- 1826 -

Natrium klorida 75,0 g mikroba yang ada atau yang masuk secara tidak
Agar 15,0 g sengaja selama ataupun sesudah proses produksi.
Merah fenol 0,025 g Pada sediaan steril dosis ganda, pengawet
Air 1000 mL ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan
Panaskan hingga mendidih selama 1 menit dengan mikroba yang mungkin masuk pada pengambilan
pengocokan. Atur pH sehingga setelah sterilisasi berulang. Satu jenis atau lebih pengawet pen
menjadi 7,4 0,2 pada suhu 25 . Sterilisasi diperbolehkan pada semua sediaan steril dosis ganda.
menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi. Pengawet tidak boleh digunakan sebagai pengganti
cara produksi yang baik atau semata-mata untuk
Reinforced Medium for Clostridia menurunkan populasi mikroba viabel dari produk
Beef extract 10,0 g tidak steril atau mengendalikan bioburden pra-
Pepton 10,0 g sterilisasi dari formulasi sediaan dosis ganda pada
waktu diproduksi. Pengawet sesuai bentuk sediaan
Yeast extract 3,0 g
dalam farmakope memenuhi syarat untuk Bahan
Soluble starch 1,0 g
Tambahan dalam Ketentuan Umum.
Glukosa monohidrat 5,0 g
Semua zat antimikroba yang digunakan bersifat
Sistein hidroklorida 0,5 g toksik. Untuk melindungi konsumen secara
Natrium klorida 5,0 g maksimum, kadar pengawet yang efektif dalam
Natrium asetat 3,0 g kemasan akhir produk hendaknya di bawah tingkat
Agar 0,5 g toksik bagi manusia berdasarkan dosis obat yang
Air 1000 mL dianjurkan. Kadar pengawet yang ditambahkan dapat
Basahi dan larutkan agar menggunakan air murni, dan dikurangi apabila bahan aktif dalam formulasi secara
panaskan hingga mendidih dengan pengadukan secara intrinsik mempunyai aktivitas antimikroba. Untuk
terus menerus. Jika diperlukan, atur pH sehingga semua produk injeksi dosis ganda atau produk lain
setelah sterilisasi menjadi 6,8 0,2 pada suhu 25 . yang mengandung pengawet, harus menunjukkan
Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang adanya efektivitas antimikroba baik sebagai sifat
tervalidasi. bawaan dalam produk maupun yang dibuat dengan
penambahan pengawet.
Columbia Agar Efektivitas antimikroba juga harus ditunjukkan
Pancreatic digest of casein 10,0 g untuk semua produk dosis ganda berbasis air pada
Meat peptic digest 5,0 g sediaan topikal, oral dan sediaan lain seperti tetes
Heart pancreatic digest 3,0 g mata, telinga, hidung, irigasi dan cairan dialisis.
Yeast extract 5,0 g Untuk pengujian, sediaan bentuk larutan dengan
Maized starch 1,0 g aktivitas air lebih dari 0,6.
Natrium klorida 5,0 g Mikroba tantang digunakan umumnya berdasarkan
Agar, tergantung pada daya 10,0-15,0 g pada cemaran yang mungkin ada pada produk obat
pembentukan gel dengan mempertimbangkan sifat fisika, formulasi dan
Air murni 1000 mL tujuan penggunaan. Mikroba tantang yang tercantum
Basahi dan larutkan agar menggunakan air murni, dan dalam pengujian ini tidak membatasi digunakannya
panaskan hingga mendidih dengan pengadukan secara mikroba spesies lain jika dianggap perlu untuk
terus menerus. Jika diperlukan, atur pH sehingga mengukur aktivitas biologi dari sistem pengawetan
setelah sterilisasi menjadi 7,3 0,2 pada suhu 25 . suatu sediaan. Mikroba tantang tambahan ini tidak
Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang masuk pembahasan dalam bab ini, tetapi mungkin
dapat ditambahkan pada penjelasan mikroba uji.
tervalidasi. Dinginkan hingga mencapai 45-50 , bila
perlu tambahkan gentamisin sulfat yang setara dengan
20 mg gentamisin basa, dan tuang ke dalam cawan PROSEDUR UMUM
Petri.
Lampiran ini dimaksudkan untuk menunjukkan
efektivitas pengawet antimikroba yang ditambahkan.
Pengawet antimikroba tersebut harus dinyatakan pada
UJI EFEKTIVITAS ANTIMIKROBA <61>
etiket. Prosedur dan kriteria keberterimaan pada
lampiran ini hanya berlaku pada produk dalam wadah
PENDAHULUAN
asli, bersegel, yang didistribusikan oleh produsen
(lihat Tabel 1 untuk katagori produk). Uji efektivitas
Pengawet antimikroba adalah zat antimikroba yang antimikroba tidak dilakukan pada wadah, tetapi
ditambahkan pada sediaan farmasi non-steril bentuk diperlukan kehati-hatian untuk mencegah
larutan. Dosis pengawet yang ditambahkan adalah penggunaan bahan wadah yang dapat berinteraksi
untuk melindungi sediaan terhadap pertumbuhan dengan pengawet.
 - 1827 -
PROSEDUR UJI FERTILITAS DAN
KESESUAIAN METODE PEROLEHAN
KEMBALI
KETENTUAN UMUM
Kemampuan prosedur untuk mendeteksi mikroba
tantang dalam sediaan uji yang telah dinetralkan harus
ditetapkan. Kesesuaian prosedur harus dipastikan
kembali jika ada perubahan bahan atau metode atau
perubahan sediaan yang berasal dari akibat kontak
langsung bahan dan berpengaruh pada hasil
pengujian.
Kemampuan media yang digunakan untuk
menumbuhkan mikroba dalam prosedur ini juga harus
ditetapkan.
PENYIAPAN GALUR UJI
Gunakan suspensi mikroba baku atau yang
disiapkan dengan teknik pemeliharaan biakan lot
benih sehingga mikroba viabel untuk inokulasi tidak
melebihi 5 pasase dari biakan induk. Tumbuhkan
mikroba uji bakteri dan kapang secara terpisah (lihat
Tabel 2).
Gunakan biakan mikroba berikut: Candida
albicans (ATCC No. 10231), Aspergillus brasiliensis
(ATCC No. 16404), Escherichia coli (ATCC No.
8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC No. 9027)
dan Staphylococcus aureus (ATCC No. 6538).
Mikroba viabel yang digunakan dalam prosedur ini
sebaiknya merupakan biakan segar (sebagai contoh
dalam fase pertumbuhan logaritma) kecuali untuk
spora biakan A. brasiliensis. Kondisi biakan untuk
biakan inokula dalam media yang sesuai yaitu
Soybean-Casein Digest atau Sabouraud Dextrose
Agar (lihat Tabel 2).
Untuk memanen biakan bakteri dan C.albicans
gunakan larutan salin LP steril sebagai pencuci
pertumbuhan di permukaan dan kumpulkan dalam
wadah steril yang sesuai. Untuk memanen spora A.
brasiliensis gunakan larutan salin LP steril yang
mengandung polisorbat 80 P 0,05%. Pembuatan
suspensi spora sebaiknya secara aspetik misal
disaring melalui wol kaca steril untuk memisahkan
hifa. Seluruh suspensi mikroba sebaiknya disiapkan
untuk memastikan bebas dari residu media
pertumbuhan dari inokula misal disentrifus kemudian
diresuspensi dalam larutan steril yang sesuai.
Cara lain, biakan mikroba persediaan dapat
ditumbuhkan dalam media cair yang sesuai misal
Soybean-Casein Digest Broth atau Sabouraud
Dextrose Broth, sel dipanen dengan disentrifus, dicuci
dan diresuspensi dalam larutan steril yang sesuai.
