VIII.

UJI MIKROBIOLOGI UNTUK BAHAN

DAN PRODUK AGROINDUSTRI

Pendahuluan
Salah satu pengujian mutu pada bahan dan produk agroindustri adalah pengujian
mutu mikrobiologi. Dari sisi bahan, hal ini penting dilakukan untuk memastikan bahwa
bahan sebelum diproses lebih lanjut menjadi produk akhir masih baik mutunya dari
aspek mikrobiologi. Karakter bahan pertanian yang mudah rusak (perishable) karena
kandungan airnya yang pada umumnya sangat tinggi serta kandungan komponen
intrinsiknya seperti karbohidrat, protein ataupun lemak yang cukup tinggi menyebabkan
mudah ditumbuhi oleh mikroba. Akibatnya mutu dari bahan pertanian tersebut sangat
menurun atau bahkan rusak sehingga tidak dapat diproses lebih lanjut atau dapat
membahayakan kesehatan manusia. Dari sisi produk juga sama. Analisis mikrobiologis
produk agroindustri penting dilakukan untuk memastikan bahwa produk tidak
terkontaminasi oleh mikroorganisme sehingga akan dapat disimpan dalam jangka waktu
lama (tergantung sifat produk dan kondisi penyimpanan yang dianjurkan) dan tidak
membahayakan kesehatan manusia yang mengkonsumsi produk tersebut.

Tujuan
- Mahasiswa mampu memahami cara uji serta prinsip uji dan mampu melakukan uji
sterilitas pada berbagai bahan pertanian
- Mahasiswa mampu memahami cara uji serta prinsip uji dan mampu melakukan uji
mikrobiologi pada berbagai produk agroindustri

Bahan dan Alat

Berbagai jenis buah, telur, susu mentah dan berbagai produk susu, PCA, APDA,
alkohol 95 %, GYWB, larutan garam fisiologis, biru metilen, mikroskop, gelas obyek,
gelas penutup, hemasitometer, inkubator, pembakar bunsen, pipet, pisau, tabung reaksi,
tabung ulir, jarum ose, pipet breed, cawan petri, penagas air, mikrometer, metil tiosianat

Prosedur
1. Uji Sterilitas Buah Padat
a. Basahi sebagian permukaan buah padat dengan alkohol 95 %.
b. Bakarlah alkohol tersebut dan pijarkan kulit buah bagian tersebut.
c. Secara aseptis kupaslah bagian yang telah dipijarkan tersebut dengan pisau steril
dan potonglah bagian dalam buah menjadi bentuk kubus kecil.
d. Masukkan potongan-potongan tersebut (4 buah) ke dalam sebuah cawan petri
dan tambahkan 15 ml PCA, goyang-goyangkan sebentar dan biarkan memadat.
e. Inkubasi pada suhu kamar selama 2-5 hari.
f. Amati ada tidaknya pertumbuhan koloni mikroba. Untuk kontrol buat PCA
tanpa potongan buah.

63
2. Uji Sterilitas Buah Berair
a. basahi permukaan buah dengan alkohol 95 % dan bakarlah.
b. lubangi bagian kulit yang telah dipijarkan dengan pinset steril atau pisau steril.
c. pipet cairan sebanyak 5 ml dan masukkan ke dalam 5 tabung berisi glucose
Yeast Water Broth masing-masing 5 ml.
d. inkubasikan pada suhu kamar selama 2 – 5 hari.
e. Amati ada tidaknya pertumbuhan yang ditandai dengan terjadinya kekeruhan
dalam media. Untuk kontrol, buat GYWB tanpa inokulasi cairan buah.

Tabel pengamatan
Sampel Pertumbuhan mikroba
Buah padat

Blanko PCA

Buah berair

Blanko GYWB

3. Menghitung Jumlah Mikroba Telur

a. Sikatlah telur utuh dengan sabun dan bilaslah dengan air bersih lalu tiriskan
b. Celupkan ke dalam alkohol 95 % selama 10 menit lalu tiriskan
c. Letakkan di atas pinggan alumunium dan pijarkan hingga alkohol habis terbakar
d. Lubangi ujung telur yang runcing, lakukan dalam nyala api sebentar dan tuang
isinya ke wadah steril. Dapat pula dilakukan pengadukan dalam telur hingga isi
tidak perlu dituang.
e. Pipet cairan telur 11 ml atau timbang secara aseptis sebanyak 11 g
f. Masukkan ke botol pengencer yang berisi larutan garam fisilogis dan butiran
gelas kocok secara keras-keras
g. Buat pengenceran hingga 10 -4
h. Inokulasikan PCA dalam cawan petri steril
i. Inkubasikan pada suhu 37oC selama 2-3 hari atau pada suhu kamar 4-5 hari
j. Amati dan hitung jumlah koloni yang terbentuk
k. Bedakan dan analisa jenis mikrobanya (kapang dan bakteri) yang tumbuh

