Buku Petunjuk Praktikum Mikrobioogi Genap 2022-2023

Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2023
Laboratorium Mikrobiologi Farmasi

Fakultas Farmasi
Universitas Muhammadiyah Surakarta
MODUL PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
Ratna Yuliani, M.Biotech.St
apt. Maryati, Ph.D.
apt. Peni Indrayudha, Ph.D
Dr. apt. Rima Munawaroh, M.Sc
apt. Cita Hanif Muflihah, M.Sc.
2023
Gambar sampul diperoleh dari:

https://www.microbiologyinpictures.com/staphylococcus%20aureus.html
https://www.microbiologyinpictures.com/bacterial%20colonies.html
MODUL PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
Ratna Yuliani, M.Biotech.St
apt. Maryati, Ph.D.
apt. Peni Indrayudha, Ph.D.
Dr. apt. Rima Munawaroh
apt. Cita Hanif Muflihah, M.Sc.
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA
2023
i
KATA PENGANTAR
Syukur alhamdulillah kepada Allah SWT akhirnya modul

Praktikum Mikrobiologi Farmasi ini dapat tersusun dengan baik. Modul
ini merupakan pedoman bagi mahasiswa semester III Fakultas Farmasi
Universitas Muhammadiyah Surakarta dalam melaksanakan
praktikum.
Praktikum Mikrobiologi Farmasi merupakan bagian dari mata
kuliah Mikrobiologi Farmasi yang diselenggarakan agar mahasiswa
lebih memahami dan mampu melakukan beberapa uji yang berkaitan
dengan mikrobiologi farmasi. Capaian pembelajaran praktikum ini
adalah mahasiswa mampu menganalisis hasil uji aktivitas antibakteri
dan uji air minum, menentukan fase-fase pertumbuhan bakteri,
menganalisis hasil skrining primer untuk memperoleh mikroorganisme
penghasil antibiotik, dan menentukan kelayakan sediaan herbal untuk
dikonsumsi.
Semoga modul praktikum ini dapat berguna bagi perkembangan
pengetahuan mahasiswa dalam menekuni ilmu farmasi. Akhinya guna
penyempurnaan buku ini, kami secara terbuka menerima saran dan
kritik. Semoga buku ini bermanfaat.
Surakarta, Agustus 2023
Penyusun
ii
TATA TERTIB PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI
1. Praktikan harus datang 5 menit sebelum praktikum dimulai,

terlambat lebih dari 10 menit dengan alasan apapun tidak diijinkan
mengikuti praktikum dan harus mengganti pada hari lain.
2. Praktikan masuk ruangan praktikum tanpa menunggu perintah dari
asisten maupun dosen.
3. Sebelum praktikum dimulai, praktikan diwajibkan:
a. Mempersiapkan dasar teori, alat dan bahan yang akan
dipraktikumkan (ditulis dalam laporan sementara).
b. Mengikuti pretest tiap satuan acara praktikum. Tidak ada pretest
ulang bagi mahasiswa yang bernilai rendah.
c. Mengumpulkan laporan resmi praktikum sebelumnya.
4. Selama praktikum:
a. Praktikan dilarang berpakaian yang melanggar batas kesopanan
dan kesusilaan. Praktikan tidak diperkenankan berpakaian ketat,
mengenakan kaos tanpa krah, bersandal (termasuk selop).
Sanksi pelanggaran tata tertib ini berupa skorsing dikeluarkan
ruang praktikum.
b. Setiap praktikan wajib membawa masker, lap bersih, dan sarung
tangan karet.
5. Setelah selesai praktikum:
a. Hasil praktikum harus disahkan oleh asisten atau dosen jaga
sambil menunjukkan hasil percobaan.
b. Meja dan kursi lab harus dirapikan dan dibersihkan. Reagen dan
peralatan serta bahan yang diambil harus dikembalikan ke
tempat semula dalam keadaan rapi.
iii
c. Praktikan yang merusakkan atau memecahkan alat praktikum

wajib mengganti dengan alat yang spesifikasinya sama sebelum
praktikum berikutnya.
6. Jika praktikan tidak hadir lebih dari 25% dari acara praktikum saja
atau dari keseluruhan praktikum, maka praktikan tersebut
dinyatakan tidak lulus praktikum Mikrobiologi Farmasi dan harus
mengulang pada tahun berikutnya.
7. Ijin ketidakhadiran hanya berlaku jika sakit (disertai surat
keterangan dari dokter), keluarga dekat (bapak, ibu, adik, atau
kakak) ada yang meninggal, dan sebab keadaan darurat yang
berkaitan dengan jiwa dan praktikan harus mengganti praktikum
pada hari lain.
8. Penggantian hari karena alasan terlambat atau ijin dilaksanakan
dengan mekanisme memo sesuai dengan peraturan yang berlaku di
Laboratorium Biologi Farmasi.
9. Praktikan harus aktif dan berinisiatif sendiri mencari pengumuman
yang berkaitan dengan praktikum Mikrobiologi Farmasi (jadwal,
pembagian kelompok, korektor, dll). Kesalahan menerima
informasi menjadi tanggung jawab mahasiswa.
10. Kesalahan penulisan pada laporan tidak boleh dihapus/di-tip-ex
tetapi dicoret lalu revisi dituliskan dan diberi paraf yang dicoret.
iv
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR .............................................................................................................2
TATA TERTIB PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI ........................................................3
DAFTAR ISI .........................................................................................................................5
MODUL 1 ...........................................................................................................................1
STERILISASI.........................................................................................................................1
MODUL 2 .........................................................................................................................10
STREAKING MICROBIAL CULTURES ON AGAR PLATES ..................................................10
MODUL 3 .........................................................................................................................14
IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA MIKROSKOPIK ................................................................14
MODUL 4 .........................................................................................................................26
IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA MAKROSKOPIK ...............................................................26
MODUL 5 .........................................................................................................................36
IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA BIOKIMIAWI .................................................................36
MODUL 6 ........................................................................................................................45
SKRINING PRIMER UNTUK MEMPEROLEH MIKROBA PENGHASIL ANTIBIOTIK ..........45
MODUL 7 .........................................................................................................................49
UJI SENSITIVITAS BAKTERI TERHADAP ANTIBIOTIK .......................................................49
MODUL 8 .........................................................................................................................55
PEMERIKSAAN POTENSI ANTIBIOTIK ...............................................................................55
MODUL 9 .........................................................................................................................60
PENETAPAN ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) EKSTRAK .................................................60
MODUL 10 .......................................................................................................................63
PEMERIKSAAN AIR MINUM SECARA BAKTERIOLOGIK ..................................................63
MODUL 11 .......................................................................................................................72
UJI ANTIBAKTERI DENGAN METODE DIFUSI SUMURAN DAN BIOAUTOGRAFI ..........72
MODUL 12 KINETIKA PERTUMBUHAN ...........................................................................77
MODUL 13 .......................................................................................................................85
UJI AKTIVITAS ANTIVIRAL.................................................................................................85
DAFTAR PUSTAKA ...........................................................................................................90
v
MODUL 1
STERILISASI
I. CAPAIAN PEMBELAJARAN
Mahasiswa diharapkan mampu memahami metode sterilisasi dan
melakukan sterilisasi terhadap alat-alat dan bahan-bahan yang
digunakan dalam praktikum.
II. DASAR TEORI

Hampir semua tindakan yang dilakukan dalam diagnosis
mikrobiologi, sterilisasi sangat diutamakan baik alat-alat yang dipakai
maupun medianya. Bila pada penanaman spesimen dalam media, petri,
ose, maupun media yang digunakan tidak steril, maka sangat tidak
mungkin untuk membedakan apakah kuman yang berhasil diisolasi
tersebut berasal dari penderita atau merupakan hasil kontaminasi dari
alat-alat atau media yang digunakan.
Suatu alat atau bahan dikatakan steril bila alat/bahan tersebut
bebas dari mikroba baik dalam bentuk vegetatif maupun spora. Tindakan
untuk membebaskan alat atau media dari jasad renik disebut STERILISASI.
Ada beberapa cara sterilisasi, dan pemilihannya tergantung dari bahan
atau alat yang akan disterilkan. Secara garis besar sterilisasi ada beberapa
cara, yaitu:
A. Pemanasan; tujuannya adalah merusak atau membunuh mikroba.
1. Pemanasan kering, yaitu dengan cara membakar atau menggunakan
udara panas (oven).
2. Pemanasan basah, dapat dikerjakan dengan merebus, uap air panas,
uap air panas dengan tekanan, dan pasteurisasi.
B. Filtrasi; tujuannya untuk membebaskan media yang tidak tahan
pemanasan dari mikroba.
C. Penyinaran dengan menggunakan sinar gelombang pendek (radiasi).
D. Sterilisasi Kimia
A. Pemanasan
Ada beberapa metode sterilisasi menggunakan panas yang dapat
digunakan dalam mikrobiologi (Tabel 1).
1
1. Pemanasan Kering
a. Pembakaran
Cara ini dapat digunakan untuk sterilisasi alat-alat yang berupa:
▪ Logam : ose, pinset dan lain-lain.
▪ Gelas : ujung pipet, bibir tabung, mulut erlemeyer dan lain-lain
pada penuangan media.
Alat yang digunakan adalah: lampu spiritus / bunsen.
Sterilisasi ose dapat dilakukan dengan membakar ose tersebut pada nyala
api lampu spiritus atau bunsen dengan cara: pemanasan dimulai dari
pangkal kawat dan setelah terlihat merah berpijar pemanasan dilanjutkan
sampai ke ujung ose dengan menggeser perlahan-lahan. Hal ini dilakukan
untuk menghindari terlontarnya sisa mikroba pada mata ose akibat
pemanasan langsung dan terlalu cepat.
b. Pemanasan dengan menggunakan udara panas.
Metode pemanasan dengan udara panas digunakan untuk
mensterilkan alat-alat gelas, termasuk: petri, tabung reaksi, botol dan
pipet. Selain itu juga dapat untuk sterilisasi bahan: minyak, serbuk
(misalnya: talk). Pada umumnya sterilisasi alat-alat tersebut dikerjakan
dengan pemanasan 175oC selama 90 – 120 menit.
2. Pemanasan Basah
a. Dengan cara merebus
Pemanasan basah digunakan untuk mensterilkan alat-alat berupa:
gunting, pinset, skalpel. Sterilisasi dilakukan dengan cara mendidihkan
alat selama 30 – 60 menit.
b. Dengan uap air panas
Metode ini digunakan terutama untuk mensterilkan media yang dapat
rusak bila disterilkan dengan uap air panas bertekanan (menggunakan
autoklaf). Sterilisasi ini dikerjakan dengan pemanasan 100o C selama 60
menit. Pada cara sterilisasi ini spora tidak mati. Untuk media yang tidak
tahan panas (Loewenstein, urea broth) dikerjakan dengan sterilisasi
bertingkat atau filtrasi. Alat yang digunakan adalah autoklaf dengan
tekanan di dalamnya tetap 1 atmosfir (klep pengatur tekanan tetap
terbuka).
2
c. Dengan uap air bertekanan (autoklaf)

Metode ini digunakan untuk sterilisasi media yang tahan terhadap
pemanasan tinggi. Sterilisasi dikerjakan dengan autoklaf pada suhu 120C
selama 10–20 menit.
Hal-hal yang perlu diperhatikan pada penggunaan autoklaf adalah:
▪ Harus ditunggu selama bekerja
▪ Hati-hati bila mengurangi tekanan dalam autoklaf.
Sterilisasi basah lebih cepat bila dibandingkan dengan sterilisasi kering
karena pada sterilisasi basah terjadi proses koagulasi protein, sedangkan
pada sterilisasi kering terjadi oksidasi protein.
d. Pasteurisasi
Pasterisasi digunakan untuk mensterilkan susu, yaitu dengan
pemanasan pada suhu 61,7o C selama 30 menit.
B. Filtrasi
Cara sterilisasi ini dipakai untuk sterilisasi media yang tidak tahan
pemanasan, misalnya urea broth, juga untuk sterilisasi vaksin, enzim,
vitamin dan antibiotika. Kelemahan cara ini adalah: hasil filtrasi tidak
bebas dari virus.
C. Penyinaran (Radiasi)
Jenis radiasi yang dapat digunakan untuk sterilisasi misalnya: sinar ultra
violet (UV), sinar gamma, sinar X dan sinar katoda (elektron berkecepatan
tinggi). Sinar UV mempunyai panjang gelombang 15–390 nm, dan yang
paling tinggi daya bakterisidnya adalah UV dengan panjang gelombang
265 nm.
Sinar UV dapat digunakan untuk sterilisasi ruang (kamar operasi, ruang
aseptis), barang dari plastik. Sinar X mempunyai daya penetrasi lebih
besar dibandingkan sinar UV. Sinar gamma mempunyai daya penetrasi
lebih kuat dibanding sinar X dan digunakan untuk sterilisasi barang-barang
yang tebal, misalnya alat-alat kedokteran yang terbungkus atau kemasan
makanan. Sinar katoda juga digunakan untuk sterilisasi barang-barang
yang sudah terbungkus.
3
D. Sterilisasi Kimia.
Antiseptik (Tabel 2) adalah bahan/zat yang dapat mencegah
pertumbuhan dan aktivitas mikroba dan biasanya digunakan untuk tubuh
(yang berhubungan dengan jaringan hidup). Prosesnya disebut antiseptis.
Desinfektan (Tabel 3) adalah bahan kimia yang dapat membunuh sel
vegetatif mikroba pada obyek yang tidak hidup, karena dapat merusak
jaringan. Prosesnya disebut desinfeksi.
Biosidal adalah suatu zat yang aksinya dipakai untuk membunuh
mikroorganisme, misal: bakterisid, virosid, sporosid.
Biostatik adalah zat yang aksinya untuk mencegah/menghambat
pertumbuhan organisme, misal: bakteriostatik, fungistatik.
Tabel 1. Common Uses of Heat to Control Bacteria

Treatment Temperature Effectiveness
Incineration >500C Vaporizes organic material on

nonflammable surfaces but may
destroy many substances in the
process.
Boiling 100C Thirty minutes of boiling kills

vegetative forms of bacteria but
may not kill bacterial endospores.
There are also toxins that are not
inactivated at 100C.
Intermittent 100C Three 30-minute intervals of

boiling boiling, followed by periods of
cooling kills bacterial endospores.
Autoclave and 121C for 15 Kills all forms of life including

pressure cooker minutes at 15 bacterial endospores. The
(steam under p.s.i. substance being sterilized must
pressure) be maintained at the effective
temperature for the entire time.
Dry heat (hot air 160C for 2 Used for materials that must
oven) hours remain dry. Good for glassware,
4
metal, but not most plastic or

rubber items.
Dry heat (hot air 170C for 1 Same as above. Note that
oven) hour increasing the temperature by 10
C shortens the sterilizing time by
50 %.
Pasteurization 63-66C for Kills most vegetative bacterial

(batch method) 30 minutes cells, including pathogens such as
streptococci, staphylococci and
Mycobacterium tuberculosis.
Pasteurization 72C for 15 Effect on bacterial cells is similar

(flash method) seconds to batch method. For milk, this
method has fewer undesirable
effects on quality or taste.
Tabel 2. Antiseptics and their actions
Chemical Action Uses
Ethanol (50-70%) Denatures proteins and Antiseptic used on skin

solubilizes lipids
Isopropanol (50- Denatures proteins and Antiseptic used on skin

70%) solubilizes lipids
Tincture of iodine Inactivates proteins Antiseptic used on skin

(2% I in 70% alcohol)
Silver nitrate Precipitates proteins General antiseptic and

(AgNO3) formally used in the
eyes of newborns.
Erythromycin drops (an
5
antibiotic) are now

used
Detergents (e.g. Disrupts cell membranes Skin antiseptics

quaternary
ammonium
compounds)
Phenolic Denature proteins and Antiseptics at low

compounds (e.g. disrupt cell membranes concentrations
carboloic acid, lysol,
hexylresorcinol,
hexachlorophene)
Beberapa bahan kimia yang bersifat antimikroba adalah :

1. Fenol dan derivatnya.
Fenol dan derivatnya bekerja dengan cara mempresipitasikan protein
secara aktif atau merusak selaput sel dengan penurunan tegangan
permukaan. Cepat bekerja sebagai desinfektan atau antiseptik,
tergantung pada konsentrasinya. Daya antimikroba fenol akan
berkurang pada suasana alkalis, suhu rendah, dan adanya sabun.
2. Alkohol.
Etanol 50 – 70 % mempunyai daya bakterisid untuk bentuk vegetatif,
sedangkan metanol daya bakterisidnya lebih rendah dibanding etanol
dan bersifat toksik terhadap mata. Alkohol beraksi dengan
mendenaturasi protein dengan jalan dehidrasi dan melarutkan lemak
sehingga membran sel rusak dan enzim-enzim akan diinaktifkan oleh
alkohol.
3. Halogen beserta gugusannya, misalnya:
▪ Iodin dipakai sebagai antiseptik pada kulit sebelum pembedahan.
▪ Hipoklorit (dalam bentuk garam Na/Ca) digunakan untuk sanitasi
alat-alat rumah tangga, yang umum dipakai adalah kalsium
hipoklorit dan sodium hipoklorit.
Halogen beserta gugusannya ini mematikan mikroorganisme dengan
cara mengoksidasi protein sehingga merusak membran dan
menginaktifkan enzim-enzim.
6
4. Logam berat dan gugusannya

Logam berat dapat mempresipitasikan enzim-enzim atau protein
esensial lain dalam sel sehingga dapat berfungsi sebagai antimikroba.
Contohnya :
Merkurokrom, metiolat sebagai antiseptik.
Perak nitrat digunakan sebagai tetes mata untuk mencegah infeksi
mata karena gonococcus pada bayi baru lahir.
5. Detergen
Detergen dengan gugus lipofilik dan hidrofilik akan merusak membran
sitoplasma.
6. Golongan aldehid
Aldehid mendesinfeksi dengan cara mendenaturasi protein, misalnya
formalin.
7. Senyawa kimia berupa gas (etilen oksid) atau gas sterilisator
Sterilisasi gas digunakan untuk bahan atau alat yang tidak dapat
disterilkan dengan pemanasan tinggi atau dengan zat kimia cair dan
dilakukan pada suhu kamar. Etilen oksida mempunyai daya penetrasi
dan sterilisasi yang besar, tetapi kelemahannya adalah bersifat toksik
dan mudah meledak.
Tabel 3. Disinfectants and their action
Chemical Action Uses
Formaldehyde (8%) Reacts with NH2, SH Disinfectant, kills

and COOH groups endospores
Chlorine (Cl2) gas Forms hypochlorous Disinfect drinking

acid (HClO), a strong water; general
oxidizing agent disinfectant
Mercuric chloride Inactivates proteins by Disinfectant,

reacting with sulfide although
groups occasionally used as
an antiseptic on skin
7
Detergents (e.g. Disrupts cell At higher

quaternary membranes concentrations and
ammonium with some
compounds) compounds is a
disinfectant
Phenolic compounds Denature proteins and Disinfectants at high