Suspensi mikroba yang digunakan untuk inokulasi
sebaiknya diatur untuk mendapatkan jumlah mikroba
lebih kurang 1 x 108 koloni per mL. Gunakan suspensi
bakteri dan khamir dalam waktu 2 jam atau 24 jam
bila disimpan pada suhu antara 2° dan 8°. Suspensi
spora yang stabil dapat disiapkan dan dipelihara pada
suhu antara 2° dan 8° sampai 7 hari. [Catatan
Perkiraan kadar inokula dapat dilakukan dengan
pengukuran turbidimetri untuk mikroba tantang
kemudian dikonfirmasi dengan angka lempeng.]
FERTILITAS MEDIA
Media yang digunakan dalam prosedur ini harus
mampu menunjang pertumbuhan mikroba. Setiap bets
media jadi dan setiap bets media yang disiapkan dari
media kering atau yang dibuat sendiri berdasarkan
komposisi media harus diuji.
Untuk media padat, jumlah koloni yang
ditumbuhkan harus sedikitnya 50% dari nilai
perhitungan inokula yang telah dibakukan. Untuk
inokula segar yang baru disiapkan, pertumbuhan
mikroba sebanding dengan pertumbuhan mikroba
dari bets media yang telah teruji.
KESESUAIAN METODE
PENGHITUNGAN DALAM SEDIAAN
Siapkan pengenceran 10-1 dengan menambahkan 1
mL sediaan (bentuk cair) pada 9 mL salin LP atau
pengencer penetral lain. Lanjutkan ke tingkat
pengenceran 10-2 dan 10-3. Tambahkan sejumlah
mikroba tantang pada setiap pengenceran sediaan,
campur dan kemudian tambahkan sejumlah volume
yang sesuai ke dalam lempeng media untuk
menghasilkan pertumbuhan kurang dari 250 koloni
per lempeng bakteri dan khamir (antara 25 dan 250
koloni) atau kurang dari 80 koloni per lempeng untuk
A. brasiliensis (antara 8 dan 80 koloni). Lempeng
sebaiknya dilakukan minimal duplo (makin besar
replikat dapat meminimalkan variabilitas perkiraan
jumlah koloni). Pada prosedur ini, sebagai kontrol
positif dimasukkan inokula ke dalam salin LP.
Pindahkan volume salin LP yang sama tanpa inokula
pada lempeng agar. Perkiraan perolehan kembali
pertumbuhan koloni dari suspensi kontrol positif ini
sedikitnya 50% (dari rata-rata).
Jika sediaan yang diencerkan menunjukkan adanya
antimikroba, perlu ditambahkan penetral khusus ke
dalam media perolehan kembali.
Kemampuan prosedur untuk mengukur efektivitas
pengawet dapat dikompromikan jika metode
mempersyaratkan kesesuaian tingkat pengenceran
(10-2 atau 10-3) koloni perolehan kembali (misal
kesulitan mengukur 3log reduksi untuk inokula 105-
106). Jika tidak diperoleh penetral atau metode yang
sesuai dan kesesuaian metode mempersyaratkan
tingkat pengenceran yang nyata, maka dapat
digunakan inokula tingkat kerapatan lebih tinggi
(misal 107-108), sehingga 3log reduksi dapat diukur.
Perolehan kembali tidak dapat dilaporkan kurang dari
 - 1828 -
1 koloni per lempeng dari rata-rata (atau 100 koloni
per mL jika digunakan 1 mL inokula pada
pengenceran 10-2 untuk lempeng yang dibuat duplo).
Penyaring membran dapat digunakan untuk
menyaring volume pengenceran lebih besar guna
mengatasi kesulitan tersebut atau menetralisasi daya
antimikroba.
PENGUJIAN SEDIAAN
KATEGORI SEDIAAN
Untuk tujuan pengujian, sediaan dibagi menjadi
empat kategori (Lihat Tabel 1). Kriteria efektivitas
antimikroba untuk sediaan tergantung cara
pemberiannya. Formulasi yang mengandung
pengawet diharapkan dapat memenuhi standar efikasi
