Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs —
Metode Horizontal untuk penghitungan mikroorganisme – Teknik penghitungan koloni
pada suhu 30ºC
1. Pendahuluan
Variasi produk makanan dan pakan yang
sangat banyak memungkinkan metode
horizontal tidak sesuai untuk semua jenis
produk tertentu. Dalam kasus ini, metode
berbeda yang secara khusus untuk produk
tersebut dapat digunakan apabila benar-
benar diperlukan sebagai alasan teknis
yang dapat dibenarkan. Namun demikian,
upaya penerapan metode horizontal harus
dilakukan sejauh mungkin.
Ketika Standar Internasional ditinjau
kembali, semua informasi yang tersedia
akan diperhitungkan mengenai sejauh
mana metode horizontal dapat diikuti
dengan alasan menjadi satui-satunya cara
dalam suatu kasus produk tertentu.
Kesesuaian metode pengujian tidak dapat
ditentukan secara langsung, dan pada
kelompok produk tertentu (Standar
Internasional dan/ atau Standar Nasional)
dimungkinkan sudah diketahui adanya
ketidak sesuaian dengan metode
horizontal.
2.
2.1 Ruang Lingkup
Standar Internasional menetapkan metode
horizontal sebagai metode penghitungan
mikroorganisme, yaitu dengan menghitung
koloni yang tumbuh dalam media padat
setelah dilakukannya inkubasi aerobic pada
suhu 30ºC. Standar Internasional ini
berlaku untuk produk yang dikonsumi
manusia atau pemberian pakan hewan.
Penerapan metode tersebut hanya dapat
dilakukan untuk pemeriksaan makanan
fermentasi tertentu dan bahan pakan ternak
yang terbatas. Pemeriksaan lainnya dapat
disesuaikan.
2.2 Referensi
ISO 6887 (all parts), Microbiology of food
and animal feeding stuffs — Preparation of
test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological
examination.
ISO 7218:1996, Microbiology of food and
animal feeding stuffs — General rules for
microbiological examinations.
ISO 8261, Milk and milk products —
General guidance for the preparation of
test samples, initial suspensions and
decimal dilutions for microbiological
examination.
ISO/TS 11133-1, Microbiology of food
and animal feeding stuffs — Guidelines on
preparation and production of culture
media — Part 1: General guidelines on
quality assurance for the preparation of
culture media in the laboratory.
3. Term dan Definisi
3.1 Mikroorganisme
Bakteri, jamur dan koloni yang dapat
dihitung sebagai pembentuk jamur, dan
diproduksi di bawah kondisi yang sudah
ditentukan dalam Standar Internasional.
4. Prinsip
4.1 Dua buah cawan tuang (pour plate)
disiapkan menggunakan media kultur
spesifik dengan jumlah tertentu dari
sampel uji, apabila produk awal adalah
cair, atau menggunakan jumlah tertentu
dari suspensi awal untuk produk lainnya.
Sepasang pour plate lainnya disiapkan
dengan kondisi yang sama, menggunakan
pengenceran desimal dari sampel uji atau
suspensi awal.
4.2 Pelat diinkubasi secara aerob pada suhu
30ºC selama 72 jam.
4.3 Jumlah mikroorganisme per mililiter
atau per gram sampel dihitung dari
banyaknya koloni yang diperoleh pada
pelat yang sudah ditentukan (lihat clause
10).
5. Media Kultur dan Pengenceran
5.1 Pengenceran sampai 47ºC dalam penangas air
Lihat bagian yang releven dari ISO 6887. (water bath) (6.5) sebelum digunakan.
Jika tidak, simpan dalam ruang gelap
5.2 Plate Count Agar (PCA) pada suhu 3ºC ± 2 ºC selama tidak
5.2.1 Komposisi lebih 3 bulan, dalam kondisi tidak
memungkinkan adanya perubahan