(e.g. carbolic acid, disrupt cell concentrations
lysol, hexylresorcinol, membranes
hexachlorophene)
Ethylene oxide gas Alkylating agent Disinfectant used to

sterilize heat-
sensitive objects
such as rubber and
plastics
III. ALAT DAN BAHAN

a. Alat
1. Cawan Petri
2. Tabung reaksi
3. Oven
4. Autoklaf
b. Bahan
1. Kapas
2. Aluminium foil
3. Media MacConkey
IV. CARA KERJA

1. Cawan Petri dibungkus dengan kertas lalu disterilkan
menggunakan oven selama 1 jam pada suhu 170C.
2. Beberapa tabung reaksi disumbat dengan kapas lalu dibungkus
dengan kertas selanjutnya disterilkan menggunakan oven
(Gambar 1) selama 1 jam pada suhu 170C.
8
3. Media MacConkey ditimbang lalu dimasukkan ke dalam labu

Erlemeyer. Media dilarutkan dalam akuades dengan bantuan
pemanasan. Labu Erlenmeyer ditutup aluminium foil lalu media
disterilkan menggunakan autoklaf selama 20 menit pada suhu
121C.
Oven Autoklaf
Gambar 1.
9
MODUL 2
STREAKING MICROBIAL CULTURES ON AGAR PLATES
Mahasiswa mampu melakukan streak plate untuk mendapatkan
koloni bakteri tunggal.
II. DASAR TEORI

Agar sreak plates are an essential tool in microbiology. They allow
bacteria and fungi to grow on a semi-solid surface to produce discrete
colonies. These colonies can be used to help identify the organism, purify
the strain free of contaminants, and produce a pure genetic clone.
In order to obtain well-isolated discrete colonies, the quadrant streak
technique should be used. This allows sequential dilution of the original
microbial material (broth culture or colonies on a plate or slant) over the
entire surface of a fresh plate. As the original sample is diluted by
streaking it over successive quadrants, the number of organisms
decreases. Usually by the third or fourth quadrant only a few organisms
are transferred on the inoculating loop and these produce a few isolated
colonies.
The quadrant streak technique is described below. Study the diagram
and read the “Tips” below the diagram (Gambar 2) before you begin the
streak plate.
1. Flame the inoculating loop until it is red hot and then allow it to cool.
2. Remove a small amount of bacterial growth (either a loopful from a
broth culture or a single colony from a plate or slant) with the sterile
inoculating loop.
3. Immediately streak the inoculating loop very gently over a quarter of
the plate using a back and forth motion (see area 1 in the figure
below).
4. Flame the loop again and allow it to cool. Going back to the edge of
area 1 that you just streaked, extend the streaks into the second
quarter of the plate (area 2).
10
area that you just streaked (area 2), extend the streaks into the third
quarter of the plate (area 3).
area that you just streaked (area 3), extend the streaks into the center
fourth of the plate (area 4) by making a series of zig-zag lines away
from the edge of area 3 into area 4.
Quadrant Streak
Gambar 2. Pola goresan metode streak plate
Inoculation of a streak plate:

Area 1: Area of initial inoculation and first streaks yields heavy growth.
Area 2: Area of second streaks from area 1 yields less dense growth.
Area 3: Area of third streaks from area 2 yields weak growth.
Area 4: Area of fourth streaks from area 3 yields single colonies.
Tips:
▪ Use the entire surface of the plate, not just the middle of the plate.
▪ Streak only one loopful of a broth culture.
▪ Remove only one colony or a barely visible number of cells from a plate
or slant.
▪ Flame the loop after you streak each quadrant.
▪ Streak lightly so that you do not gouge the agar.
▪ Cool the loop after flaming by gently touching the edge of the agar
where you have not streaked.
11
▪ Examine the plate carefully after colonies have grown. All colonies
should have the same general appearance. If there is more than one
type of colony, each type should be streaked again on a separate plate.
You will have to determine which colony is the strain of interest.
(Thiel, 1999)
III. ALAT DAN BAHAN

a. Alat
1. Jarum ose bulat
2. Lampu spiritus
b. Bahan
1. Kultur bakteri
2. Media MacConkey padat
3. Etanol 70%
IV. CARA KERJA

1. Semprot area kerja dengan etanol 70% lalu lap sampai kering.
2. Panaskan pinggiran cawan Petri menggunakan api dari lampu
spiritus.
3. Panaskan jarum ose bulat dari pangkal ke ujung sampai panas
dan merah lalu dinginkan.
4. Ambil 1 ose kultur bakteri, buka tutup cawan Petri sehingga
sedikit terbuka lalu goreskan ose pada media MacConkey
(disebut goresan 1). Lihat Gambar 3!
6. Goreskan jarum ose dengan menyentuh goresan 1 (disebut
goresan 2).
goresan 3).
goresan 4).
12
11. Panaskan pinggiran cawan Petri menggunakan api dari lampu
spiritus
12. Beri label nama spesies bakteri, kelas, kelompok, dan tanggal
praktikum.
13. Inkubasi media MacConkey yang telah ditanami bakteri selama
24 jam pada suhu 37C pada posisi terbalik (tutup cawan berada
di bagian bawah).
14. Amati warna, bentuk, dan sifat koloni bakteri yang tumbuh.
Gambar 3. Cara menggores bakteri dengan metode streak plate
13
MODUL 3
IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA MIKROSKOPIK
1. Mahasiswa mampu mengidentifikasi bakteri berdasarkan hasil
pengamatan mikroskopik.
2. Mahasiswa mampu melakukan pengecatan bakteri dengan cat
Gram dan menentukan golongan bakteri serta karakteristiknya
berdasarkan hasil pengecatan.
II. DASAR TEORI

Pemeriksaan mikroskopik terhadap bakteri dapat dilakukan dalam
keadaan hidup maupun mati. Pemeriksaan bakteri dalam keadaan hidup
dapat dikerjakan dengan membuat preparat tetesan gantung atau dengan
melihat bakteri dalam mikroskop medan gelap. Dalam keadaan mati,
bakteri dapat dibuat preparat dan dicat.
A. PEMBUATAN PREPARAT
Untuk mendapatkan hasil pemeriksaan mikroskopik yang baik,
diperlukan :
▪ Preparat yang dapat dilihat dengan baik yaitu, tidak terlalu tebal dan
tidak terlalu tipis.
▪ Pengecatan preparat yang baik.
Pembuatan preparat dari bahan berasal langsung dari penderita.

Bahan dapat berupa sputum, pus, discharge telinga, discharge
hidung, urin (perlu disentrifuge terlebih dahulu, endapannya dibuat
preparat).
Cara:
Bahan diambil dengan ose steril atau kapas lidi steril dan digoreskan pada
gelas obyek setipis mungkin. Gelas obyek dipanaskan di atas nyala api
spiritus sambil digoncangkan (jarak preparat sampai api spiritus, kira-kira
20 cm) sampai preparat tersebut kering. Setelah kering tetesi formalin 1%,
tunggu 5 menit dan dikeringkan sekali lagi dan preparat siap dicat.
14
Pembuatan preparat dari biakan cair

Cara :
▪ Gelas objek yang bersih dan steril dibebaskan dari lemak dengan
memanaskan di atas nyala api spiritus. Kuman diambil dari cat
sekunder/tanaman cair (yang sebelumnya telah diaduk secara steril)
dengan menggunakan ose steril, diratakan pada gelas obyek sehingga
membentuk diameter kira-kira 1-2 cm. Ose yang sudah dipakai untuk
mengambil kuman harus disterilkan kembali dengan membakar ose di
atas nyala api spiritus. Jika akan dipakai lagi, harus disterilkan dengan
cara yang sama.
▪ Preparat yang sudah dibuat kemudian dikeringkan dan ditetesi
formalin dengan cara seperti pembuatan preparat langsung.
Perhatian :
- Jangan memegang mata ose dengan menggunakan tangan.
- Jangan meletakkan ose di atas meja, letakkan ose pada tempat yang
telah disediakan.
- Jangan lupa mensterilkan ose pada saat akan dipakai dan sesudah
pemakaian.
Pembuatan preparat dari pertumbuhan media padat.

Cara :
▪ Satu ose kaldu diteteskan pada gelas obyek yang telah dibersihkan dan
dibebaskan dari lemak. Satu koloni kuman diambil dengan ose steril,
dicampur dengan kaldu tersebut, dihomogenkan, dan ditipiskan.
Preparat kemudian dikeringkan di atas nyala api spiritus dan
selanjutnya dikerjakan seperti membuat preparat dengan bahan
berasal dari material langsung.
B. PENGECATAN
Pada umumnya pemeriksaan langsung kurang memberikan hasil yang
memuaskan karena kontras antara sel bakteri dengan latar belakangnya
kurang jelas. Untuk meningkatkan kontras biasanya dilakukan
pengecatan.
15
1. Jenis-jenis cat
a. Mordan
Mordan adalah bahan kimia atau proses fisik yang memfiksasi cat
primer yang diserap mikroorganisme target. Contoh : kompleks yodin
yang digunakan untuk pengecatan Gram.
b. Cat sekunder atau kontras
Sebagian besar sistem pengecatan menggunakan cat sekunder atau
kontras untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat
sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dengan cat
primer. Contoh : safranin pada pengecatan Gram memberikan warna
merah.
Pengecatan Gram
Metode pengecatan ini ditemukan oleh Christian Gram pada tahun
1884. Dari sifat bakteri terhadap cat Gram, bakteri dapat digolongkan
menjadi Gram positif dan Gram negatif. Komposisi cat Gram dapat dilihat
pada Tabel 4.
Bakteri gram positif adalah bakteri yang pada pengecatan Gram
tahan terhadap alkohol sehingga tetap mengikat cat pertama dan tidak
mengikat cat kontras sehingga bakteri akan berwarna ungu. Bakteri gram
negatif adalah bakteri yang pada pengecatan Gram tidak tahan alkohol
sehingga warna cat yang pertama dilunturkan dan bakteri akan mengikat
warna kontras sehingga tampak merah.
Ada beberapa teori tentang dasar perbedaan kedua golongan tersebut:

1. Teori Salton
Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi (20 %) di dalam dinding
sel bakteri Gram negatif. Zat lipid ini larut selama pencucian dengan
alkohol. Pori-pori pada dinding sel membesar, sehingga zat warna yang
sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna.
Bakteri Gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding
selnya oleh pencucian dengan alkohol. Protein menjadi keras dan beku,
pori-pori mengecil sehingga komplek ungu kristal yodium dipertahankan
dan bakteri tetap berwarna ungu.
16
2. Teori Permeabilitas Dinding Sel

Teori ini berdasarkan tebal-tipisnya lapisan peptidoglikan dalam
dinding sel. Bakteri Gram positif mempunyai susunan dinding yang
kompak dengan lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan.
Permeabilitas dinding sel kurang dan komplek ungu kristal yodium tidak
dapat keluar.
Bakteri Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis,
hanya 1-2 lapisan dan susunan dinding sel tidak kompak. Permeabilitas
dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya
kompleks ungu kristal yodium.
Tabel 4. Komposisi Cat Gram

Cat Gram A Kristal Violet 2 gram
(warna ungu) Alkohol 96 % 20 ml
Ammonium oksalat 1 % dalam 80 ml
akuades
Cat Gram B Jodium 1 gram
(warna coklat) Kalium iodida 2 gram
Akuades 300 ml
Cat Gram C Aseton 30 ml
(tak berwarna) Alkohol 70 ml
Cat Gram D Safranin 1 gram
(warna merah) Alkohol 96 % 10 ml
Akuades 90 ml
Cara Pengecatan Gram

▪ Preparat yang telah siap dicat digenangi dengan cat Gram A selama 1-
3 menit. Di sini semua kuman yang pada pengecatan Gram dibedakan
menjadi Gram positif dan Gram negatif akan berwarna ungu sesuai
dengan warna cat Gram A. Setelah 1-3 menit cat dibuang, tanpa dicuci
dengan air.
▪ Preparat kemudian digenangi dengan cat Gram B selama 0,5-1 menit.
Akibat pemberian Gram B maka pengikatan warna oleh bakteri
menjadi lebih baik. Setelah itu cat dibuang dan preparat dicuci dengan
air.
▪ Preparat kemudian ditetesi cat Gram C sampai warna cat tepat
dilunturkan.
17
Setelah pemberian cat Gram C maka akan terjadi :

Bakteri Gram positif : tahan terhadap alkohol sehingga bakteriakan
tetap berwarna ungu.
Bakteri Gram negatif : tidak tahan terhadap alkohol, sehingga warna
ungu dari cat dilunturkan dan bakteri menjadi tidak berwarna lagi.
▪ Preparat digenangi dengan cat Gram D selama 1-2 menit. Gram D
bertindak sebagai warna kontras.
Akibat pemberian Gram D maka :
- Bakteri Gram positif karena telah jenuh mengikat cat Gram A maka
bakteri tidak mampu lagi untuk mengikat gram D sehingga bakteri
akan tetap berwarna ungu.
- Bakteri Gram negatif karena warna cat yang sebelumnya telah
dilunturkan oleh cat Gram C sehingga bakteri tidak berwarna lagi
maka bakteri akan mengikat warna cat Gram D sehingga bakteri akan
berwarna merah .
▪ Setelah itu preparat dicuci dan dikeringkan dalam udara kamar
(dengan preparat dalam posisi miring) dan setelah itu diperiksa di
bawah mikroskop (Gambar 5) dengan menggunakan pembesaran kuat.
Contoh bakteri Gram positif:
Bentuk kokus : Streptococcus, Staphylococcus, Pneumococcus,
Peptococcus, Peptostreptococcus (Gambar 4)
Bentuk batang : Corynebacterium diphtheriae, Nycobacteria,
Bacillus clostridia.
Contoh bakteri Gram negatif :
Bentuk kokus : Neisseria, Veillonella.
Bentuk batang : E. coli, Shigella, Salmonella, Klebsiella hemophillus,
Pasteurella, Bacteroides, Fusobacterium, Brusella.
18
Para ahli mikrobiologi menggunakan bermacam-macam mikroskop

cahaya dalam pekerjaannya: mikroskop medan terang, medan gelap,
http://classroom.sdmesa.edu/eschmid/Lecture4-Microbio.htm
Gambar 4. Bentuk-bentuk bakteri
19
fluoresens, dan fase kontras. Mikroskop digunakan untuk mempelajari

bentuk, struktur, karakteristik hasil pengecatan, dan motilitas
mikroorganisme yang berbeda-beda. Oleh karena itu kecakapan dalam
menggunakan mikroskop sangat penting dalam semua aspek mikrobiologi
dan harus dikuasai sejak awal (Harley dan Prescott, 2002).
Gambar 5. Mikroskop dan bagian-bagiannya
Untuk menggunakan mikroskop secara efisien, prinsip-prinsip

dasar mikroskopi seperti perbesaran (magnification), resolusi, apertur
numerik (numerical aperture), pencahayaan (illumination), dan
pengaturan lensa (focusing) harus dipahami. Perbesaran spesimen
merupakan fungsi 2 sistem lensa yaitu lensa okuler dan lensa obyektif.
Lensa obyektif terletak di dekat spesimen dan memperbesarnya sehingga
menghasilkan gambar nyata yang kemudian diperbesar oleh lensa okuler
yang menghasilkan gambar final. Mikroskop yang paling umum digunakan
dilengkapi dengan 4 lensa obyektif dan masing-masing lensa mempunyai
tingkat perbesaran yang berbeda-beda. Jika perbesaran lensa obyektif
20
digabungkan dengan perbesaran lensa okuler maka diperoleh perbesaran

total (Tabel 5) (Cappucino dan Welsh, 2017).
Tabel 5. Perbesaran total mikroskop

Perbesaran Perbesaran Total
Lensa Obyektif Lensa Okuler Obyektif dikalikan okuler
Scanning 4X 10X 40X
Low-power 10X 10X 100X
High-power 40X 10X 400X
Oil-immersion 100X 10X 1000X
(Cappucino dan Welsh, 2017)
Gambar 6. Cahaya yang masuk lensa obyektif dengan dan tanpa minyak
imersi (Cappucino dan Welsh, 2017)
Kemampuan sistem lensa mikroskop untuk memisahkan 2 titik yang

berdekatan pada spesimen atau obyek disebut resolusi atau daya pisah.
Gambar yang diamati akan semakin tajam jika resolusi semakin besar.
Resolusi dipengaruhi oleh apertur numerik lensa dan panjang gelombang
cahaya yang digunakan. Resolusi merupakan fungsi apertur numerik
21
karena panjang gelombang cahaya umumnya tetap (Pratiwi, 2008).

Apertur numerik merupakan fungsi diameter lensa obyektif dalam
kaitannya dengan focal length (jarak antara lensa dengan titik fokusnya).
Nilai apertur numerik biasanya dituliskan di tiap lensa obyektif. Resolusi
juga tergantung pada faktor lain yaitu indeks bias (kekuatan
membelokkan cahaya yang melewati udara dari gelas obyek ke lensa
obyektif). Pembelokan cahaya menyebabkan hilangnya cahaya ke lensa
obyektif sehingga mengurangi apertur numerik dan resolusi. Hilangnya
cahaya yang dibelokkan dapat dihindari dengan menggunakan minyak
mineral yang mempunyai indeks bias seperti kaca. Minyak diteteskan di
antara gelas obyek dan lensa obyektif. Dengan cara ini, cahaya yang
dibiaskan berkurang dan cahaya masuk langsung ke lensa obyektif
sehingga menghasilkan gambar yang jelas dengan resolusi tinggi (Gambar
6) (Cappucino dan Welsh, 2017).
Pencahayaan yang efektif diperlukan untuk mendapatkan
perbesaran dan resolusi yang efisien. Karena intensitas cahaya pada siang
hari tidak dapat dikontrol, maka cahaya buatan dari lampu tungsten paling
umum digunakan sebagai sumber cahaya pada mikroskop. Cahaya
melewati kondensor yang terletak di bawah meja preparat (stage).
Kondensor terdiri atas 2 lensa yang diperlukan untuk menghasilkan
apertur numerik yang maksimal. Tinggi kondensor dapat diubah dengan
memutar kenop kondensor. Kondensor harus selalu dekat dengan meja
preparat khususnya ketika menggunakan obyektif 100X (dengan minyak
imersi). Di antara sumber cahaya dan kondensor ada diafragma iris yang
dapat dibuka dan ditutup untuk mengatur banyaknya cahaya yang masuk
kondensor. Cahaya yang terlalu terang akan mengaburkan gambar
spesimen karena kurangnya kontras. Banyaknya cahaya yang masuk
mikroskop berbeda-beda untuk tiap lensa obyektif yang digunakan.
Aturan yang berlaku: semakin tinggi perbesaran lensa, semakin pendek
jarak antara spesimen/preparat dengan lensa obyektif (working distance)
sementara apertur numerik lensa obyektif meningkat (Gambar 7)
(Cappucino dan Welsh, 2017).
22
Gambar 7. Hubungan antara working distance, lensa obyektif, dan

pembukaan diafragma (Cappucino dan Welsh, 2017)
III. ALAT DAN BAHAN

a. Alat
1. Mikroskop 4. Gelas penutup
2. Jarum ose bulat 5. Lampu spiritus
3. Gelas objek 6. Pipet tetes
b. Bahan
1. Kultur bakteri
2. Preparat bakteri (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Shigella sonnei,
Bacillus spizizenii, Salmonella typhi, dan Bacillus cereus)
23
3. Minyak imersi
4. Formalin 1%
5. Cat Gram A, B, C, dan D
6. Air
7. Etanol 70%
IV. CARA KERJA

A. Pengamatan preparat secara mikroskopik
1. Hidupkan mikroskop.
2. Letakkan preparat di meja objek pada mikroskop lalu jepit.
3. Teteskan minyak imersi di atas preparat.
4. Putar lensa objektif perbesaran 100X sampai tepat di atas
preparat.
5. Putar makrometer (pemutar kasar) pelan-pelan hingga terlihat
bayangan preparat.
6. Putar mikrometer (pemutar halus) untuk memfokuskan
bayangan.
7. Amati bentuk, susunan, dan warna bakteri.
8. Tuliskan hasil pengamatan berupa bentuk, susunan, dan warna
sel serta golongan bakteri (Gram positif atau negatif).
B. Pengecatan Gram
1. Ambil bakteri menggunakan jarum ose bulat yang telah
disterilkan.
2. Goreskan bakteri setipis mungkin pada gelas objek yang telah
dibersihkan.
3. Panaskan gelas objek dengan nyala api spiritus (jarak ± 20 cm)
sampai preparat kering. Tetesi dengan formalin 1%.
4. Tunggu 5 menit dan keringkan lagi dengan pemanasan. Preparat
siap dicat.
5. Genangi preparat dengan cat Gram A selama 1-3 menit.
6. Buang cat tanpa dicuci dengan air.
7. Genangi preparat dengan cat Gram B selama 0,5-1 menit.
8. Buang cat Gram B dan cuci preparat di bawah air mengalir.
9. Tetesi preparat dengan cat Gram C sampai warna cat tepat
dilunturkan.
10. Genangi preparat dengan cat Gram D selama 1-2 menit.
24
11. Cuci preparat dengan air mengalir dan keringkan dalam suhu
kamar pada posisi miring.
12. Tutup preparat dengan gelas penutup dan tetesi bagian atas
gelas penutup dengan minyak imersi.
13. Amati hasil pengecatan di bawah mikroskop dengan perbesaran
kuat (1000X).
14. Tuliskan hasil pengamatan berupa bentuk, susunan, dan warna sel
serta golongan bakteri (Gram positif atau negatif) (Gambar 8).
https://everythingmicro.blogspot.com/2017/10/staphylococcus-identification.html
Gambar 8. Hasil pengecatan Gram bakteri Staphylococcus aureus.

