BIOLOGI SEMESTER V OLEH : 1. TUTY KURNIA 2. KOMARIAH 3. NIKI TRI DEWI 4. MUJINA 5.

LISKA SUSAN

Pembiakan dan identifikasi bakteri bersumber dari spesimen yang merupakan hasil proses infeksi, sedangkan infeksi itu sendiri dapat berasal dari berbagai sumber,

Beberapa tahapan terjadinya proses infeksi :

Infeksi memerlukan tempat masuk yang sesuai (port of entry) misalnya saluran pernafasan, saluran pencernaan, kontak langsung, gigitan serangga. Tempat masuknya bakteri biasanya spesifik terutama untuk bakteri patogen, bakteri harus tumbuh dan berkembang dalam tubuh hospes dan menyebar melalui system limfa dan aliran darah menyebar ke seluruh jaringan, Penyebaran infeksi memerlukan jalan keluar unuk menginfeksi hospes lainnya (port of exit).

Istilah mikroorganisme yang biasanya merupakan penyebab penyakit disebut patogen dan patogenitas adalah kemampuan mikroorganisme menyebabkan sakit. Virulensi berhubungan dengan derajat patogenitas bakteri. Patogenitas dan virulensi berkaitan dengan penyebaran atau toksigenitas. Penyebaran artinya kemampuan bakteri untuk masuk, menyebar dan berkembangbiak di dalam jaringan hospes. Toksigenitas berhubungan dengan kemampuan bakteri menghasilkan toksin. Virulensi dinyatakan dengan LD50 yaitu konsentrasi mikroorganisme yang menyebabkan 50 persen hewan percobaan sakit. Proses ketika mikroorganisme patogen masuk dikenal dengan infeksi, selama proses ini hospes dapat menjadi sakit, infeksi terselubung atau sehat menjadi carrier

Aspek patogenitas bakteri Patogenitas bakteri terutama disebabkan oleh adanya kapsul pada bakteri tersebut, bakteri yang tidak berkapsul lebih mudah untuk difagosit oleh sel leukosit. Hilangnya kapsul bakteri berhubungan dengan hilangnya virulensi bakteri karena kapsul diketahui sebagai faktor pengganggu. (contohnya bakteri pneumococcus) Toksin bakteri

Toksin bakteri diketahui memiliki peranan penting dalam kemampuan bakteri menimbulkan penyakit. Toksin dibagi dalam kelompok eksotoksin dan endotoksin.

Eksotoksin di hasilkan oleh bakteri ke lingkungan dan potensial serta spesifik untuk jaringan hospes, kemampuan menghasilkan eksotoksin biasanya pada bakteri gram positif batang seperti Clostridium dan Corynebacterium. Eksotoksin merupakan antigen kuat, tidak tahan panas, merupakan substansi protein, hancur oleh enzim proteolitik kecuali Clostridium botulinum, efek toksin dapat hancur oleh formalin, panas dan penyimpanan yang lama tetapi tidak untuk sifat antigeniknya, contohnya toxoid untuk program imunisasi.

B. Endotoksin.
Endotoksin ditemukan intraseluler, terdapat pada dinding sel bakteri dan toksin ini dilepaskan oleh bakteri setelah bakteri hancur, endotoksin biasanya berhubungan dengan bakteri gram negatif dan bersifat antigen lemah. Endotoksin bersifat tahan terhadap panas, polisakaridanya tidak dapat dicerna oleh enzim proteolitik, endotoksin bersifat toksin lemah dan menginduksi reaksi demam pada hospes dan dapat menyebabkan syok

Enzim ekstraseluler
Beberapa mikroorganisme memproduksi enzim ekstraseluler yang ikut berperan dalam patogenitas, enzim tersebut adalah: a. Enzim koagulase, berhubungan dengan patogenitas Staphylococcus. Uji koagulase dilakukan menggunakan plasma menyebabkan terjadinya koagulasi.

b. Kolagenase adalah enzim yang dibentuk oleh Clostridium, bersifat dapat menghancurkan kolagen sehingga menyebabkan bakteri menyebar ke jaringan

c. Hialuronidase adalah enzim yang diketahui sebagai faktor penyebaran bakteri. Enzim ini diproduksi oleh Staphylococcus, Clostridium, Streptococcus dan Pneumococcus.
d. Streptokinase dikenal pula sebagai enzim fibrinolisin, diproduksi oleh Streptococcus, Staphylococcus, dan Clostridium perfringens. Streptokinase merupakan enzim proteolitik plasma yang disebut plasmin, plasmin dapat melarutkan plasma yang terkoagulasi dan aktifitas tersebut memungkinkan bakteri menyebar e. Hemolisin merupakan kelompok substansi terlarut yang diproduksi oleh Staphylococcus, Pneumococcus, beberapa Clostridium, dan Steptococcus, hemolisin bersifat merusak jaringan. Streptolisin memiliki kemampuan melisiskan eritrosit. f. Leukosidin dalah substansi yang merusak leukosit, mereka diproduksi oleh streptococcus dan