minimal baik pada kemasan dosis ganda atau dosis
tunggal.
Tabel 1. Kategori Sediaan
Kategori Uraian Sediaan
1 Injeksi, sediaan parenteral lain
termasuk emulsi, sediaan tetes telinga,
sediaan tetes hidung steril , dan
sediaan tetes mata yang dibuat dengan
dasar atau pembawa air.
2 Sediaan topikal yang dibuat dengan
dasar atau pembawa air, sediaan tetes
hidung non-steril, dan emulsi,
termasuk sediaan yang dioleskan pada
membran mukosa.
3 Sediaan oral selain antasida, dibuat
dengan dasar atau pembawa air.
4 Antasida yang dibuat dengan
pembawa air
PROSEDUR
Pengujian dapat dilakukan dalam tiap lima wadah
asli bila volume sediaan tiap wadahnya mencukupi
dan wadah sediaan dapat ditusuk secara aseptik
(dengan jarum dan alat suntik melalui tutup karet
elastomerik), atau dalam lima wadah bakteriologi
Tabel 2. Kondisi Biakan untuk Penyiapan Inokula
Mikroba Media yang sesuai
Escherichia coli Soybean-Casein Digest
ATCC No.8739 Broth; Soybean-Casein
Digest Agar
Pseudomonas Soybean-Casein Digest
aeruginosa Broth; Soybean-Casein
ATCC No. 9027 Digest Agar
bertutup steril, berukuran mencukupi untuk volume
sediaan yang dipindahkan. Inokulasi tiap wadah
dengan satu inokula baku yang telah disiapkan dan
diaduk. Volume suspensi inokula yang digunakan
antara 0,5% dan 1,0% dari volume sediaan untuk
meminimalkan efek potensial pada sediaan. Kadar
mikroba uji yang ditambahkan pada sediaan (Kategori
1, 2, atau 3) seperti halnya kadar akhir sediaan uji
setelah diinokulasi antara 1 x 105 dan 1 x 106 koloni
per mL sediaan. Untuk sediaan Kategori 4 (antasida)
kadar akhir sediaan uji setelah inokulasi antara 1 x 103
dan 1 x 104 koloni per mL sediaan.
Kadar awal mikroba viabel dalam setiap sediaan uji
diperkirakan berdasarkan kadar mikroba dalam
inokula baku yang ditetapkan dengan metode ALT.
Inkubasi wadah yang sudah diinokulasi pada suhu
22,5º±2,5º. Ambil sampel dari setiap wadah pada
interval yang sesuai seperti tertera pada Tabel 3.
Amati dan catat setiap perubahan yang terjadi pada
interval tersebut. Tetapkan dengan prosedur ALT
jumlah koloni yang ada dari setiap sediaan uji untuk
interval yang digunakan seperti tertera pada lampiran
Uji Batas Mikroba <51>. Angka Lempeng Total
menggunakan replika lempeng minimal, dengan
menghitung rata-rata jumlah koloni sebelum
penetapan kesimpulan koloni per mL. Jika digunakan
penyaring membran, lakukan duplikasi membran
penyaring untuk setiap perkiraan.
Dengan menggunakan penghitungan kadar koloni
per mL pada pengujian awal, hitung perubahan nilai
kadar koloni per mL dalam log10 untuk tiap mikroba
pada interval pengujian dan nyatakan perubahan
kadar sebagai log reduksi. Log reduksi adalah
perbedaan antara nilai log10 koloni per mL kadar awal
dalam suspensi dan log10 koloni per mL yang bertahan
hidup pada saat itu.
KRITERIA EFEKTIVITAS ANTIMIKROBA
Persyaratan untuk efektivitas antimikroba dipenuhi
jika kriteria yang tertera pada Tabel 3 dipenuhi (Lihat
Hasil Uji pada Ketentuan Umum): Tidak terjadi
peningkatan lebih tinggi dari 0,5 log10 unit terhadap
nilai log mikroba awal.
Waktu inkubasi
Waktu inkubasi
Suhu inkubasi perolehan kembali
inokulum
mikroba
32,5º ± 2,5º 18 24 jam 3 5 hari
32,5º ± 2,5º 18 24 jam 3 5 hari
 - 1829 -