dalam komposisi dan sifatnya
 Sebelum pemeriksaan mikronbiologi
dimulai, lelehkan medium secara
menyeluruh agar tidak terjadi
keterlambatan saat menuangkan
Ketika produk susu diperiksa, tambahkan media. Kemudian dinginkan hingga 44
1.0 g susu bubuk skim per liter media ºC – 47 ºC di dalam penangas air (6.5)
kultur. Susu bubuk skim harus bebas dari sebelum digunakan.
zat-zat penghambat.  Untuk memeriksa suhu agar,
disarankan untuk meletakkan
5.2.2 Preparasi
thermometer ke dalam 15 g/l larutan
5.2.2.1 Preparasi dari medium komersil
agar kontrol ke dalam wadah terpisah
dehidrasi lengkap
yang identik dengan media yang
Ikuti petunjuk pabrik dan tambahkan jika
digunakan. Suhu larutan kontrol harus
perlu, susu skim (lihar 5.2.1). pH
terkena operasi pemanasan dan
disesuaikan jika perlu, sehingga setelah
pendinginan yang sama seperti media
sterlisasi menjadi 7,0 ± 0,2 pada suhu
itu sendiri.
25ºC.
5.2.3 Pengujian kinerja untuk jaminan
5.2.2.2 Preparasi dari komponen dasar
kualitas media kultur
dehidrasi
Untuk menguji kinerja media, lihat ISO/TS
 Larutkan dan dispersikan di dalam air,
11133-1.
dengan urutan sebagai berikut: ekstrak
jamur, enzimatis kasein, glukosa, dan
5.3 Media overlay (jika perlu lihat 9.2.7).
jika perlu susu bubuk skim.
5.3.1 Komposisi
Memanaskan air akan membantu
- agar 12-18 g
prosedur ini.
- air 1.000 ml
 Tambahkan agar dan panaskan hingga
mendidih, aduk hingga agar benar- 5.3.2 Preparasi
benar larut. pH disesuaikan jika perlu,
 Tambahkan agar ke dalam air dan
sehingga setelah sterlisasi menjadi 7,0
panaskan hingga mendidih, aduk
± 0,2 pada suhu 25ºC.
hingga agar benar-benar larut, atau
steam selama kurang lebih 30 menit.
5.2.2.3 Distribusi, sterilisasi, dan
 pH disesuaikan jika perlu, sehingga
penyimpanan
setelah sterlisasi menjadi 7,0 ± 0,2
 Tuangkan media ke dalam tabung
pada suhu 25ºC.
reaksi (6.8), sebanyak 12 ml hingga 15
ml per tabung, atau ke dalam labu atau
5.3.3 Distribusi, sterilisasi, dan
botol (6.8) dengan kapasitas tidak
penyimpanan
lebih dari 500 ml.
 Tuangkan media ke dalam tabung
 Sterilkan dalam autoclave pada 121ºC
reaksi (6.8). sebanyak 4 ml per tabung,
selama 15 menit. Apabila media akan
digunakan, dinginkan hingga 44ºC
 atau ke dalam labu atau botol (6.8)
dengan kapasitas yang sesuai.
 Strerilkan dalam autoclave pada 121ºC
selama 15 menit. Apabila media akan
digunakan, dinginkan hingga 44ºC
sampai 47ºC dalam penangas air
(water bath) (6.5) sebelum digunakan.
Jika tidak, simpan dalam ruang gelap
pada suhu 3ºC ± 2 ºC selama tidak
lebih 3 bulan, dalam kondisi tidak
memungkinkan adanya perubahan
dalam komposisi dan sifatnya
 Sebelum pemeriksaan mikronbiologi
dimulai, lelehkan medium secara
menyeluruh agar tidak terjadi
keterlambatan saat menuangkan
media. Kemudian dinginkan hingga 44
ºC – 47 ºC di dalam penangas air (6.5)
sebelum digunakan.
6. Alat dan peralatan gelas
Peralatan gelas sekali pakai merupakan
alternatif yang dapat diterima menjadi
peralatan gelas yang dapat digunakan
kembali apabila memiliki spesifikasi yang
sesuai.
Berikut peralatan laboratorium
mikrobiologi biasa dan khusus:
6.1 Alat untuk sterilisasi kering (oven)
dan sterilisasi basah (autoclave)
Lihat ISO 7218
6.2 Inkubator
Dapat dioperasikan pada suhu 30ºC ± 1ºC.
6.3 Cawan petri
Terbuat dari kaca atau plastic, dengan
diameter 90 mm sampai 100 mm.
6.4 Pipet
Kapasitas nominal 1 ml
