BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Lokasi Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Praklinik, Program Studi
Farmasi, Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat
Alat-alat yang akan digunakan pada penelitian ini adalah cabinet dryer,
grinder, seperangkat peralatan gelas (Herma, Pyrex dan Iwaki), timbangan
analitik (Mettler Toledo), sendok tanduk, spatula, panci, pemanas (heater),
termometer, stopwatch, corong buchner, vakum, rotary evaporator (heidolph),
seperangkat alat destilasi, tanur, krus silikat, desikator, tangki ikan (akuarium),
mikroskop stereo (Olympus), mikroplate-24 sumuran (Iwaki), ruangan berAC
dengan pengontrolan temperatur, spawn trap, pipet pasteur, mikropipet, cawan
porselin, tangas air.

3.2.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun turi yang
diperoleh dari peneliti sebelumnya. Bahan lainnya yakni akuades, 3,4-
dichloroaniline for zebrafish (DCA), yellow tip, blue tip, kertas saring, kertas
saring bebas abu, toluen P, reagen draggendorf, reagen mayer, kloroform, dan
asam sulfat P.

3.2.3 Subjek uji

Subjek uji yang akan digunakan pada penelitian ini adalah embrio ikan
zebra (Danio rerio) dengan bibit ikan yang berasal dari Bogor, Jawa Barat.

17
 18

3.3 Cara Penelitian

3.3.1 Pengajuan ethical clearance
Ethical clearance merupakan bentuk izin etis sebuah penelitian yang
melibatkan manusia atau hewan sebagai subjek dalam sebuah penelitian. Ethical
Clearance pada penelitian ini diajukan kepada Komite Etik Penelitian Kedokteran
dan Kesehatan, Fakultas Kedokteran, Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta.

3.3.2 Pemeliharaan hewan uji

Ikan zebra didapatkan dari toko “Shipa Aquarium” jalan Bina Marga
Baranangsiang, Bogor, Jawa Barat. Ikan dikembangbiakkan di Laboratorium Uji
Praklinik FMIPA UII. Sebelum pengiriman, ikan diberikan makan yang cukup
dan dikemas dalam wadah yang aman untuk ikan. Wadah tersebut diberikan air
dan oksigen yang cukup untuk selama perjalanan. Ikan dikirim menggunakan jasa
pengiriman paket cepat kereta api (Karya Indah Buana atau KIB cepat) dengan
durasi 24 jam. Ikan yang baru datang dimasukkan ke dalam akuarium berisi air
dan aquasafe yang telah disiapkan sehari sebelumnya. Setelah itu dipasang aerator
untuk udara yang diperlukan dalam akuarium tersebut. Suhu ruangan diatur
26±1ºC. Filtrasi air harus diperhatikan dan dipelihara di bawah siklus fotoperiod
(14 jam terang dan 10 jam gelap). Proses adaptasi ikan zebra dilakukan selama
seminggu. Ikan diberi pakan tretamin® flakes sebanyak 2 kali sehari dan artemia
3 kali seminggu sebagai tambahan nutrisi. Ikan zebra yang memenuhi kriteria
inklusi dalam penelitian ini adalah ikan yang berumur 4-7 bulan, dalam kondisi
sehat ditandai dengan gerakan berenang aktif dan secara makroskopis tidak
terdapat kecacatan anatomi tubuhnya. Ikan zebra yang masuk kriteria eksklusi
adalah ikan yang mati atau cacat sebelum percobaan dilakukan.
Pada saat perlakuan, tidak ada hal yang menyakiti ikan zebra yang
digunakan karena ikan hanya digunakan dalam proses breeding sedangkan bagian
ikan yang digunakan untuk penelitian adalah embrionya. Sebelum proses
pengembangbiakkan ikan (breeding), dipilih ikan zebra dengan kriteria sehat saja
sehingga bisa menghasilkan embrio yang fertil. Ikan yang sakit, dikeluarkan dari
penelitian dan tidak akan digunakan dalam penelitian. Setelah breeding, ikan
dikembalikan ke akuarium sebelumnya, sedangkan embrio masuk dalam proses
 19

seleksi untuk uji toksisitas. Embrio yang tidak digunakan dalam penelitian
dibiarkan tumbuh dan berkembang. Jika terdapat bangkai ikan akan dikumpulkan
lalu dibekukan dalam freezer dan dimusnahkan menggunakan insenerator.

3.3.3 Penyiapan bahan uji

Bahan uji berupa daun turi (Sesbania grandiflora (L.) Pers.) kering yang
didapatkan dari penelitian sebelumnya. Daun turi kering tersebut berasal dari
kecamatan Kediri, Lombok Barat, NTB. Daun yang digunakan merupakan daun
yang telah dikeringkan.

