Stabilitas virus hepatitis E pada pemrosesan

tekanan hidrostatik tinggi

Gambar 1. Garis tren dan interval kepercayaan 95% terkait untuk data pengambilan sampel dada
ayam ritel NARMS. Garis horizontal ditambahkan untuk menguji tren yang signifikan
dan estimasi titik dan interval kepercayaan 95% dilapis untuk ketiga survei FSIS, meskipun
ukuran sampel yang besar untuk survei 2018 membuat interval
lebar sangat sempit.

Gambar 2. Distribusi lognormal yang menggambarkan konsentrasi log10 dari

Campylobacter untuk tiga survei FSIS. Garis vertikal mewakili batas
deteksi (1/33,3 mikroorganisme/mL untuk baseline pertama dan 1/30 untuk
survei kedua dan ketiga).

Gambar 3. Angka kasus Campylobacteriosis per 100.000 diperkirakan dari FoodNet

sistem pengawasan. Garis horizontal mewakili periode waktu
(2002-2008) di mana tingkat kasus tidak berubah secara signifikan. Garis tren
mewakili dimasukkannya tes diagnostik independen budaya (CIDT) meningkat lebih cepat
daripada pengurangan angka kasus yang ditunjukkan oleh budaya
konfirmasi. Penyesuaian untuk karakteristik kinerja CIDT
metode pengujian menunjukkan tingkat kasus yang kira-kira konstan dari 2012
hingga 2016. Tingkat kasus yang disesuaikan untuk 2017–2018 tidak tersedia pada saat itu
dari studi ini.
 Virus hepatitis E (HEV) adalah agen penyebab hepatitis akut dan kronis pada manusia.
Zoonosis HEV ge notipe 3 adalah genotipe utama di Eropa. Penularan melalui makanan melalui
konsumsi daging dan daging produk yang dibuat dari babi atau babi hutan yang terinfeksi
dianggap sebagai jalur transmisi utama genotipe ini. Pemrosesan tekanan hidrostatik tinggi
(HPP) adalah teknik, yang dapat digunakan untuk menonaktifkan patogen di makanan. Di sini,
preparat strain genotipe 3 HEV yang diadaptasi dari kultur sel dalam phosphate-buffered saline
(PBS) menjadi sasaran HPP dan infektivitas yang tersisa dititrasi dalam kultur sel dengan
menghitung fokus fluoresen dari replikasi virus. Penurunan bertahap dalam infektivitas
ditemukan dengan penerapan 100 hingga 600 MPa selama 2 menit. Pada 20 C, diamati
penurunan infektivitas 0,5 log10 pada 200 MPa dan 1 log10 pada 400 MPa. Sedikit lebih tinggi
pengurangan infektivitas 1 log10 pada 200 MPa dan 2 log10 pada 400 MPa ditemukan dengan
penerapan tekanan pada 4 C. Pada kedua suhu, virus hampir sepenuhnya tidak aktif (>3,5 log10
penurunan infektivitas) pada 600 MPa; namun, sejumlah kecil virus menular yang tersisa diamati
pada salah satu dari tiga ulangan pada kedua kasus. Mikroskop elektron transmisi menunjukkan
partikel yang dibongkar dan terdistorsi dalam preparat yang diperlakukan dengan 600MPa.
Eksperimen perjalanan waktu pada 400 MPa menunjukkan penurunan infektivitas yang
berkelanjutan dari 30 detik menjadi 10 menit, menyebabkan penurunan infektivitas 2 log10 pada
20 C dan penurunan infektivitas 2,5 log10 pada 4 C selama 10 menit aplikasi tekanan masing-
masing. Model prediktif untuk inaktivasi HEV oleh HPP dihasilkan berdasarkan data yang
dihasilkan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pengobatan HPP dapat mengurangi infektivitas
HEV, yang terutama tergantung pada tinggi tekanan dan durasi perawatan HPP. Dibandingkan
dengan virus lain, HEV tampaknya relatif stabil terhadap HPP dan kombinasi tekanan
tinggi/waktu lama harus diterapkan untuk pengurangan yang signifikan dari infektivitas.

