PROSEDUR/

METODE
ANALISIS

Parameter Pertumbuhan dan Hasil | Parameter Anatomi

Parameter Fisiologi | Parameter Biokimia

Departemen Budidaya Pertanian

Fakultas Pertanian
Universitas Gadjah Mada
 DAFTAR ISI

Parameter Pertumbuhan
1. Luas daun
2. Luas permukaan akar
3. Bobot daun spesifik/Specific leaf weight (SLW)
4. Laju asimilasi bersih/Net assimilation rate (NAR)
5. Indeks luas daun/Leaf area index (LAI)
6. Laju pertumbuhan tanaman/Crop growth rate (CGR)
7. Indeks panen/Harvest index (HI)

Parameter Anatomi
Pembuatan kaca preparat

Parameter Fisiologi
1. Klorofil dan Karoten
2. Prolin
3. Potensial Air Daun
4. Kandungan Air Nisbi
5. Transpirasi (metode cobalt chloride)
6. Laju Fotosintesis (metode BTB)

Parameter Biokimia
1. Aktivitas Nitrat Reduktase
2. Superoksida
3. H2O2
4. Superoksida Dismutase
5. Malondialdehide
6. Peroksidase
7. Fenol Total
8. Asam Absisat
9. Relative electrolyte leakage
 Parameter
Pertumbuhan
1. Luas Daun
Perhitungan luas daun dapat menggunakan leaf area meter delta-T. Leaf
area meter bekerja dengan menggunakan metode scanner sehingga daun ditata
diatas kaca kemudian dilewatkan diatas scanner agar daun dapat tergambar dan
luas daun dapat diukur. Angka yang tertera pada monitor merupakan ukuran luas
daun dengan satuan centimeter persegi (cm 2).

2. Luas Permukaan Akar

Pengukuran dengan metode proyeksi dilakukan pada akar tanaman dengan
menggunakan alat Image Analysis System yang terintegrasi dengan software
WinDIAS. Siapkan sampel akar yang akar diukur. Sampel akar yang digunakan
adalah akar yang telah dibersihkan dan telah dikeringkan. Jalankan program
WinDIAS 3 version 3.2.1 pada komputer sehingga muncul tampilan menu untuk
mempersiapkan pengambilan gambar. Pastikan bahwa kamera terhubung dengan
komputer dan penutup kamera dalam posisi terbuka dengan pencahayaan yang
diatur sesuai dengan kebutuhan (tidak terlalu terang ataupun terlalu gelap). Kalibrasi
alat tersebut dengan meletakkan penggaris di atas layar pengambilan gambar,
kemudian klik “grab” dan pilih ikon penggaris. Tarik titik penggaris dari 0 sampai 8
cm, kemudian isikan di “value” angka 80 dan “unit” diisi dengan angka mm. setelah
proses kalibrasi selesai, klik tombol “video” untuk mengembalikan posisi kamera ke
mode video. Sampel akar yang sudah disiapkan tadi kemudian diletakkan di atas
meja scanner dengan rapi dan tidak saling menumpuk, posisi dan kedudukan tombol
pada “video”, kemudian pilih tombol “grab” dan blok warna sesuai dengan area yang
akan diukur panjangnya. Klik tombol “measure” untuk mendapatkan angka panjang
akar total dari sampel secara otomatis. Simpan data yang ada dan diberi nama
sesuai dengan kebutuhan. Nilai panjang yang dihasilkan dapat dilihat pada kolom
“length” dari hasil penyimpanan (Webb, 2012).

3. Bobot daun spesifik/Specific leaf weight (SLW)

Bobot daun spesifik menunjukkan kemampuan tanaman dalam menghasilkan
ketebalan daun per satuan luas daun. Bobot daun spesifik diukur menggunakan
persamaan menurut Gardner et al. (1985), sebagai berikut:
 𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑒𝑔𝑎𝑟 𝑑𝑎𝑢𝑛
𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑑𝑎𝑢𝑛 𝑠𝑝𝑒𝑠𝑖𝑓𝑖𝑘 =
𝐿𝑢𝑎𝑠 𝑑𝑎𝑢𝑛
Bobot daun spesfik dinyatakan dalam satuan g/cm 2

4. Laju asimilasi bersih/Net assimilation rate (NAR)

Laju asimilasi bersih menunjukkan kemampuan tanaman menghasilkan berat kering
hasil asimilasi per satuan luas daun per satuan waktu. Laju asmilasi bersih dihitung
menggunakan persamaan menurut Gardner et al. (1985), sebagai berikut:
𝑊2 − 𝑊1 𝑙𝑛𝐿𝑑2 − 𝑙𝑛𝐿𝑑1
𝐿𝑎𝑗𝑢 𝑎𝑠𝑖𝑚𝑖𝑙𝑎𝑠𝑖 𝑏𝑒𝑟𝑠𝑖ℎ = ×
𝑡2 − 𝑡1 𝐿𝑑2 − 𝐿𝑑1
Keterangan:
W2 = Berat total pada waktu t2
W1 = Berat total pada waktu t1
t1 = Waktu panen awal
t2 = Waktu panen akhir
Ld2 = Luas daun pada waktu t2
Ld1 = Luas daun pada waktu t1
Laju asimilasi bersih dinyatakan dalam satuan g/cm 2/minggu

