UJI BATAS MIKROBA

Uji batas mikroba dilakukan untuk memperkirakan jumlah aerob viable didalam semua
jenis persiapan dibidang farmasi, mulai dari bahan baku hingga sediaan jadi dimana harus
terbebas dari spesies mikroba tertentu. Sehingga dapat digunakan sebagai uji yang akan disajikan
dengan ketentuan yang sudah divalidasi sedemikian rupa sampai menunjukkan hasil yang sama
atau lebih baik.
Selama menyiapkan dan melaksanakan pengujian, spesies harus ditangani secara aseptic,
jika dinyatakan lain inkubasi , maka yang dimaksud adalah menempatkan wadah didalam
ruangan terkendali secara termostatik pada suhu antara 30 0 dan 350 selama 24 hingga 48 jam.
Istilah tumbuh ditujukan untuk pengertian adanya dan kemungkinan adanya perkembangan
mikroba viable.
UJI PENDAHULUAN
Validasi hasil uji yang akan disajikan berdasarkan pada ketentuan yang menunjukkan
bahwa specimen uji tidak menghambat pertumbuhan mikroba yang terdapat dalam specimen uji.
Jadi sebagai uji pendahuluan dilakukan inkulasi secara terpisah enceran specimen uji dengan
biakan viable yang terdiri dari Staphylococcus aureus, Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa
dan salmonella.
Pengujian dilakukan dengan menambahkan 1 ml tidak kurang dari 10 -3 enceran biakan
mikroba yang berumur 24 jam pada enceran pertama specimen uji ( dalam dapar posfat pH 7.2,
media fluid soybean- casein digest atau media fluid laktosa medium) dan diuji sesuai prosedur.
Jika tidak terdapat pertumbuhan mikroba pada media maka pengujian tersebut dinyatakan tidak
berlaku dan diperlukan modifikasi prosedur dengan :

Meningkatkan volume pengencer dengan tetap mempertahankan jumlah bahan uji , atau

Menambahkan zat inaktivator dengan jumlah secukupnya kedalam pengencer, atau

Modifikasi (1) dan (2) sedemikian rupa hingga terdapat pertumbuhan inokulum

Lesitin kedelei 0.5 % dan polisorbat 204,0 % adalah contoh dan konsentrasi zat yang
dapat ditambahkan ke dalam media untuk menetralkan zat penghambat yang terdapat didalam.
Sebagai alternative, ulangi pengujian menggunakan media fluidcasein digessoybean lecithin
polysorbate 20 untuk menurunkan netralisasi pengawet atau bahan anti mikroba lainnya didalam
contoh. Jika zat penghambat terdapat didalam sediaan dan dapat larut, dapat digunakan prosedur

yang divalidasi dan sesuai dengan prosedur uji menggunakan penyaringan membrane yang
tertera pada uji sterilitas.
Jika penambahan inaktivasi dan peningkatan volume seperti disebut diatas masih tidak
dapat menumbuhkan mikroba viable dan jika contoh tidak cocok diuji dengan cara penyaringan
membrane maka dapat disimpulkan bahwa kegagalan isolasi mikroba disebabkan oleh daya
bakterisida dari sediaan.
Informasi dapat berguna untuk menunjukkan bahwa contoh tidak dapat dikontaminasi
oleh jenis mikroba yang digunakan. Pemantauan perlu dilanjutkan untuk menetapkan besarnya
daya hambat dan daya bakterisida dari bahan tersebut.
Larutan Dapar dan Media
Media biakan dapat dibuat seperti dibuat di bawah ini, atau media biakan dehidrat dapat
digunakan jika sudah direkonstitusi sesuai petunjuk produsen atau distributor memiliki bahan
yang sebanding dan/atau menghasilkan media yang sama dengan media yang menggunakan
formula seperti disebut di bawah ini.
Peda pembuatan media menggunakan formula yang disebut di bawah ini, larutkan bahan
padat yang dapat larut dalam air, jika perlu panaskan hingga larup sempurna, dan tambahkan
larutan asam klorida atau natrium hidroksida secukupnya hingga diperoleh media dengan pH
yang diinginkan, jika sudah siap digunakan. Tetapkan pH pada suhu 25 2.
Jika pada formula disebut agar, gunakan agar dengan kadar air tidak lebih dari 15% dan
jika disebut air, gunakan Air Murni.
Larutan Dapar Posfat pH 7,2
Larutan 34g kalium posfat monobasa P dalam lebih kurang 500 ml air dalam labu
terukur-1000 ml; tambahkan lebih kurang 175 ml natrium hidroksida 1 N hingga pH 7,2 0,1.
Tambahkan air sampai tanda, dan campur. Masukkan dalam beberapa wadah dan sterilkan.
Simpan dalam lemari pendingin. Sebelum digunakan, encerkan 1 bagian larutan dengan 800
bagian air, dan sterilkan.
Media
Jika tidak dinyatakan lain, media harus disterilkan dengan pemanasan dalam otoklaf
(seperti yang tertera pada Sterilitas uap air dalam Sterilitas dan Jaminan Strerilitas Bahan
Konfendia. Waktu paparan tergantung pada volume yang disterilkan.
Berikut beberapa media yang dapat dibuat dalam pengujian batas mikroba
Media FCDLSP (fluid casein digest soy lecithin polysorbate 20 medium).