1. Perkenalan
Virus hepatitis E (HEV) adalah agen etiologi dari hepatitis akut pada manusia. Wabah
besar hepatitis E terjadi di negara berkembang negara karena air minum yang terkontaminasi,
sedangkan kasus sporadis dominan di negara-negara industri (Goel dan Aggarwal, 2020).
Di Eropa, jumlah kasus hepatitis E yang dilaporkan meningkat selama tahun terakhir (Aspinall et
al., 2017). Selain hepatitis akut, hepatitis kronis perjalanan penyakit, yang dapat berkembang
menjadi sirosis hati yang mengancam jiwa, telah semakin dijelaskan pada pasien transplantasi
imunosupresi (Narayanan et al., 2019).
HEV adalah virus kecil dengan diameter 40-50 nm, yang memiliki genom RNA untai
tunggal. Partikel virus ada dalam dua bentuk: partikel tidak berselubung diekskresikan oleh feses
sedangkan berselubung semu partikel telah diidentifikasi dalam serum dan supernatan kultur sel
(Yin et al., 2016). Kedua jenis partikel menular dalam kultur sel. Dalam keluarga Hepeviridae,
empat genotipe patogen manusia utama telah diidentifikasi. Sedangkan genotipe 1 dan 2 secara
eksklusif menginfeksi manusia, genotipe 3 dan 4 bersifat zoonosis dan memiliki hewan besar
reservoir pada babi dan babi hutan (Pavio et al., 2017). Transmisi bawaan makanan melalui
konsumsi daging dan produk daging yang dibuat dari hewan yang terinfeksi dianggap sebagai
jalur transmisi utama untuk geno tipe 3 dan 4. Di Eropa, genotipe 3 subtipe 3c dan 3f beredar
terutama pada manusia dan hewan (Abravanel et al., 2020).
Efisiensi metode inaktivasi untuk HEV selama pemrosesan daging sebagian besar tidak
diketahui. Kurangnya efisien dan mudah digunakan metode untuk penentuan infektivitas HEV
mencegah studi inaktivasi yang lebih besar untuk HEV di masa lalu. Meskipun kemajuan yang
signifikan telah telah dibuat dalam perbanyakan kultur sel HEV selama beberapa tahun terakhir,
sistem yang kuat dan dapat direproduksi untuk studi inaktivasi HEV secara langsung di produk
daging masih kurang (Cook et al., 2017). Baru-baru ini, stabilitas HEV dalam media kultur sel
dan PBS dengan penerapan pemanasan pendek, penyimpanan jangka panjang, nilai pH yang
berbeda dan konsentrasi garam telah dianalisis, yang dapat digunakan untuk memprediksi
perilakunya selama produksi produk daging yang berbeda (Johne et al., 2016; Wolff et al.,
2020a; Wolff dkk., 2020b). Genotipe HEV 3c strain 47832c (Johne et al., 2014) telah digunakan
dalam penelitian ini dalam sistem kultur sel, di mana sel yang terinfeksi virus divisualisasikan
oleh imunofluoresensi sebagai pembentuk fokus. unit (ffu) yang secara langsung berhubungan
dengan jumlah partikel HEV yang menular dalam sampel.
Kesesuaian pemrosesan tekanan hidrostatik tinggi (HPP) untuk menonaktifkan
mikroorganisme dan mendenaturasi protein sudah didemonstrasikan lebih dari seratus tahun
yang lalu (Bridgman, 1914; Hite, 1899). Selama beberapa dekade sekarang, aplikasi industri
tekanan hidrostatik tinggi telah ditetapkan sebagai alternatif lembut untuk termal pengobatan,
dimana berbagai produk makanan diperlakukan, seperti jus dan minuman, produk nabati, produk
daging dan makanan laut (Huang et al., 2017). Efek tekanan secara vektor tidak terarah dan oleh
karena itu seragam di seluruh sistem, berbeda dengan gradien suhu besar yang terjadi selama
perlakuan termal makanan konvensional. NS efek menonaktifkan HPP terutama dikaitkan
dengan denaturasi protein, perubahan pH, disosiasi ribosom (Molina-Gutierrez et al., 2002; Mota
et al., 2013) serta transisi fase dan perubahan fluiditas membran sel dan permeabilisasi membran
sel (Musim dingin dan Jeworrek, 2009). Namun, efek matriks harus dipertimbangkan juga.

Pengobatan HPP juga telah terbukti efisien untuk inaktivasi beberapa virus seperti
norovirus manusia (Leon et al., 2011), rotavirus (Araud et al., 2015) dan virus hepatitis A (Calci
et al., 2005). Yang pertama studi tentang inaktivasi HEV oleh pengobatan HPP telah diterbitkan
baru-baru ini, menunjukkan stabilitas yang luar biasa tinggi dari virus ini (Nasheri dkk., 2020).
Dalam penelitian ini, strain HEV 47832c juga digunakan; Namun, metode tidak langsung
mengukur HEV-RNA di supernatan kultur sel yang diinokulasi diterapkan untuk penentuan
infektivitas.
Untuk lebih menguraikan stabilitas HEV pada perlakuan HPP, sampel yang
mengandung HEV diselidiki di sini pada tekanan/waktu yang berbeda kombinasi. Untuk
mengaktifkan kompatibilitas dengan data inaktivasi yang diterbitkan sebelumnya pada HEV,
perawatan dilakukan di PBS dan residu infektivitas dinilai dengan mengukur unit pembentuk
fokus dalam kultur sel. Kondisi tekanan yang berbeda dibandingkan satu sama lain dengan
menerapkan waktu penahanan yang sama pada dua temperatur yang berbeda. Selain itu, kinetika
inaktivasi pada tekanan tetap pada rentang penahanan yang lebih lama kali dianalisis. Data
tersebut digunakan untuk menghasilkan model prediktif, yang dapat digunakan untuk
memprediksi stabilitas HEV untuk semua kombinasi tekanan/waktu penahanan/suhu dalam
analisis kondisi eksperimental.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Virus dan sel

Genotipe HEV 3c strain 47832c (GenBank acc. no. KC618403), awalnya berasal dari
pasien yang terinfeksi kronis (Johne et al., 2014), digunakan untuk semua pengujian, yang
dijelaskan dalam makalah ini. Untuk produksi virus, garis sel A549 terus-menerus terinfeksi
dengan strain ini (Johne dkk., 2014; Johne et al., 2016) digunakan. Garis sel subklonal A549/
D3, awalnya berasal dari sel A549 (Johne et al., 2016; Schemmerer et al., 2016), yang
menunjukkan kerentanan yang lebih tinggi terhadap jenis virus ini dibandingkan dengan sel
A549 normal, digunakan untuk titrasi infektivitas.