5. Indeks luas daun/Leaf area index (LAI)

Indeks luas daun merupakan gambaran tentang rasio permukaan daun terhadap
luas tanah yang ditempati tumbuh oleh tanaman. Indeks luas daun dihitung
menggunakan persamaan menurut Gardner et al. (1985), sebagai berikut:
𝐿𝑢𝑎𝑠 𝑑𝑎𝑢𝑛
𝐼𝑛𝑑𝑒𝑘𝑠 𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑑𝑎𝑢𝑛 =
𝐿𝑢𝑎𝑠 𝑡𝑎𝑛𝑎ℎ 𝑑𝑖 𝑏𝑎𝑤𝑎ℎ 𝑘𝑎𝑛𝑜𝑝𝑖

6. Laju pertumbuhan tanaman/Crop growth rate (CGR)

Laju pertumbuhan tanaman menunjukkan pertambahan bobot dalam komunitas
tanaman per satuan luas tanah dalam satu satuan waktu. Laju pertumbuhan
tanaman dihitung menggunakan persamaan menurut Gardner et al. (1985), sebagai
berikut:
1 𝑊2 − 𝑊1
𝐿𝑎𝑗𝑢 𝑝𝑒𝑟𝑡𝑢𝑚𝑏𝑢ℎ𝑎𝑛 𝑡𝑎𝑛𝑎𝑚𝑎𝑛 = ×
𝐿𝑡 𝑡2 − 𝑡1
 Keterangan:
W2 = Berat total pada waktu t2
W1 = Berat total pada waktu t1
t1 = Waktu panen awal
t2 = Waktu panen akhir
Lt = Luas tanah
Laju pertumbuhan tanaman dinyatakan dalam satuan kg/m 2/minggu.