64
Tabel pengamatan
Sampel Telur Pengenceran Pertumbuhan mikroba
Jumlah Kapang Jumlah Bakteri

Blanko PCA

4. Susu dan Produk Susu

Susu merupakan bahan pangan yang mempunyai komposisi sangat baik
sehingga mudah ditumbuhi oleh mikroorganisme. Susu yang berasal dari sapi yang
tidak sehat sering terkontaminasi oleh bakteri patogen. Proses pemanasan dilakukan
dengan tujuan utama membunuh bakteri patogen di dalam susu yang disebut proses
pasteurisasi. Dengan pasteurisasi, bakteri koliform yang sering mengkontaminasi
susu mentah akan mati. Oleh karena itu, adanya koliform pada susu yang telah
dipasteurisasi menunjukkan telah terjadinya kontaminasi kembali setelah proses
pasteurisasi.

Bahan dan Alat

Kelompok Contoh Uji Medium
Susu mentah DMC dan BM PCA
I
Es krim
Susu mentah DMC dan BM APDA
II Mentega Jumlah Kapang dan
khamir
Susu mentah DMC dan BM PCA
III Susu pasteurisasi Jumlah bakteri
termodurik
Susu mentah DMC dan BM PCA
IV
Susu bubuk Jumlah mikroba
Bahan per kelompok :
- 100 ml PCA atau APDA (pH + 3.5)
- 1 sampai 2 tabung larutan pengencer @9 ml
- 1 botol larutan pengencer 90 ml (kecuali untuk susu pasteurisasi)
- Larutan Biru Metilen (Levowitz-Weber)
- Larutan Biru metilen tiosianat

65
Alat per kelompok :
- Gelas obyek
- Kartu penolong DMC
- Pipet Breed
- Jarum Ose
- Mikrometer
- Mikroskop
- 2 – 3 tabung reaksi steril bertutup ulir
- 1 tabung reaksi steril besar (untuk es krim dan mentega)
- 4 – 6 cawan petri steril
- Inkubator 30-32oC dan suhu kamar
- Penangas air 36oC dan 45oC

Prosedur

a. Susu Mentah
1) Hitungan Mikroskopik Langsung (DMC)
Pengukuran Areal Pandang Mikroskop
- Tepatkan skala mikrometer pada mikroskop menggunakan lensa
berkekuatan rendah
- Teteskan minyak imersi pada mikrometer dan fokuskan dengan lensa
minyak imersi
- Gerakkan mikrometer sehingga salah satu garis/skala berimpit dengan batas
pinggir areal pandang dan hitung jumlah skala (0.01 mm) pada diameter
areal pandang. Jumlah skala pada diameter areal pandang biasanya berkisar
antara 14-16 , yang berarti diameter areal pandang mikroskop sampai tiga
angka di belakang koma dan tentukan luas areal pandang.
Pembuatan Preparat Kering
- Gunakan pipet Breed berukuran 0.01 ml dan kartu penolong yang
mempunyai gambar kotak-kotak berukuran 1 cm2.
- Bilas pipet Breed dengan air hangat beberapa kali untuk membersihkan
bagian-bagian yang menyumbat
- Pipet contoh susu sampai di atas batas 0. 01 ml. Seka ujung pipet dengan
kain atau kertas saring dan keluarkan kelebihan contoh sampai batas 0.01 ml
- Setiap kelompok membuat 1-2 preparat. Letakkan gelas obyek di atas kartu
penolong dan keluarkan contoh susu dari pipet Breed pada gelas obyek.
- Sebarkan dengan menggunakan loop yang bersih contoh tersebut seluas 1
cm2. Satu gelas obyek dapat digunakan untuk membuat 2 – 3 sebaran susu
@0.01 ml. Keringkan udara atau di tempat yang hangat dengan permukaan
datar selama 5 menit

66
 Pewarnaan
- Teteskan pewarna biru metilen di atas preparat dan biarkan selama 2 menit
- Buanglah kelebihan zat warna dengan menyerapnya menggunakan kertas
serap. Biarkan sampai kering dan bilaslah dengan air kemudian keringkan
di udara
Pengamatan
- Amati preparat di bawah mikroskop menggunakan minyak imersi dan
hitung rata-rata jumlah bakteri per areal pandang. Jumlah areal pandang
yang diamati tergantung dari rata-rata jumlah organisme per areal pandang.
- Hitung sel-sel bakteri yang berkelompok atau membentuk rantai sebagai
satu sel karena setiap kelompok akan membentuk satu koloni jika
dipupukkan pada medium agar cawan
- Hitung jumlah organisme per ml contoh

