J 

OURNAL OF B ACTERIOLOGY , Oktober 2008, hlm. 6448–6457 Vol. 190, No. 19              

0021-9193 / 08 / $ 08.00 + 0 doi: 10.1128 / JB.00557-08
Hak Cipta © 2008, American Society for Microbiology. Seluruh hak cipta.
 
Kloning dan Karakterisasi Wilayah DNA yang Bertanggung Jawab untuk Produksi
A
Megacin A-216 di Bacillus megaterium 216 
Antal Kiss , 1 * G abriella Balik o ´ , 1 Attila Csorba , 2 † T ungalag 
Chuluunbaatar , 1 Katalin F. Medzihradszky , 2,4 dan Lajos Alf o ¨ l
d i 3
Institute of Biochemistry, 1 Proteomics Research Group, 2 and Institute of
Genetics, 3 Biological Research Center of
the Hungarian Academy of Sciences, Szeged, Hongaria, dan Department of Pharm
aceutical Chemistry, University of California, San Francisco, San Francisco,
California 94143-2240 4
Diterima 22 April 2008 / Diterima 28 Juli 2008
 
Setelah induksi, Bacillus megaterium 216 menghasilkan yang bakteriosin 
megacin A-216, yang mengarah ke lisis dari para sel produser dan
membunuh B. megaterium dan beberapa spesies bakteri lainnya. Wilayah
DNA bertanggung jawab untuk
megacinogeny itu kloning di B. megaterium . The nukleotida urutan dari se
buah 5494-bp
panjang subfragment itu ditentukan, dan yang fungsi dari satu gen pada in
i fragmen itu dipelajari oleh menghasilkan penghapusan dan menganalisis 
mereka efek pada mega fenotipe. Sebuah terbuka membaca bingkai (ORF) 
encoding sebuah 293-asam
amino protein ituidentifted sebagai yang gen ( MEGA ) coding untuk mega
cin A-216. Pencarian BLAST mendeteksi kemiripan urutan antara
megacin A-216 dan protein dengan aktivitas fosfolipase A2 . Purifted biolo
gis aktif megacin A-216 prep- arations terkandung tiga protein. Massa spe
ktrometri analisis menunjukkan bahwa yang terbesar protein adalah yang 
full-length terjemahan produk dari para MEGA gen, sedangkan yang kedu
a lebih
pendek protein adalah fragmen dari yang lama protein dibuat oleh pembel
ahan antara Gln-185 dan Val-186. The molekul massa dari yang tiga polip
eptida yang 32.855, 21.018, dan 11.855 Da, masing-
masing. Perbandingan dari berbagai megacin persiapan menunjukkan bah
wa para rantai
utuh sebagai baik sebagai yang kedua gabungan fragmen dapat membentu
k biologis aktif megacin. Sebuah ORF terletak di
sebelah untuk para MEGA gen dan encoding sebuah 91-asam
amino protein yang ditampilkan untuk menjadi bertanggung
jawab untuk yang relatif kekebalan
 ditampilkan oleh para produser regangan terhadap megacin A-216. Selain 
itu MEGA gen, di setidaknya dua lainnya gen, termasuk sebuah gen yang
mengkode suatu 188-asam
amino protein berbagi tinggi urut kesamaan dengan RNA polimerase sigm
a faktor, yang ditunjukkan untuk menjadi diperlukan untuk induksi dari 
megacin A-216 ekspresi.

Megacins adalah bakteriosin yang diproduksi oleh tertentu strain dari yang membentuk spora