7. Indeks panen/Harvest index (HI)

Indeks panen menunjukkan distribusi bahan kering dalam tanaman yang
menunjukkan perimbangan bobot bahan kering yang bernilai ekonomis dengan total
bobot bahan kering tanaman pada saat panen. Indeks panen dihitung menggunakan
persamaan menurut Gardner et al. (1985), sebagai berikut:
𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑘𝑒𝑟𝑖𝑛𝑔 𝑢𝑚𝑏𝑖
𝐼𝑛𝑑𝑒𝑘𝑠 𝑝𝑎𝑛𝑒𝑛 =
𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑘𝑒𝑟𝑖𝑛𝑔 𝑎𝑘𝑎𝑟 + 𝑢𝑚𝑏𝑖 + 𝑏𝑟𝑎𝑛𝑔𝑘𝑎𝑠𝑎𝑛
Parameter
Anatomi
 Karakterisasi anatomi dilakukan dengan membuat preparat menggunakan organ
akar dan daun dengan disayat secara melintang dan membujur. Preparat tersebut dibuat
dengan metode embedding paraffin. Adapun tahapan pembuatan preparat untuk masing-
masing sampel adalah sebagai berikut:
1. Persiapan alat, bahan dan organ bibit yang digunakan
Alat dan bahan yang digunakan dalam pembuatan preparat meliputi silet atau
scalpet tajam, larutan untuk fiksasi, dan organ bibit (akar dan daun).
2. Hari pertama (Fiksasi)
Fiksasi bertujuan untuk menghentikan segala proses kehidupan organ tanpa
merusak struktur dan organel sel. Fiksasi dilakukan dengan cara memasukkan organ
bibit ke dalam larutan formalin acetic acid-alcohol (FAA) yang terdiri dari campuran
formalin (5 bagian), asam asetat glasial (5 bagian) dan alkohol 70 % (90 bagian),
kemudian didiamkan selama 24 jam.
3. Hari kedua (Pencucian dan dehidrasi)
Sayatan organ bibit yang telah difiksasi selama 24 jam didehidrasi terlebih dahulu
sebelum ditempelkan pada gelas benda. Fiksatif dibuang lalu diganti berturut-turut
dengan alkohol 70 % (30 menit), alkohol 80 % (30 menit), alkohol 90 % (30 menit),
alkohol 100 % (30 menit), dan alkohol 100% (30 menit). Selanjutnya dilakukan
dealkoholisasi menggunakan alkohol / xicol 3 : 1 (30 menit), alkohol / xicol 1 : 1 (30
menit), alkohol/ xicol 1 : 3 (30 menit), xicol 30 menit dan xicol 30 menit. Setelah
dealkoholisasi kemudian dilakukan dehidrasi dengan menggunakan campuran xicol /
paraffin 1 : 9 dengan temperatur 570 C selama 24 jam.
4. Hari ketiga (Infiltrasi)
Campuran xicol / paraffin 1 : 9 pada perlakuan dehidrasi dibuang dan kemudian
diganti dengan paraffin murni pada temperatur tetap 570 C selama 24 jam.
5. Hari keempat (Penyelubungan / embedding)
Paraffin yang digunakan pada tahap infiltrasi dibuang dan diganti dengan paraffin
murni yang baru dan didiamkan selama 1 jam.
6. Hari kelima (Pengirisan)
Setelah penyelubungan, sampel organ kemudian diiris dengan menggunakan
Rotary microtome dengan ketebalan 6 – 12 µm (mikronmeter). Irisan tersebut kemudian
direkatkan pada gelas benda dengan campuran Gliserin : Albumin yang dibubuhi air.
 Kemudian gelas benda diletakkan diatas Hot plate dengan temperatur 450 C sampai
pita paraffin merenggang.
7. Hari keenam (Pewarnaan)
Pewarnaan dilakukan dengan menggunakan Safranin 1% dalam alkohol 70% dan
fast green 1% dalam alkohol 95%. Kemudian gelas benda berturut-turut dimasukkan ke
dalam xicol (3 menit), xicol (3 menit), alkohol / xicol 1 : 3 (3 menit), alkohol / xicol 1 : 1
(3 menit), alkohol / xicol 3 : 1 (3 menit), alkohol 100% (3 menit), alkohol 100% (3 menit),
alkohol 95% (3 menit), alkohol 80 % (3 menit), alkohol 70% (3 menit), safranin 1% dalam
alkohol 70% (1 jam), alkohol 70% (1 menit), alkohol 80% (1 menit), alkohol 95% (1
menit), fast green 1% dalam alkohol 95% (30 detik), alkohol 100% (1 menit), alkohol
100% (1 menit), alkohol / xicol 3 : 1 (1 menit), alkohol / xicol 1 : 1 (1 menit), alkohol /
xicol 1 : 3 (1 menit), xicol (1 menit) dan xicol (1 menit).
8. Penutupan
Irisan yang diletakkan pada gelas benda kemudian ditutup dengan gelas penutup
yang telah diberi Balsam Kanada terlebih dahulu. Preparat dikeringkan diatas Hot plate
pada temperatur 450 C hingga Balsam Kanada kering.
9. Pemberian nama preparat
Preparat yang telah ditempel sayatan melintang dan membujur selanjutnya diberi
label dan diletakkan disebelah kiri sayatan. Label tersebut berisi keterangan nama
spesies, organ dan penampang. Preparat yang berisi sayatan melintang dan membujur
organ vegetative tersebut kemudian diamati di bawah mikroskop binokuler dengan
perbesaran 10xdan 40x untuk dianalisis struktur anatominya. Hasil pengamatan
preparat kemudian didokumentasikan dengan Optilab, kemudian dihitung ukuran
panjang, lebar atau diameter masing-masing selnya dengan menggunakan aplikasi
Image raster 2dan jumlah sel dengan menggunakan aplikasi counter.
Parameter
Fisiologi
1. Klorofil dan Karotenoid
Alat Bahan
Tabung Reaksi Sampel Daun
Beaker glass 50 ml Acetone 80%
Mortar Kertas Saring
Spektrofotmeter
Kuvet kaca

Langkah Kerja

a. Menumbuk 1 gram daun dengan mortar

b. Menuangkan 20 ml aseton 80 %
c. Campuran aseton dan tumbukan daun disaring dengan kertas saring yang
diletakkan di dalam corong yang dimasukkan ke dalam beaker glass 50 ml.
d. Masukkan ekstrak kedalam tabung reaksi kemudian menutupnya dengan plastik
untuk mencegah penguapan aceton
e. Menyalakan Spektrofotometer dinyalakan, didiamkan selama 15 menit.
f. Menuangkan 3 ml aseton 80 % ke dalam cuvet sebagai perlakuan blangklo.
g. Menuangkan 3 ml larutan pigmen ke dalam cuvet yang lain, dicatat absorbansinya
dengan panjang gelombang 645 m (klorofil a) dan 663 m (klorofil b) dan 470 m
(karotenoid).
h. Menghitung kadar klorofil dengan rumus sebagai berikut:
Kadar klorofil a = 0,0127 A663 - 0.00269 A645
Kadar klorofil b = 0,0229 A645 - 0.00468 A663
Total klorofil a+b = 0,0202 A645 + 0,00802 A663
A645 = absorbansi pada panjang gelombang 645 m
A663 = absorbansi pada panjang gelombang 663 m
A470 = absorbansi pada panjang gelombang 470 m

Kadar Karotenoid = A470 + (0,144 A663 – 0.638 A645)

2. Prolin
Alat Bahan
Tabung Reaksi Sampel tanaman
Waterbath Asam Sulfosalisilat
Vortex Asam Nihidrin
Spektrofotometer Asetat Glasial
Pipet Toluene
Mortar Air Es/Air dingin

