PRAKTIKUM V

IDENTIFIKASI BAKTERI PATOGEN DAN PEWARNAAN BAKTERI

Tujuan
1. Untuk mengetahui dan memahami cara mengidentifikasi bakteri Escherichia coli
dalam sediaan farmasi dan produk makanan-minuman.
2. Mengamati morfologi bakteri dengan menggunakan metode pengecatan sederhana
dan pengecatan negatif.

I. Pendahuluan

Kualitas mikrobiologi sediaan farmasi dan produk makanan-minuman merupakan

suatu faktor yang penting untuk diperhatikan, terutama dengan kontaminasi bakteri
patogen. Kontaminasi bakteri patogen, selain mempengaruhi kualitas sediaan dan produk
tersebut juga dapat membahayakan kesehatan manusia karena dapat menyebabkan
infeksi suatu penyakit.
Adanya bakteri didalam obat-obat non-steril dapat menyebabkan perubahan-
perubahan karakter organoleptis, perubahan atau penurunan dan bahkan hilangnya
aktivitas terapetik obat tersebut.
Kondisi mikrobiologis dari makanan dan minuman menentukan keamanan dan
daya tahan makanan dan minuman itu sendiri. Beberapa bakteri dapat menyebabkan
keracunan makanan dan minuman, akan tetapi jumlah mikroba yang mampu
menimbulkan keracunan bergantung kepada individu dan sifat virulensi bakteri tersebut
serta kombinasi makanan dan minuman tersebut.
Demikian halnya terhadap produk obat tradisional, sediaan kosmetik dan produk-
produk lainnya adanya kontaminasi bakteri patogen dapat mempengaruhi kualitas
sediaan tersebut, menyebabkan perubahan rasa, bau dan warna, kekeruhan dan
sebagainya.
Beberapa bakteri patogen yang sering mengkontaminasi sediaan farmasi dan
produk makanan-minuman antara lain E. coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, Bacillus
cereus dan beberapa spesies lainnya.
Escherichia Coli pertama kali diidentifikasi oleh dokter hewan Jerman, Theodor
Escherich dalam studinya mengenai sistem pencernaan pada bayi hewan. Pada tahun
1885, beliau menggambarkan organisme ini sebagai komunitas bakteri coli (Escherich
1885) dengan membangun segala perlengkapan patogenitasnya di infeksi saluran
pencernaan. Nama “Bacterium Coli” sering digunakan sampai pada tahun 1991. Ketika
Castellani dan Chalames menemukan genus Escherichia dan menyusun tipe spesies E.
coli.

Sel Bakteri Escherichia coli Koloni Bakteri Escherichia coli pada media EMBA

29
 E. coli dari anggota family Enterobacteriaceae. Ukuran sel dengan panjang 2,0 –
6,0 μm dan lebar 1,1 – 1,5 μm. Bentuk sel dari bentuk seperti coocal hingga membentuk
sepanjang ukuran filamentous. Selnya bisa terdapat tunggal, berpasangan, dan dalam
rantai pendek, biasanya tidak berkapsul. E. Coli merupakan penghuni normal usus,
seringkali menyebabkan infeksi.
Enterobacteriaceae adalah kelompok besar batang gram-negatif yang heterogen,
yang habitat alaminya adalah saluran usus manusia dan hewan. Famili ini mencakup
banyak genus (misalnya, Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella,
Serratia, dan Proteus). Beberapa organisme enterik, misalnya Escherichia coli, merupakan
bagian flora normal dan kadang-kadang menyebabkan penyakit, sementara lainnya,
Salmonela dan Shigella, selalu bersifat patogen untuk manusia.