Bakteri berbentuk bulat, berwarna ungu, dengan susunan sel
bergerombol.
25
MODUL 4
IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA MAKROSKOPIK
Mahasiswa mampu mengidentifikasi bakteri secara makroskopik.
II. DASAR TEORI

Penggunaan media sangat penting dalam pemeriksaan mikrobiologik
baik untuk isolasi, identifikasi maupun differensiasi. Media juga digunakan
untuk membawa material dari rumah sakit atau tempat lain ke
laboratorium agar kuman dalam material tersebut tetap hidup
sesampainya di laboratorium.
Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat makanan
yang diperlukan untuk menumbuhkan suatu mikroorganisme, dalam
rangka isolasi, memperbanyak penghitungan dan pengujian sifat fisiologik
suatu mikroorganisme.
Syarat-syarat media untuk mendapatkan suatu lingkungan kehidupan
yang cocok bagi pertumbuhan bakteri adalah :
1. Susunan makanan
2. Tekanan osmosis
3. Derajat keasaman
4. Temperatur
5. Sterilitas
1. Susunan Makanan
Media yang digunakan untuk pertumbuhan harus mengandung air,
sumber karbon, sumber nitrogen,mineral, vitamin, dan gas.
a. Air
Air digunakan untuk pertumbuhan bakteri, menjaga kelembaban dan
untuk pertukaran zat (metabolisme). Pada umumnya bakteri peka
terhadap kekeringan, kecuali jenis-jenis tertentu dan yang mampu
membentuk spora.
b. Sumber karbon
Sebagai sumber karbon, bakteri dapat menggunakan senyawa karbon
sederhana misalnya CO2 dan CH4 atau senyawa karbon yang kompleks
seperti sitrat, tartrat, alkohol atau gula. Berbagai bakteri mempunyai
26
kelakuan yang berbeda terhadap berbagai macam gula (glukosa,

laktosa, maltosa) dan ini dapat dipakai untuk mengidentifikasi bakteri.
c. Sumber nitrogen
Sebagai sumber nitrogen dapat digunakan unsur nitrogen sendiri atau
senyawa-senyawa nitrogen yang sederhana misal NO2, NO3, NH3, atau
senyawa nitrogen yang lebih komplek seperti asam amino, polipeptid,
peptid dan pepton.
d. Mineral
Mineral yang penting adalah Na, K, Mg, Zn, P, S, Cl, Na dan Cl
dibutuhkan dalam jumlah yang agak besar, terutama digunakan untuk
menjaga tetap dalam keadaan isotonis. NaOH digunakan untuk
menetapkan pH agar didapat pH yang optimal untuk bakteri tersebut.
e. Vitamin
Beberapa bakteri membutuhkan vitamin tertentu untuk
kehidupannya. Sebagai contoh yang jelas adalah vitamin K yang sangat
dibutuhkan oleh Bacteroides melaninogenicus.
f. Gas
Beberapa bakteri membutuhkan gas tertentu untuk kehidupannya.
Sebagai contoh Gonococcus sangat membutuhkan CO2 untuk
kehidupannya. Namun ada bakteri tertentu yaitu bakteri anaerob,
adanya O2 akan menghambat pertumbuhan, bahkan dapat
membunuhnya.
2. Tekanan Osmosis
Mengingat sifat-sifat bakteri, juga sama seperti sifat-sifat sel yang lain
terhadap tekanan osmose, maka bakteri untuk pertumbuhannya
membutuhkan media yang isotonis. Bila media tersebut hipotonis
maka media tersebut akan mengalami plasmoptysis, sedangkan bila
media tersebut hipertonis maka akan terjadi plasmolysis.
3. Derajat Keasaman (pH)
Umumnya bakteri membutuhkan pH sekitar netral. Namun ada bakteri
tertentu yang membutuhkan pH yang sangat alkalis yaitu vibrio, yang
membutuhkan pH sekitar 8-10 untuk pertumbuhannya yang optimal.
4. Temperatur
Untuk mendapatkan pertumbuhan yang optimal, bakteri
membutuhkan temperatur tertentu. Umumnya untuk bakteri yang
27
patogen membutuhkan temperatur sekitar 370C, sesuai dengan

temperatur tubuh. Namun ada bakteri patogen yang membutuhkan
suhu sekitar 420C yaitu Camphylobacter.
5. Sterilitas
Sterilitas media merupakan suatu syarat yang sangat penting.
Pemeriksaan mikrobiologis tidak dilakukan apabila media yang
digunakan tidak steril, karena tidak dapat dibedakan dengan pasti
apakah bakteri tersebut berasal dari material yang diperiksa atau
hanya kontaminan. Untuk mendapatkan suatu media yang steril maka
setiap tindakan (pengambilan media, penuangan media) serta alat-alat
yang digunakan (tabung, petri) harus steril dan dikerjakan secara
aseptik.
PENGGOLONGAN MEDIA
1. Media secara garis besar terbagi atas :
a. Media Hidup
Media hidup terutama digunakan untuk menanam/mengisolasi virus.
Di samping itu sering pula media hidup digunakan untuk mengetahui
jenis Escherichia coli yang patogen digunakan tikus putih yang
berumur 3-7 hari. Kebanyakan virus hanya dapat ditanam pada bagian
tertentu dari binatang misalnya ginjal kera dan embrio ayam.
b. Media Buatan
Media yang dibuat berasal dari kumpulan zat-zat tertentu (organik dan
anorganik). Untuk masing-masing bakteri membutuhkan susunan
media yang berbeda-beda.
2. Menurut Konsistensinya:
a. Media Padat
Media padat yang digunakan dapat berupa media padat datar, padat
miring maupun padat tegak.
b. Media Setengah Padat (Semi solid)
Misalnya: SSS (Semi Solid Sucrose), MIO (Motility Indol Ornithine),
Carry and Blair medium, Fletcher’s medium.
c. Media Cair
Contoh media cair: media gula, media kaldu, kaldu pepton, dan kaldu
darah.
28
3. Menurut Isinya :
a. Media Basal
Media basal digunakan sebagai bahan dasar untuk membuat media
lain yang lebih komplek.
Misalnya :
1. Media basal padat : kaldu agar, TSA (Tryptone Soya Agar)
2. Media basal cair : air pepton, kaldu pepton
b. Media Campuran
Selain media basal juga ditambahkan berbagai macam zat baik organik
maupun anorganik sesuai dengan kebutuhan bakteri.
4. Menurut Tingkatannya :
a. Media Sederhana
Media sederhana hanya mengandung zat-zat kimia yang sederhana,
misalnya : media larutan alkali pepton, media gula-gula.
b. Media Kaya
Selain mengandung zat-zat kimia biasa, juga mengandung zat
anorganik tingkat tinggi seperti serum, darah, telur dan lain-lain.
5. Menurut Penggunaanya :
a. Media Kaya
Media kaya digunakan untuk mendapatkan pertumbuhan jenis bakteri
tertentu yang tidak dapat tumbuh pada media sederhana misalnya :
Gonococcus, Pneumococcus, Streptococcus, Bacteroides,
Fusobacterium, Clostridia dan lain-lain. Contohnya : media agar darah,
brucella agar darah, agar coklat, kaldu darah dan lain-lain.
b. Media Eksklusif
Media ini dibuat sedemikian rupa sehingga hanya bakteri tertentu yang
dapat hidup. Hal ini dapat dilakukan dengan :
▪ Membuat pH sangat alkalis
Misalnya media cair alkali pepton dan thiosulfate citrate bile salts
sucrose (TCBS) yang digunakan untuk isolasi vibrio.
▪ Menambahkan antibiotik tertentu
29
Misalnya menambahkan kloramfenikol untuk Sabouraud, kanamisin

pada Brucella agar darah untuk bakteri anaerob tertentu.
c. Media Selektif
Media ini mempunyai susunan sedemikian rupa, sehingga kuman
yang dicari akan tumbuh dengan koloni yang khas sedang kuman
lain kurang khas.
Contoh :
▪ Media Endo, MacConkey Agar, desoxycholate citrate lactose sucrose
(DCLS) Agar, yang digunakan untuk isolasi kuman-kuman perut.
Kuman perut (Enterobacter) yang tidak memecah laktosa
(nonlactose fermented) misalnya Salmonella, Shigella, Proteus dan
lain-lain akan terlihat jernih transparan, sedang yang memecah
laktosa akan berwarna merah.
▪ Media Tellurit yang digunakan untuk isolasi Corynebacterium
diphtheriae, di mana koloni difteri akan berwarna hitam.
d. Media Pembiakan
Media ini digunakan bilamana dalam suatu material adanya kuman
yang dicari dalam jumlah yang sangat sedikit, selain itu juga
terdapatnya kuman-kuman lain dalam jumlah yang besar. Oleh
karena itu dibutuhkan media pembiakan di mana kuman yang dicari
tumbuh subur sedangkan kuman yang lain akan terhambat
pertumbuhannya.
Contoh : Media SC (selenite cysteine) broth yang digunakan sebagai
media penyubur untuk Salmonella dan media alkali pepton cair yang
digunakan sebagai media penyubur untuk Vibrio.
e. Media yang digunakan untuk mempelajari sifat-sifat biokimiawi dari
bakteri terhadap berbagai macam zat.
Contohnya antara lain :
1. Media gula-gula, misalnya : glukosa, maltosa, laktosa, dan sakarosa.
Dalam media gula-gula yang diamati:
▪ Apakah bakteri tersebut memecah gula-gula menjadi asam dan gas?
▪ Apakah bakteri tersebut memecah gula-gula hanya menghasilkan
asam tanpa gas?
▪ Apakah bakteri tersebut tidak memecah gula-gula?
2. Media darah. Dalam media ini dipelajari sifat-sifat bakteri terhadap
darah :
30
▪ Apakah bakteri tersebut menghemolisis darah (misalnya beta

Streptococcus)?
▪ Apakah bakteri tersebut hemodigesti terhadap darah (misalnya alfa
Streptococcus)?
▪ Apakah bakteri tersebut tidak berpengaruh terhadap darah
(misalnya gamma Streptococcus)?
3. Di samping itu dewasa ini untuk kemudahan, sering digunakan satu
macam media yang dapat sekaligus mempelajari berbagai sifat
bakteri.
Contoh :
a. KIA (Kliger Iron Agar)
Media ini bentuknya miring, digunakan untuk mempelajari reaksi
bakteri terhadap komponen penyusun media juga digunakan untuk
melihat produksi asam/perubahan warna dari merah menjadi
kuning, baik pada daerah yang miring (slant) ataupun pada tusukan
(butt).
Media KIA dapat digunakan untuk reaksi bakteri terhadap gula-gula,
dan kemampuan membentuk H2S yang diikat sebagai ferri sulfida
yang akan terlihat berwarna hitam.
b. TSI (Triple Sugar Iron Agar)
Prinsipnya hampir sama dengan KIA, perbedaannya dalam media TSI
mengandung tiga macam gula yaitu dekstrosa, laktosa, dan sukrosa.
c. SSS (Semi Solid Sucrose) Agar
Dalam media ini dapat dipelajari motility (pergerakan bakteri) dan
reaksi bakteri terhadap sukrosa. Di samping itu jika sukrosa diganti
dengan gula yang lain maka dapat diketahui sifat bakteri terhadap
gula tersebut.
d. LIA (Lysine Iron Agar)
Dalam media ini dapat dilihat kelakuan bakteri terhadap lisin dan
kemampuan membentuk H2S.
e. MIO (Motility Indol Ornithine)
Dalam media ini dipelajari pergerakan bakteri, kemampuan
menghasilkan indol, dan reaksi pemecahan ornitin.
f. Media yang digunakan untuk penyimpanan bakteri.
31
Contoh media agar padat miring. Dewasa ini untuk penyimpanan

bakteri/virus dalam jangka waktu yang lama dapat dengan
menyimpan pada suhu kira-kira –600 C.
Dipandang dari segi kepraktisannya, laboratorium mikrobiologi

membagi media yang dipakai sebagai berikut :
A. Media Transport :
a. BGS (Buffered Glycerol Saline)
b. Carry and Blair transport medium
c. Amies transport medium
d. Alkaline pepton water (air pepton alkalis)
e. Stuart transport medium
f. Kaldu pepton
B. Media Isolasi :
a. Kultur umum
1. Agar darah (untuk kultur dan angka kuman)
2. Agar coklat
3. DCLS (Deoxycholate Citrate Lactose Sukrosa) Agar
4. Media tellurit
5. Media untuk pertussis (Mordet Gengou Agar)
6. Thayer Martin Medium
7. MacConkey Agar
b. Penanaman Mycobacterium tuberculosis
Medium Loewenstein-Jensen dan Middlebrook
c. Penanaman Bakteri Anaerob
1. Brucella Agar darah
2. Brucella Agar darah dengan kanamisin/antibiotik lain
3. Agar darah
4. Thioglycolat
5. Thioglycolat dengan antibiotik
d. Leptospira
Fletcher’s medium
e. Jamur
Sabouraud dan Sabouraud dengan kloramfenikol
f. Enterobacteriaceae
1. DCLS
32
2. Diagnostic sensitivity test (DST) agar

3. MacConkey
C. Enriched Medium (media penyubur)
1. Selenit Cysteine Broth
2. Larutan alkali pepton
3. Kaldu darah
4. Thioglycolat
5. Gal kultur
D. Media Sensitivitas Test
1. Mueller Hinton agar
2. DST agar
3. Supristol agar
4. Brain heart infusion (BHI)
5. Agar base
E. Media Identifikasi
a. Kultur umum :
1. Media gula-gula
2. Deret media komplek untuk identifikasi kuman perut batang
Gram negatif.
b. Enterobacteriaceae :
1. KIA/TSI Agar
2. SSS (Semi Solid Sukrosa)
3. LIA
4. MIO
5. ACE (Acetate agar)
6. Urea Broth
7. MR (Methyl Red)
8. VP (Voges Proskauer)
Ketika ditumbuhkan pada berbagai macam media, mikroorganisme

akan menunjukkan rupa yang berbeda-beda. Perbedaan tersebut
dinamakan karakteristik kultur yang digunakan sebagai dasar pemisahan
mikroorganisme ke kelompok-kelompok taksonomi. Karakteristik kultur
ditentukan dengan menanam mikroorganisme pada media nutrien agar
miring dan plate, nutrient broth, dan nutrient gelatin (Cappucino dan
Welsh, 2017).
33
Koloni yang terisolasi dengan baik pada agar dapat dievaluasi

berdasarkan:
1. Ukuran: pintpoint (< 1mm), kecil, sedang, atau besar.
2. Pigmentasi: warna koloni.
3. Bentuk: bentuk koloni dideskripsikan sebagai sirkuler, tidak teratur,
dan rhizoid (seperti akar) (Gambar 9).
4. Margin/tepi: tepi dideskripsikan sebagai utuh (entire), berbelah
(lobate), berombak (undulate), seperti gigi (serrate), berbenang
(filamentous).
5. Elevasi: tingkat ketinggian koloni di atas permukaan media
dideskripsikan sebagai rata (flat), timbul (raised), mencembung
(convex), membukit (umbonate).
(Cappucino dan Welsh, 2017).
http://www.sciencebuddies.org/science-fairprojects/project_ideas/MicroBio_Interpreting_
Plates.shtml
.
Gambar 9. Bentuk, elevasi, dan tepi koloni bakteri
34
Bau koloni dapat digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Ada koloni

yang berbau khas atau berbau menyerupai bau benda lain atau koloni
tidak berbau sama sekali. Koloni dapat berupa lendir (Gambar 10), liat,
seperti mentega, atau getas (Irianto, 2006).
Gambar 10. Koloni bertekstur mukoid/berlendir yang

tumbuh pada media MacConkey (microbeonline.com, 2013)
III. BAHAN
1. Kultur bakteri Escherichia coli pada media MacConkey padat.
2. Kultur bakteri Pseudomonas aeruginosa pada media MacConkey
padat.
3. Kultur bakteri Klebsiella pneumoniae pada media MacConkey
padat.
4. Kultur bakteri Shigella sonnei pada media MacConkey padat.
5. Kultur bakteri Staphylococcus aureus pada media MacConkey
padat.
6. Kultur bakteri Bacillus subtilis subsp. Spizizenii pada media
MacConkey padat.
IV. CARA KERJA

1. Amati warna, bentuk, dan tekstur koloni bakteri tiap spesies.
2. Beri keterangan terkait kemampuan bakteri dalam
memfermentasi laktosa.
35
MODUL 5
IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA BIOKIMIAWI
Mahasiswa diharapkan mampu mengidentifikasi
bakteri berdasarkan sifat-sifat biokimiawinya.
II. DASAR TEORI

