tiap-tiap disk diberi 0.002 ml antibiotik standar, lulu diletakkan pada petri
tersebut dimana satu seri pengenceran dan satu disk yang diperiksa pada lingkaran satu
sisi dan seri yang lain serta satu disk yang diperiksa sisi yang lain. Demikian juga pada
petri berikutnya.

37
 Inkubusi dilakukan pada 37°C selama 2 jam dan dilihat zone hambatan di sekitar
disk serta diameternya diukur dalam mm. Buat grafik standar dari masing-masing petri
antara diameter zone penghambatan (mm) dengan konsentrasi antibiotik standar.

C. Alat dan Bahan

Alat : Bahan :
1. Piring petri 1. Sampe1 yang akan ditentukan
2. Cakram silinder kadarnya
3. Pinset 2. Media antibiotik No.1
4. Mikropipet dan yellow tip 3. Larutan buku ampisilin
5. Jangka sorong 4. Suspensi bakteri uji
6. Gelas ukur 10 ml

D. Cara Kerja
Prosedur Test Dillusi :
Digunakan untuk mencari MIC.
Dasarnya : Pengenceran Seri antibiotik ditambah mikroorganisme kemudian dieramkan.
MIC : Konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan kuman.
Bahan dan persiapan antibiotik :
Bahan yang diperiksa (antibiotik harus asli dan murni dan kadar (meg atau unit) serta
tanggal kadaluarsanya harus diketahui. Serbuk antibiotik kemudian ditimbang dan
dilarutkan dengan pelarut yang sesuai (sebagai larutan induk) dan disimpan pada minus
20°C atau lebih.
Metode Dilusi
A. Dilusi
1. Dilusi cair (Macro broth dilution)
a. Lakukan pengenceran antibiotik yang diperiksa, sehingga didapat beberapa
konsentrasi.
Caranya:
1) Siapkan 10 tabung steril nomor 1 s/dan 10.
2) Tabung no. 1 s/dan 10 masing-masing isi dengan 1 ml akuades steril.
3) Tabung no.1 isi dengan 2 ml larutan antibiotik.
4) Tabung no. 2 ditambah 1 ml larutan antibiotika (diambil dari tabung 1,
campur homogen, ambil 1 ml dan masukkan pada tabung no. 3, campur

38
 homogen. Ambil 1 ml masukkan pada tabung 4 dan Seterusnya sampai
no.10, yang terakhir ambil 1 ml masukkan ke tabung steril untuk kontrol
(tabung no.11).
b. Ambil 4 - 5 koloni kuman, suspensikan dengan + 1 ml BHI eramkan 37°C
selama 2 - 4 jam, untuk menyamakan pertumbuhan. Tambah akuades steril
sampai kekeruhan sebanding dengan 108 sfu/ml, dengan membandingkannya
dengan kekeruhan larutan standar Mc Farland I. Lalu encerkan 1 : 200 dengan
media cair BH1/MH broth.
Larutkan Mc farland I terdiri dari :
0,5 ml 0,048 M BaC12 (1,175 % b/v BaCl2.2H2O) dengan 99,5 ml 0,36 N
H2SO4 1% v/v.
c. Tabung no.1 s/dan 10 masing-masing tambah suspensi kuman 1 ml, kocok-
kocok supaya homogen.
d. Sedangkan kontrol, tabung ke 11 berisi sisa pengenceran antibiotika + 1 ml
media MH broth steril.
Tabung ke 13 : berisi 2 ml media MH broth steril
Tabung ke 13 : berisi 2 ml suspensi kuman
e. Eramkan semua tabung-tabung, tersebut 37°C selama 18 - 24. Lihat
pertumbuhan.
Hasil didapat : konsentrasi yang terkecil yang masih bisa menghambat
pertumbuhan kuman (MIC).
Jika konsentrasi-konsentrasi yang mempunyai hambatan masing-masing digores
pada media padat eramkan 37°C selama 18 - 24 didapat MBC (minimal
Bacteriside Concentration).
B. Dilusi padat
a. Siapkan suspensi kuman seperti pada Dilusi cair.
b. Buat beberapa pengenceran antibiotika.
c. Lelehkan media padat. Dinginkan sampai temperatur kurang lebih 50-55°C. Ambil
90 ml media tambahkan 10 ml larutan pengenceran antibiotika, kocok. Tuangkan
ke petri steril ukuran 25 ml. Biarkan 3 - 5 menit sampai mengeras.
d. Ambil kapas lidi, celupkan pada suspensi kuman, tekan-tekan pada pinggir tabung,
supaya tidak menetes. Usapkan pada permukaan media Sampai merata.
e. Eramkan 37°C 18 - 24 jam.
f. Lihat pertumbuhan kuman