Larutkan digesti pankreatik kasein P dan lesitin kedele dalam 960 ml air,panaskan dalam
tangas air pada suhu 48 sampai 500C selama kurang lebih30 menit hingga larut. Tambahkan 40
ml polisorbate 20 p , campur dan masukkan dalam wadah sesuai yang dikehendaki.
Media MSA ( Mannitol Soybean Agar medium)
Digesti pankreatik kasein p
5 g
Digesti papaiktepung kedele p
5 g
Ekstrak daging p
1g
D Manitol p
10 g
Natrium klorida P
75 g
Agar P
15 g
Merah fenol P
0.025 g
Air
1000 ml
Campur, panaskan sambil sering dikocok, dan didihkan selama 1 menit hingga melarut.
pH setelah sterilisasi 7.4 0.2.
Media BPA ( Baird- Parker Agar Medium )
Digesti pankreatik kasein p
10 g
Ekstrak daging p
5 g
Ekstrak Ragi P
1g
Litium Klorida P
5g
Agar P
20 g
Glisin P
12 g
Natrium piruvat P
10 g
Air
950 ml
Panaskan sambil sering dikocok, dan didihkan selama 1 menit. Sterilkan , dinginkan
sampai suhu antara 45 dan 500C.dan tambahkan 10 ml larutan kalium telurit P steril (1 dalam 100
) dan 50 ml emulsi kuning telur. Campur secara hati-hati dan tuang perlahan kedalam cawan.
Emulsi kuning telur telah dibuat sebagai berikut : Disinfeksi seluruh permukaan telur, Pecahkan
telur secara aseptic, dan pisahkan kuning telur seutuhnya kedalam gelas ukur berskala yang
steril. Tambahkan larutan Natrium Klorida P 0,9 % steril hingga diperoleh perbandingan kuning
telur : larutan Natrium Klorida 3 : 7. masukkan kedalam blender sterildan campur dengan
kecepatan tinggi selama 5 detik
pH yang didapatkan setelah sterilisasi 6.8 0.2.
Media VJA (Vogel Johnson Agar Medium )
Digesti pankreatik kasein p
Ekstrak Ragi P
Manitol p
Litium Klorida P

10 g
5g
10 g
5g

Kalium fospat dibasa

5g
Glisin P
10 g
Agar p
16 g
Merah fenol P
25 ng
Air
1000 ml
Didihkan bahan padat yang telah dilarutkan selama 1 menit. Sterilkan , dinginkan hingga
suhu antara 45 dan 500C dan tambahkan 20 mllarutan kalium telurit Psteril (1 dalam 100 )
pHsetelah sterilisasi 7.2 0.2.
Media CETA ( Centrimide Agar Medium )
Digesti Pankreatik gelatin
20 g
Magnesium klorida P
1.4 g
Kalium Sulfat P
10 g
Agar P
13.6 g
Setil Trimetil ammonium bromide P
0.3 g
Gliserin P
10 ml
Air
1000 ml
Larutkan bahan padatdidalam air dan tambahkan gliserin P. Panaskan sambil sering
dikocok dan didihkan selama 1 menit hingga larut.
pH setelah sterilisasi 7.2 0.2.
Media PAF (Pseudomonas Agarmedium for detection of flourescin )
Digesti pankreatik kasein P
10 g
Digesti peptic jaringan hewan P
10 g
Kalium posfat dibasa anhidrat
1,5 g
Magnesium sulfat P (MgSO4. 7H2O)
1,5 g
Gliserin P
10 g
Agar P
15 g
Air
1000 ml
Larutkan semua bahan padat didalam air sebelum ditambah gliserin P. Panaskan
sambil sering dikocok , dan didihkan selama 1 menit hingga larut.
pH setelah sterilisasi 7.2 0.2.
Media PAP (Pseudomonas Agar Medium for Detection Pyocianin )
Digesti pankreatik kasein P
20 g
Magnesium Klorida anhidrat
1,4 g
Kalium Sulfat anhidrat
10 g
Gliserin P
10 g
Agar P
15 g
Air
1000 ml

Larutkan semua bahan padat didalam air sebelum ditambah gliserin P. Panaskan
sambil sering dikocok , dan didihkan selama 1 menit hingga larut.
pH setelah sterilisasi 7.2 0.2.
Media FLM ( Fluid Lactose Medium )
Ekstrak daging P
3g
Digesti pankreatik kasein P
5g
Laktosa P
5g
Air
1000 ml
Dinginkan sesegera mungkin setelah sterilisasi
pH setelah sterilisasi 6,9 0.2
Media FSCM ( Fluid Selenite Cystine medium )
Digesti pankreatik kasein P
5g
Laktosa P
4g
Natrium Posfat
10 g
Natrium selenit asam
4g
L- sistin P
10 mg
Air
1000 ml
pH akhir 7.2 0.2.
Campur dan panaskan hingga larut. Panaskan didalam uapair mengalir selama 15 menit.
Tidak boleh disterilkan.
Media FTM (Fluid tethrationate Medium )
Digesti pankreatik kasein P
10 g
Digesti peptic jaringan hewan P
10 g
Garam empedu P
1 g
Kalsium karbonat P
10 g
Natrium tiosulfat P
30 g
Air
1000 ml
Didihkan larutan bahan padat,pada hari penggunaan tambahkan larutan yang dibuat
dengan melarutkan 5 g Kalium iodide P, dan 6 g iodium P didalam 20 ml air. Kemudian
tambahkan10 ml larutan hijau berlian P(1 dalam 1000) dan campur. Media tidak boleh
dipanaskan sesudah penambahan larutan hijau berlian .

Prosedur
Spesimen yang akan diuji disiapkan sedemikian rupa sesuai dengan sifat fisiknya dan
tidak mengubah jumlah dan jenis mikroba yang semula ada hingga diperoleh larutan atau
suspensi dari semua atau sebagian spesimen dalam bentuk yang sesuai dengan prosedur uji yang
akan dilaksankan.

