Fluorometric merupakan sebuah metode pengukuran yang menggunakan cahaya fluoresen

yang dipancarakan. Sedangkan metode fluorometrik adalah metode analisis kuantitatif yang
bersifat sangat akurat dan sensitif. Prosedur pengujian ini menggunakan kadar konsentrasi
retinol atau vitamin A alkohol di dalam darah (Futterman et al., 1975). Dalam
penggunaannya, metode fluorometri yang menggunakan paparan cahaya langsung dari
fluorosensi memiliki sistematika yang kompleks dibandingkan dengan HPLC. Namun, HPLC
membutuhkan waktu yang lebih intensif dan memakan biaya yang sangat banyak
dibandingkan dengan penggunaan metode fluorometri. Sebelum digunakan dalam
pengukuran kadar retinol pada darah manusia, metode fluorometri menggunakan fluorosensi
dilakukan untuk mengukuran sampel biologis dan produk pertanian serta peternakan yang
mengandung susu atau dairy products. Berkembangnya teknologi, menjadikan metode
fluorometri dengan multidimensional fluorosensi dilakukan pada darah manusia untuk
menghitung riboflavin, aromatic amino acids, dan co enzim lainnya seperti NADH dan FAD.
(Tamura et al., 2021)
Dalam penelitian yang dilakukan James Ronald Schroerder pada tesis yang berjudul “A
Spectrophotofluorometric Analysis of Serum Vitamin A Levels in A Defined Population”,
metode dalam analisis vitamin A, digunakan fluorosensi hijau yang dipancarkan dengan
radiasi ultraviolet dengan panjang 330 nm, namun iridiasi yang dilakukan terus menerus pada
vitamin A atau serum retinol dapat merusak kualitas dan kandungan dari vitamin tersebut.
Sehingga, untuk mencegah timbulnya rusaknya vitamin A, penambahan kadar larutan vitamin
A yang di ekstrak terlebih dahulu untuk mencocokan fluorosensi dengan kondisi vitamin
(Schroeder, 1976). Berdasarkan penelitian tersebut, didapatkan hasil bahwa :
1) Penentuan kadar vitamin A dalam sel darah merah dan plasma darah dapat ditemukan
dengan jumlah yang tidak signifikan. Sehingga, untuk pengkoreksiannya dapat
dilakukan dengan tes kadar hematokrit.
2) Spesifitas prosedur dapat ditentukan dengan tidak rusaknya kondisi vitamin A akibat
iridiasi den pengukuran fluorosensi reagen. Meskipun sampel yang digunakan adalah
darah, namun tidak ditemukan adanya bias pengukuran yang diakibatkan oleh
hemoglobin, bilirubin, kolesterol dan vitamin larut lemak lainnya yang berada di
dalam darah.
3) Penggunaan panjang sinar selama pengukuran dapat berpengaruh pada hasil
pengukuran
Sedangkan dalam pengukuran darah sampel, beberapa tahapan yang meliputi :
1) Peralatan
 Peralatan yang digunakan untuk mengukur analisis vitamin A dibuat di Aminco-
Bowman spectrophotofluorometer dengan panjang cahaya 330 nm dan 365 nm pada
suhu yang konstan (25C)
2) Sampel
Darah sebagai sampel diambil dari populasi yang akan diteliti. Sedangkan serum
retinol yang digunakan harus terlindung dari cahaya matahari langsung dengan suhu
penyimpanan sebesar 4C
3) Kalibrasi alat
Proses kalibrasi alat spektrofotometer digunakan untuk meningkatkan keakuratan
pada proses pengukuran.