II. Pewarnaan Bakteri

Zat warna adalah merupakan garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif.
Salah satu diantaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa, warna tersebut
berada pada ion positif (yaitu, zat pewarna + Cl- ), sedangkan ion negatif (Na+ dan zat
pewarna -) (Djide, 2007).
Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa atau asam. Pada zat
warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan
mempunyai muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan
memberikan zat warna mempunyai muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak
digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan pada dinding sel, membran sel, dan
sitoplasma sewaktu proses pewarnaan.
Muatan positif pada zat warna basa akan berikatan dengan muatan negatif dalam
sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat (Bibiana, 1992).
Morfologi bakteri dapat diamati dengan 2 cara yaitu :
a. Pengamatan sel yang hidup yang tidak diwarnai.
b. Pengamatan sel yang mati dan diwarnai.
Bakteri yang hidup tidak berwarna sehingga sulit dibedakan dengan lingkungan
sekelilingnya. Meskipun kontras bakteri dengan lingkungan tidak mencolok namun
susunan kimiawinya sangat berbeda. Perbedaan kimiawi inilah yang menguntungkan kita,
sehingga bakteri dapat diwarnai tanpa mewarnai lingkungan sekitarnya(Bibiana, 1992).
Keuntungan melakukan pewarnaan adalah :
a. Meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya, sehingga dapat diamati
berbagai bentuk dan susunan bakteri.
b. Memungkinkan pengamatan salah satu bagian dari sel bakteri, misalkan spora,
kapsel, atau flagela.
c. Memungkinkan penggunaan pembesaran.
Secara kimiawi, zat warna yang digunakan untuk mengamati mikroorganisme bersifat :
a. Basa, bila zat warna yang digunakan memiliki muatan pada bagian kationnya. Zat
warna ini biasanya mewarnai struktur sel yang bersifat asam.
Contoh zat warna basa :
Zat warna Pelarut
Biru metil Aqua destillata
Kristal violet Etanol
Fuksin basa Etanol
Karbol fuksin Etanol + Fenol
b. Asam, bila zat warna yang digunakan memiliki muatan pada bagian anionnya. Zat
warna ini biasanya mewarnai struktur sel yang bersifat basa.
Contoh zat warna asam :

30
 Eosin dalam bentukgaram Na-cosin
Fuksin asam
c. Netral, bila zat warna merupakan garam yang terdiri dari zat warna asam dan basa.
(Bibiana, 1992).

A. Pewarnaan Sederhana
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan 1 macam zat warna untuk
meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazimnya prosedur
pewarnaan ini menggunakan zat warna basa. Seperti kristal violet, biru metilen,
karbol fuksin basa, safranin atau hijau malakit. Kadang kala digunakan zat warna
negatif untuk pewarnaan sederhana; zat warna asam yang sering digunakan adalah
nigrosin dan merah kongo (Bibiana, 1992).
Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-
macam tipe morfologi (kokus, basilus, vibrio, spirilum, dan sebagainya) dari bahan-
bahan lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai. Di samping itu dapat pula
diamati struktur-struktur tertentu seperti endospora. berbeda denga spesimen
hidup, sel-sel yang diwarnai terfiksasi pada kaca objek sehingga dapat disimpan
sebagai dokumentasi untuk jangka waktu lama (Hadiotomoe, 1990).
B. Pewarnaan Negatif
Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi
mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Pada metode ini mikroba dicampur
dengan tinta Cina atau nigrosin, kemudian digesekkan di atas kaca obyek. Zat warna
tidak akan mewarnai bakteri, akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri.
Dengan mikroskop, mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan latar belakang
berwarna (Hadiotomoe, 1990).
Pewarnaan Gram memilah bakteri mejadi kelompok Gram positif dan Gram
negatif. Bakteri-Gram positif berwarna ungu disebabkan kompleks zat warna kristal
violet-yodium tetap dipertahankan meskipun diberi larutan pemucat, sedangkan
bakteri Gram-negatif berwarna merah karena kompleks tersebut larut sewaktu
pemberian larutan pemucat dan kemudian mengambil zat warna kedua yang
berwarna merah. Perbedaan hasil dalam pewarnaan ini disebabkan perbedaan
struktur kedua kelompok bakteri tersebut (Bibiana, 1992).
Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri positif Gram dan
negatif Gram (Hadiotomoe, 1990).