Untuk bahan padat yang tidak seluruhnya melarut, perkecil ukuran bahan hingga
merupakan serbuk cukup halus, suspensikan ke dalam pembawa tertentu, dan lakukan pengujian
seperti tertera pada Angka Mikroba Aerob Total, Uji Staphylococcuc aureus dan Pseudomonas
aeruginosa, Uji Salmonella sp dan Escherichia coli.
Untuk spesimen cair yang terdiri atas larutan, suspense dalam air atau suatu larutan
pembawa hidroalkoholik yang mengandung etanol kurang dari 30%, dan untuk bahan padat yang
mudah larut dan praktis larus sempurna di dalam 90 ml dapar posfat pH 7,2 atau media tertentu,
lakukan pengujian seperti tertera pada Angka Mikroba Aerob Total, Uji Staphylococcuc
aureusdan Pseudomonas aeruginosa, Uji Salmonella sp dan Escherichia coli.
Untuk cairan tidak campur air/salep, krim dan malam dibuat suatu suspensi dengan
menggunakan emulgator steril yang sesuai dalam jumlah yang minimal (misalnya salah satu
polisorbat), gunakan blender mekanik dan jika perlu hangatkan hingga suhu tidak lebih dari 45
san lanjutkan pengujian seperti tertera pada Angka Mikroba Aerob Total, Uji Staphylococcuc
aureusdan Pseudomonas aeruginosa, Uji Salmonella sp dan Escherichia coli.
Untuk spesimen cair dalam bentuk aerosol, dinginkan wadah dalam campuran alcohol
dan es kering selama lebih kurang 1 jam, buka tutup wadah dan biarkan hingga mencapai suhu
kamar, dan biarkan propelan terbebas, atau jika memungkinkan hangatkan wadah untuk
mendorong propelan keluar. Pindahkan bahan uji secukupnya yang diperlukan untuk pengujian
Jika hasil pengujian tidak dapat disimpulkan atau meragukan, ulangi pengujian dengan
menggunakan 20 wadah atau lebih.
Angka Mikroba Aerob Total
Untuk spesimen yang cukup melarut atau transulen hingga dapat diuji dengan metode
lempeng atau metode tabung ganda. Dengan menggunakan salah satu dari kedua cara tersebut,
mula-mula larutkan atau suspensikan 10.0 g spesimen berbentuk padat, atau 10 ml spesimen
berbentuk cair yang diukur saksama, di dalam dapar posfatpH 7,2, Media FSCD atau Media
FCDSLP hingga diperoleh 100 ml. Untuk spesimen kentalyang pada pengenceran awal (1:10)
tidak dapat dipipet, encerkan spesimen hingga diperoleh suspensi (1:50) atau (1:100), dan
seterusnya hingga dapat dipipet. Lakukan pengujian untuk menetapkan tidak terdapatnya zat
penghambat (zat antimikroba) seperti yang tertera pada Uji Pendahuluan, sebelum melakukan
penetapan Angka Mikroba Aerob Total.Masukkan spesimen ke dalam media tidak lebih dari 1
jam setelah membuat enceran yang sesuai untuk inokulasi.
Terdapat dua metode yang dapat dilakukan untuk Uji Batas Mikroba, yaitu:
1. Metode Lempeng

Metode ini dilakukan dengan cara inokulasi sediaan uji (specimen) dengan berbagai
pengenceran pada media agar tertentu. Setelah inkubasi 48 samapai dengan 72 jam, pertumbuhan
mikroba pada berbagai pengenceran diamati dan dihitung jumlah koloni yang tumbuh.
Jika perlu encerkan cairan lebih lanjut sedemikian rupa hingga 1 ml diharapkan dapat
menghasilkan 30 koloni sampai 300 koloni. Pipet 1 ml enceran akhir masing-masing ke dalam 2
cawan petri steril. Segera tambahkan ke dalam cawan 15 ml sampai 20 ml Media SCDA yang
sebelumnya telah dicairkan dan didinginkan hingga lebih kurang 45. Tutup cawan petri, campur
contoh dan agar dengan cara memiringkan atau memutarnya, dan biarkan isi cawan memadat
pada suhu kamar. Balikkan cawan dan inkubasi selama 48 jam hingga 72 jam. Setelah inkubasi,
amati pertumbuhan di dalam lempeng, hitung jumlah koloni, dan dari kedua lempeng nyatakan
rata-rata jumlah mikroba tiap g atau ml spesimen. Jika tidak ditemukan koloni mikroba di dalam
cawan dengan enceran awal (1:10), nyatakan hasil pengujian sebagai: kurang dari 10 mikroba
per g atau ml spesimen.
2. Metode Tabung Ganda
Metode ini dilakukan dengan menggunakan beberapa tabung yang berisi media dan
diinokulasikan dengan sediaan uji (spesimen) konsentrasi tertentu. Setelah diinkubasikan, amati
adanya pertumbuhan mikroba pada setiap tabung. Jumlah mikroba yang tumbuh tiap g atau ml
spesimen dihitung dari nilai duga terdekat/MPN (Most Probable Number) berdasarkan table
MPN.
Ke dalam setiap tabung dari 14 tabung berukuran sama tambahkan mesing-masing 9,0
ml Media FSCD steril. Pisahkan 12 tabung dan bagi dalam 4 kelompok masing-masing terdiri
dari 3 tabung. Satu kelompok sebagai control dan 3 kelompok lain sebagai: kelompok 1 (100),
kelompok 2 (10), kelompok 3 (1), dan 2 tabung lainnya masing-masing dinyatakan sebagai
tabung A dan tabung B. Ke dalam masing-masing tabung kelompok 1 (100) dan tabung A
dimasukkan 1ml larutan atau suspensi spesimen dan campur. Dari tabung A dipipet 1 ml ke
tabung B, dan campur. Tabung A dan tabung B masing-masing akan berisi 100 mg (100
l)
dan 10 mg (10

l) spesimen. Ke dalam masing-masing tabung kelompok 2 (10) tambahkan

1 ml dari tabung A, ke dalam masing-masing tabung kelompok (1) tambahkan 1 ml dari

tabung B. Buang sisa isi dari tabung dan inkubasikan. Setelah diinkubasi, amati adanya
pertumbuhan di dalam tabung, ketuga tabung control akan tetap jernih, dan berdasarkan ada
tidaknya pertumbuhan di kelompok 1, kelompok 2 dan kelompok 3, dan menggunakan acuan
pada table, nyatakan Nilai Duga Terdekat (MPN) mikroba tiap g atau ml spesimen.

UJI STERILITAS

Prosedur berikut dapat digunakan untuk menetapkan apakah bahan Farmakope yang
harus steril memenuhi syarat berkenaan dengan uji sterilitas seperti yang tertera pada masingmasing monografi (untuk penggunaan prosedur uji sterilitas sebagai bagian dari pengawasan
mutu di pabrik, seperti yang tertera pada Sterilisasi dan Jaminan Sterilitas Bahan Kompendia.
Mengingat kemungkinan hasil positif dapat disebabkan oleh teknik aseptic yang salah atau
kontaminasi lingkungan pada waktu pengujian, diberlakukan ketentuan pengujian 2 tahap seperti
yang tertera pada Penafsiran Hasil Uji Sterilitas.
Prosedur alternative dapat digunakan untuk menunjukan bahwa suatu bahan adalah steril,
asalkan hasil yang diperoleh sekurang-kurangnya setara keandalanya (lihat Prosedur seperti
yang tertera pada Uji dan Penetapan dalam Ketentuan Umum). Seandainya timbul perbedaan,
atau pertentangan, jika tanda adanya kontaminasi mikroba diperoleh dengan menggunakan
prosedur dalam Farmakope, maka hasil yang diperoleh menentukan bahwa bahan tersebut tidak
memenuhi syarat. Kegagalan menunjukan adanya kontaminasi mikroba dengan menggunakan
prosedur dalam Farmakope membuktikan bahwa bahan tersebut memenuhi syarat.