6.5 Penangas air
Dapat dioperasikan pada suhu 44ºC-47ºC
6.6 Alat penghitung-koloni
Contohnya, terdiri dari illuminated base
yang diterangi dengan latar belakang
gelap, dilengkapi dengan lensa pembesar
dengan perbesaran yang sesuai, yaitu
sekitar 1.5 ¥ dan alat penghitung mekanis
atau elektronik.
6.7 pH-meter
pH-meter memiliki akurasi kalibrasi ± 0.1
pH unit pada suhu 25ºC.
6.8 Tabung reaksi, flasks, atau botol
Semuanya dengan kapasitas yang sesuai
dan tidak lebih dari 500 ml.
7. Pengambilan sampel
Sampel yang sangat representatif dan
dalam kondisi baik atau belum diubah
selama perjalanan atau penyimpanan
sangat diperlukan. Pengambilan sampel
tidak termasuk ke dalam metode yang
sudah ditentukan oleh Standar
Internasional ini. Standar internasional
yang spesifik berkerja sama dengan produk
yang berkaitan. Apabila tidak terdapat
Standar Internasional khusus, maka para
pihak yang berkepentingan atau
bersangkutan dapat mencapai kesepakatan
mengenai hal tersebut.
8. Persiapan sampel uji
Siapkan sampel uji sesuai dengan bagian
yang relevan dari ISO 6887, atau ISO
8261, dan standar spesifik yang
berhubungan dengan produk tersebut.
Apabila tidak terdapat Standar
Internasional khusus, maka para pihak
yang berkepentingan atau bersangkutan
dapat mencapai kesepakatan mengenai hal
tersebut.
9. Prosedur
9.1 Uji porsi, suspensi awal, dan
pengenceran
Lihat bagian yang relevan dari ISO 6887
dan Standar Internatisonal khusus yang
sesuai dengan produk yang berkaitan.
9.2 Inokulasi dan inkubasi
9.2.1 ambil dua cawan petril steril (6.3).
Pindahkan ke setiap cawan dengan pipet
steril (6.4) sebanyak 1 ml sampel uji,
apabila sampel cair, atau 1 ml suspensi
awal
untuk produk lain (pengenceran 10-1).
9.2.2 Ambil dua cawan petri steril lainnya
dan pindahkan ke dalam setiap cawan
menggunakan pipet steril lainnya (6.4), 1
ml dari pengenceran 10-1 (produk cair) atau
1 ml dari pengenceran 10-2 (produk lain)
9.2.3 Jika perlu, ulangi prosedur dengan
pengenceran lebih lanjut, menggunakan
pipet steril yang baru untuk setiap
pengenceran decimal.
9.2.4 Jika sesuai dan memungkinkan,
hanya langkah pengenceran kritis yang
dipilih (setidaknya dua pengenceran
desimal yang berturut-turut). Hal tersebut
untuk inokulasi cawan petri yang akan
menunjukkan jumlah koloni antara 15 dan
300 koloni per pelat.
9.2.5 Tuangkan sekitar 12 ml hingga 15 ml
pelat agar penghitungan (5.2) pada 44ºC-
47 ºC ke dalam masing-masing cawan
petri. Waktu yang terlewati antara akhir
preparasi suspensi awal (atau pengenceran
10-1 pada produk cair) dan sesaat ketika
media dituangkan ke dalam cawan tidak
boleh lebih dari 45 menit.
9.2.6 Secara hati-hati, campur inoculum
dan media dengan cara memutar cawan
petri dan biarkan campuran tersebut
memadat. Cawan petri diletakkan di atas
permukaan horizontal yang dingin.
9.2.7 Setelah media sudah memadat,
dimungkinkan adanya mikroorganisme
yang terkandung pada produk tersebut
yang koloninya akan tumbuh melebihi dari
permukaan media. Tuangkan 4 ml media
overlay (5.3) pada suhu 44ºC-47ºC ke
permukaan media yang diinokulasikan dan
dibiarkan mengeras.
9.2.8 Telungkupkan cawan yang sudah
disiapkan dan letakkan di dalam inkubator
pada 30ºC ± 1ºC selama 72 jam ± 3 jam.
Tumpukan cawan harus dipisahkan satu
sama lain dari dinding dan bagian atas
inkubator.
9.3 Penghitungan koloni