2.2. Produksi virus

Protokol untuk mendapatkan penyebaran stok viral load yang tinggi digunakan di sini
seperti yang dijelaskan dalam Wolff et al. (2020a), dengan sedikit modifikasi. Secara singkat,
termos dengan terus-menerus terinfeksi dan benar-benar konfluen sel dibekukan pada suhu 20 C
dan dicairkan 3 kali, sebelum supernatannya dipanen. Untuk mengkonsentrasikan virus,
supersentrifugasi yang dikumpulkan menjadi sasaran ultrasentrifugasi seperti yang dijelaskan
(Wolff dkk., 2020a). Pelet virus yang dihasilkan disuspensikan kembali dalam seperlima puluh
volume awalnya di PBS. Semua suspensi virus dihasilkan dengan cara ini dikumpulkan,
dipisahkan dan disimpan pada suhu 20 C sampai selanjutnya menggunakan. Setelah dicairkan,
suspensi stok virus memiliki konsentrasi partikel HEV menular dari 4,1 × 104 ffu/ml.

2.3. pengobatan HPP

Eksperimen tekanan tinggi dilakukan dalam satu unit kapal (U111, UNIPRESS,
Warszawa, Polandia) menggunakan pompa piston tangan untuk generasi tekanan. Unit dapat
beroperasi pada tekanan hidrostatik tinggi hingga 0,9 GPa dalam kisaran suhu dari 20 C hingga
120 C. yang tinggi media tekanan adalah 1,2-propanediol (≥99,5%, ROTH, Jerman) dicampur
dengan air suling (50% v/v). Bejana tekan silinder kecil dengan pipa eksternal yang terbuat dari
paduan tembaga berilium berkekuatan tinggi (volume dalam: 6 ml, diameter dalam: 13 mm,
tinggi dalam: 45 mm) adalah digunakan. Untuk menentukan profil suhu, ujung termokopel
dipasang di dalam unit perawatan langsung di atas tabung sampel dan perubahan suhu selama
fase peningkatan tekanan, tekanan waktu penahanan dan pelepasan tekanan dicatat (pengukuran
frekuensi 0,5 Hz, Gambar Tambahan. 1). Termokopel dan pengukur tekanan dihubungkan ke
sistem pengukuran (ALMEMO 2590, AHLBORN, Jerman) dan data dicatat setiap 2 detik. Untuk
mengontrol suhu, bejana langsung dimasukkan ke dalam penangas air panas (CC 410, Huber,
Jerman).
Sebanyak 580 l suspensi virus ditempatkan ke dalam tabung cryo 0,5 ml (Nunc,
Thermo Scientific, Germany) dalam kondisi steril dan tabung sampel tertutup kemudian
dipindahkan ke dalam bejana saat operasi suhu. Dalam serangkaian percobaan pertama, tekanan
100 hingga 600 Mpa diterapkan untuk waktu tetap 2 menit pada 20 C atau 4 C. Dalam seri kedua
percobaan, perawatan dilakukan pada tekanan tetap 400 MPa pada waktu penahanan antara 0,5
dan 10 menit pada 20 C atau 4 C. Setiap tekanan/ kombinasi waktu dianalisis dengan tiga
ulangan, yang secara terpisah dikenai perlakuan HPP. Tekanan ditingkatkan secara manual
(dengan kecepatan rata-rata antara 1 MPa/s dan 35 MPa/s) sesuai kebutuhan tingkat tekanan dan
kemudian waktu penahanan dimulai. Tekanan meningkat menjadi 600 MPa (suhu awal 20 C)
menghasilkan suhu maksimum 24,1 C karena efek pemanasan kuasi-adiabatik selama
peningkatan tekanan. Waktu penahanan tekanan dihentikan secara manual pelepasan tekanan (ca.
10 MPa/s). Selama fase ini, suhu menurun sementara, dengan penurunan maksimum menjadi 2,1
C dalam kasus ini aplikasi tekanan 600 MPa pada suhu awal 4 C. NS suhu rata-rata (±SD) pada
semua kondisi tekanan untuk 4 C ulangan adalah 3,9 ± 0,6 C dan untuk 20 C ulangan 19,2 ± 0,7
C. NS tekanan rata-rata pada semua kondisi suhu adalah 102,7 ± 1,2 MPa, 202,6 ± 0,8 MPa,
301,2 ± 2,2 MPa, 403,4 ± 1,3 MPa, 505,5 ± 1,1 Mpa dan 603,1 ± 2,6 MPa dalam percobaan
masing-masing. Kapal itu diturunkan dan tabung sampel yang dirawat ditempatkan di atas es
sampai infektivitas titrasi. Sampel kontrol tidak diperlakukan dengan tekanan dan langsung
disimpan di atas es.

2.4. Titrasi infektivitas

Infektivitas HEV dari sampel ditentukan oleh metode titrasi, seperti yang dijelaskan
secara rinci dalam Johne et al. (2016). Secara singkat, seri pengenceran sepuluh kali lipat dari
sampel HEV digunakan untuk menginfeksi A459/D3 sel dalam format pelat sumur 96. Setelah 1
jam inkubasi, supernatan sel digantikan oleh media kultur sel. Setelah itu, sumur 96 piring
diinkubasi selama 1 minggu dalam inkubator yang dilembabkan, diikuti oleh pertukaran medium
dan masa inkubasi kedua selama 1 minggu. Setelah itu, sel yang terinfeksi diwarnai dengan
imunofluoresensi, menggunakan a antiserum protein kapsid anti HEV kelinci dan anti kelinci
berlabel FITC antibodi sekunder IgG. Fokus fluoresen dihitung secara manual dengan mikroskop
fluoresensi terbalik. Nilai infektivitas dalam ffu/ml adalah dihitung berdasarkan jumlah fokus
fluoresen yang dihitung dari sumur dengan pengenceran tertinggi menunjukkan fluoresensi,
dikalikan dengan faktor pengenceran masing-masing menggunakan perangkat lunak MS Excel.