Media
Media untuk pengujian dapat dibuat seperti yang tertera di bawah ini, atau dapat digunakan
campuran kering yang menghasilkan formulasi sama, asalkan jika direkonstitusi sesuai petunjuk
pabrik atau distributor, mempunyai sifat merangsang pertumbuhan yang sama atau lebih baik
dari formulasi yang diberikan dibawah ini.

I.

Media tioglikolat cair

L-Sistin P

0,5 g

Natrium klorida P

2,5 g

Glukosa P (C6H12O6.H2O)

5,5 g

Agar P, granul (kadar air

tidak lebih dari 15 %)

0,75 g

Ekstrak ragi P (larut dalam air)

5,0 g

Digesti pankreas kasein P

15,0 g

Natrium tioglikolat P atau

0,5 g

Asam tioglikolat P

0,3 ml

Larutan natrium resazurin P

(1 dalam 1000) dibuat segar
Air

1,0 ml
1000 ml

pH setelah sterilisasi 7,1 0,2

Campur dan panaskan hingga larut. Atur pH larutan hingga setelah sterilisasi 7,1 0,2
menggunakan Natrium hidroksida 1 N. Jika perlu saring selagi panas menggunakan kertas
saring. Tempatkan media dalam tabung yang sesuai, yang memberikan perbandingan permukaan
dengan kedalaman media sedemikian rupa sehingga tidak lebih dari setengah bagian atas media
yang mengalami perubahan warna sebagai indikasi masuknya oksigen pada masa akhir inkubasi.
Sterilisasi dalam otoklaf. Jika lebih dari sepertiga bagian atas terjadi warna merah muda, media
dapat diperbaiki satu kali dengan pemanasan diatas tangas air atau dalam uap yang mengalir
bebas hingga warna merah muda hilang. Media siap digunakan jika tidak lebih dari sepersepuluh
bagian atas media berwarna merah muda. Gunakan media tioglikolat cair untuk inkubasi dalam
kondisi aerob.

II.

Media tioglikolat alternative

(untuk alat yang mempunyai lumen kecil)

L-Sistin P

0,5 g

Natrium klorida P

2,5 g

Glukosa P (C6H12O6.H2O)

5,5 g

Ekstrak ragi P (larut dalam air)

5,0 g

Digesti pankreas kasein P

15,0 g

Natrium tioglikolat P atau

0,5 g

Asam tioglikolat P

0,3 ml

Air

1000 ml

pH setelah sterilisasi 7,1 0,2

Panaskan semua bahan dalam wadah yang sesuai hingga larut. Campur, dan jika perlu, atur pH
larutan hingga setelah sterilisasi 7,1 0,2 menggunakan natrium hidroksida 1 N. Saring jika
perlu, tempatkan dalam tabung yang sesuai dan sterilisasi dengan uap air. Media dibuat segar
atau dipanaskan di tangas uap atau didinginkan saat akan digunakan. Tidak boleh dipanaskan
kembali. Gunakan media tioglikolat alternative dengan cara yang menjamin kondisi anaerob
selama masa inkubasi.

III.

Soybean-Casein Digest Medium

Digesti pankreas kasein P

17,0 g

Digesti papaik tepung kedele

3,0 g

Natrium klorida P

5,0 g

Kalium fosfat dibasa P

2,5 g

Glukosa P (C6H12O6.H2O)

2,5 g

Air

1000 ml

pH setelah sterilisasi 7,3 0,2

Larutkan semua bahan padat dalam air, hangatkan hingga larut. Dinginkan larutan hingga suhu
kamar, dan jika perlu atur pH larutan hingga setelah sterilisasi 7,3 0,2 menggunakan natrium
hidroksida 1 N. Saring jika perlu, dan bagikan dalam tabung yang sesuai. Sterilisasi dengan uap
air.
Gunakan Soybean-Casein Digest Medium untuk inkubasi dalam kondisi aerob.
Catatan :
Jika digunakan media tioglikolat cair dan Soybean-Casein Digest Medium dalam Prosedur Uji
Inokulasi Langsung ke Dalam Media Uji untuk menetapkan specimen yang mengandung
antibiotic golongan penisilin atau sefalosporin, secara aseptic tambahkan sejumlah penisilinase
ke dalam tabung media untuk menginaktifkan antibiotic dalam specimen uji. Tetapkan jumlah
penisilinase yang diperlukan dengan menambahkanya ke dalam tabung Media tioglikolat cair
dan sejumlah antibiotic penisilin atau sefalosporin setara jumlah antibiotic dalam specimen uji,
inokulasi media dalam 1 ml pengenceran (1 dalam 1000) biakan 18 jam sampai 24 jam
Staphyloccus aureus (ATCC 29737) dalam Media Tioglikolat Cair, dan inkubasi selama 24 jam

pada suhu 30o sampai 35o: pada saat ini harus teramati pertumbuhan mikroba yang spesifik.
Lakukan uji konfirmasi di daerah yang benar-benar terpisah dari tempat uji sterilitas.

Cairan Pengencer dan Pembilas

Cairan A
Larutkan 1 g digesti peptik jaringan hewan P seperti yang tertera pada Spesifikasi Pereaksi dalam
Pereaksi, indikator dan larutan dalam air hingga 1 liter, saring atau sentrifus hingga jernih, atur
pH hingga 7,1 0,2, bagikan ke dalam sejumlah wadah 100 ml dan strilisasi dengan uap air.
Catatan : Jika cairan A digunakan untuk uji sterilitas pada specimen yang mengandung antibiotic
golongan penisilin atau sefalosporin, secara aseptic tambahkan sejumlah penisilinase steril ke
dalam cairan A yang digunakan membilas membrane untuk menginaktifkan residu antibiotika
pada membrane setelah larutan specimen uji disaring.

Cairan D
Jika specimen uji mengandung lesitin atau minyak, atau untuk uji alat kesehatan steril dengan
lumen kecil menngunakan penyaring membrane, gunakan Cairan A yang ditambah 1 ml
polisorbat 80 per liter, atur pH hingga 7,1 0,2, bagikan dalam labu dan sterilisasi dengan uap
air.