bakteri gram positif Bacillus megaterium (13, 17, 36, 39). Megacinogeny itu pertama
kali dijelaskan di 1954 (17). Diamati bahwa beberapa sel dalam budaya yang
berkembang B. megaterium 216 spontan menghasilkan suatu zat yang segaris sel-sel lainnya B.
megaterium strain tapi tidak mempengaruhi sebagian besar spesies bakteri lainnya. Produksi zat
ini, kemudian disebut megacin A-216, adalah diinduksi oleh UV light (17), N -methyl- N ' -nitro- 
N -nitrosoguanidine (28), atau mitomycin C (23).Induc- tion dari megacin A-216 sintesis meng
arah ke lisis dari para budaya di 2 ke 3 h (17). Bebas
sel supernatan dari sebuah diinduksi budaya dari B. megaterium 216 membunuh sel-sel sensitif
bahkan dalam 10 4 pengenceran ganda,
sedangkan yang produser ketegangan 216 pameran relatif kekebalan terhadap para bakteriosin
(17). Seperti bakteriosin pada umumnya, megacin A-216 memiliki lebih mempersempit
spektrum antibakteri:
selain B. megaterium , itu adalah aktif terhadap beberapa strain dari Bacillus subtilis , Bacillus
anthracis , Micrococcus aurantiacus , dan M. cinnabareus (17, 18, 28).
Banyak pengamatan menunjukkan bahwa megacin A-216 tindakan oleh im- pasangan
integritas membran sel bakteri yang sensitif. Mi- gambar croscopic menunjukkan bahwa isi sel
sebagian kembali disewa dari bakteri dibunuh, sedangkan dinding sel muncul untuk
 

* Penulis yang sesuai . Alamat surat : Institute of Biochemistry, Biological Research Center of

the Hungarian Academy of Sciences,
6726 Szeged, Temes v ´ a r i krt . 62. , Hongaria . Telepon : 3 6 6 2 59 9 630 . Fax:
36 62 433 506. E-mail: kissa@brc.hu.
† Alamat saat ini: Institut Kimia
Medis, Universitas Szeged , 6720 Szeged, D o ´ m t ´ e r 8. , Hongaria.
A Diterbitkan sebelum dicetak pada 8 Agustus 2008.

tinggal utuh dan yang bentuk dari yang sel yang dipertahankan (19). Megacin A-216 adalah ak
tif terhadap protoplas dari megacin-sensitif strain (13, 28). Dalam media isoosmotik, bahan sel
dari plasts proto menjadi kurang padat setelah megacin pengobatan, tetapi yang sel kontur
tetap terlihat untuk waktu yang lama. Ini pengamatan menunjukkan bahwa megacin A-
216 entah bagaimana kerusakan yang permeabilitas
membran penghalang tapi tidak tidak merusak yang membran com- pletely. The
bacteriocidic efek dari megacin A-216 dihambat
 oleh rendah suhu, menunjukkan keterlibatan dari enzimatik ac- tivity di megacin A-216
tindakan (13).
Megacin A-216, pertama dimurnikan oleh Belanda, itu ditemukan untuk menjadi sebuah 
protein asam pencetus sekitar pH 4.0 (14). Studi selanjutnya menentukan bahwa ia memiliki
massa molekul asli ~ 66 kDa, berisi dua subunit berbeda dengan massa molekul masing-
masing 30 dan 15 kDa, dan menampilkan aktivitas fosfolipase A2 (PLA2) (27, 28, 39).
Sebuah spesifik inhibitor dari megacin A-216, dimurnikan dari budaya dari B. megaterium 2
16, itu disarankan untuk berunding kekebalan untuk yang diproduksi sendiri
bakteriosin. Substansi sebagian dimurnikan,
yang kimia alam itu tidak diidentifikasi, dihambat dengan efek toksik serta aktivitas fosfolipase
dari megacin A-216 (26).
Setelah pengakuan produksi bakteriosin di
lain B. megaterium strain, sebuah klasifikasi dari megacins itu diusulkan
(jenis A, B, dan C). Berdasarkan pada yang inducibility oleh seorang yang
rendah tingkat UV iradiasi atau mitomycin C pengobatan, megacin A-216 itu diklasifikasikan
sebagai tipe A (15). Dalam konteks yang lebih luas, sifat
fisik dan enzimatik aktivitas tempat megacin A-216 di kelas III dari bakteriosin yang
diproduksi oleh gram
positif bakteri (12, 20). Ada yang hanya sebuah beberapa bakteriosin (megacin A-216, megaci
n

 
6448

 
 

A-19.213, dan thuricin) yang telah telah terbukti untuk memiliki aktivitas lipase phospho- (9,