2.5. Analisis statistik data

Analisis statistik dari set lengkap hasil eksperimen dibuat menggunakan lingkungan R
untuk komputasi statistik versi 3.6.3 (R Core Team, 2019) dengan paket “multicomp” v1.4–13
(http://m ultcomp.R-forge.R-project.org). Efek dari faktor eksperimental "tahan waktu",
"tekanan" dan "suhu" dianalisis melalui a ANCOVA multi-faktorial menggunakan "tekanan" dan
"suhu" sebagai faktor independen tanpa interaksi dan "waktu penahanan" sebagai variabel
bersama. Untuk mengidentifikasi perbedaan signifikan yang diberikan oleh "tekanan" individu
dan tingkat faktor "suhu" pada aktivitas HEV sisa perbandingan rata-rata tingkat faktor
dilakukan dengan fungsi glht() yang menerapkan Penyesuaian multiplisitas Bonferroni
(Bonferroni, 1936). Bijaksana keluarga tingkat kesalahan dikendalikan pada tingkat signifikansi
alpha = 5%. Untuk memeriksa untuk memenuhi asumsi ANCOVA plot diagnostik pada
heteroskedastisitas, normalitas, dan pengamatan berpengaruh dihasilkan dan diperiksa. Semua
kode R yang dihasilkan tersedia dalam data KNIME alur kerja analisis (lihat 2.6).

2.6. Pengembangan model prediktif

Untuk pembuatan model inaktivasi HEV prediktif, kami menggunakan gratis,
perangkat lunak sumber terbuka KNIME Analytics Platform versi 4.1.3 (KNIME AG, Zurich,
Swiss, www.knime.com) dengan KNIME ekstensi "PMM Nodes" (versi 1.2.2.202008191506,
Federal Jerman Institut Penilaian Risiko (BfR), https://foodrisklabs.bfr.bund.de /pmm-lab/).
Proses pembuatan model mengikuti apa yang disebut pendekatan “satu langkah pas” (lihat Jewel,
2012). Inspeksi visual dari data inaktivasi HEV yang tersedia selama berbagai waktu penahanan
menyebabkan keputusan untuk menerapkan persamaan model primer bi-phasic (seperti yang
dijelaskan oleh Juneja et al., 2010) untuk menggambarkan pengurangan tergantung waktu
holding infektivitas HEV pada kondisi lingkungan yang konstan. Karena kelangkaan data
eksperimen, parameter "waktu persimpangan" dari persamaan model biphasic ditetapkan
menjadi 2 menit. Pengaruh faktor lingkungan "suhu" dan "tekanan" dimodelkan melalui
persamaan linear log untuk dua tingkat inaktivasi model utama "D1" dan “D2”. Untuk ini, kami
mengadaptasi persamaan #5 dari Farakos dan Zwie tering (2011); di sini, parameter "Pref"
ditetapkan ke 600 MPa dan "Tref" tetap pada 20 C. Untuk menyesuaikan formula gabungan
melalui yang diukur titik data dalam pendekatan satu langkah, ekstensi KNIME “PMM-Lab”
digunakan. PMM-Lab melakukan pencarian berbasis kemungkinan maksimum melalui ruang
parameter dimensi tinggi seperti yang dijelaskan oleh Lorimer dan Kiermeier (2007) mulai dari
100 set parameter terbaik mulai nilai-nilai. Untuk menghindari overfitting, persamaan model
awal disederhanakan dengan prosedur penghapusan parameter mundur berulang, di mana
parameter model yang tidak signifikan dihapus satu per satu. Proses eliminasi parameter model
dilanjutkan sampai semua estimasi parameter model berbeda nyata dari “0”. Proses ini
menghasilkan persamaan model akhir sebagai berikut:

Value = Y0 − ⎛ ⎜⎜⎜⎝ Time 10 log10DPrefTref + ( 600− pressure zP ) − ( 20− T zT ) ⎞ ⎟⎟⎟⎠ − (Time >
2)*(Time − 2) const +(Time > 2)*(Time − 2) ⎛ ⎜⎝ 10 log10DPrefTref + ( 600− pressure zP ) − ( 20− T zT )
⎞⎟