3.3.4 Ekstraksi daun turi (Sesbania grandiflora (L.) Pers.)

Daun turi (Sesbania grandiflora (L.) Pers.) yang telah kering diserbukkan
menggunakan miller. Kemudian, ekstrak air daun turi dibuat dengan metode
infundasi, yakni sebanyak 50 gram serbuk simplisia dilarutkan ke dalam panci
dengan akuades 500 ml hingga mencapai suhu 90°C dan didiamkan selama 15
menit. Setelah itu, ekstrak yang didapat kemudian disaring menggunakan kertas
saring selagi masih panas. Ekstrak yang dihasilkan selanjutnya dipekatkan dengan
menggunakan rotary evaporator sampai didapatkan ekstrak yang kental. Ekstrak
kental kemudian ditimbang dan dihitung rendemen ekstraknya yang dinyatakan
dalam persen (%). Terakhir, ekstrak dikemas dalam wadah kaca yang gelap dan
disimpan ke dalam desikator. Berikut rumus persen rendemen yang digunakan
untuk perhitungan :

rat kstrak
% Rendemen
rat simplisia

3.3.5 Karakterisasi ekstrak daun turi (Sesbania grandiflora (L.) Pers.)

3.3.5.1 Uji kandungan alkaloid
Dua tabung reaksi disiapkan. Kemudian, dalam tiap tabung dimasukkan
0,5 gram ekstrak daun turi yang sudah dilarutkan dalam 5 ml akuades.
Selanjutnya, pada salah satu tabung ditambahkan beberapa tetes dari reagen
dragendorff dan tabung lainnya diberikan reagen mayer. Jika terbentuk adanya
 20

endapan jingga pada tabung yang ditetesi pereaksi dragendorff dan endapan putih
pada tabung yang ditetesi pereaksi mayer, hal itu membuktikan adanya senyawa
alkaloid (Saifudin et al., 2011).

3.3.5.2 Uji kandungan terpenoid

Sebanyak 5 ml ekstrak daun turi dicampur dengan 2 ml kloroform dan
dipekatkan menggunakan H2SO4 sebanyak 3 ml. Warna coklat kemerahan yang
muncul pada daerah antarmuka menunjukkan adanya terpenoid.

3.3.5.3 Penetapan kadar air ekstrak daun turi (Sesbania grandiflora (L.)
Pers.)
Kadar air ekstrak daun turi ditetapkan dengan menggunakan metode
destilasi toluena. Toluena yang digunakan dijenuhkan terlebih dahulu. Kemudian,
kurang lebih 2 gram ekstrak ditimbang dengan seksama dimasukkan ke dalam
labu alas bulat dan ditambahkan toluena yang telah dijenuhkan dengan air. Alat
dipasang dan toluena dituangkan ke dalam tabung penerima melalui pendingin.
Labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit, setelah toluena mulai mendidih,
penyulingan diatur 2 tetes/detik, lalu 4 tetes/detik. Setelah semua toluena
mendidih, dibiarkan tabung penerima mendingin sampai temperatur kamar.
Setelah lapisan air dan toluena memisah sempurna, volume air dibaca dan
dihitung kadar air dalam persen terhadap berat ekstrak semula (Saifudin et al.,
2011). Rumus menghitung kadar air :
olum air
Kadar Air (%)
B rat ahan

3.3.5.4 Penetapan kadar abu total ekstrak daun turi (Sesbania grandiflora
(L.) Pers.)
Dua gram ekstrak daun turi dimasukkan dalam krus silikat yang telah
dipijarkan dan ditimbang. Dipijarkan perlahan-lahan hingga arang habis,
didinginkan dan ditimbang. Ditambahkan air panas dan disaring menggunakan
kertas saring bebas abu. Dipijarkan sisa kertas dan kertas saring dalam krus yang
sama. Filtrat dimasukkan ke dalam krus. Selanjutnya filtrat diuapkan, dipijarkan
 21

hingga bobot tetap dan ditimbang. Terakhir, dihitung kadar abu pada bahan yang
telah dikeringkan di udara (Anonim, 2000). Rumus menghitung kadar abu :

Kadar abu
B rat samp l a al

3.3.5.5 Penetapan kadar abu tak larut dalam asam

Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu selanjutnya dididihkan
dengan asam sulfat encer P sebanyak 25 ml selama 5 menit. Bagian yang tidak
larut dalam asam selanjutnya dikumpulkan dan disaring menggunakan kertas
saring bebas abu. Kemudian dicuci dengan menggunakan air panas, dipijarkan
hingga bobot tetap dan ditimbang. Penetapan kadar abu tidak larut dalam asam
diperoleh dari perhitungan kadar abu tidak larut dalam asam terhadap bahan yang
telah dikeringkan di udara (Anonim, 2000).