28, 39). Menariknya, bakteriosin
ini, al- meskipun jelas berbeda protein, memiliki sejenis produser host (erat terkait gram
positif bakteri) dan sejenis genetik lo- calizations (dikodekan oleh plasmid) (9, 39).
Sebuah studi yang menggunakan fusi protoplas dan transformasi protoplas menunjukkan
bahwa determinan genetik dari produksi megacin A-216 , kekebalan terhadap megacin A-
216, dan indusibilitas produksi megacin A-216 dapat dialihkan ke dalam strain B.
megaterium non- megacinogenic , dan
akuisisi yang mEGA fenotipe itu dikaitkan dengan para pengalihan dari suatu
~ 47-kb plasmid (pBM309), salah satu dari yang 10 adat plasmid
hadir di B. megaterium 216 (32). Fragmen dari pBM309 yang kloning di B. megaterium , dan p
ara gen yang bertanggung jawab untuk produksi megacin yang lokal untuk sebuah sekitar 10-
kb wilayah dari pBM309; Namun, ini DNA wilayah itu tidak dianalisis luar membangun peta
pembatasan (30, 41).
 The diperbaharui bunga di bakteriosin sebagai antimikroba agen (5, 8, 10) dan di B. megateri
um sebagai sebuah industri mikroorganisme dan kloning tuan
rumah (38) mendorong kita untuk meninjau kembali megacinogeny dari
B. megaterium . Minat pada B. megaterium disorot oleh proyek sekuensing seluruh-genom
yang sedang berlangsung (http: // www
.bios.niu.edu / b_megaterium). Kami Tujuannya adalah untuk mempelajari dengan ular
molec- mekanisme yang mendasari yang megacin A-
216 tindakan dan yang relatif kekebalan ditampilkan oleh para produser ketegangan. The PLA2 
aktivitas dan inhibitor alami yang terkait (26) membuat para megacin A-216 sistem sangat
menarik
karena PLA2 enzim memainkan penting peran dalam sebuah lebar kisaran dari fisiologis dan
patofisiologis proses (3), serta di virulensi
bakteri (35). Karena itu rekombinan plasmid dibangun sebelumnya (30, 41) yang tidak tersedia,
sebagai langkah pertama menuju karakterisasi dari yang megacin A-
216 sistem, kami recloned yang wilayah megacin A-216, ditentukan urutan DNA-
nya, dan digunakan penghapusan pemetaan untuk mengidentifikasi para gen
yang mengendalikan produksi dan kekebalan mega- cin A-216 . Tugas dari para MEGA gen itu 
juga dikonfirmasi oleh massa spektrometri (MS) analisis dari dimurnikan megacin A-216. Kami 
melaporkan data yang menunjukkan bahwa para dua subunit sebelumnya terdeteksi di megacin
A-216 persiapan
(39) adalah produk pembelahan proteolitik dari protein yang dikodekan oleh gen megA .
 