Bakteri berdasarkan kebutuhan energi, dibagi dalam dua kelompok, yaitu:

Bakteri autotrof Bakteri autotrof memperoleh energi dan tumbuh pada anorganik media, membutuhkan karbondioksida sebagai sumber karbon Bakteri heterotrof Bakteri heterotrof mendapatkan energi dari sumber karbon organik.Bakteri heterotrof membutuhkan penambahan gula, asam amino, purin, pirimidin dan vitamin pada media kultur. Fermentasi gula merupakan sumber energi utama

Morfologi bakteri Ukuran bakteri coccus berdiameter 1 micron (), bakteri batang memiliki lebar 0.5 dan panjang of 2 , sedangkan spirochaeta berbentuk ulir dengan lebar 0.2 dan lebar 10 . Bentuk-bentuk bakteri: Struktur bakteri Struktur umum bakteri terdiri dari Dinding sel Membrane sitoplasma Sitoplasma Inti

Struktur khusus bakteri: Kapsul, merupakan substansi eksretori, sebagai benteng pertahanan melawan fagositosis oleh sel darah putih dan penetrasi virus Flagel , berasal dari protein elastin yang berada di sitoplasma dan keluar badan bakteri berfungsi sebagai organ pergerakan Spora, bentuk vegetatif bakteri untuk bertahan pada lingkungan yang kurang menguntungkan

Inclusion bodies, vakuola yang berfungsi sebagai tempat sisa material di sitoplasma Metode mikroskopis adalah merupakan upaya mendapatkan informasi sementara terhadap bakteri penyebab infeksi, akan tetapi pembiakan biasanya diperlukan untuk identifikasi secara pasti dan mengenal sifat bakteri. Tujuan dari pembiakan bakteri adalah terdiri dari tiga tujuan utama yaitu: 1) Untuk menumbuhkan dan mengisolasi seluruh bakteri yang ada dalam spesimen 2) Untuk penentuan jenis bakteri mana yang pertumbuhannya paling menyerupai bakteri penyebab infeksi dan bakteri mana yang sepertinya merupakan kontaminan 3) Untuk mendapatkan pertumbuhan bakteri yang cukup terhadap bakteri yang sesuai secara klinik sehingga dapat diidentifikasi sesuai sifat pertumbuhannya

Media perbenihan

Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zatzat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolasi mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya sesuai kebutuhan bakteri. Oleh karena bakteri yang berbeda memerlukan kebutuhan akan nutrisi yang berbeda pula , sehingga dikembangkan berbagai macam media pertumbuhan untuk digunakan dalam diagnosa mikrobiologi. Media perbenihan terdiri dari dua bentuk yaitu bentuk cair dan padat (agar). Pada media cair, bahan-bahan gizi dilarutkan dalam air sehingga pertumbuhan bakteri ditandai dengan perubahan warna madia menjadi keruh, semakin banyak bakteri tumbuh akan semakin keruh larutan. Diperlukan jumlah bakteri 106 sehingga dapat terlihat adanya pertumbuhan tanpa mikroskop. Media padat dibuat dengan penambahan bahan pengeras pada campuran bahan gizi dan air. Biasanya digunakan agarosa yang memiliki sifat cair pada suhu 95C tetapi berbentuk padat pada suhu dibawah 50C. Dengan kondisi inkubasi yang sesuai bakteri dapat tumbuh dan berkembang dalam jumlah yang banyak sehingga dapat dilihat tanpa menggunakan mikroskop. Pertumbuhan bakteri membentuk kelompok yang terdiri dari satu jenis bakteri yang disebut koloni, dengan kata lain dalam satu koloni adalah bakteri yang sama genus dan spesiesnya memiliki karakteristik gen dan fenotip yang sama. Pembiakan bakteri yang terdiri dari satu macam koloni yang seragam disebut dengan pembiakan murni. Pembiakan yang murni diperlukan untuk identifikasi bakteri, untuk memudahkan pengambilan koloni yang sama ketika ditanam pada media identifikasi.