Langkah Kerja
a. Daun sebanyak 0.5 g dihaluskan dengan mortar
b. Menambahkan larutan asam sulfosalisilat 3% sebanyak 10 ml. Hasil tumbukan
disaring dengan kertas saring
c. Filtrat yang didapatkan diambil sebanyak 2 ml kemudian direaksikan dengan
menambahkan Asam Nihidrin sebanyak 2 ml dan asetat glasial sebanyak 2 ml
didalam tabung reaksi
d. Campuran filtrate kemudian diinkubasi pada suhu suhu 100oC selama 1 jam. Reaksi
diakhiri dengan memasukkan tabung reaksi ke dalam beaker glass berisi es.
e. Campuran diekstrak dengan 4 ml toluen kemudian digojok dengan vortex selama 15-
20 detik.
f. Menunggu beberapa saat hingga campuran terpisah.
g. Toluen warna merah yang mengandung prolin di bagian atas disedot dengan pipet.
h. Absorban larutan dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm,
dengan blanko berupa toluene.
i. Kandungan Prolin dihitung menggunaan rumus
Prolin (µmol prolin g-1) = 64,3649 x hasil bacaan absorbansi + (-5,2967) x 0,347.
3. Potensial Air
Alat Bahan
Water bomb sholander Nitogen
Sampel daun/batang tanaman

Potensial air (Ψw) diukur menggunakan alat water bomb sholander, prinsip kerjanya
adalah dengan memberikan tekanan gas nitrogen kepada organ tanaman yang terlebih
dahulu dimasukkan ke dalam alat dengan menyisakan sedikit bagian pelepah di bagian
luar alat. Potensial air ditentukan dengan melihat bagian daun yang berada diluar alat
(melihat batang daun yang dijepit menggunakan rubber seal), jika air telah keluar dari
batang tersebut, maka tekanan gas dihentikan dan dicatat jumlah tekanan yang diberikan
sebagai potensial air daun. Potensial air daun dinyatakan dengan satuan Mega pascal
(Mpa).
Klasifikasi cekaman kekeringan berdasarkan nilai potensial air daun:
a. Cekaman ringan, yaitu jika potensial air daun menurun 0.1 MPa atau kandungan air
nisbi menurun 8-10 %
b. Cekaman sedang, jika potensial air daun menurun 1.2 s/d 1.5 MPa atau kandungan
air nisbi menurun 10-20 %
c. Cekaman berat, jika potensial air daun menurun > 1.5 MPa atau kandungan air nisbi
menurun >20%
d. Apabila tanaman kehilangan lebih dari 50% air jaringannya dapat dikatakan bahwa
tanaman mengalami kekeringan
4. Kandungan air nisbi
Kadar air nisbi (KAN) adalah suatu ukuran yang menunjukkan kandungan
air rata-rata yang terdapat pada suatu organ tanaman misalnya daun. Faktor yang
mempengaruhi kadar air nisbi adalah suhu atau temperatur udara, kelembaban
udara, radiasi matahari, dan kadar lengas.

Alat Bahan
Timbangan Sampel daun segar
Oven Plastik
Aquadest

Langkah Kerja:
a. Mengambil sampel daun segar dan kemudian ditimbang (bs)
b. Memasukkan daun kedalam plastik, kemudian merendamnya didalam aquades
selama 48 jam untuk mendapatkan bobot turgid (bt) kemudian ditimbang.
c. Mengeringkan daun dengan oven sampai bobot konstan sebagai bobot kering
(bk). Perhitungan kadar air nisbi mengggunakan rumus:
𝑏𝑠−𝑏𝑘
KAN = [ ] x 100%
𝑏𝑡−𝑏𝑘