39
PERTANYAAN :
1. Dalam metode difusi agar, sebut dan jelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi hasil
pengukuran kadar antibiotik?
2. Sebut dan jelaskan metode lain untuk menetapkan kadar antibiotik?

TABEL PELARUT DAN PENGENCER ANTIBIOTIK

No. Antibiotika Pelarut Pengencer

1. Ampicillin Buffer fosfat pH 8,0 + Buffer fosfat pH

0,14 0,1 M

2. Carbanecillin Aqua Aquadestilata

3. Cephalotin Buffer fosfat 0,1 M pH Aquadestilata

6,0

4. Chloramphenicol Ethanol Aquadestilata

5. Clindamycin Aqua Aquadestilata

6. Cyloserine Aqua Aquadestilata

7. Erythromycin Ethanol Aquadestilata

8. Erthambutol Aqua Aquadestilata

9. Flucilosin Saline Saline 0,85% Aquadestilata

10. Gemtamycin Buffer Fosfat Buffer fosfat 0,1 M pH 8 Aquadestilata

11. Isonized Aqua Aqua Aquadestilata

12. Kanamycin Buffer fosfat 0,1 M pH Aquadestilata

8.0

13. Kanamycin NaOH 1 N Aquadestilata

14. Nilidixic Limethyl paramide Aquadestilata

15. Nitro furantion Aqua Aquadestilata

16. Oxacillin Aqua Aquadestilata

17. P. Amino Salisilat Aqua Aquadestilata

40
18. Penicillin Aqua Aquadestilata

19. Polymixyn Dimethyl sulfoxic Aquadestilata

20. Rifampin Aqua Aquadestilata

21. Streptomycin Aqua panas + sedikit Aquadestilata

NaOH 10%

22. Sulfon Amide Aqua Aquadestilata

23. Tetracyclin Aquadestilata

41
 PERCOBAAN 8
UJI KEPEKAAN KUMAN

A. Tujuan
Setelah menempuh praktikum ini, mahasiswa diharapkan:
a. Melakukan uji sensitivitas mikrobia terhadap antibiotik.
b. Menentukan mikrobia uji termasuk sensitif atau resisten terhadap antibiotik yang
diujikan.

B. Dasar Teori
Pada saat ini banyak sekali jenis antibiotik yang digunakan untuk mengobati
penyakit yang disebabkan oleh mikrobia patogen. Antibiotik yang digunakan dalam
medis bertujuan untuk mengeliminasi infeksi oleh mikrobia atau mencegah penyebaran
infeksi. Antibiotik harus mampu menghambat atau membunuh mikrobia penyebab
infeksi tetapi tidak toksis terhadap inangnya. Penentuan antibiotik yang cocok untuk
mengobati infeksi tertentu sangat penting dalam klinik. Sangat tidak baik menggunakan
antibiotik yang tidak efektif melawan mikrobia patogen.
Pemeriksaan ini bertujuan untuk mengetahui obat-obat yang paling cocok (paling
poten) untuk kuman penyebab penyakit terutama pada kasus-kasus penyakit kronis.
Selain itu, juga mengetahui adanya resistensi bakteri terhadap berbagai macam
antibiotik. Secara garis besar, suatu kuman akan resisten terhadap suatu antibiotik
disebabkan :
a. Memang kuman tersebut resisten terhadap antibiotika yang diberikan.
b. Akibat pemberian dosis dibawah dosis pengobatan.
c. Akibat penghentian obat sebelum kuman tersebut betul-betul terbunuh oleh antibiotik.
Pada pemerikasaan uji sensitivitas dapat dikerjakan dengan beberapa Cara :
1. Dilusi cair atau dilusi padat
Pada prinsipnya, antibiotik diencerkan hingga diperoleh beberapa konsentrasi. Pada
dilusi cair, masing-masing konsentrasi obat ditambah suspensi kuman dalam media.
Pada dilusi cair masing-masing konsentrasi obat ditambah suspensi kuman dalam
media. Pada dilusi padat, tiap konsentrasi obat dicampur dengan media agar, lalu
ditanami kuman.