Gambar 1 Spektrofotometer

Dried Blood Spots

Dried Blood Spots (DBS) dapat digunakan untuk mengukur retinol. Dalam pemeriksannya,
terdapat kolerasi positif antara reaksi konsentrasi retinol di DBS dan sample plasma
konevensional. Pengambilan sampel darah dilakukan pada bagian ujung jari atau tumit kaki
dan darah kemudian diteteskan pada kertas filter (Schleicher and Schuell 903 specimen
collection paper) yang selanjutnya dikeringkan selama 3 am di ruangan yang gelap dengan
temperatur ruangan sebesar 25C (Gibson, 2005). Suhu dalam penyimpanan harus dijaga agar
tidak terlalu lembab untuk mencegah kerusakan retinol pada DBS. Meskipun telah dilakukan
pemeriksaan vitamin A menggunakan metode DBS pada serum retinol, perlu dilakukan uji
lanjutan seperti uji HPLC dengan tingkat sensitivitas yang tinggi untuk mencegah perbedaan
hasil uji tes. Dibandingkan dengan uji HPLC, metode DBS lebih mudah dilakukan. Alasan
mengapa DBS lebih mudah dilakukan daripada metode HPLC adalah, pada metode DBS
tidak diperlukan banyak tahapan, pengambilan sampel darah sangat sedikit (berupa tetesan
darah), sampel yang didapatkan dan diletakan di kartu DBS mudah untuk diberi label,
didistribusikan, dan disimpan (Craft et al., 2000).
Selain dapat digunakan untuk analisis molekul Vitamin A dalam darah, DBS dapat digunakan
sebagai pendeteksi molekul lain seperti asam nukleat (DNA dan RNA) cytomegalovirus,
HIV, serta virus hepatitis A

Gambar 2 Contoh Dried Blood Spots

Prosedur DBS meliputi tahapan (Swasthikawati, 2019) sebagai berikut :

1) Sebelum pengambilan sampel, ujung jari diusap dengan kapas alkohol
2) Jari ditusuk dengan jarum, lalu ditekan hingga darah menetes pada kertas filter.
3) Posisi pada saat darah diteteskan harus berada di tengah kertas dan dibiarkan hingga
membentuk spot darah (lingkaran)
4) DBS kemudian dibiarkan kering pada suhu ruangan tertutup atau kedap udara selama
3-4 jam
5) Sampel DBS yang sudah kering kemudian ditumpuk dan diberikan kertas glisin untuk
menghindari kontaminasi antar sampel sebagai pembatas.
6) Pada saat proses pendistribusian atau pemindahan sampel, sampel dimasukan ke
wadah atau plastik kedap udara untuk mengurangi kelembaban udara untuk mencegah
rusaknya sampel DBS
Gambar 3 Langkah-Langkah Sampling DBS
Sumber

Craft, N. E., Haitema, T., Brindle, L. K., Yamini, S., Humphrey, J. H., & West, K. P. (2000). Retinol
analysis in dried blood spots by HPLC. Journal of Nutrition, 130(4), 882–885.
https://doi.org/10.1093/jn/130.4.882
Futterman, S., Swanson, D., & Kalina, R. (1975). A new, rapid fluorometric determination of retinol in
serum. Investigative Ophthalmology, 14(2), 125–130.
Gibson, S. R. (2005). Principles of Nutritional Assessment (2nd ed.). Oxford University Press.
Schroeder, J. R. (1976). A Spectrophotofluorometric Analysis of Serum Vitamin A Levels in a Defined
Population by.
Swasthikawati, S. R. I. (2019). Metode Dried Blood Spot ( Dbs ) Sebagai Solusi Sampling Darah Daerah
Terpencil. BioTrends, 10(1), 1–7.
http://terbitan.biotek.lipi.go.id/index.php/biotrends/article/viewFile/254/216
Tamura, Y., Inoue, H., Takemoto, S., Hirano, K., & Miyaura, K. (2021). A Rapid Method to Measure
Serum Retinol Concentrations in Japanese Black Cattle Using Multidimensional Fluorescence.
Journal of Fluorescence, 31(1), 91–96. https://doi.org/10.1007/s10895-020-02640-w