Keterangan :
bs = bobot segar
bk = bobot kering
bt = bobot turgid
5. Laju Transpirasi
Laju transpirasi banyak ditentukan oleh membuka dan menutupnya stomata yang juga
dipengaruhi oleh turgor pada sel penutup.
Alat Bahan
Penjepit Kertas Kertas cobalt chloride
Timer Sampel daun/batang tanaman
Mika Transparan
Langkah Kerja
e. Menyiapkan cobalt chloride, dan memastikan pada saat sebelum pengamatan kertas
berwarna biru
f. Meletakan kertas cobalt chloride pada bagian bawah daun menutupi stomata,
kemudian mika transparan ukuran 3 x 3 cm diletakkan di bawah kertas kobalt klorid.
g. Untuk memperkuat, pada bagian bawah daun dijepit dengan penjepit kertas.
h. Menunggu perubahan warna kertas kobalt klorid dari biru menjadi merah muda
selanjutnya dicatat waktunya.
i. Rentang waktu tersebut menggambarkan kecepatan transpirasi tanaman. Nilai waktu
kemudian diubah menjadi unit kehilangan air (Bailey et al.,1951). Selanjutnya
dilakukan perhitungan menggunakan rumus sebagai berikut:
Laju transpirasi = 1/L x 60/T x cf (mg/jam/cm 2)
Keterangan :
T = Waktu yang diperlukan untuk perubahan warna kertas kobalt klorid (menit)
L = Luas kertas kobalt klorid (cm 2)
cf = Faktor kalibrasi, yaitu kenaikan berat dalam mg dari 1 cm 2 kertas kobalt
klorid yang mengalami perubahan warna (0.38 mg/cm 2)
cf = L x 0.38 mg/cm2 (mg)
 7. Laju Fotosintesis
Alat Bahan
Tabung reaksi/venotube BTB (Bromthymol Blue)
Suntikan Sodium Bikarbonat (Na2CO3)
Spektrofotometer Aquadest
Plastik
Langkah Kerja
1. BTB sebanyak 0.01 gram dimasukan kedalam labu takar dan ditambahkan 2 gram
sodium bikarbonat dan akuades hingga mencapai tanda tera (1 liter)
2. Kurva standard dibuat menggunakan 4 tabung reaksi yang bertutup karet lunak.
Masing-masing tabung diisi dengan larutan BTB 10 ml. Gas CO2 sebanyak 0 ml, 0,1
ml, 0,2 ml, 0,3 ml, dan 0,4 ml ditambahkan kedalam tabung dan digojog selama 1-2
menit. Semua tabung diukur transmitansinya menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelobang 615 nm. Kemudian dibuat gambar kurva standar hubungan antara
transmitansi degnan kadar CO2.
3. Pengukuran laju fotosintesis dilakukan dengan menyungkup daun tanaman, dan
didiamkan kurang lebih 3 jam.
4. Gas yang ada dalam sungkup kemudian diambil menggunakan suntukan sebanyak
10 ml dan dimasukan kedalam 10 ml BTB (1:1), dan digojog selama 1-2 menit.
5. Transmitansi larutan BTB diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelobang
615 nm. Banyaknya CO2 dihitung dengan menggunakan kurva standar hubungan
antara kadar CO2 dengan transmitansi.
6. Tingkat respirasi dihitung dengan menggunakan rumus:
𝑿. 𝑩𝑴 𝑪𝑶𝟐. 𝑽𝒂𝒔
𝑳𝒂𝒋𝒖 𝒇𝒐𝒕𝒐𝒔𝒊𝒏𝒕𝒆𝒔𝒊𝒔 (
𝑩𝒆𝒓𝒂𝒕 𝑪𝑶𝟐.𝑳𝑫. 𝑾𝒂𝒌𝒕𝒖
Keterangan:
X = Konsentrasi CO 2 (%) y = ax + b
Y = Transmitansi (hasil pembacaan dari spektrofotometer)
A = Konstanta dari regresi linier
B = koefisien dari regresi linier
BM CO2= berat molekul CO 2 (44,01)
Vas = Volume air space (ml)
Berat CO2= 24 gram (suhu tertentu)
LD = luas daun yang disungkup (dm2)
Waktu = waktu yang dibutuhkan untuk menyungkup (jam)
Parameter
Biokimia
1. Aktivitas Nitrat Reduktase
Alat Bahan
Tabung reaksi Buffer fosfat 0.1 M Ph 7.0
Mikropipet Sodium nitrat (NaNO3) 5 M
Timbangan Napthyl Etyline Diamine (NED) 0.02%
Pisau/gunting Sulfanilaminde (SA) 1%
Flakon Aquades
Spektrofotometer 3 N HCl

Langkah Kerja
a. Bahan berupa organ daun tanaman yakni helaian daun tanpa tulang sebanyak 200
mg (0,2 g) dipotong tipis-tipis (1 mm)
b. Disiapkan tabung gelap yang berisi 5 ml larutan buffer fosfat 0,1 M pH 7 (campuran
NaH2PO4 0,1 M dan Na2HPO4 0,1 M).
c. Potongan daun dimasukkan ke dalam tabung gelap tersebut dan didiamkan selama
24 jam. Setelah 24 jam, buffer diganti dengan 5 mL buffer baru.
d. Menambahkan 0,1 ml NaNO3 5 M dan dicatat waktunya sebagai awal inkubasi selama
2 jam.
e. Menyiapkan reagen pewarna dalam tabung reaksi yang terdiri dari 0,2 mL
sulphanilamide 1% dalam 3 N HCl dan 0,2 mL larutan Naphthylenediamine 0,02%.
f. Setelah 2 jam, sebanyak 0,1 mL cairan inkubasi dari tabung gelap dimasukkan ke
dalam reagen pewarna. Kemudian ditunggu sampai berwarna merah muda sebagai
tanda telah terjadi reduksi nitrat menjadi nitrit oleh enzim nitrat reduktase atau
minimum 15 menit lalu ditambahkan 2,5 ml aquades.
g. Larutan dibaca absorbansinya dengan Spectrophotometer pada panjang gelombang
540 nm. Tingkat aktivitas nitrat reduktase (ANR) dinyatakan dalam jumlah mikromol
NO2-/gram/jam dengan rumus:
As 1000 1 500
ANR = x x x mikromol/NO2-/jam
A0 B T 1000
Keterangan:
As: nilai absorbansi larutan sampel B: berat segar daun sample (300 mg)
Ao: nilai absorbansi standar (0,0106 atau 0,0142) T: waktu inkubasi
2. ROS: Kandungan superoksida (O2-)
Alat Bahan
Mortar Nitogen Cair
Tabung reaksi buffer fosfat 50 mM pH 7,8 yang
Water bath mengandung 0,05% NBT dan 10 mM
Spektrofotometer NaN2
kuvet