Di sini "Nilai" mewakili infektivitas residual yang diprediksi di log10 (ffu/ml) setelah
memperlakukan sampel untuk waktu penahanan yang berbeda "Waktu" (dalam detik) pada
kondisi "tekanan" konstan (dalam MPa). “Y0” mewakili infektivitas awal pada “Waktu” = 0
menit; “const”, “log10DPrefTref”, “zP” dan "zT" adalah parameter model yang dipasang selama
proses pembuatan model, di mana "const" mewakili tingkat inaktivasi HEV di detik fase
inaktivasi (yaitu setelah waktu penahanan 2 menit); "log10DPrefTref" adalah log10-waktu yang
dibutuhkan untuk pengurangan infektivitas 1 log (nilai-D) untuk inaktivasi tekanan pada 600
MPa dan 20 C, "zP" dan "zT" adalah perubahan tekanan / suhu yang diperlukan untuk
mengurangi nilai-D hingga 90% (1 pengurangan log10 dari "log10D"). Proses pembuatan model
lengkap didokumentasikan dalam alur kerja KNIME yang disediakan berdasarkan permintaan.
NS model prediksi akhir untuk inaktivasi HEV selanjutnya diekspor ke format pertukaran model
independen perangkat lunak PMF-ML (http://sourcefo
rge.net/projects/microbialmodelingexchange/), yaitu sebagai file PMFX yang menampung semua
estimasi parameter model, data eksperimen mentah, dan semua metadata yang relevan, termasuk
deskripsi kisaran model penerapan. File yang dihasilkan dapat diakses melalui model berikut:
repositori:http://data.d4science.org/ctlg/RAKIP_portal/hepatitis_e_virus_inactivation_model_for
_hpp_treatment.
2.7. Mikroskop elektron
10 l supernatan dari virus yang diberi tekanan atau tidak diobati suspensi diadsorpsi pada
tembaga berlapis karbon-formvar 400 mesh grid (Plano GmbH, Jerman) selama 5 menit diikuti
dengan fiksasi dengan glutaraldehida selama 1 menit lagi. Kelebihan cairan dihilangkan dengan
aksi kapiler pasif menggunakan kertas tisu. Kisi-kisi itu kemudian dikontraskan dengan 2%
uranil asetat selama 1 menit dan kelebihan cairan dihilangkan seperti sebelumnya. Kisi-kisi
dibiarkan kering dan diperiksa dalam Jeol 1400 Plus TEM (Jeol, Jepang), dioperasikan pada 120
kV. Enam area grid yang berbeda adalah diperiksa untuk memeriksa homogenitas sampel.
Pencitraan dilakukan dengan kamera Olympus Veleta G2 (EMSIS, Jerman). Diameter partikel
diukur menggunakan perangkat lunak ITEM yang disediakan oleh Olympus.
3. Hasil
3.1. Perawatan HEV pada 100 hingga 600 MPa selama 2 menit
Persiapan HEV di PBS diperlakukan pada dua suhu yang berbeda selama 2 menit pada
tekanan atmosfer dan tekanan antara 100 MPa dan 600MPa. Pada 4 C serta pada 20 C, secara
bertahap mengurangi jumlah sisa HEV menular ditentukan oleh peningkatan kondisi tekanan
(Gbr. 1). Tingkat inaktivasi yang sedikit lebih tinggi terbukti pada 4 C dibandingkan dengan 20
C. Secara rinci, rata-rata infektivitas menurun dibandingkan dengan perawatan kontrol di bawah
tekanan atmosfer sekitar 0,5 log10 ffu/ml pada 200 MPa, 1 log10 ffu/ml pada 400 MPa dan >3,5
log10 ffu/ ml pada 600 MPa ditemukan pada 20 C. Pada 4 C, penurunan rata-rata sekitar 1 log10
ffu/ml pada 200 MPa, 2 log10 ffu/ml pada 400 MPa dan >3,5 log10 ffu/ ml pada 600 MPa
ditentukan. Pada 600 MPa, hanya satu unit pembentuk fokus yang ditemukan di salah satu dari
tiga ulangan di keduanya suhu.
3.2. Perawatan HEV pada 400 MPa untuk waktu penahanan yang berbeda
Ketergantungan inaktivasi HEV pada waktu penahanan tekanan adalah dianalisis pada
400 MPa, yang mewakili tekanan yang banyak digunakan untuk HPP pengobatan makanan.
Sekali lagi, percobaan dilakukan pada dua suhu 4 C dan 20 C. Pada waktu penahanan tekanan
antara 30 detik dan 10 min, jumlah sisa virus menular menurun terus menerus, dengan tingkat
inaktivasi yang lebih tinggi di awal dan tambahan yang lebih rendah menonaktifkan efek pada
inkubasi lebih lama (Gbr. 2). Sekali lagi, HEV lebih efisien dinonaktifkan pada 4 C
dibandingkan dengan 20 C. Secara rinci, berarti infektivitas menurun sekitar 0,5 log10 ffu/ml
setelah 1 menit, 1,5 log10 ffu/ ml setelah 5 menit dan 2 log10 ffu/ml setelah 10 menit ditemukan
pada 20 C. Pada 4 C, penurunan rata-rata sekitar 1 log10 ffu/ml setelah 1 menit dan sekitar 2,5
log10 ffu/ml setelah 5 atau 10 menit ditentukan. Sisa virus menular terdeteksi di semua ulangan
pada waktu penahanan terlama 10 menit pada kedua suhu.
Gambar 1. Inaktivasi HEV dengan perlakuan pada tekanan atmosfer dan kondisi HPP terpilih
dari 100 MPa hingga 600 MPa. Persiapan HEV di PBS menjadi sasaran: perlakuan pada tekanan
yang ditunjukkan selama 2 menit, pada (A) 20 C atau (B) 4 C. Jumlah residu HEV yang menular
ditentukan dengan penghitungan metode kultur sel unit pembentuk fokus (ffu) per ml. Tiga
ulangan biologis diperlakukan secara independen, masing-masing kemudian dianalisis sekali
dalam kultur sel. residu terukur HEV menular untuk setiap ulangan (lingkaran abu-abu) dan rata-
rata aritmatika untuk setiap kondisi pengobatan (kolom hitam) ditampilkan. Perbedaan nyata (*p
< 0,05, **p <0,01) antara sampel yang diberi perlakuan HPP dan tidak diberi perlakuan (tekanan
atmosfer) ditunjukkan.

Gambar 2. Waktu inaktivasi HEV selama pengobatan HPP pada 400 MPa. Persiapan HEV di
PBS menjadi sasaran pengobatan HPP untuk durasi yang ditunjukkan pada: (A) 20 C atau (B) 4
C. Jumlah sisa HEV menular ditentukan dengan metode kultur sel yang menghitung unit
pembentuk fokus (ffu) per ml. Tiga biologis ulangan diperlakukan secara independen, masing-
masing kemudian dianalisis sekali dalam kultur sel. HEV menular residual yang diukur untuk
setiap ulangan (lingkaran abu-abu) dan rata-rata aritmatika untuk setiap durasi pengobatan
(kolom hitam) ditampilkan. Perbedaan nyata (*p < 0,01) antara perlakuan HPP dan tidak
perlakuan (durasi = 0 min) sampel ditunjukkan. Untuk ini, perbandingan berganda post-hoc
sarana dengan nilai-p yang disesuaikan dengan metode Bonferroni diterapkan, di mana holding
yang berbeda kali dianggap sebagai tingkat faktor independen dalam model linier umum.