Bakteri melakukan aktivitas biokimia untuk pertumbuhan dan
perkembangbiakan menggunakan bahan makanan yang diperoleh dari
lingkungannya. Perubahan biokimia yang terjadi baik di dalam maupun di
luar bakteri diatur oleh enzim yang merupakan katalis biologis.
Fermentasi merupakan reaksi biokimia yang menghasilkan energi dan
molekul organik berperan sebagai penerima dan pendonor elektron.
Kemampuan mikroorganisme untuk memfermentasi karbohidrat dan
jenis produk yang dihasilkan sangat penting dalam identifikasi bakteri.
Karbohidrat tertentu mungkin difermentasi menjadi beberapa produk
akhir yang tidak sama tergantung pada mikroorganisme yang terlibat.
Produk-produk akhir seperti alkohol, asam, gas, atau molekul organik
yang lain merupakan ciri khas mikroorganisme tertentu. Jika bakteri yang
mampu memfermentasi ditumbuhkan dalam media cair yang
mengandung glukosa, mikroorganisme tersebut mungkin memproduksi
asam organik sebagai hasil samping fermentasi. Asam yang dilepaskan
akan menurunkan pH media. Jika indikator pH seperti merah fenol atau
bromkresol ungu merupakan komponen media, produksi asam akan
mengubah warna media menjadi kuning. Gas yang diproduksi selama
proses fermentasi dapat dideteksi menggunakan tabung kecil yang
diletakkan secara terbalik dalam media cair yang disebut tabung Durham.
Jika gas diproduksi, media cair di dalam tabung Durham akan digantikan
oleh gas yang terjebak di dalam tabung yang berupa gelembung (Harley
dan Prescott, 2002).
Banyak protein mengandung asam amino bersulfur dalam jumlah
yang banyak seperti sistein. Ketika bakteri menghidrolisis protein
tersebut, asam amino akan dilepaskan dari protein dan diambil oleh
bakteri sebagai makanan. Sistein dengan adanya enzim sistein desulfurase
akan kehilangan atom sulfur melalui penambahan hidrogen dari air dan
36
menghasilkan gas hidrogen sulfida. Gas hidrogen sulfida juga bisa

diproduksi dengan reduksi senyawa inorganik yang mengandung sulfur
seperti tiosulfat, sulfat, atau sulfit. Ketika bakteri tertentu mengambil
natrium tiosulfat, bakteri dapat mereduksinya menggunakan enzim
tiosulfat reduktase menjadi sulfit dan melepaskan gas hidrogen sulfida
(Gambar 11) (Harley dan Prescott, 2002).
Gambar 11. Produksi hidrogen sulfida oleh bakteri (Harley dan Prescott,
2002).
37
Tabel 6. Aktivitas bakteri terhadap komponen media diferensial (Lindquist, 2010)
Media SIM agar dapat digunakan untuk mendeteksi ada atau tidak
adanya pergerakan bakteri dan produksi indol. Pergerakan (motilitas) ada
jika pertumbuhan kultur tidak sebatas di garis tusukan inokulasi.
Pertumbuhan bakteri yang tidak bergerak (nonmotil) hanya pada
sepanjang tusukan inokulasi. Media semisolid seperti MIO juga dapat
digunakan untuk menentukan motilitas bakteri. Selama pertumbuhan,
bakteri yang motil akan bergerak dari garis inokulasi untuk membentuk
kekeruhan pada media sedangkan bakteri yang tidak bergerak hanya
tumbuh di sepanjang tusukan (Harley dan Prescott, 2002).
38
Tabel 7. Identifikasi Enterobacteriaceae dengan uji biokimia
Species KIA SSS LIA MIO Ace Ure
Mir Teg H2S Rek Mot Mir Teg H2S Rek Mot I nd
Salmonella typhi K A +/0 K + K K/N +/0 A + 0 0 0
S. paratyphi A K AG 0/+ K + K A 0/+ K + 0 0 0
S. enteritidis K AG 0/+ K + K K/N + K + 0 + 0
S. gallinorus K A + K 0 K K/N 0 A 0 0 + 0
S. Pullorum K AG + K 0 K K/N + K 0 0 + 0
Shigella dysenteriae K A 0 K 0 K A 0 A 0 0 0 0
S. flexneri K A 0 K/d 0 K A 0 A 0 d 0 0
S. boydii K A 0 K 0 K A 0 A 0 d 0 0
S. sonnei AG 0 K/d 0 K A 0 K 0 + 0 0
Escherichia coli A/K AG 0 K/d + K K/d 0 K/d + + + 0
Edwardsiella tarda K AG + 0 + K K/N +/0 K + + K 0
Arizona K AG + 0 + K K/N +/0 K + d X 0
Citrobacter K/A AG + 0 0 K A/AG +/0 K + d X +/0
Klebsiella AG A 0 K/A 0 K K/d 0 A 0 0 X 0/+
Enterobacter A/K AG 0 A/d + K K/N 0 K + 0/+ X +/0
Serratia K/A A 0 K + K/N K/N 0 K + 0/+ X X
Pseudomonas K N0 0 K + K K/N 0 N + d X X
Aeromonas hidrophil K A 0 A + K A 0 A + d X X
Proteus vulgaris A/K AG + A + R A 0/+ A + +/0 X +
P. mirabilis K/A AG + K/d + R A 0/+ K + +/0 X +
P. morganii K A/d 0 K + K/R A 0 K + +/0 X +
Providencia rettgeri K A 0 K/d + R A 0 A + +/0 X +
Vibrio cholera K A 0 A + K N 0 A + + X X
V. nag (sp) K A 0 d + K N 0 K + + X X
V. parahaemolytica K A 0 K + K N 0 K + + X X
Keterangan :
K = alkali A = asam X = tidak penting
G = gas R = red d = delayed/ (lambat)
N = netral + = positif 0 = negatif
Mir = miring Teg = tegak Rek = reaksi
Mot = motility Ace = asetat Ure = urea
Ind = indol
MIO medium:
▪ Motility. Observe for cloudiness in the medium (growth away from the
stab line). For a non-motile organism, growth may be seen along cracks
in the medium caused by gas production, but there will be clear
pockets of no growth.
39
▪ Indole production. About one-half dropperful of Kovacs reagent is

added to the medium. A red ring indicates production of indole from
the breakdown of tryptophan (Lindquist, 2010).
Tabel 8. Komposisi Media KIA, TSI, LIA, dan MIO
Uji Manitol
Uji ini dapat digunakan untuk membedakan S. aureus dan yang lain
karena pada umumnya S. aureus mampu memfermentasi manitol dalam
keadaan anaerob, sedangkan spesies yang lain jarang.
40
Ada dua cara pemeriksaan :

1. Satu koloni bakteri diinokulasikan pada media agar manitol di dalam
tabung, dengan cara menusukkan ke bawah sepanjang tabung,
kemudian diinkubasikan pada 35oC selama 48 jam. Uji dinyatakan
positif bila terjadi perubahan warna menjadi kuning pada bagian
atas dan bawah media tersebut.
2. Bakteri digoreskan pada agar garam manitol (Manitol Salt Agar
=MSA) dan diinkubasikan pada 37o C selama 36 jam. Bila daerah
disekitar koloni berwarna kuning menunjukkan bahwa bakteri
tersebut adalah S. aureus.
III. ALAT DAN BAHAN

a. Alat
1. Jarum ose lurus
2. Lampu spiritus
b. Bahan
1. Media kliger iron agar (KIA) miring dalam tabung reaksi
2. Media lysine iron agar (LIA) miring dalam tabung reaksi
3. Media motility iron ornithine (MIO) dalam tabung reaksi
4. Media mannitol salt agar (MSA) miring dalam tabung reaksi
5. Etanol 70%
IV. CARA KERJA

A. Penanaman pada media KIA, LIA, dan MSA*
1. Semprot area kerja dengan etanol 70% dan lap sampai kering.
2. Panaskan jarum ose lurus sampai panas dan merah lalu dinginkan.
3. Panaskan mulut tabung reaksi pada api lampu spiritus.
4. Ambil kultur bakteri, tusukkan pada bagian tegak, tarik lalu
goreskan dengan pola zig-zag pada bagian miring.
6. Tutup mulut tabung dengan kapas.
7. Labeli tabung dengan nama media, spesies bakteri, kelas,
kelompok, dan tanggal penanaman.
8. Inkubasi kultur selama 24 jam pada suhu 37C.
41
9. Amati warna media pada bagian tegak dan miring, ada tidaknya
warna hitam pada media, dan ada tidaknya gas yang terbentuk
(Gambar 12).
* Media MSA hanya untuk ditanami Staphylococcus aureus.
B. Penanaman pada media MIO

2. Panaskan jarum ose lurus sampai panas dan merah lalu dinginkan.
4. Ambil kultur bakteri, tusukkan pada media MIO, tarik tegak lurus
(jangan digoyang).
6. Tutup mulut tabung dengan kapas.
7. Labeli tabung dengan nama media, spesies bakteri, kelas,
kelompok, dan tanggal penanaman.
8. Inkubasi kultur selama 24 jam pada suhu 37C.
9. Amati warna media dan pertumbuhan bakteri.
V. INTERPRETASI HASIL
1. Media KIA
a. Penggunaan karbohidrat
Bagian miring: asam (warna kuning), basa (warna merah)
Bagian tegak: asam (warna kuning), basa (warna merah)
Bagian miring berwarna merah dan bagian tegak berwarna kuning
menandakan bahwa hanya glukosa yang difermentasi.
Bagian miring berwarna kuning dan bagian tegak berwarna
kuning menandakan bahwa glukosa dan laktosa difermentasi.
Bagian miring berwarna merah dan bagian tegak berwarna merah
menandakan bahwa glukosa dan laktosa tidak difermentasi.
b. Produksi gas
Produksi gas ditandai dengan pecahnya media atau adanya
gelembung.
c. Produksi H2S
Produksi H2S ditandai dengan warna hitam pada media, seluruh
bagian atau sebagian.
42
Merah
Kuning
Hitam
https://users.stlcc.edu/kkiser/TSIreact.jpg
Gambar 12. Hasil uji biokimia menggunakan media TSI
2. Media LIA
Kultur yang memproduksi lisin dekarboksilase secara cepat
menyebabkan reaksi alkalin (basa) sehingga media berwarna ungu.
Organisme yang tidak mendekarboksilasi lisin menghasilkan reaksi
basa pada bagian miring (ungu) dan asam pada bagian tegak (kuning).
Kultur yang menghasilkan hidrogen sulfida (H2S) menyebabkan
warna hitam pada media.
Deaminasi lisin ditandai dengan bagian miring yang berwarna merah
dan bagian tegak yang berwarna kuning.
3. Media MIO (HIMEDIA)

Pergerakan bakteri (motility) diindikasikan dengan pertumbuhan
bakteri keluar garis inokulasi. Organisme yang tidak bergerak
(nonmotile) hanya tumbuh sepanjang garis inokulasi (Gambar 13).
Dekarboksilasi ornitin ditandai dengan ungu pada seluruh media
sedangkan reaksi negatif ditandai dengan warna kuning atau warna
kuning dengan pita ungu di bagian atas media.
Produksi indol ditandai dengan pembentukan warna merah muda
pada bagian atas media setelah penambahan reagen Kovacs dan
penggojogan sedang. Reaksi negatif ditandai warna kuning.
43
Gambar 13. Hasil uji motilitas bakteri. Bakteri yang tidak bergerak (A)
dan bergerak (B) dalam media.
4. Media MSA
Bakteri yang mampu memfermentasi manitol tampak sebagai koloni
berwarna kuning dengan warna kuning pada media sedangkan
bakteri yang tidak memfermentasi manitol mempunyai koloni
berwarna merah muda sampai merah dengan tidak ada warna kuning
pada media.
44
MODUL 6
SKRINING PRIMER UNTUK MEMPEROLEH
MIKROBA PENGHASIL ANTIBIOTIK
Mahasiswa mampu melakukan berbagai teknik mikrobiologi dalam
skrining (menanam, mengisolasi, memurnikan biakan, dan
melakukan uji terhadap kemampuan biakan penghasil antibiotik).
II. DASAR TEORI

Mikroba penghasil antibiotik terseleksi diperoleh dari proses skrining, di
mana mikroba tersebut potensial untuk menghasilkan metabolit yang
dapat menghambat pertumbuhan atau reproduksi mikroba patogen. Hasil
yang positif dari proses skrining primer masih harus mengalami penelitian
lebih lanjut sampai menjadi antibiotik yang bisa dimanfaatkan. Mikroba
terdapat dimana-mana termasuk dalam tanah. Tanah merupakan sumber
yang kaya akan mikroba, dan telah banyak menghasilkan antibiotik yang
digunakan sekarang.
Cara untuk memperoleh antibiotik melalui :

1. Skrining Primer
Skrining primer adalah prosedur selektif untuk mendeteksi atau
mengisolasi banyak mikroba/metabolit yang dikehendaki dari sejumlah
besar populasi. Adapun tujuan daripada skrining primer adalah sebagai
berikut :
a. Memperoleh mikroba penghasil antibiotik
b. Mengisolasi dan mengumpulkan mikroba penghasil antibiotik
c. Menguji kemampuan mikroba penghasil antibiotik dengan mikroba uji
2. Skrining Sekunder
Skrining sekunder mempunyai tujuan sebagai berikut :
a. Menentukan mikroba yang menghasilkan antibiotik
b. Memperoleh antibiotik yang bersifat spesifik
III. ALAT DAN BAHAN

a. Alat
1. Neraca analitik 3. Lampu spiritus
2. Tabung reaksi steril
45
4. Pelubang gabus (cork 6. Inkubator

borer) 7. Mikropipet
5. Jarum ose bulat 8. Spreader
9. Penggaris
b. Bahan
1. Salin steril 5. Kultur bakteri cair
2. Media Czapek dox 6. Etanol 70%
3. Media Sabouraud 7. Yellow tips
4. Media Mueller Hinton 8. Blue tips
IV. CARA KERJA

Tahap I
1. Suspensikan 0,5 gram sampel tanah dengan larutan salin 5 ml
dalam tabung steril 1 (10-1).
2. Ambil 0,5 ml suspensi pengenceran 10-1 dan masukkan ke dalam
tabung reaksi steril 2 yang berisi salin sebanyak 4,5 ml (10-2).
3. Ambil 0,5 ml suspensi pengenceran 10-2 dan masukkan ke dalam
tabung reaksi steril 3 yang berisi salin sebanyak 4,5 ml (10-3).
4. Ambil 100 µl suspensi tersebut (10-3), teteskan ke dalam petri
steril yang telah dituangi media selektif padat (Czapex Dox) lalu
ratakan menggunakan spreader.
5. Labeli dengan keterangan asal tanah, media, kelas, kelompok,
dan tanggal percobaan.
6. Inkubasi 28oC dalam posisi terbalik sampai praktikum berikutnya.
7. Deskripsikan mikroorganisme yang tumbuh.
Tahap II
1. Buat 3 lubang pada media Sabouraud menggunakan cork borer
yang telah disterilkan.
2. Pilih 3 koloni yang dominan pada media Czapex Dox, iris
menggunakan cork borer yang telah disterilkan, masukkan ke
dalam lubang pada media Sabouraud.
3. Labeli cawan dengan keterangan asal tanah, media, kelas,
kelompok, dan tanggal percobaan.
4. Inkubasi 28oC dalam posisi terbalik sampai praktikum berikutnya.
46
5. Deskripsikan mikroorganisme yang tumbuh.
Tahap III
1. Panaskan pinggiran cawan Petri berisi media MH pada api lampu
Bunsen.
2. Inokulasi media MH dengan kultur bakteri cair lalu ratakan
menggunakan spreader yang telah disterilkan, diamkan selama 10
menit.
3. Buat lubang pada media MH menggunakan cork borer yang telah
disterilkan.
4. Iris 3 koloni dominan menggunakan cork borer yang telah
disterilkan lalu pindah ke media MH.
5. Labeli cawan dengan nama bakteri uji, media, kelas, kelompok,
dan tanggal percobaan.
6. Inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam dalam posisi terbalik.
7. Amati ada tidaknya zona hambat pada daerah sekitar koloni
(Gambar 14).
8. Jika ada zona hambat, ukur diameter zona hambat menggunakan
penggaris.
https://microbepost.org/2015/10/13/antibiotics-weapons-or-signals/
Gambar 14. Hasil skrining primer tahap III. Zona hambat di sekitar
jamur mengindikasikan bahwa jamur menghasilkan antibiotik.
48
MODUL 7
UJI SENSITIVITAS BAKTERI TERHADAP ANTIBIOTIK
Mahasiswa mampu melakukan uji sensitivitas bakteri terhadap
antibiotik dan menginterpretasikan hasilnya.
II. DASAR TEORI

Pemeriksaan uji sensitivitas bakteri bertujuan :
1. Mengetahui obat-obat yang paling cocok (paling poten) untuk bakteri
penyebab penyakit terutama pada kasus-kasus penyakit yang kronis.
2. Mengetahui adanya resistensi bakteri terhadap berbagai antibiotik.
Secara garis besar resistensi bakteri terhadap antibiotik disebabkan :

a. Secara alamiah bakteri resisten terhadap antibiotik yang diberikan.
b. Akibat pemberian dosis di bawah dosis yang diberikan.
c. Akibat penghentian obat sebelum kuman-kuman tersebut betul-betul
terbunuh oleh antibiotik.
Pemeriksaan uji sensitivitas dapat dikerjakan dengan beberapa cara :

A. Dilusi cair atau dilusi padat
Pada prinsipnya antibiotika diencerkan hingga diperoleh beberapa
konsentrasi. Pada dilusi cair, masing-masing konsentrasi obat ditambah
suspensi kuman dalam media; sedangkan pada dilusi padat tiap
konsentrasi obat dicampur dengan media agar, lalu ditanami kuman.
B. Difusi
Media yang dipakai adalah agar Mueller Hinton.
Pada metode difusi ini ada beberapa cara, yaitu:
1. Cara Kirby Bauer.
a. Sedikitnya 3-5 koloni terisolasi baik dengan tipe morfologi yang sama
dipilih dari kultur semalam plat agar MH, disuspensikan ke dalam 4-
5 ml BHI cair, diinkubasi pada 370 C sampai mencapai atau melebihi 0,5
Mc Farland (biasanya 2-3 jam).
b. Suspensi di atas ditambah salin steril hingga kekeruhan tertentu sesuai
dengan standart 0,5 Mc Farland/konsentrasi kuman 1-2 x 108 CFU per
ml (CFU = Colony Forming Unit).
49
c. Kapas lidi steril dicelupkan ke dalam suspensi kuman lalu ditekan-

tekan pada dinding tabung supaya tidak menetes kemudian diusapkan
pada permukaan media agar hingga rata.
d. Kemudian kertas samir (disk) yang mengandung antibiotik diletakkan
di atas media, diinkubasi pada 370C selama 18-24 jam (Wanger, 2007).
Dibaca hasilnya :
1. Zona radikal = suatu daerah di sekitar disk di mana sama sekali tidak
diketemukan adanya pertumbuhan bakteri. Potensi antibiotik diukur
dengan mengukur diameter dari zona radikal.
2. Zona irradikal = suatu daerah di sekitar disk menunjukkan
pertumbuhan bakteri dihambat oleh antibiotik tersebut, tetapi tidak
dimatikan. Di sini akan terlihat adanya pertumbuhan yang kurang
subur/lebih jarang, dibanding dengan daerah di luar pengaruh
antibiotik tersebut.
Gambar 15. Visualisasi zona hambat radikal dan irradikal
3. Cara sumuran
a,b,c sama dengan cara Kirby Bauer.
d. Pada agar tersebut dibuat sumuran dengan garis tengah tertentu
menurut kebutuhan. Ke dalam sumuran tersebut diteteskan larutan
antibiotik yang digunakan. Diinkubasi pada 370C selama 18-24 jam.
Dibaca hasilnya, seperti pada cara Kirby Bauer.
50
3. Cara pour plate

a dan b, sama dengan cara Kirby Bauer.
c. Dengan menggunakan ose khusus, ambillah satu mata ose dan
masukkan dalam 4 ml agar base 1,5 % yang mempunyai temperatur
500 C (diambil dari waterbath).
d. Setelah suspensi kuman tersebut dibuat homogen, tuanglah pada
media Muller Hinton agar.
e. Tunggulah sebentar sampai agar tersebut membeku, letakkanlah disk
antibiotik.
f. Eramkanlah selama 15-20 jam dengan temperatur 370C.
g. Bacalah dengan disesuaikan standard masing-masing antibiotik.
Untuk masing-masing antibiotik dan jenis kumannya, mempunyai

diameter yang berbeda-beda untuk dinilai sebagai antibiotik yang sensitif
(poten dalam terapi) seperti pada Tabel 9.
51
Tabel 9. Interpretasi zona diameter standard dan korelasinya dengan MIC