Langkah Keja
a. Menimbang sampel daun/jaringan yang akan dianalisis seberat 0.5 gram
b. Menambahkan 7 ml larutan buffer fosfat 50 mM pH 7,8 yang mengandung
0,05% NBT dan 10 mM NaN2
c. Menginkubasi ekstrak dalam dalam ruangan gelap selama 1 jam.
d. Mengambil 2 ml larutan dan dipanaskan dalam water bath dengan suhu 850C
selama 10 menit
e. Mendinginkan dalam ice bath selama 5 menit.
f. Nilai absorbansi diukur pada panjang gelombang 580 nm menggunakan
spektrofotometer
3. ROS: Hidrogen Peroksida (H2O2)
Alat Bahan
Centrifuge tube Nitrogen cair
Timbangan TCA 0,1% (w/v)
Centrifuge 100 mM buffer potasium fosfat
Spektrofotometer kalium iodida (KI) (1 M KI w/ dalam H2O)

Langkah Kerja
a. Menimbang sampel tanaman seberat 0.5 gram
b. Menggerus sampel dengan menggunakan nitrogen cair
c. Memasukan sampel kedalam centrifuge tube, kemudian menambahkan 5 ml 0,1%
(w/v) asam trikloroasetat (TCA)
d. Menghomogenisasi menggunakan centrifuge pada kecepatan 15.000 rpm selama
10 menit
e. Mengambil 0,5 mL supernatan dimasukkan ke tabung reaksi dan menambahkan 0,5
mL 100 mM buffer potasium fosfat dan 2 mL reagen kalium iodida (KI) (1 M KI w/
dalam H2O).
f. Menginkubasi campuran supernatant selama satu jam di tempat gelap
g. Melakukan pembacaan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang
390 nm. Sebagai blangko digunkan 0,1% TCA
h. Kandungan H2O2 dihitung menggunakan persamaan dari kurva standar H2O2 yang
diketahui konsentrasinya. Kurva standar ditentukan dengan cara menyiapkan H2O2
murni dalam berbagai konsentrasi. Disiapkan larutan stok H2O2 1000 ppm kemudian
diencerkan menjadi beberapa konsentrasi tertentu lalu dibaca absorbansinya
menggunakan Spectronic 21D pada panjang gelombang 390 nm.
4. Antioksidan Enzimatik: Superoksida Dismutase (SOD) (metode: Marklund, 1974)
Alat Bahan
Centrifuge tube Nitogen Cair
Centrifuge buffer fosfat pH 6.5
Timbangan Tris-HCl buffer pH 8,2
Mortar 1 mM 25 EDTA
Microtube (jika dibutuhkan) 0,2 mM pirogalol
Spektrofotometer
Micropipet

Langkah Kerja
a. Menimbang sampel seberat 0.5 gram
b. Menggerus sampel menggunakan nitrogen cair kemudian dimasukkan kedalam
centritube
c. Menambahkan buffer fosfat pH 6.5 kedalam centritube, kemudian melakukan
sentrifugasi pada kecepatan 15.000 rpm selama 10 menit
d. Mengambil supernatant sebanyak 0.5 ml, kemudian menambahkan 50 mM Tris-HCl
buffer pH 8,2 dengan 1 mM 25 EDTA digunakan sebagai media reaksi
e. Mencampurkan 100 µl 0,2 mM pirogalol (dilarutkan dalam 50 mM PPB pH 6,5) untuk
memulai reaksi
f. Penurunan absorbansi pyrogallol dipantau di 420 nm
g. Pengujian SOD dilakukan pada akhir pengamatan. Perhitungan untuk mendapatkan
nilai kandungan SOD adalah sebagai berikut :

Persentase penghambatan = (ΔA420nm /min Uninhibited – ΔA420nm /min Inhibited) (100)

(ΔA420nm /min Uninhibited – ΔA420nm /min Blanko)

Unit/ml Enzim = Persen Pengahambatan (Faktor Pengencer)

(50%) (0.1)
Antioksidan Enzimatik: Superoksida Dismutase (SOD)