3.3. Analisis statistik dan pemodelan prediktif

Analisis statistik menegaskan bahwa faktor lingkungan "tekanan" dan "waktu
penahanan" memiliki efek terkuat pada HEV inaktivasi (kedua faktor dengan nilai p <10− 8)
(Gambar Tambahan 2). Pengaruh suhu juga signifikan secara statistik (nilai-p = 0,04), tetapi
sejauh ini tidak sekuat dua lainnya. Tidak ada pengaruh interaksi yang signifikan antara “suhu”
dan “tekanan”. Dari perbandingan berpasangan post-hoc dari tingkat tekanan yang berbeda dapat
menyimpulkan bahwa 600 MPa menghasilkan inaktivasi HEV yang jauh lebih tinggi
dibandingkan dengan semua tingkat tekanan lainnya di bawah 500 MPa. 500 Mpa pengobatan
masih menunjukkan inaktivasi yang lebih tinggi secara signifikan dibandingkan dengan 100 MPa
dan perlakuan kontrol (tekanan atmosfer). Berdasarkan data, model prediksi baru untuk
inaktivasi HEV adalah dihasilkan. Model inaktivasi HEV ini (Gbr. 3) menunjukkan hasil yang
memuaskan akurasi dengan kesalahan akar rata-rata kuadrat keseluruhan (RMSE) sebesar 0,42
log10 ffu/ml (R2 = 0,88) untuk data eksperimen yang diukur. yang dipasang estimasi parameter
model adalah: Y0 = 4,23 + 0,06; konstanta = 16,4 ± 6.1; log10DPrefTref = 0,235 ± 0,024; zP =
549,4 ± 40 dan zT = 141,3 ± 31,4. Patut dicatat bahwa model terakhir juga memiliki "tekanan",
"suhu" dan "waktu penahanan" sebagai parameter input. Ini sejalan dengan hasil dari analisis
statistik.
3.4. Mikroskop elektron sampel yang dirawat dan yang tidak diobati
Untuk lebih mendalami mekanisme penonaktifan HEV melalui Perawatan HPP,
persiapan HEV tanpa perawatan tekanan dan satu setelah perawatan pada 600 MPa selama 2
menit pada 20 C dianalisis dengan TEM. Sebagai ditunjukkan pada Gambar. 4A dan C, partikel
kecil dengan diameter 40-50 nm menyerupai partikel HEV diidentifikasi dalam persiapan yang
tidak diobati. Dalam preparasi yang diberi perlakuan tekanan, partikel-partikel itu tidak
diidentifikasi (Gbr. 4B dan D). Sebaliknya, agregat dari struktur yang lebih kecil kemungkinan
besar menunjukkan partikel virus yang dibongkar, serta terdistorsi partikel, ditemukan di sini.

Gambar 3. Visualisasi hasil prediksi untuk HEV model inaktivasi yang menggambarkan sifat bi-
fasik dari persamaan model utama dengan parameter "dalam waktu persimpangan" = 2 menit (A)
untuk dua percobaan (20 C dan 4 C) pada 400 MPa dengan waktu penahanan yang berbeda dan
di (B) untuk eksperimen dengan tekanan berbeda kondisi selama 2 menit pada 4 C. Nilai terukur
diwakili oleh simbol dengan bentuk dan warna yang berbeda (pengukuran dari percobaan yang
sama memiliki kesamaan warna dan bentuk). Garis mewakili prediksi dari Model inaktivasi
HEV untuk waktu penahanan yang diberikan, di mana warna garis sesuai dengan kondisi
lingkungan pengukuran berwarna sama. Misalnya dalam (A) lingkaran merah mewakili
pengukuran pada 20 C dan 400 MP sedangkan garis merah memberikan prediksi oleh model di
kondisi yang sama dari 0 hingga 10 menit. (Untuk interpretasi referensi warna dalam legenda
gambar ini, pembaca dirujuk ke versi web artikel ini.)

4. Diskusi
HPP semakin banyak digunakan untuk pengawetan makanan. Di sini, efisiensi teknik ini
berkaitan dengan inaktivasi HEV diselidiki. NS genotipe 3c strain 47832c yang disesuaikan
dengan kultur sel digunakan dengan titrasi sistem berbasis deteksi HEV menggunakan
imunofluoresensi. Di Eropa, genotipe 3c adalah salah satu jenis utama yang beredar saat ini
(Abravanel et al., 2020), yang juga telah terdeteksi pada makanan (Szabo et al., 2015). NS
sistem telah terbukti cocok untuk studi inaktivasi seperti yang ditunjukkan untuk stabilitas panas,
garam, dan pH HEV (Johne et al., 2016; Wolff et al., 2020a; Wolff dkk., 2020b). Oleh karena
itu, sistem yang sama diterapkan di sini untuk analisis stabilitas HEV di PBS di HPP.
Penggunaan PBS memungkinkan dibandingkan dengan perawatan dan virus lain karena
beberapa inaktivasi studi telah dilakukan dengan menggunakan matriks ini. Sistem
memungkinkan kami untuk menentukan inaktivasi virus hingga penurunan 4 log10 dalam titer
virus, yang merupakan nilai yang juga digunakan untuk menentukan aktivitas virus disinfektan
dalam standar Eropa (Steinmann, 2004).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa HEV dapat diinaktivasi oleh HPP, meskipun
kombinasi tekanan/waktu tinggi harus digunakan untuk efisiensi inaktivasi. HPP pada 20 C
sedikit kurang efisien dibandingkan pada 4 C. Ketergantungan jangka waktu dari efek HPP pada
inaktivasi virus juga telah telah dijelaskan untuk virus lain, misalnya, untuk murine norovirus,
yang lebih efisien diinaktivasi oleh HPP pada 0 C atau 4 C dibandingkan dengan 20 C (Huang et
al., 2014; Lou et al., 2011). Satu penjelasan untuk nama fenomena ini mungkin merupakan efek
nonaktif tambahan dari pembekuan selama pengurangan tekanan pada suhu rendah. Namun,
tingkat yang lebih tinggi dari inaktivasi pada suhu yang lebih rendah juga ditemukan pada
tekanan rendah, di mana tidak ada pembekuan sampel yang diamati selama pelepasan tekanan.