42
2. Difusi
Media yang digunakan adalah agar Miller Hinton. Pada metode difusi ini ada
beberapa Cara yaitu : cara Kirby-Bauer, cara sumuran dan Cara pour plate.
A. Cara Kirby Bauer
1. Diambil beberapa koloni kuman dari pertumbuhan 24 jam, disuspensikan ke
dalam 0,5 ml BHI cair, diinkubasi 5 - 8 jam pada 370°C.
2. Suspensi tersebut ditambah akuades steril hingga kekeruhan tertentu sesuai
dengan standar) dengan konsentrasi kuman 108 CFU (colony fomine unit) per
ml.
3. Kapas lidi steril, dicelupkan ke dalam suspensi kuman tersebut, lalu ditekan-
tekan pada dinding tabung hingga kapasnya tidak terlalu basah, lalu dioleskan
pada permukaan media hingga rata.
4. Kemudian diletakkan kertas Samir (disk) yang mengandung antibiotik
diatasnya, diinkubasi pada 370°C selama 18 - 24 jam.
5. Amati dan ukur zone radikal atau ir-radikal.
B. Cara Sumuran
1. Diambil beberapa koloni kuman dari pertumbuhun 24 jam, disuspensikan ke
dalam 0,5 ml BHI cair, diinkubasi 5-8 jam pada 370°C.
2. Suspensi tersebut ditambah akuades steril hingga kekeruhan tertentu (sesuai
dengan standard) dengan konsentrasi kuman 108 CFU (Colony formine unit)
per ml.
3. Kapas lidi steril, dicelupkan ke dalam suspensi kuman tersebut, lalu ditekan-
tekan pada dinding tabung hingga kapasnya tidak terlalu basah, lalu dioleskan
pada permukaan media hingga rata.
4. Pada agar tersebut dibuat sumuran dengan garis tengah tertentu sesuai
kebutuhan. Ke dalam sumuran tersebut diteteskan antibiotika yang digunakan,
lalu diinkubasi pada 3700C selama l8-24 jam.
5. Amati dan ukur zone radikal atau ir-radikal.
C. Cara Pour Plate
1. Diambil beberapa koloni kuman dari pertumbuhan 24 jam, disuspensikan ke
dalam 0,5 ml BHI cair, diinkubasi 5-8 jam pada 370°C.

43
 2. Suspensi tersebut ditambah akuades steril hingga kekeruhan tertentu (sesuai
dengan standard) dengan konsentrasi kuman 108 CFU (colony formine unit) per
ml.
3. Dengan menggunakan ose khusus, diambil satu mata ose suspensi kuman dan
masukkan ke dalam 4 ml agar base l,5% yang suhunya 500°C (diambil dari
water bath).
4. Setelah larutan kuman tersebut dibuat homogen, tuanglah pada media Muller
Hinton agar.
5. Setelah agar membeku letakkan disk antibiotik. Inkubasikan selama 15 – 20 jam
pada 370°C.
6. lnterpretasikan hasilnya sesuai standar masing-masing.
Untuk masing-masing antibiotik dan jenis kumannya, mempunyai diameter yang
berbeda~beda untuk dinilai sebagai antibiotik yang sensitif (poten dalam terapi).
Diameter hambatan pertumbuhan mikrobia oleh antibiotik diukur dan
diinterpretasikan dengan antibiogram.
Zone Radical
Suatu daerah disekitar disk dimana sama sekali tidak ditemukan pertumbuhan
bakteri. Potensi antibiotik diukur dengan mengukur diameter zone radikal tersebut.
Suatu daerah disekitar disk dimana pertumbuhan bakteri dihambat oleh
antibiotiktersebut, tetapi tidak dimatikan. Disini akan terlihat adanya penumbuhan yang
kurangsubur/lebih jarang, dibandingkan dengan daerah di luar pengaruh antibiotik
tersebut.