Alat Bahan
Centritube Nitrogen Cair
Centrifuge Sampel/Organ tanaman
Timbangan Buffer fosfat pH 6.5
Mortar Tris EDTA pH 8.2
Microtube (jika dibutuhkan) Pyrogallol 2mM
Micropipet
Spektrofotometer

Langkah Kerja

a. Menimbang sampel seberat 0.5 gram

b. Menggerus sampel menggunakan nitrogen cair kemudian dimasukkan kedalam
centritube
c. Menambahkan buffer fosfat pH 6.5 kedalam centritube, kemudian melakukan
sentrifugasi pada kecepatan 15.000 rpm selama 10 menit
d. Mengambil buffer fosfat pH 6.5 (dalam keadaan dingin) 0.2 ml, kemudian
menambahkan 1 ml Tris-EDTA buffer pH 8,2
e. Memasukkan sample/supernatant sebanyak 0.1 mL setiap akan diukur absrobansinya
f. Memasukan pyrogallol 2mM sebanyak 10 mikro mili
g. Mengukur absorbansi pada panjang gelombang 420 selama 1.5 menit
h. Blanko dibuat dengan mencapurkan 1 ml Tris EDTA + 0.2 ml buffer fosfat
i. Pengujian SOD dilakukan pada akhir pengamatan. Perhitungan untuk mendapatkan
nilai kandungan SOD adalah sebagai berikut :

Persentase penghambatan = (ΔA420nm /min Uninhibited – ΔA420nm /min Inhibited) (100)

(ΔA420nm /min Uninhibited – ΔA420nm /min Blanko)

Unit/ml Enzim = Persen Pengahambatan (Faktor Pengencer)

(50%) (0.1)
5. Kandungan Malondialdehide (MDA)
MDA (peroksidasi lipid) merupakan senyawa reaktif yang terbentuk secara alami dan
merupakan penanda stres oksidatif
Alat Bahan
Centritube Nitrogen Cair
Centrifuge Sampel/Organ tanaman
Timbangan TCA 0,1% (w/v)
Mortar TBA 0,5% dalam TCA 20%
Microtube (jika dibutuhkan) Air Es
Spektrofotometer
Micropipet

Langkah Kerja
a. Menimbang sampel tanaman sebanyak 1 gram
b. Menggerus sampel tanaman menggunakan nitrogen cair kemudian
memasukannya kedalam centritube
c. Menambahkan 2 ml larutan asam trikloroasetat (TCA) 0,1% (w/v).
d. Diambil 1,5 ml larutan disentrifugasi pada 15.000g selama 10 menit.
e. Diambil 0,5 ml supernatan ditambahkan ke 1,5 ml asam tiobarbiturat (TBA) 0,5%
dalam TCA 20%.
f. Campuran dikocok lalu diikubasi di dalam water bath dengan suhu 90oC selama
20 menit. Tabung reaksi dimasukkan ke dalam gelas beaker yang berisi es.
g. Setelah dingin, disentrifugasi pada 10.000g selama 5 menit.
h. Supernatan dimasukkan ke kuvet lalu diukur absorbansinya dengan Spectronic
21D pada panjang gelombang 532 nm dan pada 600 nm. MDA dihitung
menggunakan koefisien absorbsi 155 mM-1cm -1. Sebagai blangko adalah TCA
0,1%
i. Kandungan MDA dihitung dengan rumus :
((selisih absorban 532 dan 600 nm)/155 mM -1cm -1 x 106
Berat segar daun
6. Antioksidan Enzimatik: Kandungan Peroksidase (POD) (metode: Sigma Aldrich)
Alat Bahan
Centrifuge Nitrogen Cair
Centritube Buffer fosfat pH 7
Micropipet H2O2
Spektrofotometer pyrogallol

Langkah Kerja
a. Menimbang sampel tanaman seberat 0.5 gram
b. Menggerus sampel tanaman menggunakan nitrogen cair kemudian
memasukkannya kedalam centritube
c. Menambahkan 1.5 ml Buffer fosfat pH 7, mendiamkannya selama beberapa
menit
d. Mengambil ekstrak sebanyak sebanyak 0,1 ml kemudian menambahkan larutan
H2O2 ke dalam ekstrak
e. Menambahkan pyrogallol kedalam ekstrak
f. Mengukur perubahan absorbansi menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 420 nm selama 1,5 menit setiap 20 detik.
g. Perhitungan kandungan enzim POD adalah sebagai berikut :
Peroksidase (POD) = ΔA420nm/20 sec Sample - ΔA420nm/20 sec Blangko (3) (FP)
(12) (10)
Antioksidan enzimatik: Peroksidase (POD)

Alat Bahan
Centrifuge Nitrogen Cair
Centritube Buffer fosfat pH 7
Micropipet H2O2
Spektrofotometer Pyrogallol
Aquabidest
Buffer potassium fosfat pH 6