MATERIAL DAN METODE
Strain, plasmid, dan kondisi pertumbuhan. The B. megaterium strain
216 (MEGA + MegC + ), KM (Spo - ; megacin sensitif), AL (MEGA + Arg - Leu - Str r ;
pBM309), dan THT (KM THR - Nya - Trp - Str r ) yang dijelaskan sebelumnya (17,
32). Mutan resisten kanamisin dari strain THT diperoleh dari
K. Fodor. Escherichia coli ER1821 F - glnV44 e14 (McrA - ) endA1 thi-1 A ( mcrC-
mrr ) 114 :: IS 10 diperoleh dari New England Biolabs digunakan sebagai inang
kloning E. coli .
Untuk mendapatkan sebuah E. coli - B. megaterium jemput vektor dengan sebuah tunggal PstI 
situs, bagian dari polycloning situs dari yang 4,7-kb plasmid vektor pHY300PLK (16) telah dih
apus oleh pencernaan dengan EcoRI dan XbaI, mengisi-
in yang berakhir dengan Klenow polimerase, dan ligasi ujung tumpul untuk menghasilkan
pHY301. Semua plasmid rekombinan yang dilaporkan di sini didasarkan pada pHY301. Bakteri
secara rutin ditumbuhkan dalam media LB pada suhu 30 ° C ( B. megaterium ) atau pada suhu
37 ° C ( E. coli ). Ampisilin itu digunakan di 100
µ g / ml, tetrasiklin pada 10 µ g / ml ( B. megaterium ) atau 12,5 µ g / ml ( E. coli ), dan
kanamisin pada 50 µ g / ml.
Teknik DNA. DNA plasmid dimasukkan ke dalam B.
megaterium melalui transformasi protoplas (42). Plasmid persiapan, pembatasan pencernaan, a
garosa gel elektroforesis, dan kloning dari DNA fragmen yang dilakukan keluar dengan
menggunakan prosedur standar (33). Untuk preparasi plasmid dari B. megaterium , sel pertama
kali diubah menjadi protoplas melalui inkubasi dengan lisozim untuk memfasilitasi lisis. Urutan
DNA ditentukan oleh sequencer otomatis .
Uji Megacin. Aliquots lima mikroliter budaya semalam yang
dipipet dan diizinkan untuk kering ke dalam permukaan dari LB agar piring. Setelah inkubasi 
pada 30 ° C selama 6 jam, plat dilapis dengan LB-kanamisin agar lembut (0,4 ke 0,5%) yang
mengandung 1/100 vol dari suatu padat budaya dari para Kn r mutan dari B. megaterium keteg
angan THT dan diinkubasi pada 30 ° C dalam
semalam. Kanamisin telah ditambahkan ke dalam lembut agar pertumbuhan menghambat dari
koloni diuji. Zona bening yang mengelilingi koloni mengidentifikasi klon yang
menghasilkan megacin.
Untuk mempelajari UV cahaya induksi dari megacin A-216 produksi, yang agar piring denga
n budaya tes kering diinkubasi pada 30 ° C selama 2 jam dan kemudian diiradiasi dengan sinar
UV (lampu germicid) selama 15 s. Setelah pengobatan UV, piring dikembalikan ke 30 °
C untuk 4 jam dan kemudian megacin produksi itu diuji sebagai dijelaskan di atas.
Kekebalan terhadap megacin A-216 diperkirakan dengan titrasi lisat bebas sel
dari sebuah mitomycin C-diinduksi B. megaterium budaya 216 pada clone diuji dan,
sebagai suatu kontrol, pada sensitif regangan B. megaterium KM (pHY301). Aliquots lima
mikroliter dari seri pengenceran dari yang lisat yang dipipet ke dalam permukaan dari sebuah l
embut lapisan agar 3-ml mengandung 10 μ l dari padat B.
megaterium budaya. Setelah sebuah semalam inkubasi pada 30 °
C, dengan tingkat dari resistensi itu dinilai oleh menentukan pengenceran tertinggi yang
menyebabkan tempat yang jelas di halaman bakteri. Di bawah
kondisi dari para pengujian, yang 10 5 ganda pengenceran masih disebabkan lisis dari yang se
nsitif KM
regangan, sedangkan klon membawa yang utuh mega wilayah yang tidak terpengaruh bahkan 
oleh para murni lisat.
Pemurnian protein . Megacin A-216 itu dimurnikan oleh suatu modifikasi dari metode yang
dijelaskan sebelumnya (14, 39). Biakan B. megaterium 216 semalam diencerkan 1: 100 ke
dalam media LB segar . Setelah gemetar pada 30 °
C selama 2 jam, mitomycin C telah ditambahkan ke sebuah konsentrasi dari 0,5 μ g /
ml dan gemetar itu terus untuk 3 ke 4 jam sampai lisis terjadi.
Semua langkah-langkah dari pemurnian yang dilakukan pada 4 ° C. Sel puing-
puing itu dihapus oleh sentrifugasi. Protein yang diendapkan dari dalam supernatan dengan me
nambahkan am- monium sulfat ke 80% saturasi. The diendapkan materi itu dilarutkan dalam P
C penyangga (20 mM natrium fosfat [pH 6.0], 10 mM 2-mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA, 5% 
gliserol) dan didialisis terhadap yang sama penyangga. Protein diendapkan
selama dialisis yang dihapus oleh sentrifugasi. The solusi itu diperlakukan dengan 2%
streptomycin sulfat untuk menghapus asam nukleat. Setelah sentrifugasi, yang su pernatant itu
didialisis PC penyangga dan dimuat ke DE52 (Whatman) pertukaran
anion kolom equilibrated dengan yang sama penyangga. Protein yang dielusi
dengan sebuah 0 ke 0,5 M linear NaCl gradien di PC penyangga. Fraksi yang diuji untuk
megacin kegiatan A-216 dengan titrasi pada B. megaterium KM ketegangan. Fraksi aktif yang
dikumpulkan didialisis terhadap buffer PC dan dimuat ke kolom hidroksiapatit
yang disetimbangkan dengan buffer PC . Protein yang dielusi dengan sebuah 20 ke 400 mM na
trium fosfat (pH 6,0) gradien yang mengandung 10 mM 2-mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA,
dan 5% gliserol. Puncak fraksi megacin mengandung
yang dikumpulkan, dan para protein itu diendapkan dengan amonium sulfat (80% saturasi). Th
 e endapan dilarutkan dalam volume minimal penyangga S (20
mM natrium fosfat [pH 7,4], 150 mM NaCl, 10 mM 2-mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA) dan
selanjutnya dimurnikan dengan filtrasi gel pada Sephacryl S-200 kolom di penyangga S.
Sediaan megacin yang dimurnikan didialisis terhadap buffer PC dan disimpan di
- 80 ° C selama beberapa bulan dengan hanya sedikit kehilangan aktivitas
biologis. Konsentrasi protein yang ditentukan oleh para Bradford reaksi, menggunakan Bio-
Rad protein assay reagen dengan serum bovine albumin kalibrasi kurva.
Estimasi dari native molekul berat
badan dengan gel ftltration. Sebuah sampel dari dimurnikan megacin A-216 (450 μ l, 7,5 mg
/ ml) dimuat ke 1-by-50-cm Sephacryl S-
200 kolom di S penyangga. Dekstran biru 2000 yang digunakan untuk penentuan dari para pen
gecualian volume, dan aldolase, bovine serum albumin, chymotrypsinogen A, dan RNase A (d
engan molekul massa dari 158, 67, 25, dan 13,7 kDa, masing-masing) yang digunakan
untuk kalibrasi.
Elektroforesis protein. Sodium dodesil sulfat-poliakrilamida
gel elektroforesis trophoresis (SDS-PAGE) dari protein yang dilakukan di 12% gel menggunak
an Coomas- sie brilian biru R-250 pewarnaan.
Untuk elektroforesis bawah nondenaturing kondisi, SDS dan 2-mercaptoeth-
anol yang dihilangkan. Megacin sampel bermigrasi ke
arah yang anoda. Protein yang diekstraksi dari nondenaturing gel oleh electroelution. Gel poto
ngan mengandung un- patri band yang dipotong keluar menggunakan berdekatan gel irisan den
gan bernoda megacin band dan prestained penanda berat molekul sebagai
panduan. Elektroelusi dilakukan dalam peralatan elektroforesis gel Little Blue Tank (ISCO)
menggunakan 1 × Tris-glisin (25 mM Tris, 192 mM glisin [pH 8,3]) di dalam tangki dan
0,2 × Tris-glisin di ruang
penyimpanan sampel . Dua ratus volt (1 ke 2 mA per sampel pemegang) telah diterapkan untu
k 7 h.
MS. Sampel disiapkan untuk MS dengan destruksi dalam gel (http: //ms-facility.ucsf
.edu / ingel.html). Secara
singkat, disulfida jembatan yang dikurangi oleh dithiothreitol, dan kemudian residu Cys bebas
yang teralkilasi oleh Iodoacetamide. Sampel yang diinkubasi dengan sisi-rantai
dilindungi babi tripsin (Promega) untuk 4 jam pada 37 ° C. Tak
terpecah mencerna yang dianalisis pada suatu Bruker Reflex III matriks-dibantu