Bahan-bahan media pertumbuhan 1. Bahan dasar a. Air (H2O) sebagai pelarut b. Agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45C. c. Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar. d. Silica gel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme autotrof obligat.

2. Nutrisi atau zat makanan

a. Nikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea. Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg b. Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau anorganik sesuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam organik. c. Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain dan sejumlah vitamin.

3. Bahan tambahan Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan tertentu, misalnya phenol red (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme. Antibiotik ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan.

4. Bahan lain yang sering digunakan dalam pembuatan media a. Peptone, adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai.Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya. b. Meat extract, mengandung basa organik terbuat dari otak,limpa, plasenta dan daging sapi. c. Yeast extract, terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (Bcomplex). d. Karbohidrat, ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunakan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll.Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,51%.

Klasifikasi dan fungsi media:

1. Medium berdasarkan sifat fisik

Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat.
Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth),TSB (Trypticase Soy Broth)

2. Medium berdasarkan komposisi

Medium sintesis,misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.

Medium semi sintesis,misalnyanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.

Medium non sintesis, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.

3. Medium berdasarkan tujuan

Media untuk isolasi misalnya Nutrient Broth, Blood Agar. Media selektif/penghambat Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Saltbroth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam. Media diperkaya (enrichment) misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, buffer charcoal yeast extract agar yang mengandung L-cystein dan bahan gizi lain untuk pertumbuhan legionella pneumophila penyebab penyakit legionnair. Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik. Contohnya adalah Kosers Citrate medium, yang digunakanuntuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon. Media untuk karakterisasi bakteri Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth,Arginine Agar. Media diferensial misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni, media Mac conkey agar merupakan media diferensial dan slektif karena tidak dapat menumbuhkan bakteri gram positif.

Dari sekian banyak macam media, media yang paling sering digunakan untuk identifikasi bakteri adalah

1. Brain-Heart infusion (BHI) / perbenihan cair. BHI biasanya digunakan untuk media pertumbuhan spesimen darah 2. Perbenihan cair Gram negative (GN broth). 3. Columbia CNA mengandung darah Contohnya untuk perbenihan Lactobacillus spp dari specimen secret vagina, streptococcus yang menyebabkan infeksi pada vagina dan wanita hamil. 4. Hektoen Enteric agar (HE) 5. Mac conkey agar misalnya salmonella spp. Untuk bakteri yang tidak meragikan laktosa misalnya shigella spp memberikan warna koloni jernih transparan 6. Phenyl ethyl alcohol (PEA) 7. Perbenihan cair tioglikolat 8. Agar darah 9. Agar coklat dan Thayer martin Biasanya bakteri patogen yang tumbuh pada media agar coklat yaitu: Neisseria meningitidis ,Haemophilus spp (terlibat dalam infeksi saluran pernafasan dan telinga) 10. Agar Thayer martin Thayer martin agar adalah media diperkaya dan selektif untuk isolasi Neisseria gonorhoeae.

Sterilisasi media
Bahan media yang telah dilarutkan , baik media cair maupun untuk media padat harus dilakukan terlebih dahulu melalui proses sterilisasi menggunakan Autoclave yaitu alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121C (250F). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan selama 15 menit. dan waktu harus dihitung dimulai ketika suhu telah mencapai 121 C . Setelah di autoclave media harus mencapai suhu sekurangnya 50 C sebelum dituang ke dalam cawan petri steril (biasanya 25 ml untuk satu cawan petri) sedangkan untuk penambahan bahanbahan seperti darah, antibiotik, vitamin dan mineral harus ditambahkan pada saat agar dingin sebelum dituang ke cawan petri. Untuk komponen media yang tidak tahan panas dapat dilakukan sterilisasi dengan cara filtrasi membran