Cairan K
Digesti peptic jaringan hewan P

50 g

Ekstrak daging P

3,0 g

Polisorbat 80 P

10,0 g

Air

1000 ml

pH setelah sterilisasi 6,9 0,2

Sterilisasi dengan uap air.
Catatan :
Cairan steril tidak boleh bersifat antibakteri atau antijamur jika digunakan sebagai pelarut,
pengencer, ataupun pembilas pada uji sterilitas.

UJI FERTILITAS
Tetapkan sterilitas tiap lot media dengan menginkubasikan sejumlah wadah yang
mewakili, pada satu dan selama waktu yang tertera pada uji. Lakukan uji fertilitas terhadap tiap
lot media dari tiap otoklaf dengan menginokulasikan duplo wadah tiap media secara terpisah
dengan 10 mikroba hingga 100 mikroba viabel dari tiap galur yang tertera dalam tabel berikut,
dan diinkubasi pada kondisi yang sesuai.
Media uji memenuhi syarat jika terjadi pertumbuhan yang nyata dalam semua wadah
media yang diinokulasi dalam kurun waktu 7 hari. Penetapan dapat dilakukan simultan dengan
media uji untuk pengujian sterilitas. Uji sterilitas dinyatakan tidak abash, jika media uji
menunjukkan respon pertumbuhan yang tidak memadai.
Jika media segar tidak digunakan dalam waktu 2 hari, simpan dalam tempat yang gelap,
lebih baik pada suhu 20 hingga 25 0C. Jika media siap pakai simpan dalam wadah yang tidak
tertutup kedap, dapat digunakan jika selama tidak kurang dari 1 bulan, dengan ketentuan media
diuji dalam kurun waktu 7 hari sebelum penggunaan dan indikator warna memenuhi syarat. Jika
disimpan dalam wadah tertutup, media dapat digunakan selama tidak lebih dari 1 tahun, dengan
ketentuan fertilitas media diuji setiap 3 bulan dan indikator warna memenuhi syarat.
BAKTERIOSTATIK DAN FUNGISTATIK
Sebelum melakukan uji sterilitas cara inokulasi langsung terhadap suatu bahan, tetapkan
tingkat aktivitas bakteriostatik dan fungistatik dengan prosedur, buat pengenceran biakan bakteri
dan jamur tidak kurang dari galur mikroba seperti yang tertera pada uji fertilitas. Inokulasi
media uji fertilitas dengan 10 mikroba hingga 100 mikroba viabel, gunakan volume media yang
tertera pada tabel jumlah dan untuk bahan cair pada pemilihan spesimen uji dan masa inkubasi.
Tambahkan sejumlah tertentu bahan ke dalam setengah dari jumlah wadah yang mengandung
inokulum dan media. Inkubasi wadah pada suhu dan kondisi seperti yang tertera dalam tabel
selama tidak kurang dari 7 hari.
Jika pertumbuhan mikroba uji dalam campuran media bahan secara visual sebanding
dengan pertumbuhan dalam tabung kontrol, gunakan jumlah media seperti yang tertera pada
tabel jumlah untuk bahan cair dalam pemilihan spesimen uji dan masa inkubasi. Jika bahan yang
diuji dengan cara seperti di atas adalah bakteriostatik dan atau fungistatik, gunakan sejumlah zat
penetral steril yang sesuai, jika tersedia. Kesesuaian zat penetral ditetapkan seperti yang tertera
pada uji di bawah ini. Jika zat penetral tidak tersedia, tetapkan jumlah bahan dan media yang
sesuai seperti yang tertera di bawah ini.

Ulangi pengerjaan di atas, gunakan sejumlah tertentu bahan dan volume media yang lebih
besar untuk menetapkan perbandingan bahan dan media yang tidak merugikan pertumbuhan
mikroba uji. Jika sejumlah tertentu bahan dalam 250 ml media masih mempunyai daya
bakteriostatik dan fungistatik, kurangi jumlah bahan hingga diperoleh jumlah maksimum yang
tidak menghambat mikroba uji dalam 250 ml media. Untuk cairan dan suspensi yang jumlahnya
kurang dari 1 ml, perbesar jumlah media hingga cukup untuk mengencerkan dan mencegah
hambatan pertumbuhan. Untuk bahan padat yag tidak segera larut atau dapat terdispersi, jika
jumlahnya kurang dari 50 mg, perbesar jumlah media hingga cukup untuk mengencerkan untuk
mencegah hambatan pertumbuhan. Dalam tiap kasus, gunakan perbandingan jumlah bahan dan
media yang telah diketahui untuk uji sterilitas.
Jika digunakan penyaringan membran, buat perbandingan yang sama menggunakan
sejumlah tertentu bahan uji dan cairan pengencer dan pembilas yang sesuai, bilas membran 3
kali, tiap kali dengan 100 ml cairan pengencer dan pembilas. Inokulasikan sejumlah tertentu
mikroba viabel pada cairan pengencer dan pembilas yang tertera yang digunakan untuk
menyaring bahan uji dan pada cairan pengencer dan pembilas saja. Pertumbuhan mikroba uji dari
membran digunakan untuk menyaring bahan diikuti cairan pengencer dan pembilas yang telah
diinokulasi secara visual sebanding dengan pertumbuhan dari membran yang hanya digunakan
untuk menyaring cairan pengencer dan pembilas yang telah diinokulasi.
PROSEDUR UMUM
Prosedur pengujian terdiri dari:
1. inokulasi langsung ke dalam media uji dan
2. teknik penyaringan membran.
Prosedur ini terutama berguna untuk cairan dan serbuk yang dapat larut yang bersifat
bakteriostatik atau fungistatik, untuk memisahkan mikroba kontaminan dari penghambat
pertumbuhan. Prosedur harus divalidasi untuk penggunaan tersebut. Dengan alasan yang sama,
cara ini sangat berguna untuk bahan seperti minyak, salep, atau krem yang dapat melarut ke
dalam cairan pengencer bukan bakteriostatik atau bukan fungistatik. Penggunaannya juga untuk
uji sterilitas permukaan atau lumen kritis alat-alat kesehatan. Karena sifat bahan yang akan diuji
bervariasi dan faktor lain yang mempengaruhi pada waktu melakukan uji sterilitas, maka perlu
diperhatikan ketentuan berikut dalam melakukan uji sterilitas.
Cara membuka Wadah
Bersihkan permukaan wadah luar ampul dan tutup vial dan tutup botol menggunakan
bahan dekontaminasi yang sesuai, dan ambil isi secara aseptik. Jika isi vial dikemas dalam
hampa udara, masukkan udara steril dengan alat steril yang sesuai, seperti alat suntik dengan