C. Alat dan Bahan

Alat Bahan :
1. Petri l. Media nutrien agar
2. Penggaris 2. Kultur mikrobia uji
3. Erlenmeyer 3. Bermacam-macam antibiotik dan paper disk

D. Cara Kerja
1. Siapkan dan sterilisasi 25 ml media nutrien agar dalam erlenmeyer.
2. Setelah agak dingin campur dengan mikrobia uji, homogenkan.
3. Tuang dalam petri steril, tungggu sampai beku.
4. Pasang paper disk di atas permukaan agar.

44
 5. Tetesi dengan 10 ml larutan antibiotik.
6. Inkubasi 37°C selama 24 jam.
7. Ukur diameter hambatannya untuk masing-masing antibiotika dengan masing-masing
mikrobia uji. Antibiotik yang digunakan adalah gentamisin, streptomisin, dan
ampisilin.
8. Interpretasikan hasil dengan antibiogram (lihat label)

PER TANYAAN :
1. Apa pentingnya uji sensitivitas antibiotik da1am klinik?
2. Sebutkan 2 metode difusi dan jelaskan perbedaan masing-masing cara?
3. Jelaskan penyebab bakteri resisten terhadap antibiotik yang diberikan?
4. Sebutkan media yang digunakan pada metode difusi?

Tabel Interpretasi Zone Diameter Standard dan Korelasinya dengan MIC

Korelasi dengan
Zone diameter (mm)
MIC
Antibiotik Isi disk Resisten Sensitif Sensitif
Interme Sensitif
(kurang/ (lebih/ (kurang
diate (lebih)
sama) sama) dari)

1. Ampicilin 10 µgr 11 12-13 14 32 8

Kuman perut dan
11 12-13 14 32 8
entercococus

Staphyloccoccus 20 21-28 20 2 0,2

Hemophylus 19 - 29 - 2,0
2. Cabenillin 50 µgr
Proteus 17 18-22 23 32 16
Pseudomonas 12 13-14 15 250 125
3. Cephalotin 30 µgr 14 15-17 18 32 10
4. Chloramphenicol 30 µgr 11 13-17 18 25 12,5
5. Clidamycin 2 µgr 14 15-16 17 2 1
6. Erythromycin 15 µgr 13 14-17 18 25 6
7. Gentamycin 10 µgr 11 13 6 6

45
8. Kanamycin 30 µgr 13 14-17 18 25 6
9. Methicilin 5 µgr
Staphyloccoccus 9 10-13 14 - 3
10. Neomycin 30 µgr 12 13-16 17 - 10
11. Penicillin G 10 µgr
Staphyloccoccus 20 21-28 29 - 0,11
Kuman lain 11 12-2 22 32 1,5
12. Plimixin B 300 µgr 8 9-11 12 - 50
13. Streptomycin 10 µgr 11 12-14 15 15 6
14. Tetracyclin 30 µgr 14 15-18 19 12 4
15. Vancomycin 30 µgr 9 10-11 11 - 5
16. Sulfa 150-300 35 mg/ 10 mg/
12 13-16 17
µgr 100 ml 100 ml
17. Citromoxazole 25 µgr 10 11-15 16 200 35
18. Nitrofurantioin 300 µgr 14 13-18 19 100 25
19. Nalidixic acid 30 µgr 13 13-18 19 32 12