3.3.5.6 Uji cemaran logam berat (Pb dan Cd)

Uji cemaran logam berat (Pb dan Cd) dilakukan di Laboratorium Terpadu
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Islam Indonesia.
Ekstrak kental daun turi dibuat 3 sampel dan ditimbang masing-masing 0,1733
gram, 0,1605 gram dan 0,1525 gram. Tiga sampel tersebut didekstruksi
menggunakan asam nitrat hingga larutan bening kemudian masing-masing
diambil 25 ml dimasukkan dalam labu ukur 25 ml. Setelah itu, semua sampel
diinjeksikan ke dalam instrumen AAS (Atomic Absorption Spektrophotometry
atau Spektrofotometri serapan atom).

3.3.6 Uji pendahuluan

Uji pendahuluan dilakukan dengan optimasi dosis untuk menentukan dosis
ekstrak daun turi yang akan dipaparkan pada subjek uji. Optimasi dosis dilakukan
dengan menentukan 5 konsentrasi ekstrak daun turi yakni dari konsentrasi
terendah (100 ppm) yang menyebabkan 0% kematian sampai konsentrasi tertinggi
(300 ppm) yang menyebabkan 100% kematian embrio (Anonim, 2013).
 22

3.3.7 Pemijahan ikan zebra (breeding) dan seleksi embrio

Proses pemijahan ikan zebra (breeding) dilakukan menggunakan ikan
jantan dan ikan betina dewasa dengan perbandingan 1:2 (jantan : betina). Ikan
zebra dibiarkan dalam akuarium pada suhu 25-28°C dengan perbandingan
siklusnya 14 jam : 10 jam (terang : gelap). Tahap awal dimulai dari siklus terang,
yang mana ikan zebra jantan dan betina dipisah dalam dua akuarium berbeda, lalu
sebelum memasuki tahap siklus gelap, ikan zebra jantan dan betina diberikan
makan terlebih dahulu, selanjutnya digabungkan dalam satu akuarium yang sudah
diisi air dan kelereng, selanjutnya dibiarkan selama 10 jam pada keadaan gelap.
Keesokan harinya, ovulasi dan pembuahan dirangsang pada awal periode terang
oleh adanya kelereng. Selain memicu pembuahan, kelereng juga berfungsi
menjaga agar telur yang dihasilkan tidak dimakan oleh ikan dewasa. Telur yang
dihasilkan langsung dipindahkan ke dalam cawan petri untuk selanjutnya
dilakukan seleksi embrio (Anonim, 2013). Proses seleksi embrio dilakukan
dibawah mikroskop stereo. Embrio yang fertil ditandai dengan warna yang
transparan dan selaput embrio (korion) utuh. Embrio yang tidak fertil ditandai
dengan warna putih susu (tidak transparan).
Kriteria inklusi embrio ikan zebra yang digunakan untuk penelitian yakni
embrio yang fertil dan umurnya kurang dari enam jam setelah pemijahan.
Sedangkan, kriteria eksklusi embrio ikan zebra yakni embrio yang mengalami
koagulasi selama pembiakan dan embrio yang berumur lebih dari 6 jam setelah
fertilisasi karena akan menghalangi senyawa uji melewati selaput membran
embrio (Anonim, 2013).

3.3.8 Uji toksisitas embrio ikan zebra (Danio rerio)

Ekstrak air daun turi sebanyak 20 mg dilarutkan dalam labu ukur 10 ml
dengan pelarut akuades hingga tanda batas dan dibuat larutan stok dengan
konsentrasi 2000 ppm. Larutan stok diencerkan menjadi 5 konsentrasi sampel uji
yang terpilih pada uji pendahuluan. Lima konsentrasi tersebut yakni 100 ppm, 150
ppm, 200 ppm, 250 ppm dan 300 ppm. Kemudian disiapkan larutan kontrol
(internal, negatif, pelarut dan positif). Larutan untuk kontrol internal dan kontrol
negatif adalah air statis (static water) yang merupakan air akuarium sebagai media
 23