Dengan meningkatkan tekanan atau waktu penahanan, efek menonaktifkan menjadi

lebih tinggi. Secara keseluruhan, HEV menunjukkan stabilitas yang cukup tinggi terhadap
perlakuan HPP. Pada tekanan 400 MPa selama 2 menit, yang sesuai dengan kondisi pengobatan
yang banyak digunakan dalam industri makanan, infektivitas HEV adalah menurun untuk 1
log10 ffu/ml (20 C) atau 2 log10 ffu/ml (4 C). Bahkan pada 600 MPa selama 2 menit, sisa HEV
menular dapat dideteksi dalam satu dari tiga ulangan, meskipun dengan jumlah yang sangat
rendah di sekitar deteksi membatasi. Perbandingan langsung dengan data dari virus lain sulit
dilakukan karena matriks yang berbeda dan rezim suhu/tekanan/waktu sebagian besar diterapkan
dalam studi yang diterbitkan. Feline calicivirus, pengganti untuk norovirus manusia,
menunjukkan penurunan infektivitas >7 log10 setelah pengobatan dengan 450 MPa pada 15 C
selama 1 menit dalam media kultur sel serta dalam air mineral (Buckow et al., 2008). Norovirus
murine menunjukkan >6 log10 infektivitas menurun setelah pengobatan dengan 450 MPa pada
20 C selama 5 min dalam media kultur sel (Kingsley et al., 2007). Sebaliknya, titer infeksi virus
hepatitis A menurun hanya 2 log10 setelah pengobatan pada 400 MPa pada 20 C selama 5 menit
dalam media kultur sel yang mengandung 15 g/l garam (Grove et al., 2009). Demikian pula,
norovirus manusia dalam tiram tidak sepenuhnya tidak aktif pada 400 MPa pada 25 C selama 5
menit, tetapi hanya pada 600 MPa pada kondisi tersebut (Leon et al., 2011). Hal ini
menunjukkan bahwa manusia virus bawaan makanan seperti virus hepatitis A atau norovirus
manusia berperilaku lebih mirip seperti HEV mengenai penonaktifan HPP, tetapi bahkan di
antara ini, HEV tampaknya memiliki stabilitas yang lebih tinggi untuk HPP.

Perbedaan menjadi jelas ketika membandingkan hasil kami dengan a studi baru-baru ini
diterbitkan oleh Nasheri et al. (2020). Sedangkan kami menemukan penurunan terus menerus
dari infektivitas dengan meningkatkan tekanan dan waktu, Nasheri dkk. melaporkan efek
menonaktifkan yang hampir sama pada 400 MPa atau 600 MPa dan pada waktu penahanan 1
menit atau 5 menit. Juga, hanya minimal infektivitas menurun 2 log10 dalam media kultur dan
0,5 log10 dalam hati pate ditentukan dalam penelitian itu, bahkan pada pengobatan 5 menit pada
600 MPa. Sebaliknya, kami mengamati penurunan infektivitas >3,5 log10 pada pengobatan 2
menit pada 600 MPa. Perlu disebutkan bahwa strain HEV yang sama memiliki telah digunakan
dalam kedua studi, sehingga tidak termasuk efek strain-spesifik. Satu perbedaan antara kedua
penelitian adalah metode yang digunakan untuk titrasi sisa infektivitas setelah pengobatan.
Sedangkan kami menggunakan sistem titrasi berbasis imunofluoresensi, Nasheri et al. digunakan
sebagai perbandingan kuantitatif HEV-RNA pada 2 minggu setelah inokulasi sampel ke dalam
kultur sel. Ada kemungkinan bahwa RNA bebas yang tersisa atau RNA yang ada dalam kapsid
tidak menular yang terdistorsi dari inokulum memiliki telah diukur selain RNA yang dihasilkan
dari sel yang terinfeksi oleh metode, yang mungkin menyebabkan perkiraan stabilitas HEV yang
terlalu tinggi.
Gambar 4. Analisis mikroskop elektron transmisi preparasi HEV. (A, C) HEV yang tidak
diobati, (B, D) Persiapan HEV diperlakukan pada 600 MPa selama 2 menit pada 20 C. (A, B)
perbesaran yang lebih rendah, (C, D) perbesaran yang lebih tinggi. Panah kecil: partikel seperti
HEV, panah kosong: struktur yang dibongkar atau terdistorsi. Pewarnaan uranil asetat.