Isi Diameter zona hambatan Korelasi dengan MIC
(mm) (mg/ml)
Antibiotik disk Resisten Interme- Sensitif Resisten Sensitif
() diet () () ()
1. Ampicillin 10 g
- kuman perut 11 12-13 14 32 8
dan Enterococcus
- Staphylococcus 20 21-28 29 2 0,2
- Hemophylus 19 - 20 - 2
2. Carbenillin 50 g
- Proteus 17 18-22 23 32 16
- Pseudomonas 12 13-14 15 250 125
3. Chepalotin 30 g 14 15-17 18 32 10
4. Chloramphenicol 30 g 11 13-17 18 25 12,5
5. Clidamycin 2 g 14 15-16 17 2 1
6. Erythromycin 15 g 13 14-17 18 8 2
7. Gentamycin 10 g 11 - 13 6 6
8. Kanamycin 30 g 13 14-17 18 25 6
9. Methicillin 5 g
- Staphylococcus 9 10-13 14 - 3
10. Neomycin 30 g 12 13-16 17 - 10
11. Penicillin G 10 unit
- Staphylococcus 20 21-28 29 - 0,11
- kuman lain 11 12-22 22 32 1,5
12. Polimixin B 300 g 8 9-11 12 - 50
13. Streptomycin 10 g 11 12-14 15 15 6
14. Tetracyclin 30 g 14 15-18 19 12 4
15. Vancomycin 30 g 9 10-11 11 - 5
16. Sulfa 150-300g 12 13-16 17 35mg/100ml 10mg/100ml
17. Citromoxazole 25 g 10 11-15 16 200 35
18. Nitrofurantoin 300 g 14 15-18 19 100 25
19. Nalidixic acid 30 g 13 14-18 19 32 12
III. ALAT DAN BAHAN

a. Alat 5. Pinset
1. Lampu spiritus 6. Penggaris
2. Inkubator 7. Cork borer
3. Mikropipet 8. Silinder logam steril
4. Spreader
52
b. Bahan
1. Kultur cair bakteri 5. Media Mueller Hinton
2. Yellow tips 6. Cork borer
3. Disk antibiotik 7. Lempeng silinder
4. Disk kosong 8. Larutan antibiotik
IV. CARA KERJA

Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik
spiritus.
menit.
3. Letakkan beberapa disk antibiotik di atas media menggunakan
pinset.
4. Labeli cawan dengan keterangan nama bakteri uji, kelas,
5. Inkubasi pada suhu 37C selama 24 jam dalam posisi terbalik.
6. Amati ada tidaknya zona hambat pada daerah sekitar disk.
7. Jika ada zona hambat, ukur diameternya menggunakan penggaris
(Gambar 15) sebanyak 2 kali dari sisi yang berbeda dan hitung
rata-rata diameternya dalam satuan mm. Jika tidak ada zona
hambat, diameternya dihitung sama dengan diameter disk.
Tentukan sifat bakteri terhadap antibiotik berdasarkan Tabel 9.
, http://mikrobiologie.lf3.cuni.cz/engl/pract1.htm
Gambar 16 Cara mengukur diameter zona hambat hasil uji

sensitivitas bakteri menggunakan penggaris.
53
Uji aktivitas antibiotik menggunakan metode difusi disk, sumuran,

dan silinder
spiritus.
menit.
3. Letakkan disk kosong dan silinder di atas media.
4. Buat sumuran menggunakan cork borer.
5. Masukkan 10 L larutan antibiotik ke dalam sumuran, disk, dan
silinder.
6. Labeli cawan dengan keterangan nama bakteri uji, kelas,
7. Inkubasi pada suhu 37C selama 24 jam dalam posisi tegak.
8. Amati ada tidaknya zona hambat pada daerah sekitar disk,
sumuran, dan silinder. Ambil silinder.
9. Jika ada zona hambat, ukur diameternya menggunakan penggaris
(Gambar 15) sebanyak 2 kali dari sisi yang berbeda dan hitung
rata-rata diameternya dalam satuan mm. Jika tidak ada zona
hambat, diameternya dihitung sama dengan diameter disk.
54
MODUL 8
PEMERIKSAAN POTENSI ANTIBIOTIK
Mahasiswa mampu melakukan uji antibakteri dengan metode dilusi
cair dan menentukan Kadar Hambat Minimal larutan antibakteri yang
diuji.
II. DASAR TEORI

Tujuan pemeriksaan ini adalah untuk mengetahui daya antibakteri
dari suatu antibiotik terhadap bakteri standar.
Ada beberapa cara pemeriksaan potensi antibiotik yaitu:
A. Agar diffusi : untuk industri obat-obatan juga rumah sakit, dan untuk
menetapkan potensi obat dalam bentuk bahannya.
B. Turbidimetri :
1. Pengenceran seri bahan pemeriksaan/larutan obat, ditambah
suspensi kuman dengan konsentrasi 104 CFU per ml. Suspensi
kuman ini diperoleh dengan mengencerkan pertumbuhan kuman
dalam kaldu yang telah diinkubasi semalam. Kemudian campuran
tersebut diinkubasi 18-24 jam. Lalu dicari MIC-nya (Minimum
Inhibitory Concentration), yaitu konsentrasi terkecil yang masih
mampu menghambat pertumbuhan kuman.
2. Cara yang lebih teliti adalah dengan menggunakan kurva berbagai
konsentrasi antibiotika.
Prosedur uji dilusi

Metode ini digunakan untuk mencari MIC.
Dasar : pengenceran seri antibiotik ditambah mikroorganisme
kemudian dieramkan.
MIC : konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan
kuman.
Bahan yang dipersiapkan (antibiotik) :

Bahan yang diperiksa (antibiotik) harus asli dan murni dan kadar (mcg atau
unit) serta tanggal kadaluwarsanya harus diketahui. Serbuk antibiotik
kemudian ditimbang dan dilarutkan dengan pelarut yang sesuai (sebagai
larutan induk) dan disimpan pada suhu -200 C atau lebih.
55
Dilusi
1. Dilusi cair (macro broth dilution)
a. Lakukan pengenceran antibiotika yang diperiksa, sehingga didapat
beberapa konsentrasi. Pelarut dan pengencer antibiotik dapat dilihat
pada Tabel 10.
Caranya :
▪ Siapkan 10 tabung steril (ukuran 13 x 100 mm) nomor 1 s/d 11.
▪ Tabung no. 2 s/d 11 masing-masing diisi dengan 0,5 ml BHI/MH
Broth steril
▪ Tabung no. 1 dan 2 masing-masing diisi dengan 0,5 ml larutan
antibiotik.
▪ Larutan antibiotik di tabung no 2 dicampur homogen dan diambil
sebanyak 0,5 ml larutan dipindahkan ke tabung no 3, demikian
seterusnya sampai tabung nomor 9, blue tips diganti tiap kali
pengenceran larutan antibiotik tersebut.
▪ Larutan antibiotik di tabung no 9 diambil 0,5 ml dan dibuang.
▪ Tabung no 10 tidak diberi larutan antibiotik (kontrol bakteri).
b. Penyiapan inokulum bakteri sama seperti penyiapan inokulum untuk
uji difusi, tetapi setelah kekeruhan sama dengan standar 0,5 Mc
Farland, inokulum diencerkan 1:100 (106 CFU/ml) menggunakan NaCl
0,9% steril. Dalam 15 menit, 0,5 ml suspensi bakteri ditambahkan ke
dalam tiap tabung kecuali tabung nomor 11 (kontrol media).
Konsentrasi inokulum akhir adalah 105 CFU/ml.
c. Sebanyak 10 μl suspensi bakteri dari tabung nomor 10 (kontrol
bakteri) digoreskan ke media MH Agar dan diinkubasi semalam untuk
mengecek kemurnian isolat dan kebenaran ukuran inokulum. Adanya
sekitar 50 koloni mengindikasikan kerapatan inokulum 5 x 105 CFU/ml.
d. Semua tabung diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Sebelum
diamati, tabung digojog dengan baik. Kadar hambat minimum (KHM)
adalah konsentrasi terendah antibiotik yang menghambat
pertumbuhan bakteri, ditandai dengan tidak adanya kekeruhan visual
dibandingkan dengan kontrol negatif.
e. Kadar bunuh minimum (KBM) adalah konsentrasi terendah antibiotik
yang membunuh sebagian besar (99,9%) inokulum bakteri. KBM
ditetapkan dengan menggoreskan 50 μl suspensi dari semua tabung
yang jernih pada uji dilusi (penentuan KHM) ke plate agar yang
terpisah. Setelah inkubasi 37oC selama 18-24 jam, jumlah koloni yang
56
tumbuh pada masing-masing plate dicatat. Konsentrasi pertama yang

menghasilkan kurang dari 25 koloni dianggap sebagai KBM (Qaiyumi,
2007; Smith, 2004)
2. Dilusi padat
a. Siapkan suspensi kuman seperti pada dilusi cair
b. Buat beberapa pengenceran antibiotika.
c. Lelehkan media padat. Dinginkan sampai temperatur kurang lebih 50-
550C. Ambil 90 ml media tambahkan 10 ml larutan pengenceran
antibiotik, kocok. Tuangkan ke petri steril kurang lebih 25 ml. Biarkan
3-5 menit sampai mengeras.
d. Ambil kapas lidi, celupkan pada suspensi kuman, tekan-tekan pada
pinggir tabung supaya tidak menetes. Usapkan pada permukaan
media sampai merata.
e. Inkubasi 370C 18-24 jam. Kemudian lihat pertumbuhan kuman.
III. ALAT DAN BAHAN

a. Alat
1. Lampu spiritus
2. Inkubator
3. Mikropipet
4. Tabung reaksi
5. Rak tabung reaksi
b. Bahan
1. Kultur cair bakteri
2. Blue tips tips
3. Larutan antibakteri
4. Media BHI cair
5. Etanol 70%
57
Tabel 10. Pelarut dan Pengencer Antibiotik
Antibiotik Pelarut Pengencer
1. Ampicilin Buffer fosfat pH 8.0 + 0,14 Buffer fosfat 0,1 M
2. Carbenicillin Akuades Akuades
3. Cephalotin Buffer fosfat 0,1 M pH 6.0 Akuades
4. Chloramphenicol Ethanol Akuades
5. Clindamycin Akuades Akuades
6. Cycloserine Akuades Akuades
7. Erytromycin Ethanol Akuades
8. Ethambutol Akuades Akuades
9. Flucilosin Saline Saline 0,85 % Akuades
10.Gentamycin Buffer Fosfat Buffer fosfat 0,1 M pH 8.0 Akuades
11.Isoniazed Akuades Akuades
12. Kanamycin Buffer fosfat 0,1 M pH 8 Akuades
13. Nalidixic acid NaOH 1 N Akuades
14. Nitro furantoin Limethyl paramide Akuades
15. Oxacillin Akuades Akuades
16. P. Amino Salisilat Akuades Akuades
17. Penicillin Akuades Akuades
18. Polymixcyn Akuades Buffer phospat pH 7
19. Rifampicin Dimethyl sulfoxid Akuades
20. Streptomycin Akuades Akuades
21. Sulfon Amide Akuades panas + sedikit NaOH Akuades
10%
22. Tetracyclin Akuades Akuades
23. Vancomycin Akuades Akuades
IV. CARA KERJA

2. Siapkan 9 tabung steril dan beri nomor 1-9.
3. Tabung no. 2-9 masing-masing diisi 0,5 ml BHI steril
4. Tabung no.1 diisi 1 ml larutan antibakteri
5. Tabung no. 2 ditambah 0,5 ml larutan antibakteri dari tabung
no. 1, campur homogen.
6. Ambil 0,5 ml larutan dari tabung no. 2 lalu masukkan ke dalam
tabung no. 3, campur homogen.
7. Ambil 0,5 ml larutan dari tabung no. 3 lalu masukkan ke dalam
tabung no. 4, campur homogen.
58
8. Lakukan seterusnya sampai tabung no. 7, campur homogen,

ambil 0,5 ml dan buang.
9. Tambahkan 0,5 ml suspensi bakteri dalam media BHI
(106 CFU/ml) ke dalam tabung no. 1-8
Tabung kontrol:
Tabung no. 8 (K1): berisi 0,5 ml media BHI + 0,5 ml suspensi
bakteri
Tabung no. 9 (K2): berisi 0,5 ml media BHI
10. Inkubasi semua tabung (termasuk tabung kontrol) pada suhu
37C selama 18-24 jam.
11. Gojog tiap tabung dan amati pertumbuhan bakteri (kekeruhan
pada tiap tabung). Media yang jernih menandakan tidak ada
pertumbuhan bakteri yang terlihat.
12. Tentukan nilai KHM larutan antibakteri yang diuji (Gambar 16).
http://www.bsac.org.uk/wpcontent/uploads/2015/12/Susceptibility-testing-methods.pdf
Gambar 17. Hasil uji dilusi cair dan penentuan nilai KHM
59
MODUL 9
PENETAPAN ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) EKSTRAK
Mahasiswa mampu melakukan uji dan menetapkan angka lempeng
total ekstrak.
II. DASAR TEORI

Angka lempeng total merupakan salah satu parameter non spesifik
ekstrak, yaitu aspek yang tidak terkait dengan aktivitas farmakologi secara
langsung namun mempengaruhi aspek keamanan dan stabilitas ekstrak
dan sediaan yang dihasilkan. ALT menunjukkan jumlah koloni bakteri
aerob mesofil per gram sampel, setelah sampel diinokulasikan pada
media lempeng agar dengan cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang
sesuai. Terdapat batasan nilai ALT dari BPOM RI baik terhadap bahan baku
ekstrak maupun sediaannya.
III. ALAT DAN BAHAN

I. Alat
1. Laminar air flow (LAF) 6. Rak tabung reaksi
2. Lampu spiritus 7. Cawan Petri steril
3. Inkubator 8. Neraca analitik
4. Mikropipet 9. Labu takar
5. Tabung reaksi steril 10. Microwave atau kompor
II. Bahan
1. Ekstrak 4. Media plate count agar
2. Etanol 70% (PCA)
3. Pepton dilution fluid 5. Blue tips
(PDF)
IV. CARA KERJA

1. Semprot permukaan dalam LAF dengan etanol 70% dan lap
sampai kering.
2. Semprot alat dan bahan yang akan digunakan dengan etanol 70%
lalu masukkan ke dalam LAF.
3. Nyalakan lampu UV selama 15 menit.
4. Siapkan 6 tabung reaksi steril di dalam LAF.
60
5. Timbang 1 gram ekstrak lalu masukkan ke dalam labu takar 10 mL.

Tambahkan larutan PDF sampai tanda, gojog sampai homogen
(disebut pengenceran 10-1).
6. Masukkan suspensi ekstrak tersebut ke dalam tabung reaksi steril
(tabung 1).
7. Masukkan 9 ml PDF ke dalam tabung reaksi 2-6.
8. Gojog tabung 1 dan ambil 1 ml suspensi ekstrak (10-1) lalu
masukkan ke dalam tabung 2 (10-2).
13. Cairkan media PCA menggunakan microwave atau kompor.
Tunggu sampai hangat (45 ± 1oC).
14. Pipet suspensi dengan pengenceran 10-1-10-6 sebanyak 1 ml lalu
masukkan tiap pengenceran ke dalam cawan Petri steril.
15. Tuang 20 mL PCA hangat ke dalam cawan Petri steril yang telah
berisi 1 ml suspensi ekstrak dengan pengenceran 10-1-10-6.
16. Goyang dan putar cawan Petri sedemikian rupa hingga suspensi
tersebar merata. Diamkan hingga memadat.
17. Lakukan uji sebanyak 2 kali (duplo).
18. Tuang 20 ml media PCA hangat ke dalam cawan Petri steril dan
diamkan hingga memadat (kontrol media).
19. Masukkan 1 ml PDF ke dalam cawan Petri steril lalu tambah
dengan 20 ml media PCA hangat, goyang dan putar hingga PDF
tersebar merata. Diamkan hingga memadat (kontrol pengencer).
20. Setelah media memadat, cawan petri inkubasi pada suhu 35-37oC
selama 24-28 jam dengan posisi terbalik. Amati dan hitung jumlah
koloni yang tumbuh.
Penghitungan menurut Farmakope Indonesia edisi VI (2020)

Pilih cawan dari satu tingkat pengenceran dengan jumlah koloni tertinggi
yang kurang dari 250 untuk ALT. Hitung jumlah rata-rata koloni dalam media
biakan dan jumlah koloni per g atau per mL sediaan. Jumlah koloni rata-rata
61
dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya.
Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total dalam setiap gram
sampel.
Penghitungan menurut Monografi Ekstrak (2004)