Langkah Kerja
a. Menimbang sampel tanaman seberat 0.5 gram
b. Menggerus sampel tanaman menggunakan nitrogen cair kemudian
memasukkannya kedalam centritube
c. Menambahkan 0.5 ml Buffer fosfat pH 7, mendiamkannya selama beberapa
menit/di centrifuge
d. Mengambil ekstrak sebanyak sebanyak 0,1 ml kemudian menambahkan larutan
H2O2 sebanyak 0.08 mL, aquabisest 1 ml, dan potassium fosfat buffer pH 6
e. Menambahkan pyrogallol sebanyak 0.16 ml
f. Mengukur perubahan absorbansi menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 420 nm selama 1,5 menit setiap 30 detik
g. Perhitungan kandungan enzim POD adalah sebagai berikut :
Peroksidase (POD) = ΔA420nm/20 sec Sample - ΔA420nm/20 sec Blangko (3) (FP)
(12) (10)
7. Fenolik total (antioksidan non enzimatik)
Senyawa phenolic beraksi sebagai agen pereduksi, penangkap radikal bebas,
pemberi hidrogen, peredam singlet oxygen, dan potensial sebagai pengkhelat logam.
Alat Bahan
Oven Folin-ciocalteu
Timbangan Na2CO3 7%
Mortar Aquabidest
Spektrofotometer

Langkah Kerja
a. Sampel tanaman dioven selama 48 jam pada suhu 40oC
b. Menimbang sebanyak 50 mg (0,05g), kemudian menghaluskan sampel dengan
mortar lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi
c. Menambahkan 0,4 ml Folin-ciocalteu kemudian dibiarkan selama 5-8 menit
d. Menambahkan 4 ml Na2CO3 7% dan menyaringnya dengan kertas saring
e. Campuran dimasukkan ke dalam labu takar 10 ml lalu menambahkan aqua
bidestilata sampai batas tanda 10 mL, kemudian endiamkan selama 2 jam
f. Ekstrak dimasukkan kedalam kuvet untuk dibaca absorbansinya pada panjang
gelombang 765 nm menggunakan spektrofotometer. Sebagai blangko digunakan
aquabidestilata.
g. Kandungan fenolik total dihitung menggunakan persamaan dari kurva standar
fenolik total yang diketahui konsentrasinya. Kurva standar fenolik total ditentukan
dengan cara disiapkan fenol murni sebagai standar dalam berbagai konsentrasi.
Disiapkan larutan stok fenol 1000 ppm kemudian diencerkan menjadi beberapa
konsentrasi tertentu lalu dibaca absorbansinya dengan spectronic 21D pada panjang
gelombang 765 nm.
8. Fitohormon: Asam Absisat
Alat Bahan
Tabung reaksi Methanol
HPLC H3PO4 (6..8 mM)
BHT
NaHCO3

Penentuan kadar asam absisat pada daun mengikuti prosedur Yokota et al.
(1994). Pada penentuan ini digunakan larutan standar yaitu dengan menimbang 0,002
gram asam absisat dan dimasukkan dalam labu ukur 5 ml, kemudian ditambahkan
dengan eluent sampai tanda. Standar stok adalah 40 ppm dari larutan standar ini
kemudian dibuat campuran baku asam absisat dengan konsentrasi 12.5 ; 25; 50; 100;
250, dan 1000 ppm. Daun yang diukur kandunga asam absisatnya ditimbang kira-kira 1
gram kemudian di potong-potong halus. Setelah dipotong halus kemudian ditambahkan
25 ml methanol yang telah dicampur dengan 6.8 mM H3PO4 dengan perbandingan 50:50.
Pada methanol dilarutkan 25 mg BHT/500 ml. pH dicek dan ditetapkan menjadi 8.5
dengan menambahkan 1 M NaHCO 3. Larutan dirotavor pada suhu 350 0C sehingga
tinggal fase cair. Fase larutan dimurnikan dengan kolom seppak C18, kemudian
ditambahkan menjadi 10 atau 25 ml dengan fase gerak dan disaring dengan millex 0.45
mikromol. Larutan siap diinjeksikan ke HPLC.
9. Relative electrolyte leakage (REL)
Langkah Kerja
a. Jaringan daun diiris setebal 5,0 ±0,2 mm, diletakkan di tabung glas (Opticlear;
KIMBLE, Vineland, New Jersey, USA) berisi 10 mL air deionized.
b. Gelas tabung disumbat dan disimpan dalam ruangan dengan temperatur (25ºC)
selama 15 menit. Electrical conductivity (EC 0) awal diukur menggunakan
ECmeter.
c. Jaringan daun kemudian diinkubasi pada rak berisi air dengan suhu 100ºC
selama 15 min, dan didinginkan hingga 25ºC kemudian diukur EC akhir (EC 1).
d. Nilai REL kemudian dapat ditentukan dengan perhitungan sebagai berikut :
Electrolyte Leakage (%) = EC 1 X 100 %
EC0