46
 PRAKTIKUM 9
PEMERIKSAAN JAMUR

A. Tujuan
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat melakukan
pemeriksaan terhadap jamur.

B. Dasar Teori
Pada mikologi kedokteran ada 3 (tiga) tipe penyakit jamur (mikosis), antara lain :
1. Mikosis superfasial = menyerang lapisan korneum dari kulit, kuku dan rambut.
Penyebab dari mikosis superfasial dapat dibagi :
a. Jamur golongan dermatophyta terbagi menjadi 3 genus :
- Trichophyton (menyerang kulit, kuku, dan rambut).
- Microsporum (menyerang rambut dan kulit).
- Epidermophyton (menyerang kuku dan kulit).
Menyebabkan penyakit yang dikenal dengan dermatophytosis (kurap atau kadas atau
ringworm atau tinea).
b. Jamur golongan non dermatophyta
- Piedra (rambut) disebabkan oleh Piedra hortai.
- Tinea versicolor (panu) disebabkan oleh Malassezia furfur.
2. Mycosis subcutis
Penyakit ini menyerang kulit, selaput lendir, dan jaringan di bawah kulit (subcutis),
jarang menyebar ke viscera.
a. Phycommycosis subcutis disebabkan oleh Basidiobolus ranarum dan B.
Meristophorus.
b. Mycetoma disebabkan jamur Schizomycophyta dan Eumycophyta.
c. Sporotrichosis oleh Sporotrichum schenkii.
d. Chromonycosis oleh jamur Dematiaceae.
e. Rhinosporidiosis oleh jamur Rhinosporidium.
3. Mycosis profunda/sistemik
a. Actinornycosis oleh Actinomycetes
b. Nocardiosis oleh jamur Nocardia
c. Candidiasis oleh jamur Candida
d. Aspergillosis oieh jamur Aspergillus

47
 e. Cryptococcosis oleh jamur Cryptococcus
f. Histoplasmosis oleh jamur Histoplasma
g. Blastomyosis oleh jamur Blaslomyces
h. Coccidiodomycosisoleh jamur Coccidioides

C. Alat dan Bahan

Bahan yang diperiksa, tergantung dari tipe penyakitnya.
1. Mycosis superfisialis = kerokan pada kulit, kuku, dan rambut.
2. Mycosis subcutis =
a. Pus dan bahan aspirasi pada mycetoma
b. Biopsi pada mycetoma dan phycomycosis
3. Mycosis profunda =
a. Feses, rectal swab. oral swab pada penyakit candidiasis dan gastroenteritis.
b. Sputum, bronchial washing, biopsi dan bahan hasil operasi pada penyakit
aspergillosis, histoplasmosis, nocardiasis, dan candidiasis.
c. Vaginal swab pada candidiasis vaginae.
d. Liquor cerebrospinal untuk meningitis (Criptoccocosis).

D. Cara Kerja
1. Pemeriksaan Mikroskopik
a. Preparat natief (tanpa pengecatan)
Dengan menggunakan larutan garam fisiologis atau KQH 10-20%
b. Dengan pengecatan
1) Sederhana
Lactophenol (LP) = coklat muda
Lactophenol catton blue (LPCB) = biru
2) Differential
Gram : semua jamur akan tercat gram positif.
ZN : Jamur tercat ZN negatif kecuali Nocardia sp.
Gomorimethanamm Silver Nitrat (GSM) : jamur berwarna merah, kontras
berwarna hijau.
Periodic Acid Shift (PAS) : jamur berwarna merah, kontras berwarna
kuning/hijau muda.
Modifikasi Brown Brenn :jamur berwarna coklat, kontras kuning.