31
Media
Pepton Dilution Fliud (PDF), Tryptic Soy Broth (TSB), Eosin Methylene Blue Agar (EMBA),
Trypton Broth, MR – VP medium, Simmon’s Citrate Agar, Nutrient Agar (NA).
Pereaksi
Merah Metil, Larutan Alfa Naftol, Larutan Kalium Hidroksida, Pereaksi Kovacks, pereaksi
untuk pewarnaan gram.
Bakteri Uji
Escherichia coli

Alat
Mikroskop, Inkubator, cawan petri, tabung reaksi, oven, autoklaf, gelas erlenmeyer, pipet
ukur, gelas ukur, obyek gelas, pipet tetes

Prosedur Kerja
1. Homogenisasi Sampel
a. Sampel tanpa biakan bakteri
- Timbang 10 gr cuplikan, masukkan kedalam erlenmeyer steril
- Tambahkan 90 ml PDF, campur sampai homogen.
b. Sampel yang ditambah biakan bakteri
- Timbang 10 gr cuplikan, masukkan kedalam erlenmeyer steril
- Tambahkan 90 ml PDF, campur sampai homogen.
- Tambahkan 0,1 ml biakan bakteri, homogenkan.
2. Pengkayaan
- Pipet 10 ml dan masukkan ke dalam gelas erlenmeyer 100 yang berisi 90 ml TSB,
homgenkan.
- Inkubasi pada suhu 35 – 37 °C selama 24 jam.
3. Uji Selektif
- Siapkan masing-masing 2 cawan petri yang berisi media padat EMBA.
- Ambil 1 sengkelit dari tiap biakan pengkayaan untuk digoreskan pada cawan petri
yang telah berisi media EMBA secara zig-zag.
- Inkubasi pada suhu 35 – 37°C selama 24 - 48 jam dengan posisi cawan dibalik.
- Amati koloni spesifik yang tumbuh yaitu bentuk bulat, diameter 2-3 mm, warna hijau
dengan kilap logam dan bintik biru kehijauan di tengahnya.

32
4. Isolasi
Pilih satu koloni terduga dari cawan petri yang berisi media EMBA, pindahkan dengan
cara gores zig-zag pada media NA miring. Inkubasi pada suhu 35 – 37 °C selama 24 – 48
jam. Catat hasil pengamatan.

5. Uji Konfirmasi :
Dari media NA miring dilanjutkan dengan uji IMVIC dengan cara sebagai berikut :

a. Uji Indol
Satu singkelit biakan NA miring diinokulasikan ke media Tryptone Broth dan
diinkubasi pada suhu 35-37 0C selama 24-48 jam. Ke dalam biakan tersebut
ditambahkan 0,2-0,3 ml pereaksi Kovac dan dikocok, didiamkan selama 10 menit.
Jika terbentuk cincin berwarna merah cherry dipermukaan biakan menunjukkan
reaksi indol positif.

b. Uji Metil Merah

Satu singkelit biakan NA miring diinokulasikan ke media MR-VP dan diinkubasi pada
suhu 35-370C selama 24-48 jam (bila perlu masa inkubasi dilanjutkan sampai 5 hari).
Ke dalam biakan tersebut ditambahkan 5 tetes larutan merah metal. Biakan yang
berwarna merah menunjukkan reaksi positif.

c. Uji Voges-Proskauer
Satu singkelit biakan NA miring diinokulasikan ke media MR-VP dan diinkubasi pada
suhu 35-37 0C selama 48 jam. Ditambahkan 0,6 ml larutan α-naftol dan 0,2 ml
larutan KOH 40% kemudian didiamkan selama 2 – 4 jam. Biakan yang berwarna
merah mudah hingga merah menyala menunjukkan reaksi positif. Bila tidak ada
perubahan menunjukkan reaksi negatif.

d. Uji Sitrat
Satu singkelit biakan NA miring diinokulasikan ke media Simmon’s Citrat Agar dan
diinkubasi pada suhu 35-37 0C selama 24-48 jam. Perubahan warna biakan (hijau
menjadi biru) menunjukkan reaksi positif, bila biakan tetap hijau menunjukkan reaksi
negatif.