Tabel pengamatan
Sample Jumlah sel per kotak besar Jumlah sel /ml contoh

2) Uji Biru Metilen

- Tambahkan 1 ml larutan biru metilen tiosianat ke dalam tabung reaksi steril
yang bertutup ulir .
- Dengan menggunakan pipet 10 ml steril, pipet 10 ml contoh susu yang telah
dikocok dan dihangatkan sampai 36oC. Balikkan tabung reaksi perlahan-
lahan sebanyak 3 kali untuk mencampurkan biru metilen dengan susu.
Jangan sekali-sekali dikocok
- Tempatkan dalam penagas air dengan segera suhu 36 oC dan catat waktu
dimulainya percobaan.
- Setelah 5 menit, balikkan tabung reaksi sekali lagi untuk mencampurkan zat
warna. Setelah itu tabung tidak boleh dibolak-balikkan atau diaduk
- Amati perubahan warna setiap 30 menit dan catat MBRT (methylene blue
reduction time) yaitu waktu dimana 4/5 bagian contoh susu di dalam tabung
telah berubah warnanya menjadi putih
- Tentukan mutu susu masuk dalam klasifikasi berikut :
Kelas 1 : sangat baik, tidak berubah meskipun lebih dari 8 jam
Kelas 2 : baik, berubah warna 6 – 8 jam
Kelas 3 : sedang, berubah warna 2-6 jam
Kelas 4 : buruk , berubah warna kurang dari 2 jam
- Perkirakan jumlah koloni berdasar Tabel sbb:

67
 MBRT (jam) Perkiraan jumlah koloni (x 104)
0.5 – 3.5 80 atau lebih
4 40
4.5 25
5 15
5.5 10
6 6
6.5-8 2.5
8 1

Tabel pengamatan
Waktu Warna sampel
(jam) Sampel .......................... Sampel .................................
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
7.5
8
8.5

Kesimpulan
Sampel Kelas Mutu Susu Perkiraan Jumlah Mikroba

b. Es Krim
- Dengan menggunakan spatula, pindahkan kira-kira 15-20 g es krim ke dalam
tabung reaksi berukuran besar dan steril
- Rendam tabung tersebut ke dalam penangas air suhu 45 oC sampai es krim
meleleh seluruhnya. Waktu pelelehan tidak boleh lebih dari 15 menit

68
 - Aduk es krim dengan pipet 10 ml steril dan pindahkan sebanyak 10 ml ke
dalam larutan pengencer 90 ml. Setelah dikocok, lakukan pengenceran
selanjutnya hingga 10-2.
- Buatlah pemupukan duplo sebanyak 10 -1, 10-2 dan 10-3 ml contoh
menggunakan PCA.
- Inkubasi selama 2-3 hari pada suhu 30-32oC.
- Hitung jumlah koloni yang tumbuh dan berapa jumlah mikroba/ml es krim.

Tabel Pengamatan
Pengenceran Jumlah koloni Jumlah mikroba /ml es krim
10-1 ulangan 1
10-1 ulangan 2
Rata-rata
10-2 ulangan 1
10-2 ulangan 2
Rata-rata
10-3 ulangan 1
10-3 ulangan 2
Rata-rata

c. Mentega
- Tujuannya untuk menentukan jumlah kapang dan khamir.
- Gunakan spatula untuk memindahkan 15-20 g mentega ke dalam tabung reaksi
besar steril.
- Rendam dalam penangas air 45oC selama 10 menit.
- Gunakan pipet hangat untuk memindahkan 10 ml mentega cair ke dalam
larutan pengencer 90 ml.
- Kocok dan buat pemupukan 10-1 dan 10-2 contoh menggunakan Acidified
Potato Dextrose Agar (pH + 3.5).
- Setelah inkubasi pada suhu kamar selama 3-5 hari, hitung jumlah koloni yang
tumbuh dan laporkan jumlah kapang dan khamir per ml mentega.
Tabel Pengamatan
Pengenceran Jumlah koloni Jumlah kapang dan khamir
/ml mentega
-1
10 ulangan 1
10-1 ulangan 2
Rata-rata
10-2 ulangan 1
10-2 ulangan 2
Rata-rata
10-3 ulangan 1
10-3 ulangan 2
Rata-rata