48
 3) Special
Tinta cina : kapsula mengkilat dasar hitam.
Mucicarmine : kapsula merah
4) Lain-lain
HE dan Giemsa untuk pemeriksaan jaringan
2. Cara pembuatan preparat dan pengccatan
a. Cara membuat kerokan kulit
1) Bersihkan kulit dengan alkohol 70%.
2) Kerok dengan skapel bagian tepi datri lesi yang paling aktif dan tertutup oleh
squama.
3) Hasil kerokan diletakkan dipetri.
4) Letakkan setetes larutan KOH 10% pada objek glass.
5) Basahkan ujung ose pada larutan tersebut kemudian kenakan pada kerokan
kulit.
6) Ambil beberapa squama, letakkan pada larutan KOH, tutuplah dengan dek
glass.
7) Tunggulah di bawah mikroskop dengan kondensor rendah, mula-mula dengan
perbesaran 10x10, untuk mencari bagian kulit yang diperiksa, kemudian dengan
perbesaran 10x45 dan bila perlu dengan perbesaran 10x100 (dengan minyak
emerisi).
Catatan :
Untuk anak kecil di mana seperti di atas lebih sulit dikerjakan, maka dapat
dilakukan dengan cara CELOPHAN TAPE. .
Caranya : kulit yang dicurigai dibersihkan dengan alkohol 70%. Ambil celophan tape
yang paling tipis dan tidak berwarna, tempelkan pada kulit tersebut.
Letakkan di atas objek glass dan teteaskan KOH 10%. Tutup dek glass dan
periksa di bawah mikroskop.
b. Cara membuat sediaan rambut
Seperti diketahui infeksi jamur pada rambut dikenal ada 2 type, yaitu :
1. Type Ectotric
Disini rambut patah di bagian atas dan jamur tampak sebagai spora/hypa taruna
di bagian luar rambut.
Penyebabnya : Microposprum canis, M. hypseum, M. audoini, M. violaceum,
Trichophyton ferruginum, t. rabrum.

49
2. Type Endotrix
Rambut patah pada kulit dan rambut jambur tampak sebagai hypha/spora di
dalam jamur.
Penyebabnya : Trichopyton rosaseum, T Shcoenleini, T Tonsurans, T.
violaseum.
Type 1 lebih sering, diketemukan dari pada type 2 untuk infeksi jamur
pada rambut kepala dengan Piedra hitam pada pemeriksaan makroskopik
tampak sebagai benjolan hitam, keras dan tidak dapat dilepaskan pada rambut.
Pada pemeriksaan makroskopik akan tampak anyaman hype yang padat dengan
ascus diantaranya.
Cara pembuatan preparat : rambut yang dicurigai diambil dan dipotong-
potong kemudian diberi KOH 10% dan diperiksa seperti pada pemeriksaan
kulit.

50
 PERCOBAAN 10
PEMERIKSAAN ANGKA KUMAN

A. Tujuan
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat menentukan jumlah
kuman per ml bahan cair atau per gram bahan padat.

B. Dasar Teori
Dalam pemeriksaan ini perlu diperhatikan bahwa pada waktu pengambilan bahan perlu
dihindari terjadinya kontaminasi dari container, kulit atau organ lain penderita. Harus
dilakukan pemeriksaan secepat mungkin agar jumlah kuman tidak bertambah urine. Cara
pengambilan specimen urine :
Spesimen urine diambil dengan metode mid stream voiled urine. Pancaran urine dapat dibagi
menjadi 3 bagian :
1) 1/3 bagian adalah urine yang pertama keluar meruakan pendorong atau pembersih
kuman yang ada di uretra bagian ini tidak diambil.
2) 1/3 bagian berikutnya ditampung dalam container steril
3) 1/3 bagian adalah urine akhir, dibuang

C. Alat dan Bahan

Alat :
Tabung reaksi dan rak Cawan petri
Ose Beaker Glass
Labu Takar
Ose

D. Cara Kerja
1. Urine diambil seperti cara tersebut di atas dan segera diperiksa.
2. Dilakukan seri pengenceran : 1/1; 1/10; 1/100; 1/1000 bila perlu sampai 1/10000
3. Penanaman dan perhitungan angka dapat dilakukan dengan cara :
a. Pada petri yang berisi medium agar darah (untuk gram positif) / Mac.Conkey
(untuk gram negative) dituang 1 ml urine.
b. Urine diratakan di permukaan agar