Waktu inkubasi
Waktu inkubasi
Mikroba Media yang sesuai Suhu inkubasi perolehan kembali
inokulum
mikroba
Staphylococcus aureus Soybean-Casein Digest 32,5º ± 2,5º 18 24 jam 3 5 hari
ATCC No. 6538 Broth; Soybean-Casein
Digest Agar

Candida albicans Sabouraud Dextrose 22,5º ± 2,5º 44 52 jam 3 5 hari

ATCC No. 10231 Broth; Sabouraud
Dextrose Agar

Aspergillus brasiliensis Sabouraud Dextrose 22,5º ± 2,5º 6 10 hari 3 7 hari

ATCC No. 16404 Agar; Sabouraud
Dextrose Broth

Tabel 3. Kriteria untuk Mikroba Uji

Untuk Sediaan Kategori 1
Bakteri Koloni tidak kurang dari 1,0 log reduksi dari jumlah hitungan awal pada hari ke-7,
tidak kurang dari 3,0 log reduksi dari hitungan awal pada hari ke-14, dan tidak
meningkat sampai dengan hari ke-28.

Kapang dan khamir Koloni tidak meningkat dari jumlah hitungan awal sampai hari ke-7, 14 dan 28.
Untuk Sediaan Kategori 2
Bakteri Koloni tidak kurang dari 2,0 log reduksi dari jumlah hitungan awal pada hari ke-14,
dan tidak meningkat pada hari ke-14 sampai hari ke-28.

Kapang dan khamir Koloni tidak meningkat dari jumlah hitungan awal sampai hari ke-14 dan 28.
Untuk Sediaan Kategori 3
Bakteri Koloni tidak kurang dari 1,0 log reduksi dari jumlah hitungan awal pada hari ke-14,
dan tidak meningkat pada hari ke-14 sampai hari ke-28.

Kapang dan khamir Koloni tidak meningkat dari jumlah hitungan awal sampai hari ke-14 dan 28.
Untuk Sediaan Kategori 4
Bakteri, kapang dan Koloni tidak meningkat dari jumlah hitungan awal pada hari ke-14 dan 28.
khamir

UJI KINERJA RESISTENSI INDIKATOR
BIOLOGI <65>
PENGHITUNGAN ANGKA SPORA
Untuk indikator biologi dengan pembawa kertas,
lepaskan tiga buah indikator biologi yang relevan dari
masing-masing wadahnya. Dispersikan kertas
pembawa dengan memasukkan ke dalam 250 mL
blender steril berisi 100 mL Air Murni dingin,
campurkan hingga terbentuk suspensi homogen.
Umumnya pencampuran dilakukan selama 15 menit
atau lebih untuk memperoleh perolehan kembali yang
optimal. Pindahkan sejumlah 10 mL alikuot suspensi
ke dalam 16 x 125 mm tabung bertutup ulir steril.
Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Uap Basah
dengan Pembawa Kertas, panaskan tabung berisi
suspensi dalam tangas air pada 95º 100º selama 15
menit (syok panas) dimulai setelah suhu mencapai
95º. Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Panas Kering
dengan Pembawa Kertas dan Indikator Biologi
Sterilisasi Etilen Oksida, dengan Pembawa Kertas,
panaskan tabung berisi suspensi dalam tangas air pada
80º 85º selama 10 menit dimulai setelah suhu
mencapai 80º. Dinginkan secara cepat dalam tangas
air-es pada 0º - 4º. Pindahkan 1 mL alikuot masing-
masing ke dalam dua tabung yang sesuai, dan lakukan
seri pengenceran secukupnya dalam Air Murni steril,
pengenceran dipilih dengan hasil penghitungan 30
300 koloni, tetapi tidak kurang dari 6, pada tiap
pasangan lempeng dengan perlakuan sebagai berikut
ini. Bila indikator biologi mempunyai kadar spora
rendah, mungkin seri pengenceran perlu dimodifikasi
dan menggunakan lempeng lebih banyak untuk tiap
pengenceran. Siapkan seri terpisah lempeng untuk
tiap alikuot. Masukkan 1,0 mL suspensi dari tingkat