69
d. Susu Pasteurisasi
- Tujuannya adalah untuk melihat bakteri termodurik yang masih hidup setelah
proses pasteurisasi
- Pipet 5 ml susu ke dalam tabung reaksi bertutup ulir. Contoh susu jangan
sampai tercecer pada leher atau bagian atas tabung reaksi.
- Letakkan tabung berisi susu tersebut ke dalam penangas air pada suhu 63 oC
(tepatnya 62.8oC).
- Sebagai kontrol terhadap suhu, letakkan satu tabung berisi susu dan
termometer. Setelah suhu pada tabung kontrol mencapai 62.8 oC, hitung waktu
sampai 30 menit.
- Angkat tabung dan dinginkan segera dengan mencelupkan dalam air yang
diberi es.
- Buat pengenceran 10 -1 dan 10-2 dari contoh susu yang telah dipasteurisasi
tersebut dan lakukan pemupukan duplo yang berisi 10 -1, 10-2 dan 10-3 ml
contoh menggunakan PCA
- Inkubasi selama 2-3 hari pada suhu 30-32oC
- Hitung koloni yang tumbuh dan laporkan sebagai jumlah bakteri termodurik
per ml atau LPC (Laboratory Pasteurization Count) per ml

Tabel Pengamatan
Pengenceran Jumlah koloni Jumlah mikroba /ml susu
pasteurisasi
10-1 ulangan 1
10-1 ulangan 2
Rata-rata
10-2 ulangan 1
10-2 ulangan 2
Rata-rata
10-3 ulangan 1
10-3 ulangan 2
Rata-rata

e. Susu Bubuk
- Timbang sebanyak 10 g susu bubuk dan pindahkan ke dalam 90 ml larutan
pengencer yang telah dihangatkan 45oC
- Kocok perlahan-lahan diamkan 1-3 menit dan kocok kembali dengan baik
sampai susu bubuk larut. Hindari timbulnya busa yang berlebihan
- Buat pengenceran sampai 10 -3 dan lakukan pemupukan duplo terhadap 10-1,
10-2 dan 10-3 sebanyak 1 ml contoh menggunakan PCA.
- Inkubasi selama 2-3 hari pada suhu 30-32oC
- Hitung jumlah koloni yang tumbuh dan laporkan jumlah mikroba per g susu
bubuk

70
 Tabel Pengamatan
Jumlah mikroba
Pengenceran Jumlah koloni
per g susu bubuk
10-1 ulangan 1
10-1 ulangan 2
Rata-rata
10-2 ulangan 1
10-2 ulangan 2
Rata-rata
10-3 ulangan 1
10-3 ulangan 2
Rata-rata

f. Sayuran
Sayuran merupakan bahan pangan yang sering terkontaminasi oleh tanah
dan kotoran. Kontaminasi dapat terjadi selama pemanenan, pengangkutan,
maupun pemasaran.

Bahan dan alat

Sayuran segar (kubis, sawi putih, sawi hijau, bayam)
Sayuran rusak/busuk air (wortel, buncis, labu siam, timun)

Prosedur
1. Sayuran daun
- Potonglah secara aseptik sayuran daun seluas 2 cm x 2.5 cm menggunakan
pinset dan gunting/pisau yang terlebih dahulu dicelupkan ke dalam alkohol
90% dan dipijarkan.
- Celupkan potongan tersebut ke dalam erlenmeyer yang berisi 25 ml larutan
pengencer
- Setelah dikocok sebanyak 25 kali, lakukan penanaman suspensi tersebut
sebyak 1 ml atau 0.1 ml, masing-masing pada dua cawan petri.
- Tuangkan PCA cair pada masing-masing cawan, biarkan membeku dan
inkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 30 – 32ᵒC selama 2 – 3 hari.
- Hitung koloni yang tumbuh, dan hitung jumlah koloni mikroba per cm2
permukaan sayur sebagai berikut:

Jumlah koloni mikroba per cm2 permukaan

1 cm2 25 ml
= 2 ×2.5 cm2 × 1 ml atau 0.1 ml × jumlah koloni rata-rata dalam 1 ml atau 0.1 ml

2. Sayuran busuk
- Dengan menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan, ambillah bagian-
bagian dari sayuran yang mengalami busuk air, dan goreskan pada setengah
bagian dari 5 cawan yang masing-masing berisi media sebagai berikut:

71
 a. Skim Milk Agar (SMA) untuk pertumbuhan mikroba proteolitik
b. Starch Agar (SA) untuk ertumbuhan mikroba amilolitik
c. MacConkey/Violet Red Bile Agar (VRBA) untuk pertumbuhn bakteri
Gram negatif
d. Azide Dextrose Tryptone Bromcresol Purple Agar (DTBPA) untuk
pertumbuhan bakteri pembentuk asam
- Setengah bagian lagi dari masing-masing cawan tidak diinokulasikan
sebagai kontrol.
- Inokulasikan semua cawan pada suhu 30 – 32 ᵒC selama 2 – 3 hari. Koloni
mikroba pembentuk asam akan dikelilingi oleah area yang berwarna kuning.

Tabel Pengamatan
Media Kontrol Sayuran 1 Sayuran 2
Skim milk agar

Starch agar

VRBA

DTBPA

72