51
 c. Petri diletakkan dalam posisi miring, sisa urine dipepet dan dibuang (diperkirakan
urine yang melekat pada permukaan 1/10 x 1 = 0,1 ml)
d. Diinkubasi 37oC selama 24 jam.
e. Diulangi untuk seri pengenceran.
f. Cara perhitungan kuman :
i. Untuk urine asli : µ X 10 X 1 = ….. cfu/ml urine
ii. Untuk pengenceran : 1/10 : µ x 10 x 10 x 1 = ………. Cfu/ ml urine
iii. Untuk pengenceran 1/100 : µ x 10 x 10 x 10 x 1 = ……….. cfu/ ml urine
Pedoman penilaian hasil kultur angka kuman :

Jumlah kuman/
Penilaian
ml urine

0 Koloni kuman tidak tumbuh

Kemungkinan terjadi kontaminasi oleh kuman yang terdapat di

100-103
kulit, atau vagina

Kemungkinan karena kontaminasi atau terlambat dalam

103-105
mengerjakan pemeriksaan laboratorik

105 Telah terjadi infeksi.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 1994. Farmakope Indonesia, edisi 4, Departeman Kesehatan RI, Jakarta

Anonim. 1993, Dasar-dasar Pemeriksaan Mikrobiologi.
Djide, N. 2003. Mikrobiologi Farmasi, Jurusan farmasi F-MIPA UNHAS.
Drs. Saldanis Ismail DHSM, M.Pd.2013,Mikrobiologi-Parasitologi,Kemenkes RI
Dr. Padoli, S.Kp., M.Kes, 2013, Pengantar Mikrobiologi, BPPSDM Kemenkes RI

52
LAMPIRAN
JADWAL PRAKTIKUM

Minggu ke- Materi Praktikum

Shift 1 Shift 2
1 Pembagian kelompok
Aturan, topik dan tugas praktikum
Penggunaan alat selama praktikum
Pengenalan alat-alat praktikum

2 Percobaan 1 Pretest Perc. 1 & 2

3 Pretest Perc. 2 &3 Percobaan 1 & 2
4 Percobaan 2 &3 Pretest Perc. 3
5 Pretest Perc. 4 Percobaan 3
6 Percobaan 4 Pretest Perc. 4 & 5
7 Pretest Perc. 5 & 6 Percobaan 4 & 5
8 Percobaan 5 &6 Pretest Perc. 6 & 7
9 Pretest Perc. 7 &8 Percobaan 6 & 7
10 Percobaan 7 &8 Pretest Perc. 8 & 9
11 Pretest Perc. 9 & 10 Percobaan 8 & 9
12 Percobaan 9 & 10 Pretest Perc. 9 & 10
13 Pretest Perc. 11 Percobaan 9 & 10
14 Percobaan 11 Pretest Perc. 11
15 - Percobaan 11
16 Presentasi Hasil Praktikum
17 Ujian Akhir Semester

53
 FORMAT LAPORAN TERTULIS

1. Judul Praktikum (Percobaan ke....)

2. Tujuan Praktikun

3. Tinjauan Pustaka (maksimal 2 halaman)

4. Alat dan bahan

5. Cara Kerja (Menggunakan Flow chart)

6. Hasil Percobaan

7. Pembahasan

8. Kesimpulan

9. Daftar Pustaka (minimal 3)

Laporan mengacu pada contoh format laporan di atas. Dibuat pada kertas HVS A4 yang
ditulis dengan tulisan yang rapi dan jelas.
Format laporan sementara sama dengan format laporan tertulis (hanya no. 1-5 dan 9). Ditulis
pada kertas HVS A4 dan dibawa sebagai persyaratan masuk praktikum, dan harus lulus
pretes sebelum praktikum.
Laporan Percobaan adalah lanjutan dari laporan sementara dengan tambahan pembahasan
dan kesimpulan. Dikumpulkan pada praktikum minggu selanjutnya..

54