 
 ARA. 1. Megacin A-216 produksi oleh B. megaterium THT sel yang
membawa berbagai bagian dari yang megacin A-216 wilayah dan oleh para orangtua B. 
megaterium 216 saring. Megacin A-216 produksi itu diuji oleh para overlay uji seperti yang
dijelaskan dalam Bahan dan Metode. Koloni di dalam baris
bawah yang disinari oleh UV light. Angka mengacu pada plasmid pMGC rekombinan (lihat te
ks dan Gambar 2). Bm, B. megaterium 216.
 
 

spektrometer massa ionisasi desorpsi laser-waktu penerbangan (MALDI-

TOF) dalam mode reflektron . Salah
satu mikroliter dari 10 μ l dari digest solusi yang dimuat dengan 1 μ l 2,5-Dihydroxybenzoic as
am solusi (Sigma-Aldrich) sebagai sebuah matriks untuk para MS anal- ysis. Kalibrasi
eksternal diterapkan. Pembusukan pasca-sumber (PSD) analisis yang dilakukan untuk
memperoleh informasi urutan untuk dipilih peptida.
Metode bioinformatis . DNA dan protein urutan kesamaan pencarian yang dilakukan dengan
menggunakan paket program BLAST (1, 2), berpasangan
perbandingan dari urutan oleh para BLAST 2 Urutan Program (37), dilestarikan domain pencari
an dengan program CD-Search (22), dan pencarian tanda tangan PROSITE oleh Scan-
Prosite Program (6). Dalam semua kasus, standar pengaturan yang digunakan.
Nomor aksesi urutan nukleotida. Data urutan
nukleotida telah disimpan di GenBank dengan aksesi no. EU014074.
 