Lingkungan yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroba

Kondisi lingkungan yang optimal akan mendukung pertumbuhan bakteri pada media pembiakan, empat faktor lingkuangan yang paling penting, yaitu: a) Tersedianya oksigen atau karbondioksida Kebanyakan bakteri klinik adalah terdiri dari bakteri aerob, anaerob fakultatif atau anaerob obligat. Bakteri aerob adalah bakteri yang menggunakan oksigen sebagai reseptor elektron. b) Suhu Bakteri pathogen biasanya tumbuh sangat baik pada suhu yang sama dengan suhu jaringan dan organ tubuh hospes yaitu 37C walaupun demikian suhu pembiakan biasanya berada pada rentang 35-37C. akan tetapi beberapa bakteri memerlukan suhu tertentu untuk inkubasinya mislnya: campylobacter jejuni (42 C), listeria monocytogenes dan yersinia enterocolitica (dapat tumbuh pada suhu 0 C tapi suhu optimum antara 20 dan 40 C c) pH pH adalah pengukuran konsentrasi ion hydrogen pada lingkungan mikroorganisme. d) Kelembaban Air merupakan komponen yang sudah terdapat dalam media, baik pada media padat ataupun cair tapi untuk penyimpanan dalam jangka waktu yang lama saat pembiakan bakteri akan menyebabkan kehilangan sebagian besar kadar air yang timbul karena proses evaporasi. Kehilangan air dari media dapat mengganggu petumbuhan bakteri melalui dua cara yaitu: o berkurangnya air yang merupakan komponen penting yang akan digunakan untuk metabolisme bakteri o dengan berkurangnya air maka konsentrasi zat terlarut dalam media akan meningkat, dengan meningkatnya konsentrasi zat terlarut akan meningkatkan tekanan osmotik sehingga akan menekan sel bakteri dan sel akan lisis

Isolasi bakteri
Isolasi atau pembiakan adalah proses menumbuhkan mikroorganisme dari tempat infeksi (lingkungan in vivo) melalui berbagai spesimen dan menumbuhkan dalam lingkungan tiruan di laboratorium (lingkungan invitro). Ketika bakteri tumbuh pada media, pada umumnya populasi bakteri akan mudah diamati tanpa mikroskop karena berada dalam jumlah yang banyak berupa koloni bakteri sehingga memungkinkan untuk identifikasi laboratorik selanjutnya . Keberhasilan pemindahan bakteri dari lingkungan in vivo ke in vitro memerlukan nutrisi dan lingkungan yang dibutuhkan oleh bakteri patogen tersebut. Karena pada lingkungan in vivo bakteri dapat menggunakan berbagai hasil metabolik dan jalur fisiologik untuk pertumbuhan selama berada di dalam tubuh hospes kemudian secara tiba-tiba harus dapat menyesuaikan diri dengan kondisi tiruan di laboratorium. Dengan demikian sangatlah penting untuk menyediakan nutrisi yang dibutuhkan dan lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan bakteri Di dalam tubuh, populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam jenis bakteri untuk memisahkan bakteri patogen perlu dilakukan isolasi di laboratorium populasi bakteri ini dapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya. Untuk memperoleh hasil yang baik dalam pertumbuhan bakteri maka perlu cara kerja yang aseptik, dan sterilisasi ose sebelum digunakan mengambil koloni yang dicurigai sebagai penyebab infeksi.

Inkubasi

Metode-metode yang digunakan untuk mengoptimalkan kondisi inkubasi :

inkubasi dilakukan pada suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri (35C-37C) dan kelembaban udara yang mengandung CO2 sekitar 3-5% untuk pertumbuhan bakteri yang memerlukan CO2 lebih banyak diperlukan inkubasi pada tempat khusus yang mengandung CO2 (tablet natrium bikarbonat dengan kelembaban dan penutupan yang sangat erat akan menghasilkan CO2 yang cukup , sebagai alternatif dapat juga dilakukan inkubasi pada sungkup lilin yang dapat menghasilkan CO2 3%

Identifikasi bakteri
1) Evaluasi morfologi koloni Evaluasi morfologi koloni dengan memperhatikan warna koloni, bentuk koloni (seperti titik, bundar, berfilamen,atau tidak beraturan), elevasi koloni (cembung, cekung, datar), serta batas koloni (halus atau tidak beraturan) 2) Pemeriksaan mikroskopis Pemeriksaan mikroskopis dengan cara pewarnaan gram dengan melihat diferensiasi (termasuk bakteri gram positif atau negatif), bentuk (coccus, batang, koma, atau pleimorf), susunan (sendiri-sendiri, diplo, berantai, atau seperti anggur)
3) Uji biokimia Uji biokimia dilakukan untuk melihat karakteristik bakteri melalui reaksi biokimia, yang biasa dilakukan diantaranya: 1. TSIA (Tripel Sugar Iron Agar) Digunakan untuk identifikasi bakteri gram negatif batang, untuk melihat kemampuan meragi glukosa dan sukrosa atau laktosa. 2. Fermentasi karbohidrat/gula-gula 3. MR/VP (methyl red /voges proskauer) 4. SIM(sulfur, indol, motility) Uji ini untuk mengetahui pergerakkan bakteri, produksi indol dan pembentukkan gas H2S 5. Simon citrate Uji ini dilakukan untuk menentukkan bakteri yang menggunakan sitrat sebagai sumber karbon