pertumbuhan embrio. Larutan pada kontrol internal dan kontrol negatif ini disebut
dilution water. Larutan kontrol pelarut adalah akuades yang merupakan pelarut
dari sampel uji (esktrak air daun turi). Sedangkan larutan kontrol positif adalah
larutan 3,4-dicloroaniline (DCA) yang ditimbang 4 mg dan dilarutkan dalam 1 L
air statis. Semua larutan selanjutnya dimasukkan dalam inkubator sehingga
suhunya sesuai dengan suhu perkembangan embrio yakni 26±1°C.
Selama menunggu proses inkubasi larutan uji, 8 mikroplate yang berisi 24
sumuran disiapkan, dimana dari 8 mikroplate digunakan 5 mikroplate untuk 5
konsentrasi sampel uji, 1 mikroplate untuk kontrol positif (DCA), 1 mikroplate
untuk kontrol negatif (dilution water) dan 1 mikroplate lagi untuk kontrol pelarut
(akuades). Dari 24 sumuran, 20 sumuran tiap mikroplate digunakan untuk 5
konsentrasi sampel uji dan kontrol (negatif, positif dan pelarut). Sisa 4 sumuran
tiap mikroplate diberikan kontrol internal (dilution water). Embrio yang telah
diseleksi dimasukkan dalam tiap sumuran sebanyak 1 embrio, sehingga total
embrio yang digunakan tiap mikroplate sebanyak 24 embrio. Setelah itu
kemudian larutan uji dimasukkan dalam tiap sumuran. Selanjutnya, semua
mikroplate dimasukkan dalam ruangan dengan suhu yang sesuai dengan suhu
embrio (Anonim, 2013).

3.3.9 Pengamatan embrio secara mikroskopis

Pengamatan mikroskopis pada embrio ikan zebra dilakukan tiap 24 jam
hingga 96 jam menggunakan mikroskop stereo. Ada 4 parameter yang diamati,
yakni koagulasi embrio, pembentukan somit, lepasnya bagian tail-bud dari yolk
dan detak jantung (Anonim, 2013).

3.4 Analisis Hasil

Setelah diamati secara mikroskopis, kemudian dihitung persentase embrio
yang mengalami koagulasi, embrio yang mengalami pembentukan somit, embrio
yang mengalami pelepasan bagian tail-bud dari yolk, embrio yang mengalami
detak jantung serta persentase abnormalitas perkembangan embrio. Berikut adalah
rumus-rumus yang digunakan :
 24

1) Rumus menghitung persentase embrio ikan zebra yang mengalami koagulasi

dalam satu kelompok uji :

total m rio ang koagulasi

total jumlah m rio ang igunakan
2) Rumus menghitung persentase embrio ikan zebra yang mengalami
pembentukan somit dalam satu kelompok uji :

jumlah m rio ang m ngalami p m ntukan somit

total jumlah m rio ang hi up

Gambar 3.1 1-5 = Ekstrak air daun turi konsentrasi 300 ppm, 250 ppm, 200 ppm,
150 ppm dan 100 ppm; iC = internal control/kontrol internal (dillution water);
nC= negative control/kontrol negatif (dillution water); pC = positif
control/kontrol positif (3,4-dicloroaniline); sC = solvent control/kontrol pelarut
(Akuades)
Sumber : (Anonim, 2013)
 25

3) Rumus menghitung persentase embrio ikan zebra yang mengalami lepasnya

tail-bud dari yolk dalam satu kelompok uji :

jumlah m rio ang m ngalami l pasn a

total jumlah m rio ang hi up

4) Rumus menghitung persentase embrio ikan zebra yang terlihat adanya detak
jantung dalam satu kelompok uji :

jumlah m rio ang t rlihat tak jantung

total jumlah m rio ang hi up

5) Rumus menghitung persentase abnormalitas perkembangan embrio ikan

zebra dalam satu kelompok uji :

jumlah m rio m ngalami a normalitas p rk m angan

total jumlah m rio ang igunakan

Selain 5 perhitungan di atas, juga dilakukan perhitungan persentase

kematian embrio dengan rumus sebagai berikut :

jumlah m rio m ngalami

% kematian embrio
total jumlah m rio ang igunakan

Persentase kematian embrio yang didapatkan kemudian digunakan untuk

menghitung LC50 menggunakan metode analisis dalam Microsoft Office Excel
dengan membuat persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit dengan log
konsentrasi. Persamaan garis lurus untuk menghasilkan LC50 dihitung dengan cara
memasukkan nilai 5 (probit untuk 50% kematian hewan uji) sebagai garis y
sehingga didapatkan x sebagai nilai log konsentrasi. Antilog dari nilai x tersebut
adalah nilai LC50 yang dicari.
 26

3.5 Skema Penelitian

Pengajuan ethical clearance

Pemeliharaan hewan uji

Penyiapan bahan uji

Ekstraksi

Karakterisasi ekstrak daun Turi (Sesbania grandiflora (L.) Pers.)

Uji Alkaloid Uji Terpenoid Uji kadar air Uji kadar abu Cemaran logam

Uji pendahuluan

Pemijahan ikan zebra dan seleksi embrio

Uji toksisitas pada Embrio Ikan Zebra (Danio rerio)

5 konsentrasi ekstrak air Kontrol Kontrol Kontrol

daun turi (300 ppm, 250 negatif positif pelarut
ppm, 200 ppm, 150 ppm (dillution (DCA) (akuades)
dan 100 ppm water)

Pengamatan embrio secara mikroskopis

Analisis hasil

Gambar 3.2 Skema kerja penelitian