Cawan Petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni
antara 30-300 dipilih. Jumlah koloni rata-rata dari kedua cawan dihitung
lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai
Angka Lempeng Total dalam setiap gram contoh. Bila ditemui jumlah
koloni kurang dari 30 atau lebih dari 300, maka diikuti petunjuk sebagai
berikut:
(1) Bila hanya salah satu diantara kedua cawan yang menunjukkan
jumlah antara 30-300 koloni, dihitung rata-rata dari kedua cawan dan
dikalikan dengan faktor pengenceran.
(2) Bila pada cawan petri dari dua tingkat pengenceran yang berurutan
menunjukkan jumlah antara 30-300 koloni, maka dihitung jumlah koloni
dan dikalikan faktor pengenceran kemudian diambil angka rata- rata. Jika
pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi didapati jumlah kolonilebih
besar dari dua kali jumlah koloni yang seharusnya, maka dipilih tingkat
pengenceran terendah missal pada pengenceran 10-2 diperoleh 140
koloni dan pada pengenceran 10-3 diperoleh 32 koloni, maka dipilih
jumah koloni pada tingkat pengenceran 10-2.
(3) Bila dari seluruh cawan petri tidak ada satupun yang menunjukkan
jumlah antara 30-300 koloni, maka dicatat angka sebenarnya dari tingkat
pengenceran terendah dan dihitung sebagau Angka Lempeng Total
Perkiraan.
(4) Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan dan bukan
disebabkan karena faktor inhibitor, maka Angka Lempeng Total
dilaporkan sebagai kurang dari satu dikalikan faktor pengenceran
terendah.
(5) Bila jumlah koloni per cawan lebih dari 3000, maka cawan dengan
tingkat pengenceran tertinggi dibagi dalam beberapa sektor (2,4, atau 8).
Jumlah koloni dikalikan dengan faktor pembagi dan faktor
pengencerannya, hasil dilaporkan sebagai Angka Lempeng Total
Perkiraan.
(6) Bila jumlah koloni lebih dari 200 pada bagian cawan, maka jumlah
koloni adalah 200 x 8 x faktor pengenceran. Angka Lempeng Total
Perkiraan dihitung sebagai lebih besar dari jumlah koloni yang diperoleh.
62
MODUL 10
PEMERIKSAAN AIR MINUM SECARA BAKTERIOLOGIK
Mahasiswa dapat melakukan pemeriksaan air minum dan
menentukan kelayakannya untuk dikonsumsi.
II. DASAR TEORI

Macam-macam standard dan tes yang digunakan untuk pemeriksaan air
tergantung pada penggunaan air untuk minum, renang, produksi
/pengolahan ikan, industri. Flora bakteri di dalam air minum sangat
bermacam-macam dan tidak sama pada setiap contoh air. Karena itu
sebaiknya perlu diadakan pemeriksaan yang teratur terhadap air minum.
Bila dari pemeriksaan suatu laboratorium dinyatakan baik (pemeriksaan
tunggal), belum tentu air tersebut baik sebagai air minum.
A. Standar Air Minum

Standard yang dipakai adalah WHO. Semua sampel tidak boleh
mengandung E. coli dan sebaiknya juga bebas dari bakteri Coliform.
Standard dari WHO tersebut ialah :
1. Dalam setiap tahun, 95 % dari sampel-sampel tidak boleh
mengandung Coliform dalam 100 ml.
2. Tidak ada sampel yang mengandung E. coli dalam 100 ml.
3. Tidak ada sampel yang mengandung Coliform lebih dari 10 dalam 100
ml.
4. Tidak boleh ada Coliform dalam 100 ml dari dua sampel yang
berurutan.
B. Frekuensi Sampling
Sering mengambil sampel dan diperiksa dengan cara yang sederhana
lebih baik daripada jarang mengambil sampel walaupun cara
pemeriksaannya lebih lengkap.
Pengambilan sampel perlu ditingkatkan bila keadaan :
1. Sangat panas.
2. Kecepatan aliran berkurang.
3. Hujan deras terus menerus.
4. Angin kencang.
5. Angin berdebu.
63
C. Metode Sampling dan Pengirimannya

Pada waktu sampling, harus selalu dijaga agar tidak terjadi
kontaminasi. Untuk itu digunakan botol steril yang tertutup (screw cup)
yang dibalut dengan celophan sebelum diautoklaf. Bila yang akan diambil air
yang telah diklorinasi, botol diberi sedikit larutan Na2S2O3, misalnya 0,1 ml
dari 3 % Na2S2O3 tiap 100 ml air sebelum disterilkan.
Petunjuk untuk sampling adalah sebagai berikut :

1. Botol steril tidak boleh dibuka sebelum akan digunakan untuk
mengambil sampel dan tidak boleh dicuci dulu sebelum diisi sampel.
2. Perekat pada tutup dibuka.
3. Tutup dibuka, dijaga agar jari-jari tidak menyentuh mulut botol atau
permukaan tutup botol bagian dalam.
4. Botol segera diisi dengan air dan ditutup kembali seperti semula.
Harus diberi ruang udara dalam botol agar populasi bakteri dalam
udara tersebut juga ikut bercampur dengan air.
5. Sampel dari kran
Buka penutup kran (kalau ada) bersihkan bagian luar dan dalam dari
kran. Alirkan air selama 2-3 menit sebelum mengisi botol
penampung.
6. Sampel dari sungai, mata air, danau, bak persediaan atau sumur
Harus dilakukan agar mendapatkan sampel yang representatif dari air
yang digunakan konsumen. Oleh karena itu tidak tepat bila
pengambilan sampel sangat dekat dengan sumber/tempat
persediaan air atau tempat keluarnya. Aliran/arus pada daerah yang
stagnasi harus dihindari dan dihindari pula perusakan tempat
persediaan air. Bila mengambil air dalam volume yang besar
digunakan sampling stick. Botol diikat pada ujung tongkat yang
panjangnya 4-8 kaki dan tutupnya dibuka. Botol dimasukkan secara
cepat sedalam satu kaki dari permukaan dengan menghadap ke
bawah, botol akan segera bergerak dengan mulut botol. Jika sudah
penuh, botol segera diangkat dari air dan segera ditutup. Jika tidak
digunakan sampling stick, masukkan botol dekat dasar dengan
tangan. Tenggelamkan botol dalam air sedalam 3 cm dan gerakkan
botol dalam air menentukan arus.
64
7. Sampel dari pompa tangan

Pompa digerakkan 5 menit sebelum diambil sampelnya. Permukaan
pompa dibakar dulu. Sampel ditampung langsung dari pompa ke
botol.
Besar Sampel
Volume minimum yang diperlukan untuk analisis dari semua jenis air
adalah 100 ml. Jika akan diperiksa adanya patogen misalnya Salmonella,
volume sampelnya 500 ml.
Pengiriman Sampel
Sampel segera dimasukkan ke dalam portable ice box pada central
cannister. Di sekitar cannister diletakkan es yang dipotong-potong atau
dry ice. Bila lama pengiriman (dari pengambilan sampai laboratorium)
kurang dari 4 jam, tidak perlu temperatur seperti refrigator, tapi cukup
dijaga dalam keadaan dingin selama perjalanan. Laboratorium harus
menerima kabar waktu pengiriman dan harus disertai form yang lengkap
pada sampel.
D. Pengujian Bakteriologik dari Air Minum.

Pengujian bakteriologik ini terutama berhubungan dengan kesehatan
lingkungan dalam usaha membasmi bakteri patogen dalam air minum.
Oleh karena kuman patogen biasanya ada dalam jumlah kecil, maka tidak
sesuai bila digunakan sebagai standar untuk pengujian, sehingga bakteri
yang berasal dari faeses dipakai sebagai indikator adanya bakteri patogen
yang berasal dari perut.
Kuman patogen dapat berasal dari manusia, binatang (piaraan dan
liar) dan burung, walaupun demikian tidak dapat diasumsikan bahwa air
dari persedian yang tertutup untuk pabrik (diisolasi) dan distok akan
bebas dari kuman perut, walaupun biasanya derajat kontaminasi jauh
berkurang. Yang biasa digunakan sebagai indikator dari populasi faeses
adalah E. coli, juga Streptococcus faecalis, Clostridium perfingens dan virus
perut.
Ada beberapa metode pemeriksaan air minum, diantaranya :

1. Metode Most Probable Number (MPN)/Angka Paling Mungkin (APM)
Golongan coliform termasuk bakteri batang Gram negatif yang tidak
membentuk spora dan fakultatif anaerob, yang tumbuh dengan adanya
garam empedu dan memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam
pada 37C, oksidase negatif. E.coli adalah salah satu grup coliform yang
65
dapat memfermentasi laktosa dengan membentuk asam dan gas pada

44C, indol positif, tidak dapat menggunakan citrat, menghasilkan asam
dari manitol pada 37C, MR positif, VP negatif.
Media yang dipergunakan :
a. LB (Lactose Broth, Gibco b. BGLB (Brilian Green Lactose
Broth)
Beef extract 3,5 g Pepton
Pepton 5,0 g Lactose
Lactose 5,0 g Ox gall
Distilled Water 1 L Briliant Green
Distilled Water 1 L
Catatan :
Untuk memudahkan pembacaan, tabung II yang sudah diberi satu
tetes cairan dari tabung I yang menghasilkan gas diletakkan tepat di
belakang tabung tahap I tersebut, serta seluruh tabung tahap I ikut
dieramkan lagi bersama tabung tahap II. Hal ini sangat perlu untuk
menghitung jumlah coliform.
Jumlah coliform (Tabel 9) dapat dilihat dengan dari buku :
Standar Method for The Examination of Water and Waste Water.
Edition, 1971, Michael J. Taras.
MPN INDEX AND 95 % Conference limits for various combination of
positive and geatif result when three 100 ml portions, three 1 ml portions
and three 0,1 portions are used.
2. Filtrasi Membran
Sebagian besar laboratorium menggunakan metode ini jika
kekeruhan air memerlukan filtrasi. Sejumlah volume air yang cocok,
difiltrasi melalui membran steril. Volume aliquot untuk air kualitas tinggi
adalah 50 - 100 ml, sedangkan untuk kualitas rendah dan air
terkontaminasi yang telah diencerkan ialah 10 ml. Jumlah koloni pada
membran yang baik untuk dihitung ialah 10-80 koloni. Keuntungan dari
metode membran ini ialah dapat dikerjakan dengan cepat seBAB lebih
baik memeriksa dengan frekuensi yang lebih banyak dengan metode
sederhana daripada dengan metode yang lebih rumit seperti metode
MPN.
66
a. Prosedur Umum
Simpan air dalam pendingin sampai siap diperiksa. Digunakan
membran asetat (0,45) pada filter stainles steel. Cuci dengan akuadest
steril setiap ganti air yang difiltrasi dan harus diganti sesudah dipakai 6
sampel.
1. Saring sejumlah volume tertentu yang sesuai melalui membran
steril.
2. Gunakan pompa vakum. Dengan tang steril, ambil membran dan
letakkan pada media dengan menempelkan bagian yang
mengandung bakteri pada agar, hati-hati agar tidak terjadi
gelembung udara antara membran dan agar.
3. Inkubasikan dan hitung koloni. Hitung jumlah koloni per 100 ml
sampel, dengan anggapan 1 koloni berasal dari membran.
b. Konfirmasi Koloni dan Perhitungan Kuman

Sebagian koloni adalah khas, 5-100 % adalah tetap tergantung pada
jumlah seluruh koloni. Bila ada koloni yang jelas berbeda morfologinya,
tiap grup dihitung dan ditetapkan terpisah (ditetapkan sendiri-sendiri).
Bila koloni dianggap campuran, gunakan metode seperti pada The
Bacteriological Examination of Water Supply Sample.
67
Tabel 11. Jumlah Tabung yang Memberikan Reaksi Positif pada Pemeriksaan Air Minum
MPN INDEX
3 of 10 mL 3 of 1 mL each 3 of 0,1 mL MPN per 100
each each mL
0 0 0 <3
0 0 1 3
0 1 0 3
1 0 0 4
1 0 1 7
1 1 0 7
1 1 1 11
1 2 0 11
2 0 0 9
2 0 1 14
2 1 0 15
2 1 1 20
2 2 0 21
2 2 1 28
3 0 0 23
3 0 1 33
3 0 2 64
3 1 0 43
3 1 1 755
3 1 2 120
3 2 0 93
3 2 1 150
3 2 2 210
3 3 0 240
3 3 1 160
3 3 2 1100
3 3 3 2400
1. Menghitung golongan Coliform

Untuk air yang tidak diobati diambil 50 dan atau 10 ml disaring.
Filter diletakkan pada agar M-ENDO-LES atau agar tepol. Inkubasikan
68
pada 30C, 119 jam. Semua koloni yang berwarna metalik pada M-
ENDO-LES, atau kuning pada agar tepol termasuk golongan Coliform
yang mengkilat dapat terdapat di bagian tepi koloni.
Untuk air yang tidak diobati, diambil 100 ml dan difiltrasi. Filter
diletakkan pada agar tepol dan diinkubasi seperti di atas. Hitung koloni
yang kuning, juga yang orange atau kuning muda.
Untuk menegaskan, dilakukan subkultur pada Brilian Green Lactose
Bile Broth dan diinkubasi pada 36C, catat adanya gas pada 24 ± 2 jam
dan pada 48 ± 2 jam.
2. Menghitung E.coli
Untuk air yang tidak diobati, ambil 50 ml dan atau 10 ml difiltrasi
dan membran diletakkan pada agar M-ENDO-LES atau agar tepol,
diinkubasi pada 30C, 1,5 –2 jam, kemudian pada 44,4C, 18-32 jam.
Hitung koloni yang mengkilat pada Endo dan kuning pada tepol. Koloni
E. coli ada yang tidak spesifik baik ukuran maupun warnanya (kuning –
coklat tua).
Untuk air yang diobati, biasanya yang difiltrasi adalah 100 ml. Filter
letakkan pada agar tepol, inkubasi pada 36º C selama 2-4 jam dan
kemudian pada 44,4º C, 18-20 jam. Hitung koloni yang datar-cembung
atau cembung berwarna kuning.
Untuk menegaskan inkubasikan pada media Fennels, pada 44,4º C
selama 24 jam. Catat tabung-tabung yang mengeluarkan gas dan indol.
3. Menghitung Faecal Streptococci

Faecal Streptococci terdapat pada usus binatang dan manusia dan
termasuk spesies streptococcus faecalis dan S. faecium. Adanya
organisme tersebut dalam air yang bebas E. coli tapi dengan jumlah
Coliform yang tunggal, menandakan adanya pencemaran faeces.
Faecal Streptococci lebih resisten chlorin dan oleh karena itu
penggunaan indeks dari pengobatan yang efisien dapat mencapai nol
setelah chlorinasi. Tehnik yang digunakan tergantung pada
penggunaan sodium azide sebagai inhibitor yang selektif dan tumbuh
44C. Volume air yang sesuai difiltrasi ( untuk air yang diobati 100 ml
). Kemudian membran diletakkan pada media datar kuning dari sinetz
dan Bartley ‘s glucosa azide. Untuk air yang diobati diinkubasi pada
36C selama 4 jam kemudian pada 44,4C selama 44 jam.
69
4. Metode Plate Count

Perhitungan bakteri secara umum pada air, menggunakan petunjuk
untuk mengelola penandaan air. Dapat dilihat bahwa kontaminasi
pada air yang sudah dichlorinasi jumlahnya sedikit. Di USA jumlahnya
kurang dari 300 per ml. Bakteri yang dapat tumbuh di air, dapat
tumbuh lebih baik pada suhu 22C, daripada temperatur yang lebih
tinggi. Bakteri yang tumbuh paling baik pada suhu 37C, biasanya
dalam air tidak dapat tumbuh dengan baik dan lebih banyak karena
pencemaran dari sumber eksternal. Jika dua grup dari bakteri berbeda
secara nyata, diperlukan perhitungan yang berbeda (sendiri-sendiri).
Tes untuk sampel dan penggeseran yang sesuai :
a) Tambahkan 1 ml pada 2 petri.
b) Campur air sampel dengan 15 Nutrien Agar yang cair dan biarkan
beku.
c) Inkubasi pada 20-22º C, 3 hari dan yang lain 37º C, 1 hari.
d) Hasil dinyatakan sebagai jumlah koloni yang tumbuh per ml dari
sampel asli.
III. ALAT DAN BAHAN

a. Alat
1. Propipet
2. Pipet ukur steril
3. Mikropipet
4. Tabung reaksi
5. Tabung Durham
6. Inkubator
b. Bahan
1. Media LB
2. Media BGLB
3. Sampel air minum
IV. CARA KERJA
1. Ambil sampel air minum yang akan diperiksa dengan wadah
steril.
2. Siapkan 9 tabung reaksi steril yang telah berisi tabung
Durham.
70
3. Masukkan media LB sebanyak 5 mL ke dalam 3 tabung; 9,5

mL ke dalam 3 tabung yang lain; dan 9,95 mL dalam 3
tabung
4. Masukkan air minum ke dalam tabung reaksi kosong dan
yang telah berisi media LB hingga volume total 10 mL.
5. Inkubasi pada suhu 37C selama 18-24 jam.
6. Amati ada/tidaknya gas. Pembentukan gas ditandai dengan
adanya gelembung pada tabung Durham.
7. Jika tidak ada gas berarti air minum tidak mengandung
coliform.
Jika ada gas berarti kemungkinan air minum mengandung
coliform.
8. Lakukan uji penegasan: Ambil satu tetes cairan dari semua
tabung, lalu masukkan masing-masing ke dalam media
BGLB.
9. Inkubasi pada 37C selama 18-24 jam.
10. Amati ada/tidaknya gas. Pembentukan gas ditandai dengan
adanya gelembung pada tabung Durham.
11. Jika tidak ada gas berarti air minum tidak mengandung
coliform.
Jika ada gas berarti air minum mengandung coliform
12. Hitung MPN per mL sampel menggunakan tabel 11.
71
MODUL 11
UJI ANTIBAKTERI DENGAN METODE DIFUSI SUMURAN DAN BIOAUTOGRAFI
1. Mahasiswa mampu melakukan uji aktivitas antibakteri
dengan metode difusi sumuran dan menganalisis hasilnya.
2. Mahasiswa mampu melakukan bioautografi dan menganalisis
hasilnya.
II. DASAR TEORI