jarum dilengkapi bahan penyaring untuk sterilisasi. Untuk kapas murni, perban, pembalut,
benang bedah dan bahan Farmakope sejenis, buka kemasan atau wadah secara aseptik.
Pemilihan Spesimen Uji dan Masa Inkubasi
Untuk bahan cair, gunakan volume bahan dan media untuk setiap unit dan jumlah wadah
per media tidak kurang dari sepertiga pada tabel jumlah untuk bahan cair dalam bab ini. Jika
kuantitas isi cukup, bahan dapat dibagi dan ditambahkan pada kurva media. Jika volume setiap
wadah tidak cukup untuk kedua media, gunakan wadah dengan sejumlah dua kali. Untuk bahan
selain cairan, uji 20 unit bahan dengan masing-masing media. Untuk bahan yang hanya
lumennya harus steril, bilas lumen dengan sejumlah media yang sesuai hingga diperoleh kembali
tidak kurang dari 15 ml.

PROSEDUR UJI INOKULASI KE DALAM MEDIA UJI

1. CAIRAN
Pindahkan cairan dari wadah uji menggunakan pipet atau jarum suntik steril. Secara aseptik
diinokulasikan sejumlah tertentu bahan dari tiap wadah uji ke dalam tabung media. Campur
media dengan cairan tanpa aerasi berlebihan. Inkubasi dalam media tertentu seperti yang tertera
pada Prosedur Umum, selama tidak kurang dari 14 hari. Amati pertumbuhan pada media secara
visual sesering mungkin sekurangnya pada hari ke-3 atau ke-4 atau ke-5, pada hari ke-7 atau ke8 dan pada hari terakhir dari masa uji.
Jika zat uji menyebabkan media menjadi keruh sehingga ada atau tidaknya pertumbuhan
mikroba tidak segera dapat ditentukan secara visual, pindahkan sejumlah memadai media ke
dalam tabung baru berisi media yang sama, sekurangnya 1 kali antara hari ke-3 atau ke-7 sejak
pengujian dimulai. Lanjutkan inkubasi media awal dan media baru selama total waktu tidak
kurang dari 14 hari sejak inokulasi awal.
2. SALEP DAN MINYAK YANG TIDAK DAPAT LARUT DALAM ISOPROPIL MIRISTAT
Pilih 20 wadah yang mewakili, dibagi atas 2 kelompok terdiri dari 10 wadah dan
diperlakukan tiap kelompok sebagai berikut: Secara aseptik pindahkan 100 mg dari tiap wadah
dari 10 wadah ke dalam labu berisi 100 ml pembawa air steril yang dapat mendispersi homogen
bahan uji dalam seluruh campuran cairan. [catatan pemilihan bahan pendispersi yang bercampur
dengan pembawa air, dapat berbeda sesuai dengan sifat salep atau minyak. Sebelum digunakan
secara rutin, uji bahan pendispersi untuk memastikan bahwa kadar yang digunakan tidak
mempunyai efek antimikroba yang bermakna selama selang waktu inkubasi menggunakan
prosedur uji seperti yang tertera pada bakteriostatik dan fungistatik]. Campur 10 ml alikot dari

campuran cairan yang diperoleh dengan 80 ml tiap media dan lakukan penetapan seperti yang
tertera pada cairan, mulai dari inkubasi dalam media tertentu seperti..
3. ZAT PADAT
Ambil sejumlah tertentu produk dalam bentuk padat kering (atau yang terlebih dahulu dibuat
larutan atau suspensi dalam cairan pengencer steril) sesuai dengan tidak kurang dari 300 mg tiap
wadah atau seluruh isi wadah jika tiap isi kurang dari 300 mg. Inokulasikan ke dalam masingmasing tidak kurang dari 40 ml media Tioglikolat cair dan Soybean-Casein Digest Medium.
Jumlah wadah dan kondisi inkubasi sama seperti yang tertera pada Cairan, mulai dari Amati
pertumbuhan pada media...
4. KAPAS MURNI,
SEJENISNYA

PERBAN,

PEMBALUT,

BENANG

BEDAH DAN

BAHAN

Dari setiap kemasan kapas, perban gulung atau pembalut perban yang diuji diambil secara
aseptik dua bagian atau lebih masing-masing 100 sampai 500 mg dari bagian paling dalam. Dari
individu contoh kemasan tunggal seperti bantalan perban, ambil secara aseptik sejumlah 250 mg
sampai 500 mg atau keseluruhan contoh bila ukurannya kecil, seperti pembalut serap berperekat
25 mm x 75 mm atau lebih kecil atau benang bedah. Secara aseptik pindahkan bagian bahan uji
ini ke dalam sejumlah tertentu wadah media yang sesuai dan inkubasi seperti yang tertera pada
prosedur umum. Lakukan seperti yang tertera pada cairan.
5. ALAT KESEHATAN STERIL
Ketentuan umum digunakan untuk alat kesehatan steril yang diproduksi dalam lot, masingmasing terdiri dari sejumlah unit. Ketentuan khusus digunakan untuk alat kesehatan steril yang
diproduksi dalam jumlah kecil atau dalam unit individu yang akan mengalami kerusakan bila
dilakukan uji sterilitas biasa. Untuk alat seperti itu, harus dilakukan modifikasi yang sesuai dan
dapat diterima pada uji sterilitas.
Untuk alat yang bentuk fdan ukurannya memungkinkan dicelupkan keseluruhan ke dalam
tidak lebih dari 1000 ml media, uji alat utuh menggunakan media yang sesuai, inkubasi seperti
yang tertera pada prosedur umum. Untuk alat yang mempunyai pipa atau saluran seperti alat
transfusi atau infus atau yang ukurannya menyebabkan pencelupan tidak dapat dilakukan dan
hanya saluran cairannya yang harus steril, bilas lumen masing-masing dari 20 unit dengan
sejumlah secukupnya media Tioglikolat Cair dan Soybean-Casein Digest Medium hingga
diperoleh kembali tidak kurang dari 15 ml tiap media, dan inkubasi dengan tidak lebih dari 100
ml masing-masing media seperti yang tertera pada prosedur umum. Untuk alat dan lumen yang
sangat kecil sehingga media Tioglikolat Cair tidak mengalir, gunakan media Tioglikolat
alternatif, tetapi inkubasi dilakukan secara anaerob.