6. Pewarnaan Gram
a. Persiapan Sediaan Apusan Bakteri
- Bersihkan kaca objek dengan cara menyemprotkan alkohol
- Ambil biakan menggunakan jarum ose secara aseptik
- Suspensikan pada kaca objek dengan menambahkan setetes air suling atau
NaCl 0,9%, ratakan suspensi hingga tidak terlalu tebal
- Biarkan apusan mengering diudara, fiksasi dengan melewatkan diatas nyala
bunsen

33
 b. Pewarnaan sediaan Apusan Mikroba
- Teteskan 2-3 tetes larutan Kristal violet pada apusan, biarkan selama 1-2
menit
- Cuci kelebihan warna dengan air mengalir lalu keringkan
- Teteskan larutan Iodin sebanyak 2-3 tetes pada apusan dan biarkan selama
1-2 menit
- Cuci kelebihan Iodin dengan air mengalir lalu keringkan
- Teteskan alkohol-HCl atau alkohol 95% kemudian biarkan selama 30 detik
- Bilas dengan air mengalir lalu keringkan
- Teteskan larutan Safranin pada apusan dan biarkan selama 45 detik
- Bilas kelebihan Safranin dengan air mengalir lalu biarkan kering
- Tiriskan obyek gelas sediaan yang telah diberi cat warna sebelumnya,
keringkan dengan kertas saring atau tissu tanpa menggosok permukaan
yang diwarnai, amati menggunakan mikroskop pada perbesaran 100 kali
(100x) yang sebelumnya preparat telah ditambahkan setetes minyak
emersi
c. Interpretasi Hasil :
Escherichia coli dinyatakan positif dalam produk bila hasil uji IMVIC sebagai berikut :
Indol : Positif (+)
Metal Merah : Positif (+)
VP : Negatif ( - )
Sitrat : Negatif ( - )
d. Pelaporan
Catat semua hasil pengamatan dan buat laporan dalam Lembar Pelaporan Hasil
Praktikum

1. Pengecatan sederhana
- Diambil 1 ose suspensi bakteri Staphylococcus aureus, ditaruh pada objek glass.
- Diratakan dengan deg glass.
- Difiksasi di atas lampu spiritus.
- Ditetesi metilen biru sebanyak 1-2 tetes, dibiarkan selama 1-2 menit.
- Dicuci dengan air mengalir, sisa air dikeringkan dengan kertas isap.
- Diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x.
- Digambar bentuk morfologinya.
- Diulangi cara yang sama untuk bakteri Bacillus substilis.
2. Pengecatan negatif
 Diletakkan setetes nigrosin pada ujung objek glass.
 Dimasukkan inokulum bakteri Staphylococcus epidermidis dari 1 ose ke dalam nigrosin,
dicampurkan.
 Diambil deg glass lalu diletakkan, autoklaf, inkubator
di sebelah luar nigrosin dengan posisi miring (30°).
 Deg glass digeser secara perlahan-lahan hingga membentuk lapisan tipis.
 Diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x.
 Digambar bentuk morfologinya.
 Diulangi cara yang sama untuk bakteri Escherichia coli.

34
 Lembar Pelaporan Hasil Praktikum

Nama : ..................... Nilai : .....................

NIM : ..................... Asisten : .....................
Tgl Praktikum : .....................

ACC, Tanggal : Tanda Tangan Asisten :

35
ACC, Tanggal : Tanda Tangan Asisten :

36
37
38