Bioautografi merupakan teknik laboratorium untuk mendeteksi
senyawa dalam campuran kompleks dan matriks yang mempengaruhi
kecepatan pertumbuhan organisme uji. Metode tersebut didasarkan pada
aktivitas biologis analit yang dapat berupa antibakteri, antijamur,
antitumor, antiprotozoal dan lain-lain. Bidang utama bioautografi adalah
mencari senyawa antibiotik baru dan antijamur baru, antitumor,
antiprotozoal dengan mempelajari aktivitas biologis senyawa yang berasal
dari tanaman, mikroorganisme, dan dari sumber lain. Bioautografi banyak
digunakan untuk skrining senyawa antimikroba. Metode difusi dan dilusi
juga digunakan.
Bioautografi
Kromatografi kertas yang diikuti oleh bioautografi digunakan
pertama kali pada tahun 1946 oleh Goodal dan Levi untuk menentukan
kemurnian penisilin. Metode tersebut dinamakan bioautografi kontak
(kertas kromatogram diletakkan di atas media yang telah diinokulasi
bakteri sehingga antibiotik dapat berdifusi dari kertas ke agar). Fisher dan
Lautner serta Nicolaus dkk memperkenalkan kromatografi lapis tipis-
bioautografi pada tahun 1961. Keuntungan utama bioautografi adalah
dapat memberikan terkait aktivitas antimikroba senyawa yang telah
dipisahkan dari campuran. Metode bioautografi biasanya dibagi menjadi
beberapa kategori: difusi agar atau bioautografi kontak, immersion atau
agar-overlay bioautography, dan bioautografi langsung.
a. Bioautografi kontak
Dalam bioautografi kontak, antimikroba berdifusi dari plat KLT atau kertas
ke media agar yang telah ditanami bakteri uji. Kromatogram diletakkan
72
menghadap ke media dan dibiarkan beberapa menit atau jam agar

senyawa dapat berdifusi. Setelah itu, kromatogram diambil dan media
agar diinkubasi. Zona hambat akan teramati di permukaan media tepat di
spot senyawa antimikroba. Metode tersebut mirip metode difusi disk.
Kelemahan bioautografi kontak adalah kesulitan untuk memperoleh
kontak yang baik antara media dan plat serta menempelnya adsorben
pada permukaan agar. Masalah tersebut dapat diatasi dengan
menggunakan plat asam silikat-kaca, chromAR dan lain-lain.
b. Immersion bioautography
Dalam bioautografi imersi, kromatogram dituangi media hangat yang
telah ditambah bakteri uji. Setelah media memadat, inkubasi, dan
pewarnaan (biasanya menggunakan pewarna tetrazolium), zona hambat
atau pita pertumbuhan dapat diamati. Kadang-kadang sebelum inkubasi
plat dibiarkan beberapa jam pada suhu rendah agar senyawa dapat
berdifusi dengan baik.
Agar-overlay merupakan gabungan dari bioautografi kontak dan
bioautografi langsung. Antimikroba dipindahkan dari plat KLT ke media
agar seperti pada bioautografi kontak tetapi selama inkubasi dan
visualisasi, media agar tetap berada pada plat seperti bioautografi
langsung. Agar-overlay dianjurkan khususnya ketika bioautografi
langsung tidak mungkin dilakukan. Pada tahun 1960an, bioautografi
kontak dan imersi dalam versi yang beragam digunakan secara rutin.
c. Bioautografi langsung
Dalam bioautografi langsung, plat yang sudah dielusi dimasukkan ke
dalam suspensi mikroorganisme yang ditumbuhkan dalam media cair
yang sesuai atau suspensi mikroorganisme disemprotkan ke plat. Plat
diinkubasi dan mikroorganisme tumbuh langsung di atas plat. Pemisahan
senyawa, pre-inkubasi, inkubasi, dan visualisasi dilakukan secara langsung
pada plat. Untuk menentukan lokasi dan visualisasi senyawa antibakteri,
garam tetrazolium biasanya digunakan. Garam tersebut diubah oleh
enzim dehidrogenase dalam mikroorganisme hidup menjadi formazan
yang berwarna. Jika bakteri pada plat KLT dapat dibunuh oleh senyawa
antibakteri, warna tidak terbentuk pada daerah/spot senyawa (disebut
zona hambat). Zona hambat berupa daerah berwarna pucat dengan latar
belakang yang berwarna.
73
Pewarna tetrazolium yang sering digunakan adalah 3-{4,5-

dimetiltiazol-2-il}-2,5-difenilltetrazolium bromida yang disebut MTT.
Reduksi garam tetrazolium dapat ditingkatkan beberapa kali dengan
penambahan deterjen (misalnya Triton X-100) pada pewarna. Uji
langsung dapat juga dilakukan dengan bakteri luminesen seperti
Photobacterium phosphoreum atau Vibrio fischeri. Plat dimasukkan
dengan cepat ke dalam suspensi bakteri, ditutup dengan plat kaca, dan
bioluminesens diukur menggunakan Peltier-cooled charged coupled
device (CCD) camera atau luminograph video imaging system.
Alternatifnya prosedur fotografik dengan film sinar X dapat digunakan.
Jika bakteri terpapar senyawa beracun bioluminesens berkurang sebagai
sinyal terganggunya proses penting di dalam sel. Meskipun begitu tidak
ada perubahan pertumbuhan bakteri dan metode dimasukkan ke
bioautografi langsung.
Bioautografi langsung biasanya dilakukan tanpa gel agar. Plat
dimasukkan ke dalam atau disemprot dengan kultur bakteri cair dengan
kekentalan yang sesuai yang menjamin kondisi untuk kehidupan bakteri
uji. Metode bioautografik lain yang disebut agar spray assay dapat
dianggap sebagai versi agar dari bioautografi langsung. Dehydrated
potato dextrose agar (PDA) disterilisasi, lalu didinginkan sampai suhu 48C
digunakan untuk menyiapkan larutan spora yang akan disemprotkan ke
plat KLT. Penyemprotan menggunakan penyemprot manual dilakukan
secara cepat untuk menghindari memadatnya media. Inokulum
dipadatkan pada ketebalan 0,5 mm dan plat diinkubasi pada suhu 25C
selama minimal 60 jam pada udara lembab sampai spora menghasilkan
lapisan miselium gelap. Zona hambat dapat dilihat tanpa pewarnaan.
Metode yang mirip juga digunakan oleh Mackeen dkk untuk menguji
aktivitas antijamur Garcinia atroviridis, tanaman buah dari Malaysia.
III. ALAT DAN BAHAN

a. Alat
1. Lampu spiritus 6. Lampu UV 254 nm
2. Pensil 7. Mikropipet
3. Penggaris 8. Pinset
4. Chamber 9. Spreader
5. Pipa kapiler 10. Inkubator
74
b. Bahan
1. Etanol 70% 8. Ampisilin 10%
2. Lempeng silika gel GF254 9. Eugenol 5%
3. Toluen 10. Media Mueller Hinton padat
4. Etil asetat 11. Kultur cair bakteri
5. Kertas saring 12. Yellow tips
6. Minyak cengkeh 5% 13. Bayclin
7. Minyak cengkeh 10%
IV. CARA KERJA

DIFUSI SUMURAN
2. Inokulasi media MH padat dengan 200 l kultur cair bakteri dan
ratakan menggunakan spreader. Diamkan selama 10 menit.
3. Buat 4 sumuran menggunakan cork borer no. 3, buang potongan
media ke dalam wadah berisi bayclin.
4. Masukkan 20 l ampisilin 10%, toluen, minyak cengkeh 5%, dan
minyak cengkeh 10% ke dalam sumuran.
5. Inkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37C (tidak terbalik).
6. Amati dan hitung diameter zona hambat di sekitar sumuran
menggunakan penggaris.
BIOAUTOGRAFI
1. Siapkan fase diam silika gel GF254. Tandai lempeng silika dengan
memberi garis berjarak 1 cm dari bagian bawah lempeng dan
0,5 cm dari bagian atas lempeng (jarak elusi 5 cm).
2. Siapkan fase gerak toluen:etil asetat = 93:7 v/v. Campur 1860 L
toluen dengan 140 l etil asetat dalam chamber fase gerak.
Jenuhkan fase gerak dengan meletakkan kertas saring di dalam
chamber dan biarkan sampai basah (chamber tertutup rapat).
3. Totolkan minyak cengkeh 10% dan eugenol 5% pada fase diam
dan biarkan sampai kering.
4. Periksa totolan di bawah lampu UV 254 nm. Jika totolan kurang
pekat, tambah totolan.
5. Masukkan lempeng ke dalam chamber yang berisi fase gerak dan
elusi sampai batas.
75
6. Ambil lempeng dan biarkan fase gerak menguap.

7. Periksa totolan di bawah lampu UV 254 nm. Hitung Rf tiap
bercak.
8. Ambil 200 L kultur cair bakteri dan ratakan menggunakan
spreader. Diamkan selama 10 menit.
9. Letakkan lempeng di atas media yang telah diinokulasi dengan
bakteri menggunakan pinset dan diamkan selama 20 menit.
10. Ambil lempeng dengan pinset dan buang dalam wadah berisi
bayclin.
11. Inkubasi cawan Petri pada suhu 37oC selama 24 jam dalam posisi
terbalik.
12. Amati ada/tidaknya zona hambat. Hitung Rf bercak yang
memiliki zona hambat dan cocokkan dengan Rf bercak hasil KLT.
Senyawa yang mempunyai aktivitas antibakteri mempunyai Rf
yang sama dengan zona hambat (Gambar 18).
Zona
hambat
Gambar 18. Hasil KLT dan bioautografi

ekstrak etanol bunga cengkeh
76
MODUL 12
KINETIKA PERTUMBUHAN
1. Mahasiswa mampu menghitung pertumbuhan bakteri dan
membuat kurva pertumbuhan bakteri.
2. Mahasiswa mampu menentukan fase-fase pertumbuhan bakteri.
3. Mahasiswa mampu menghitung konstanta kecepatan
pertumbuhan dan waktu generasi bakteri.
II. DASAR TEORI

Pertumbuhan mikroba didefinisikan sebagai bertambahnya jumlah
bakteri dalam waktu tertentu. Mikroba dapat tumbuh dengan cara:
1. Pembelahan biner (sel melakukan duplikasi komponen-komponen
selnya, diikuti dengan pembelahan sehingga dua sel anakan memiliki
komponen yang sama),
2. Budding (organisme baru berkembang dari hasil pertunasan karena
adanya pembelahan sel pada satu situs tertentu, organisme ini tetap
melekat dan akan memisahkan diri dari induk hanya ketika sel anakan
telah dewasa. Contohnya pada khamir)
Kinetika pertumbuhan mikroorganisme berhubungan dengan laju
pertumbuhan sel dan bagaimana laju pertumbuhan tersebut dapat
dipengaruhi oleh berbagai kondisi kimia dan fisika yang ada di sekitarnya.
Selama fase pertumbuhan, sel-sel muda dan tua bercampur satu sama lain
dengan perbandingan yang heterogen, berubah komposisinya secara
kontinyu dan beradaptasi dengan lingkungan media pertumbuhannya.
Telaah pertumbuhan populasi bakteri membutuhkan prosedur untuk
menginokulasikan sel hidup ke dalam media cair steril kemudian
menginkubasikan pada suhu, pH optimum, dan kebutuhan oksigen yang
sesuai. Pada kondisi tersebut, pertumbuhan akan cepat dicapai sehingga
dinamika pertumbuhan dapat diikuti dan diamati. Jumlah sel yang
meningkat dapat dicatat dan diplotkan dalam suatu kurva sehingga
didapatkan hubungan antara peningkatan jumlah sel dengan waktu
inkubasi. Dari kurva ini, akan diperoleh suatu tahapan pertumbuhan, laju
pertumbuhan, dan waktu generasi pada kondisi standar.
77
Kurva pertumbuhan mikroba terdiri atas beberapa fase seperti

ditunjukkan pada Gambar 21. Fase pertama adalah lag phase, yaitu fase
adaptasi bakteri terhadap lingkungan. Metabolisme seluler pada fase ini
pada dasarnya dilakukan untuk beradaptasi terhadap perubahan pH,
persediaan nutrien, dan inhibitor pertumbuhan yang ada di dalam media.
Meskipun dijumpai perbesaran sel, pembelahan sel belum berlangsung.
Akibatnya, jumlah sel belum meningkat secara nyata.
Fase kedua dalam kurva pertumbuhan bakteri adalah logarithmic
phase atau fase eksponensial. Pada fase ini, sel sudah mampu
beradaptasi dengan nutrisi dan kondisi fisik dan kimia di dalam media,
secara fisiologis sel akan bereproduksi dengan pembelahan biner pada
laju yang konstan dan cepat. Pertambahan jumlah sel secara eksponensial
berarti pertambahan sel akan mencapai jumlah maksimal untuk selang
waktu tertentu. Durasi fase eksponensial ini tergantung pada jenis bakteri
dan komposisi media, umumnya dapat dicapai sekitar 6-12 jam.
Fase ketiga dalam kurva pertumbuhan bakteri adalah fase stasioner.
Dalam fase ini, tidak ada peningkatan jumlah sel bahkan jumlah sel
mencapai maksimum untuk suatu periode tertentu. Faktor penyebabnya
antara lain berkurangnya nutrisi untuk melangsungkan metabolisme
esensial dan akumulasi produk metabolisme yang mungkin bersifat toksik.
Fase berikutnya yaitu fase penurunan atau fase kematian. Pada fase ini,
sel mikrob yang resisten terhadap lingkungan dapat dijumpai dalam
jumlah yang kecil.
Gambar 19. Kurva pertumbuhan bakteri pada kultur sistem batch

78
Mengukur Pertumbuhan Mikroba

1. Pengukuran secara langsung dengan penghitungan jumlah sel
• Pengukuran menggunakan mikroskop dan Petroff-Hauser
counting chamber (Gambar 22)
• Yang dihitung adalah jumlah sel tiap satuan volume
• Tidak dapat membedakan sel hidup dengan sel yang mati
2. Pengukuran secara tidak langsung
• Metode turbidimetri
• Cahaya yang disebarkan oleh sel-sel bakteri proporsional
dengan ukuran dan densitasnya
• Membutuhkan sumber cahaya dan photocell
• spektrofotometer
3. Penghitungan sel
• Menghitung Colony forming unit tiap satuan volume (CFU/mL)
• Setiap koloni terdiri atas jutaan sel bakteri, namun semuanya
berasal dari satu sel tunggal
• Koloni yang dihitung berjumlah antara 30-300
• Pengenceran berseri, hitung koloni, membran filter
• Hanya menghitung bakteri-bakteri yang dapat tumbuh dalam
kondisi nutrisi yang terdapat di dalam medium, akibatnya tidak
semua bakteri yang ada di dalam sampel bisa dihitung
• Selain teknik cawan tuang dan cawan sebar, dapat dilakukan
modifikasi dengan cara menambah tahap filtrasi untuk
meningkatkan jumlah sampel
Gambar 20. Penghitungan jumlah sel dengan Petroff-

Hausser counting chamber
79
Mengapa Pemahaman terhadap Kinetika Pertumbuhan Mikroba

Diperlukan?
Seorang peneliti perlu memahami kinetika pertumbuhan mikrob
karena dua alasan ini:
1. Untuk interpretasi data pertumbuhan bakteri secara tepat dan akurat
Sebuah contoh kasus adalah bagaimana pH medium mempengaruhi
pertumbuhan bakteri dalam sistem kultur batch. Pada awalnya, kultur
bakteri ditumbuhkan di dalam medium dengan pH 7.0, digunakan sebagai
inokulum lalu dipindahkan ke medium yang baru dengan pH medium
sebesar 5.5 dan 7.5. Kultur ini diinkubasi pada suhu yang sama dan diambil
sampelnya pada waktu yang sama. Bentuk kurvanya diperlihatkan pada
Gambar 23.
Interpretasi terhadap grafik pertumbuhan tersebut akan sangat
dipengaruhi oleh pada waktu kapan dilakukan pengambilan sampel yang
terakhir. Jika sampel diambil pada waktu 1, tampak secara sekilas bahwa
kultur pada pH 5.5 mengalami penghambatan pertumbuhan. Namun,
ingat kembali bahwa kultur bakteri ini berasal dari kultur dengan pH 7.0,
dengan demikian sel-sel bakteri di dalam medium pH 5.5 masih
mengalami lag phase untuk beradaptasi dengan kondisi pH yang baru.
Kultur yang diambil pada waktu 2 menunjukkan adanya
pertumbuhan yang cepat pada kedua kondisi pH, sekilas juga tampak
bahwa bakteri tumbuh lebih cepat pada pH 7.5. Pada waktu 3, terlihat
bahwa pH 5.5 adalah kondisi pH yang paling mendukung pertumbuhan
karena konsentrasi sel atau biomassanya lebih tinggi daripada kultur
dengan pH 7.5. Sebetulnya, nutrien mineral yang ada di dalam medium
5.5 lebih banyak yang terlarut di dalam larutan asam sehingga lebih
mudah digunakan untuk mendukung pertumbuhan bakteri. Akibatnya,
konsentrasi bakteri pada pH 5.5 menjadi lebih tinggi dibandingkan pH 7.5.
Kultur yang diambil pada waktu 4 menunjukkan hasil yang sangat
berbeda. Perbedaan konsentrasi bakteri pada kedua kondisi medium ini
akan menimbulkan suatu kesimpulan bahwa sel-sel bakteri mengalami
80
lisis pada pH 5.5. Pada kenyataannya, sel membutuhkan lebih banyak

energi pada kultur dengan pH 5.5 untuk menjaga pH internal selnya tetap
netral dibandingkan dengan kultur dengan pH 7.5. Akibatnya, sel akan
mati apabila tidak mampu melakukan metabolisme untuk mencukupi
kebutuhan energinya. Hal inilah yang menyebabkan berkurangnya jumlah
bakteri pada waktu tersebut.
Jumlah sel (sel/L) atau biomassa (g/L)
Gambar 21. Contoh kurva pertumbuhan bakteri pada dua macam

medium
2. Untuk optimasi pertumbuhan dan pembentukan produk
Pengetahuan kinetika pertumbuhan bakteri diperlukan untuk
menentukan waktu yang tepat untuk memanen kultur bakteri ataupun
hasil metabolismenya. Seorang peneliti dapat menentukan apa yang ia
butuhkan dari suatu kultur, apakah biomassa atau produk metabolitnya.
Apabila yang dibutuhkan adalah biomassa, maka kultur bakteri tersebut
harus ditumbuhkan sampai jumlahnya maksimum kemudian dipanen dan
dipisahkan dari medium kulturnya untuk mendapatkan sel bakteri.
Namun jika yang dibutuhkan adalah metabolitnya, akan diperlukan
pengetahuan mengenai kapan pembentukan metabolit tersebut
berlangsung dan kapan produksi optimalnya tercapai.
81
Pembentukan metabolit dapat dibagi menjadi dua macam, yaitu:

a. Produk yang berasosiasi dengan pertumbuhan
Metabolit dihasilkan sejak dimulainya fase pertumbuhan bakteri
(Gambar 24). Oleh karena itu, konsentrasi produk meningkat bersamaan
dengan bertambahnya konsentrasi sel. Untuk mendapatkan produk
dalam jumlah optimal, pemanenan dilakukan pada akhir fase
eksponensial. Contoh metabolit yang bisa dipanen adalah komponen sel
(DNA, RNA) dan enzim-enzim ekstraseluler dan intraseluler seperti
amilase, β-galaktosidase, dan lain-lain.
b. Produk yang tidak berasosiasi dengan pertumbuhan
Metabolit seperti ini disintesis tidak bergantung pada kecepatan
pertumbuhan, namun bergantung pada konsentrasi sel. Oleh karena itu,
metabolit ini dapat dipanen pada waktu sel sudah memasuki fase
stasioner. Contoh metabolit ini adalah metabolit sekunder seperti protein
antibodi, asam laktat, etanol, dan lain-lain.
Gambar 22. Ilustrasi pembentukan (A) produk yang berasosiasi dengan

pertumbuhan dan (B) produk yang tidak berasosiasi dengan pertumbuhan
82
III. ALAT DAN BAHAN

A. Alat
1. Lampu spiritus
2. Spektrofotometer
3. Kuvet
4. Mikropipet
5. Inkubator
6. Cawan Petri steril
7. Anaerobic jar
B. Bahan
1. Kultur cair bakteri Clostridium bifermentans
2. Media agar darah
3. Etanol 70%
4. Akuades steril
5. Blue tips
IV. CARA KERJA

a. Pembuatan kurva standar jumlah sel (CFU/ml)
1. Masukkan 1 ml suspensi kultur C. bifermentans ke dalam 9 ml
akuades steril (pengenceran 10x).
2. Ambil 1 ml dari pengenceran 10x dan masukkan ke dalam 9 ml
akuades steril (pengenceran 102x).
3. Ulangi langkah di atas sampai 7 kali pengenceran (107).
4. Ukur optical density (OD) tiap pengenceran pada panjang
gelombang 660 nm.
5. Ambil 100 l suspensi dari tiap pengenceran (10-107x) dan sebar
di cawan Petri lalu tuangkan agar darah.
6. Inkubasi di dalam anaerobic jar selama 24 jam pada suhu 37C.
7. Hitung koloni yang membentuk zona bening.
8. Buat kurva hubungan OD dengan jumlah koloni
9. Buat persamaan regresi liniernya: y = bx + a.
y = jumlah koloni (CFU/ml)
x = OD660
83
b. Pembuatan kurva pertumbuhan