Jika karena ukuran dan bentuk alat tidak dapat diuji dengan cara pencelupan, keseluruhannya
ke dalam tidak lebih dari 1000 ml media, uji bagian alat yang paling sulit disterilisasi, jika
mungkin lepaskan 2 atau lebih bagian yang paling dalam dari alat. Secara aseptik pindahkan
bagian tersebut ke dalam sejumlah tertentu tabung berisi tidak kurang dari 1000 ml media yang
sesuai. Inkubasi seperti yang tertera pada prosedur umum.
Jika spesimen uji dalam media mempengaruhi uji karena bakteriostatik atau fungistatik, bilas
seksama alat dengan cairan pembilas sesedikit mungkin seperti yang tertera pada cairan
pengencer dan pembilas. Peroleh kembali cairan bilasan dan uji seperti yang tertera pada Alat
kesehatan dalam prosedur uji menggunakan penyaringan membran.
6. ALAT SUNTIK KOSONG ATAU TERISI STERIL
Uji sterilitas alat suntik terisi steril dilakukan sama seperti uji pada produk steril dalam ampul
dan vial. Cara inokulasi langsung dapat digunakan jika penetapan bakteriostatik dan fungistatik
telah menunjukkan aktivitas yang tidak merugikan dalam kondisi pengujian untuk alat suntim
terisi yang dilengkapi jarum steril, keluarkan isi produk melalui lumen. Untuk alat suntik yang
dikemas dalam jarum terpisah, secara aseptik pasang jarum dan pindahkan produk ke dalam
media yang sesuai. Beri perhatian khusus yang menunjukkan bahwa bagian jarum yang
disertakan (bagian yang akan masuk ke jaringan tubuh) adalah steril. Untuk alat suntik kosong
steril, masukkan media atau pengencer steril ke dalam alat suntik melalui jarum yang disertakan,
atau jika tidak disertakan melalui jarum steril yang dipasang untuk tujuan pengujian dan
pindahkan isi dengan cepat ke dalam media yang sesuai.
PROSEDUR UJI MENGGUNAKAN PENYARINGAN MEMBRAN
Jika teknik penyaringan membran digunakan untuk bahan cair yang dapat diuji dengan
cara inokulasi langsung ke dalam media uji, uji tidak kurang dari volume dari jumlah seperti
yang tertera pada pemilihan spesimen uji dan masa inkubasi. Peralatan: unit penyaring membran
yang sesuai terdiri dari satu perangkat yang dapat memudahkan penanganan bahan uji secara
aseptik dan membran yang telah diproses dapat dipindahkan secara aseptik untuk inokulasi ke
dalam media steril ke dalam penyaringnya dan membran diinkubasi in situ. Membran yang
sesuai umumnya mempunyai porositas 0,45 m, dengan diameter lebih kurang 47 mm, dan
kecepatan penyaringan air 55 ml sampai 75 ml permenit pada tekanan 70 cm Hg. Unit
keseluruhan dapat dirakit dan disterilkan bersama dengan membran sebelum digunakan atau
membran dapat disterilkan terpisah dengan cara apa saja yang dapat mempertahankan
karakteristik penyaring dan menjamin sterilitas penyaring dan perangkatnya.
1. CAIRAN YANG DAPAT BERCAMPUR DENGAN AIR
Secara aseptik pindahkan sejumlah volume tertentu yang dibuuhkan untuk kedua media
seperti yang tertera pada tabel Jumlah untuk bahan cair dalam pemilihan spesimen uji dan masa
inkubasi, langsung ke dalam satu atau dua corong penyaring membran terpisah atau ke dalam

tabung penampung steril terpisah sebelum dipindahkan. Jika volume cairan dalam wadah kurang
dari 50 ml atau 50 ml sampai kurang 100 ml dan tidak kurang dari 20 wadah diwakili satu
membran, atau setengan bagian membran dipindahkan ke dalam tiap media. Jika volume cairan
50 ml sampai kurang dari 100 ml perwadah dan dimaksudkan untuk pemberian intravena, atau
100 ml sampai 500 ml, secara aseptik pindahkan seluruh isi tidak kurang dari 10 wadah melalui
tiap penyaring dari dua rakitan penyaring atau tidak kurang dari 20 wadah jika hanya digunakan
satu rakitan penyaring. Jika volume cairan lebih dari 500 ml, secara aseptik pindahkan tidak
kurang dari 500 ml dan tiap isi wadah tidak kurang dari 10 wadah melalui tiap penyaring dari
dua rakitan penyaring atau isi tidak kurang dari 20 wadah jika hanya satu rakitan penyaring.
Lewatkan segera tiap spesimen melalui penyaring dengan bantuan pompa vakum atau tekanan.
Jika cairan sangat kental dan tidak mudah disaring melalui 1 membran atau 2 membran
maka diperlukan lebih dari dua rakitan penyaring. Dalam hal ini, setengah jumlah membran yang
digunakan diinkubasi dalam masing-masing media, asalkan volume dan jumlah wadah per media
yang disyaratkan dipenuhi. Jika produk bersifat bakteriostatik atau fungistatik, bilas membran 3
kali, tiap kali dengan 100 ml cairan A.
Secara aseptik pindahkan membran dari alat pemegang, potong membran menjadi
setengah bagian (jika hanya digunakan satu), celupkan membran atau setengah bagian membran
ke dalam medium SCDM dan inkubasi pada suhu 20 0hingga 25 0C selama tidak kurang darti 7
hari. Dengan cara yang sama, celupkan membran atau setengah bagian membran lainnnya ke
dalam 100 ml media FTM dan inkubasi pada 30 0C hingga 35 0C selama tidak kurang dari 7 hari.