9.3.1 Hitung koloni di cawan dengan
menggunakan peralatan penghitungan
koloni jika perlu. Periksa cawan di bawah
cahaya yang redup untuk menghitung
koloni secara tepat. Objek yang
meragunakn diperiksa menggunakan
perbesaran yang lebih tinggi jika perlu,
untuk membedakan koloni dari benda
asing.
9.3.2 Koloni yang menyebar dianggap
sebagai koloni tunggal. Apabila kurang
dari seperempat cawan ditumbuhi secara
menyebar, maka hitung koloni pada bagian
yang tidak terpengaruh dari piring dan
hitung sesuai dengan jumlah seluruh
cawan. Apabila lebih dari seperempatnya
ditumbuhi koloni secara menyebar, maka
tidak dihitung.
10. Ekspresi hasil
10.1 Metode penghitungan
Lihat amendemen 1 pada ISO 7218:1996
10.2 Keakuratan
10.2.1 Umum
Data presisi dievaluasi untuk cawan yang
mengandung lebih dari 15 dan kurang dari
300 koloni. Presisi data tergantung pada
asosiasi flora dan matriks sampel. Data
yang disajikan berasal dari studi
kolaboratif (lihat referensi [1], [2], dan
[3]), serta valid untuk susu mentah dan
susu pasteurisasi. Keduanya dimungkinkan
digunakan sebagai perkiraan apabila
jumlah koloni dalam suatu produk lain
ditetapkan.
10.2.2 Pengulangan
Perbedaan mutlak antara dua hasil uji
tunggal independent, diperoleh dengan
menggunakan metode yang sama pada bahan
uji yang identik di laboratorium dan dengan
semua peralatan yang sama dalam waktu
singkat, tidak boleh lebih besar dari batas
pengulangan, r = 0.25, dalam log10
mikroorganisme per mililiter (atau setara
dengan 1.8 skala normal dalam
mikroorganisme per mililiter).
10.2.3 Reproduksibilitas
Perbedaan mutlak antara dua hasil tes
tunggal, diperoleh melalui metode uji yang
sama dengan bahan dan peralatan di
laboratorium yang berbeda, serta operator
yang berbeda. Tidak boleh lebih dari batas
reproduktifitas, R = 0.45, dalam log10 mi
mikroorganisme per mililiter.
10.3 Interpretasi hasil uji
Dalam contoh berikut, data presisi yang
didapatkan rata-rata memiliki tingkat
probabilitas 95% dan analisis satu sampel
dipertimbangkan
Hasil kedua: log 104.55 = 36.000 atau
log 105.45 = 280.000
Perbedaan antara hasil pertama dan kedua
di laboratorium kedua dapat diterima, jika
hasil pada laboratoriu kedua tidak lebih
rendah dari 36.000 atau tidak lebih tinggi
dari 280.000.
10.4 Batas kepercayaan
Lihat ISO 7218
11. Hasil pengujian
Laporan pengujian harus menentukan;
a) semua informasi yang diperlukan untuk
identifikasi sampel secara lengkap
b) metode pengambilan sampel yang
digunakan, jika diketahui
c) metode pengujian yang digunakan, yang
mengacu pada Standar Internasional ini
d) semua rincian operasi yang tidak
ditentukan dalam Standar Internasional ini,
atau dianggap opsional, bersamaan dengan
rincian dari setiap peristiwa yang
memungkinkan dapat mempengaruhi hasil;
e) hasil tes yang diperoleh.

a) Kondisi pengulangan
Hasil pertama: 105 = 100.000

Perbedaan antara hasil pertama dan kedua

tidak boleh lebih besar dari 0.25 log10 unit.

Hasil kedua: log 104.75 = 56.000 atau

log 105.25 = 178.000

Perbedaan antara hasil pertama dan kedua

dapat diterima, jika hasil kedua tidak lebih
rendah dari 56.000 atau tidak lebih tinggi
dari 178.000.

b) Kondisi reproduksibiltas
Hasil di laboratorium pertama (rata-rata
penentuan duplikat): 105 = 100.000

Perbedaan antara hasil pertama dan kedua

di laboratorium kedua tidak boleh lebih
besar dari 0.45 log10 unit.