1. Ambil 1,5 ml kultur C. bifermentans dan masukkan ke dalam 48,5
ml media pertumbuhan.
2. Inkubasi pada suhu 37C.
3. Ambil 1 ml larutan media dan ukur OD-nya pada jam ke-0, 3, 6, 7,
8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 21, 24, 45.
4. Hitung koloni dalam satuan CFU/ml dengan substitusi nilai OD ke
dalam persamaan regresi linier.
5. Buat kurva hubungan antara waktu vs CFU/ml.
6. Buat kurva hubungan antara waktu vs log CFU/ml.
7. Tentukan fase-fase pertumbuhan bakteri berdasarkan kurva hubungan
antara waktu vs log CFU/ml!
8. Hitung waktu generasi (GT)!
84
MODUL 13
UJI AKTIVITAS ANTIVIRAL
1. Mahasiswa mampu memahami prinsip pengujian antivirus
menggunakan telur ayam.
2. Mahasiswa mampu menghitung titer penghambatan virus
berdasarkan uji hemaglutinasi (dry lab).
II. Dasar Teori

Virus merupakan penyebab infeksi terkecil (garis tengah 20-300 nm)
(Jawetz dkk., 1986). Virus mempunyai wujud sub-mikroskopis yang hanya
mampu hidup dan berkembang di dalam organisme hidup lainnya,
sebagai akibatnya sering menyebabkan penyakit. Partikel virus terdiri dari
virion yang pada dasarnya terdiri dari molekul asam deoksiribose nukleat
(DNA) atau asam ribose nukleat (RNA) yang terselubung dalam selubung
protein. Virion ini sanggup menularkan asam nukleat dari satu inang ke
inang lainnya, memanfaatkan enzim inang untuk memperbanyak dirinya
di dalam sel inang tersebut dengan cara mengambil alih metabolisme sel
inang atau mengintegrasikan genomnya pada genom inang, dengan cara
tersebut virus akan mengalihkan sifat-sifat sel inang sesuai dengan
kepentingannya (Sastrahidayat, 1989). Asam nukleat virus mengandung
informasi yang perlu untuk memprogramkan sel hospes yang terinfeksi
agar membentuk sejumlah makromolekul virus-spesifik yang diperlukan
untuk menghasilkan keturunan virus, selama siklus replikasi banyak
dihasilkan asam nukleat virus dan protein pembungkus. Protein
pembungkus dirakit menjadi kapsid yang menutupi dan mempertahankan
asam nukleat virus terhadap lingkungan luar sel dan mempermudah
perlekatan dan kemungkinan penetrasi virus pada sel-sel baru yang peka
(Jawetz dkk., 1986).
Penyakit infeksi yang disebabkan oleh virus telah banyak diketahui,
baik yang menyerang manusia, hewan ataupun tumbuhan.
Syahrurachman (1994) menyebutkan bahwa berbagai penemuan baru
85
dalam bidang virologi terus berkembang, walaupun demikian masih
banyak tantangan yang dihadapi untuk memecahkan persoalan-persoalan
penyakit akibat infeksi virus, baik dalam bidang patogenesis, diagnosis,
pengobatan, pencegahan maupun rehabilitasinya. Banyak cara dilakukan
untuk mengetahui jenis virus penyebab infeksi dan substansi yang
berguna untuk menghambat infeksi virus.
Substansi yang dapat mencegah atau menghambat infeksi virus pada
tanaman ditemukan dalam berbagai varietas pada beberapa sumber
seperti jamur, bakteri, tanaman, serangga dan hewan tingkat tinggi
(Lucas, 1965). Substansi alami yang berasal dari tanaman dan
mikroorganisme sebagai sumber agen antiviral harus diteliti lebih luas lagi
sebagai awal untuk mensintesis substansi baru (Tomaru, 1987).
Kultivasi virus dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu: in vivo, in vitro
dan in ovo. In ovo merupakan pembiakan virus pada telur. Telur
merupakan perbenihan virus yang sudah steril dan embrio telur yang
tumbuh di dalamnya tidak membentuk zat anti yang dapat mengganggu
pertumbuhan virus. Telur merupakan sumber sel hidup yang relatif murah
untuk isolasi virus, karena itu cara in ovo sering digunakan dalam
laboratorium (Syahrurachman, 1994).
Beberapa jenis virus dapat dibiakkan pada sel-sel yang membungkus
rongga telur berembrio atau pada embrio yang sedang tumbuh itu sendiri.
Tempat kultivasi dan umur embrio yang digunakan untuk kultivasi
tergantung pada virus yang dibiakkan. Ada beberapa tempat yang biasa
digunakan untuk kultivasi virus pada telur berembrio, diantaranya yaitu:
ruang amnion, membran korioallantois, kantong kuning telur, dan ruang
allantois. Ruang allantois terletak pada rongga vaskular yang selama
pertumbuhan embrio ruang ini berkapasitas besar, terdiri dari 5-10 ml
cairan allantois. Kultivasi virus dengan telur pada ruang allantois biasanya
diinkubasi selama 3-7 hari setelah inokulasi (Dennis, 1989). Ruang ini bisa
untuk pertumbuhan virus terutama untuk pembuatan vaksin atau untuk
percobaan lainnya seperti yang sudah dilakukan oleh Hirst dengan uji
86
inhibitor hemaglutinasi (HI) pada titrasi influenza. Inokulasi pada ruang
allantois berguna untuk kultivasi virus influenza (Buddingh, 1985). Cara
kultivasi ini juga digunakan untuk virus ND dengan embrio ayam yang
berumur 9-12 hari (Cappucino, 1983).
III. Alat dan Bahan

A. Alat
1. Alat suntik 1ml dan 5 ml
2. Lampu teropong
3. Bor pelubang
4. Gunting
5. Pinset
6. Cawan petri
7.
8. Nampan telur (egg tray)
9. Tabung reaksi atau flakon
10. Lampu spiritus
11. Inkubator dan mesin penetas
12. Pelatmikro
13. Diluter
14. Multimikropipet dan yellowtips
15. Kulkas
16. Tabung volumeter
B. Bahan
1. Ekstrak kloroform daun Ageratum zoides
2. Telur ayam berembrio umur 9-12 hari
3. Vaksin ND La Sota
4. Eritrosit ayam 2,5% dan 0,5%
5. Antibiotik Streptomycin Sulfate dan Vicillin
6. Larutan Phospat Buffer Saline (PBS) pH 7,2
7. Asam Sitrat
8. Parafin padat
9. Alkohol 70% dan betadin
87
IV. Preparasi Bahan
1.Pembuatan ekstrak
2.Perlakuan telur ayam berembrio
Telur ayam berembrio umur 9 hari, dipilih yang mempunyai bentuk dan
berat yang hampir sama, warna cangkang telur yang sama, rongga udara telur
yang terletak pada ujung telur, dilihat dengan alat bantu lampu teropong, selain
itu lampu teropong juga digunakan untuk melihat pergerakan embrio yang
menandakan adanya kehidupan. Telur diberi tanda pada dua tempat yaitu pada
rongga udara dan pemasukkan inokulan yang terletak dihadapan kepala embrio
ayam. Telur disimpan pada inkubator atau almari penetas dengan suhu 370C dan
kelemBABan 60%.
3.Preparasi antibiotik
Streptomycin 1000 mg dilarutkan dalam 5 ml PBS steril. Vicillin 1000 mg
dilarutkan dalam akuades steril. Penggunaan antibiotik dengan perbandingan
1:1 yaitu vicillin 2,5 mg/ml dan streptomycin 2,5 mg/ml.
4.Preparasi virus
Virus didapat dari vaksin aktif strain lentogenik yang mempunyai dosis
50, berbentuk padat (kering beku). Setiap dosis vaksin mengandung virus ND
minimal 107 EID50. Setiap ekor ayam diberi 1 dosis vaksin. Vaksin 1 dosis dibuat
dengan cara menambahkan 2,5 ml PBS lalu diambil 0,05 ml atau 50 l vaksin
untuk diinokulasikan pada tiap telur ayam berembrio. Penyimpanan vaksin
dalam suhu 40 C.
5.Preparasi eritrosit ayam
Darah dari ayam ditambah dengan asam sitrat, disentrifuse satu menit,
dibuang supernatan atau beningan pada bagian atas, ditambah PBS seperti
volume awal lalu disentrifuse satu menit, lapisan atas dibuang, hal ini diulangi
sampai tiga kali. Bagian bawah diambil dimasukkan dalam tabung volumeter,
disentrifuse selama 10 menit. Skala pada volumeter dibaca yang menunjukkan
letak pelet, hasilnya dalam persen yang kemudian diencerkan dengan PBS
sesuai dengnan konsentrasi yang diinginkan.
V. Cara Kerja
A. Penanaman dan pemanenan virus
1. Ekstrak tanaman yang diduga mengandung substansi antiviral ditambah
antibiotik dimasukkan dalam ependorf lalu di inkubasi selama satu jam
(ependorf I).
88
2. Virus ditambah antibiotik dimasukkan dalam ependorf lalu di inkubasi selama
satu jam (ependorf II).
3. Ependorf I dan II dicampur kemudian diinkubasi selama 15 menit lalu diambil
0,2 ml dengan alat suntik 1 ml, dimasukkan ke telur yang telah dilubangi pada
ruang allantois (dihadapan kepala embrio).
4. Kedua lubang ditutup dengan paraffin cair.
5. Telur diinkubasi pada mesin penetas selama 3 hari.
6. Setiap hari telur diamati dengan menggunakan lampu teropong.
7. Pada hari ketiga telur dimasukkan ke almari es.
8. Hari berikutnya dilakukan pemanenan virus dengan membuka cangkang telur
pada bagian rongga udara dengan menggunakan pinset sampai terlihat cairan
allantois.
9. Cairan allantois diambil sebanyak 3 ml dengan menggunakan alat suntik 5 ml
lalu dimasukkan dalam flakon.
10. Dilakukan uji Hemaglutinasi.
B. Uji hemaglutinasi
1. PBS sebanyak 50 μl dimasukkan pada sumuran no. 1- 12.
2. Cairan allantois sebanyak 50 μl dimasukkan pada sumuran no. 1- 11.
3. Eritrosit ayam 0,5% sebanyak 50 μl dimasukkan pada sumuran no. 1 lalu
dilakukan pengenceran berseri sampai sumuran no. 11.
4. Pengamatan dilakukan setelah sumur no. 12 terjadi endapan eritrosit yang
ditandai dengan adanya titik besar berwarna merah kira-kira 15-30 menit.
5. Dilakukan pembacaan titer virus, kemudian hasilnya dibandingkan dengan
kontrol negatif (kontrol virus).
89
DAFTAR PUSTAKA
DepKes RI, 1994, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan

RI.
BPOM, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, DepKes RI,
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, Direktorat
Pengawasan Obat Tradisional, Jakarta.
Atlas, R. M., 1995, Principles of Microbiology, Mosby.
Atlas, R. M., Brown, A. E, 1989, Experimental Microbiology Fundamental

& Application
BPOM, 2004, Monografi Ekstrak Tumbuhan Obat Indonesia, 147-148,

BPOM RI, Jakarta.
Brock, T. D, 1997, Biology of Microorganisms, Prentice Hall International,

Inc.
Cappucino, J. G. dan Welsh, C., 2017, Microbiologi: A Laboratory Manual,

11th edition, Pearson.
Choma, I., 2005, The Use of Thin-Layer Chromatography with Direct

Bioautography for Antimicrobial Analysis, (online),
(http://www.lcgceurope.com/lcgceurope/Features/The-Use-of-
Thin-Layer, diakses 20 Agustus 2008)
Harley, J.P. dan Prescott, L.M., 2001, Laboratory Exercise in Microbiology,

Fifth edition, The McGraw-Hill Companies.
Irianto, K., 2006, Mikrobiologi, Jilid 1, Yrama Widya, Bandung.
Jawetz, Melnick, Adelberg’s, 1995, Medical Microbiology, 20th Edition,

Prentice-Hall International Inc.,
90
Lee, Y.K. 2006. Microbial Biotechnology: Principles and Application. Edisi

ke-2. Singapura: World Scientific Publishing.
Lindquist, J., 2010, Differential Media : Multipurpose Enteric Screening

Media (KIA, TSIA, LIA, and MIO medium),
http://www.jlindquist.net/generalmicro/dfmultinf.html, (diakses
tanggal 5 Januari 2012).
Madigan, Martinko, Parker, 1997, Biology of Microorganism, Prentice

Hall.
Pelczar, M. J., Chan, E. C. S., 1986, Dasar-Dasar Mikrobiologi,

diterjemahkan oleh Hadioetomo, R. S., Penerbit Universitas
Indonesia, Jakarta.
Pratiwi, S. T., 2008, Mikrobiologi Farmasi, Penerbit Erlangga, Jakarta.
Qaiyumi, S., 2007, Macro- and Microdilution Methods of Antimicrobial

Susceptibility Testing, dalam Schwalbe, R., Steele-Moore, L., &
Goodwin, A.C. (Eds.), Antimicrobial Susceptibility Testing
Protocols, 75-79, CRC Press, London.
Schlegel, H. G., 1993, General Microbiology, 7th Edition, Cambridge

University Press
Smith, J.M.B., 2004, Laboratory evaluation of antimicrobial agents, dalam

Denyer, S.P., Hodges, N.A., & Gorman, S.P. (Eds.), Hugo and
Russell’s Pharmaceutical Microbiology, 7th Ed., 196-200, Blackwell
Science, Massachusetts.
Sunatmo, T.I. 2007. Eksperimen Mikrobiologi dalam Laboratorium.

Jakarta, Ardy Agency.
Thiel, T., 1999, Streaking Microbial Cultures on Agar Plates, Department

of Biology, University of Missouri, St. Louis.
91
Tortora, G.j., Funke, B.R., dan Case C.L., 2013, Microbiology An

Introduction, 11th ed., Pearson.
Wagner, H. and Bladt, S., 1996, Plant Drug Analysis : A Thin Layer
Chromatography Atlas, 2nd Ed., 126, 206, 362-364, Springer-Verlag,
Berlin.
Sumber website:
www.microbiologyplace.com
http://www.asmcue.org/documents/MotilityMedia.ASMCUE.pdf
https://www.bd.com/ds/technicalCenter/inserts/L007472(10).pdf
http://www.oxoid.com/uk/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM003
3&org=66&c=uk&lang=en
http://www.oxoid.com/uk/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM038
1&org=124&c=uk&lang=en
https://catalog.hardydiagnostics.com/cp_prod/Content/hugo/MannitolS
altAgar.htm
http://classroom.sdmesa.edu/eschmid/Lecture4-Microbio.htm
http://www.sciencebuddies.org/science-fair
projects/project_ideas/MicroBio_Interpreting_Plates.shtml
https://microbeonline.com/colony-morphology-bacteria-describe-
bacterial-colonies/
https://www.cdc.gov/std/gonorrhea/lab/diskdiff.htm
http://mikrobiologie.lf3.cuni.cz/engl/pract1.htm
https://microbepost.org/2015/10/13/antibiotics-weapons-or-signals/
http://www.bsac.org.uk/wpcontent/uploads/2015/12/Susceptibility-
testing-methods.pdf
https://users.stlcc.edu/kkiser/TSIreact.jpg
https://everythingmicro.blogspot.com/2017/10/staphylococcus-
identification.html
https://www.kruuse.com/en/ecom/Laboratorium/Udstyr_laboratorium/
Inkubatorer/Memmert/prod_290349.aspx
http://hirayama.isterilizer.com/en/hirayama-hve-50-top-load-sterilizer- at-
hve-50
https://bio-protocol.org/e1828
92

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobioogi Genap 2022-2023

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Deskripsi Asli:

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Buku Petunjuk Praktikum Mikrobioogi Genap 2022-2023

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2023

Laboratorium Mikrobiologi Farmasi

Gambar sampul diperoleh dari:

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

Syukur alhamdulillah kepada Allah SWT akhirnya modul

Surakarta, Agustus 2023

1. Praktikan harus datang 5 menit sebelum praktikum dimulai,

c. Praktikan yang merusakkan atau memecahkan alat praktikum

II. DASAR TEORI

c. Dengan uap air bertekanan (autoklaf)

Tabel 1. Common Uses of Heat to Control Bacteria

Incineration >500C Vaporizes organic material on

Boiling 100C Thirty minutes of boiling kills

Intermittent 100C Three 30-minute intervals of

Autoclave and 121C for 15 Kills all forms of life including

metal, but not most plastic or

Pasteurization 63-66C for Kills most vegetative bacterial

Pasteurization 72C for 15 Effect on bacterial cells is similar

Tabel 2. Antiseptics and their actions

Chemical Action Uses

Ethanol (50-70%) Denatures proteins and Antiseptic used on skin

Isopropanol (50- Denatures proteins and Antiseptic used on skin

Tincture of iodine Inactivates proteins Antiseptic used on skin

Silver nitrate Precipitates proteins General antiseptic and

antibiotic) are now

Detergents (e.g. Disrupts cell membranes Skin antiseptics

Phenolic Denature proteins and Antiseptics at low

Beberapa bahan kimia yang bersifat antimikroba adalah :

4. Logam berat dan gugusannya

Tabel 3. Disinfectants and their action

Chemical Action Uses

Formaldehyde (8%) Reacts with NH2, SH Disinfectant, kills

Chlorine (Cl2) gas Forms hypochlorous Disinfect drinking

Mercuric chloride Inactivates proteins by Disinfectant,

Detergents (e.g. Disrupts cell At higher

Phenolic compounds Denature proteins and Disinfectants at high

Ethylene oxide gas Alkylating agent Disinfectant used to

III. ALAT DAN BAHAN

IV. CARA KERJA

3. Media MacConkey ditimbang lalu dimasukkan ke dalam labu

II. DASAR TEORI

Gambar 2. Pola goresan metode streak plate

Inoculation of a streak plate:

III. ALAT DAN BAHAN

IV. CARA KERJA

Gambar 3. Cara menggores bakteri dengan metode streak plate

II. DASAR TEORI

Pembuatan preparat dari bahan berasal langsung dari penderita.

Pembuatan preparat dari biakan cair

Pembuatan preparat dari pertumbuhan media padat.

Ada beberapa teori tentang dasar perbedaan kedua golongan tersebut:

2. Teori Permeabilitas Dinding Sel

Tabel 4. Komposisi Cat Gram

Cara Pengecatan Gram

Setelah pemberian cat Gram C maka akan terjadi :

Para ahli mikrobiologi menggunakan bermacam-macam mikroskop

fluoresens, dan fase kontras. Mikroskop digunakan untuk mempelajari

Gambar 5. Mikroskop dan bagian-bagiannya

Untuk menggunakan mikroskop secara efisien, prinsip-prinsip

digabungkan dengan perbesaran lensa okuler maka diperoleh perbesaran

Tabel 5. Perbesaran total mikroskop

Kemampuan sistem lensa mikroskop untuk memisahkan 2 titik yang