2. CAIRAN YANG TIDAK BERCAMPUR DENGAN PEMBAWA AIR (KURANG DARI 100
mL PERWADAH)
Menggunakan isi tidak kurang dari 20 wadah (40 wadah jika masing-masing mengandung
volume tidak mencukupi untuk kedua media), pindahkan volume yang diinginkan untuk kedua
media, seperti yang tertera pada tabel Jumlah untuk Bahan Cair dalam Pemilihan Spesimen Uji
dan Masa Inkubasi, langsung dalam satu atau dua corong penyaring membran terpisah atau ke
dalam tabung penampung steril terpisah sebelum dipindahkan. Diperlukan volume tidak kurang
dari 20 wadah untuk satu membran atau setengah bagian membran yang dipindahkan ke dalam
tiap media. Lewatkan segera tiap spesimen melalui penyaring dengan bantuan pompa vakum
atau tekanan.
Jika bahan uji berupa cairan kental atau suspensi dan tidak sesuai untuk penyaringan
cepat, secara aseptik tambahkan cairan pengencer secukupnya ke dalam kumpulan spesimen
yang akan disaring untuk menambah kecepatan aliran. Jika produk yang bersifat bakteriostatik
atau fungistatik atau yang mengandung pengawet, bilas membran satu sampai tiga kali, tiap kali
dengan 100 ml cairan A. Jika bahan uji mengandung lesitin atau minyak, gunakan cairan D
sebagai pengganti cairan A.

Setelah penyaringan dan pencucian, perlakukan membran seperti yang tertera pada cairan
yang dapat bercampur dengan pembawa air, mulai dari pindahkan membran secara aseptik dari
alat pemegang..
3. ZAT PADAT YANG DAPAT DISARING
Amati lebih kurang 6 g produk dalam bentuk padat kering (atau sejumlah larutan atau
suspensi produk, yang dibuat dengan menambahkan pengencer steril ke dalam wadah, sebanding
dengan 6 g bahan padat), atau tidak kurang dari 300 mg tiap wadah yang diuji, atau seluruh isi
wadah jika isi tiap wadah kurang dari 300 mg bahan padat kecuali dinyatakan lain pada
monografi jumlah wadah sama seperti yang tertera pada cairan yang dapat bercampur dengan
pembawa air. Secara aseptik masukkan spesimen ke dalam tabung berisi 200 ml cairan A dan
aduk hingga larut. Jika spesimen tidak larut sempurna, gunakan 400 ml cairan A, atau secara
aseptik bagi spesimen dalam 2 bagian dari uji tiap bagian dengan 200 ml cairan A. Pindahkan
larutan ke dalam satu atau dua corong penyaring membran, dan segera saring dengan bantuan
pompa vakum atau tekanan. Jika contoh uji bersifat bakteriostatik atau fungistatik, bilas
membran 3 kali, tiap kali dengan 100 ml cairan A. setelah selesai penyaringan dan pembilasan,
perlakukan membran seperti yang tertera pada cairan yang dapat bercampur dengan pembawa
air, mulai dari secara aseptik pindahkan membran dari alat pemegang...
4. SALEP DAN MINYAK YANG LARUT DALAM ISOPROPIL MIRISTAT
Larutkan tidak kurang dari 100 mg dari tiap isi wadah, tidak kurang dari 20 wadah (40 wadah
jika masing-masing mengandung volume tidak mencukupi untuk kedua media) dalam tidak
kurang dari 100 ml isopropil miristat dengan pH ekstrak air tidak kurang dari 6,5 seperti yang
tertera pada spesifikasi pereaksi dalam pereaksi, indikator dan larutan yang lebih dulu telah
disterilkan dengan penyaringan melalui penyaring membran 0,22 m. Goyang labu untuk
mendapatkan permukaan bahan yang lebar terhadap pelarut. Saring segera salep yang telah
dilarutkan. Secara aseptik pindahkan campuran ke dalam 1 corong atau 2 corong penyaring
dengan bantuan pompa vakum atau tekanan. Jaga seluruh penyaring membran ditutupi cairan
untuk mendapatkan efesiensi maksimum penyaring.
5. ZAT PADAT YANG TIDAK DAPAT DISARING
Uji sterilitas untuk bahan ini dengan cara penyaringan membran tidak dianjurkan, kecuali jika
dapat ditunjukkan bahwa tidak terjadi penyumbatan pada filter.lakukan seperti yang tertera pada
zat padat pada prosedur uji inokulasi langsung ke dalam media uji.
6. ALAT KESEHATAN
Alat yang mempunyai saluran kecil steril dapat diuji sterilitas dengan teknik penyaringan
membran sebagai berikut :

Secara aseptik alirkan sejumlah volume tertentu cairan D melalui tiap lumen tidak kurang dari 20
alat hingga diperoleh tidak kurang dari 100 ml dari tiap alat. Kumpulkan cairan dalam wadah
aseptik dan saring seluruh volume melalui penyaring membran seperti yang tertera pada Cairan
yang dapat bercampur dengan Pembawa air, mulai dari Secara aseptik pindahkan membran dari
alat pemegang..
Jika volume alat besar, dan ukuran lot kecil, lakukan uji sejumlah unit yang sesuai seperti yang
tertera pada kasus serupa dalam alat kesehatan, pada prosedur uji inokulasi langsung ke dalam
media uji.
PENAFSIRAN HASIL UJI STERILITAS
1. Tahap Pertama
Pada interval waktu tertentu dan pada akhir periode inkubasi, amati isi semua wadah akan
adanya pertumbuhan mikroorganisme seperti kekeruhan dan atau pertumbuhan pada permukaan.
Jika tidak terjadi pertumbuhan, maka bahan uji memenuhi syarat.
Jika ditemukan pertumbuhan mikroba, tetapi peninjauan dalam pemantauan fasilitas pengujian
sterilitas, bahan yang digunakan, prosedur pengujian dan kontrol negatif menunjukkan tidak
memadai atau teknik aseptik yang salah digunakan dalam pengujian, tahap pertama dinyatakan
tidak abash dan dapat diulang.
Jika pertumbuhan mikroba teramati tetapi tidak terbukti uji tahap pertama tidak abash, lakukan
tahap kedua.
2. Tahap Kedua
Jumlah spesimen uji yang diseleksi minimum dua kali jumlah tahap pertama. Volume minimum
tiap spesimen yang diuji dan media dan periode inkubasi sama dengan tertera pada tahap
pertama. Jika tidak ditemukan pertumbuhan mikroba, bahan yang diuji memenuhi syarat. Jika
ditemukan pertumbuhan, hasil yang diperoleh membuktikan bahwa bahan uji tidak memenuhi
syarat. Jika dapat dibuktikan bahwa uji pada tahap kedua tidak absah karena kesalahan atau
teknik aseptik tidak memadai, maka tahap kedua diulang.