Perbedaan penting lainnya antara kedua studi adalah penggunaan matriks yang berbeda
seperti yang kami gunakan PBS dan Nasheri et al. (2020) budaya bekas sedang dan pate hati.
Efek spesifik matriks yang ditandai dengan perawatan HPP telah dijelaskan untuk virus lain
(Kingsley, 2013). Sebagai contoh, murine norovirus menunjukkan penurunan infektivitas 7
log10 setelah pengobatan dengan 400 MPa pada 4 C selama 2 menit dalam media kultur sel,
sedangkan yang sama pengobatan dalam pure stroberi menyebabkan penurunan infektivitas
hanya 4 log10 (Lou et al., 2011). Bahkan dalam sampel dengan matriks yang hanya sedikit
berbeda komposisi, perbedaan signifikan dalam inaktivasi oleh HPP telah dijelaskan, mis. untuk
virus hepatitis A, yang lebih efisien dinonaktifkan pada kerang yang diasinkan dibandingkan
dengan kerang yang tidak diasinkan (Pavoni et al., 2015), atau untuk murine norovirus, yang
jauh lebih tahan terhadap inaktivasi HPP pada buah kering dibandingkan dengan buah segar beri
(Huang et al., 2014).
Data inaktivasi virus oleh HPP daging produk langka, tetapi pengobatan calicivirus
kucing dengan 400 MPa at 12 C selama 5 menit pada hati babi mengakibatkan penurunan
infektivitas 5 log10, sedangkan hanya penurunan infektivitas 1,3 log10 ditentukan pada saat yang
sama kondisi pada ham (Emmoth et al., 2017). Data kami menunjukkan inaktivasi HEV yang
hampir lengkap di PBS di tekanan sangat tinggi 600 MPa, yang juga didukung oleh elektron
kami analisis mikroskopis. Struktur bulat kecil dengan bentuk khas partikel HEV terdeteksi pada
sampel yang tidak diberi perlakuan, tetapi tidak pada sampel yang diberi perlakuan pada 600
MPa selama 2 menit, di mana hanya struktur yang menyerupai terdistorsi dan partikel yang
dibongkar dapat diidentifikasi. Efek struktural serupa dari HPP telah diamati untuk virus lain,
misalnya, untuk murine norovirus atau rotavirus (Araud et al., 2015; Lou et al., 2011)

Akhirnya, data dapat digunakan untuk membuat model prediktif untuk HEV inaktivasi
di bawah berbagai tekanan (0,1–600 MPa) dan waktu penahanan (0–10 menit) kondisi. Karena
modelnya bersifat empiris, seharusnya hanya digunakan dalam kisaran tekanan eksperimental,
suhu (4–20 C) dan kondisi waktu penahanan. Selanjutnya, akan bermanfaat untuk menghasilkan
data eksperimental independen untuk memungkinkan validasi model di masa depan, yang berada
di luar cakupan penelitian ini. Sebagai model yang dihasilkan disediakan dalam pertukaran
model perangkat lunak-independen format (PMF-ML) validasi seperti itu sekarang dapat
dilakukan oleh siapa saja peneliti lain juga. Penelitian kami memiliki keterbatasan tertentu.
Pertama-tama, hanya sampel kecil nomor dapat diselidiki dalam kisaran terbatas kombinasi
tekanan/waktu. Pengembangan kultur sel yang lebih efisien dan mudah ditangani sistem harus
ditujukan di masa depan untuk mengatasi pembatasan dalam nomor sampel. Kedua, hanya
pengobatan di PBS yang telah dianalisis jauh. Efek berbeda dari protein dan zat lain seharusnya
ditentukan di masa depan. Idealnya, stabilitas HPP dari HEV harus dianalisis langsung dalam
produk daging. Namun, setidaknya di laboratorium kami, pemulihan HEV menular dari produk
daging menunjukkan efisiensi yang sangat rendah (data tidak ditampilkan), sehingga mencegah
titrasi infektivitas HEV langsung dari matriks makanan tersebut. Oleh karena itu, studi masa
depan harus fokus
pada pengembangan metode yang efisien untuk pemulihan HEV menular dari produk daging.

5. Kesimpulan
HEV dapat dinonaktifkan oleh HPP dan penurunan infektivitas secara bertahap diamati oleh
tekanan yang lebih tinggi dan interval waktu penahanan yang lebih lama. Dibandingkan dengan
virus lain, HEV menunjukkan stabilitas yang tinggi terhadap HPP. A model matematika telah
dihasilkan memungkinkan prediksi HEV inaktivasi di PBS pada kombinasi tekanan / waktu
penahanan yang berbeda. Di dalam masa depan, data yang dihasilkan dan model harus divalidasi,
ketika metode yang efisien dan andal untuk analisis infektivitas HEV secara langsung di produk
daging tersedia. Secara umum dapat disimpulkan dari penelitian bahwa HPP dapat dianggap
sebagai metode pengobatan untuk makanan di untuk mengurangi risiko penularan HEV bawaan
makanan. Namun, efisiensi penerapannya harus dinilai di masa depan dengan
mempertimbangkan kemungkinan efek dari matriks spesifik, jumlah HEV . yang diharapkan
dalam persiapan daging dan konsentrasi HEV yang diinginkan di final produk. Deklarasi
kepentingan bersaing Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak mengetahui persaingan
keuangan minat atau hubungan pribadi yang tampaknya dapat mempengaruhi pekerjaan yang
dilaporkan dalam makalah ini. Ucapan Terima Kasih Kami ingin mengucapkan terima kasih
kepada Silke Apelt dan Maria-Margarida Vargas (BfR, Berlin, Jerman) untuk bantuan teknis
yang sangat baik di laboratorium dan Stefan Boguslawski (TU Berlin, Jerman) untuk teknis yang
sangat baik dukungan selama persiapan unit tekanan tinggi. Proyek ini secara finansial didukung
sebagian oleh hibah dari Federal Food Safety dan Kantor Veteriner Konfederasi Swiss (nomor
proyek 4.18.01) dan dengan hibah intramural (no. 46-002) dari Federal Jerman Lembaga
Penilaian Risiko.