 
HASIL
Kloning dari para DNA wilayah bertanggung
jawab untuk megacinogeny. Plasmid pBM309 membawa para genetik faktor
penentu dari megacin A-216 produksi dan kekebalan (32) dimurnikan
dari B. megaterium AL, sebuah ketegangan menyimpan hanya ini plasmid. Kami memilih untu
k mengkloning yang ~ 10-kb PstI fragmen, yang, dalam sebuah sebelumnya studi (30), telah dit
unjukkan untuk membawa para MEGA gen. Untuk mendapatkan sebuah vektor shuttle plasmid
dengan situs PstI unik, pHY300PLK (Ap r Tc r ), awalnya dikembangkan sebagai B.
subtilis - E. coli shuttle vector (16), telah dimodifikasi untuk menghasilkan pHY301, seperti
yang dijelaskan dalam Bahan dan Metode. Fragmen PstI dari pBM309 diikat ke pHY301 yang
diuji PstI, dan DNA yang diligasi digunakan untuk mentransformasi protoplas dari strain B.
megaterium THT tanpa plasmid . Berubah sel yang diregenerasi di sebuah ing tetrasiklin-
contain- batch yang budaya. Hal itu diasumsikan bahwa yang diperoleh kapasitas dari megacin
A-216 produksi akan memberkati klon yang
membawa satu mega gen dengan sebuah sangat kuat selektif keuntungan. Analisis
pembatasan dari para plasmid dimurnikan dari Tc r klon mengungkapkan bahwa semua yang
terkandung sama ~ 10-kb PstI fragmen. Satu plasmid (pMGC1) dipilih untuk analisis lebih
lanjut. Dalam uji overlay, B. megaterium THT koloni menyimpan
pMGC1 pro teknya sebuah mempersempit jelas zona sekitar yang koloni, yang menjadi lebih
 luas ketika koloni sebentar terkena UV tion
irradia-; ini mengindikasikan bahwa para kloning PstI fragmen yang terkandung dalam unsur-
unsur genetik yang terkait dengan fenotipe MEGA (Gbr. 1). Menariknya, pMGC1 diberikan
Mega +fenotipe juga untuk E. coli ER1821 sel, meskipun
zona pertumbuhan penghambatan itu lebih kecil daripada di
sekitar mega + B. megaterium kumpulkan onies (tidak ditampilkan).
Fragmen HindIII 5,5 kb dari sisipan pMGC1 adalah sub-

diklon di pHY301 untuk menghasilkan pMGC3 dan menjadi sasaran analisis lebih lanjut.
Analisis urutan wilayah DNA yang bertanggung jawab atas megacinogeni. Urutan
nukleotida (5494 bp) dari para kloning HindIII fragmen itu ditentukan (GenBank aksesi tidak
ada. EU014074). Sembilan rangka baca terbuka (ORFs) dimulai
dengan ATG, pengkodean sebuah protein lebih lama dari 50 amino asam dan tidak tumpang
tindih dengan ORFs lainnya, diidentifikasi (Gambar. 2 dan Tabel 1). Urutan diterjemahkan
dari semua ORFs digunakan untuk mencari database GenBank untuk asam amino yang
sama urutan . Mulai dan berhenti koordinat dari para ORFs dan hasil dari pencarian BLASTP
tercantum dalam Tabel 1. Pergi dari kiri ke kanan pada peta Gambar. 2, produk diterjemahkan
dari ORF59 menunjukkan sebuah media tingkat dari kesamaan untuk sebuah hipotetis protein 
Bacillus cereus AH1134 dan lemah kesamaan untuk sebuah nomor dari
lainnya hipotetis bakteri protein di dalam basis data. The pra protein dicted (P91) dikodekan
dengan ORF berikutnya menunjukkan Mar- ginal kesamaan urutan ke protein tunggal, protein
hipotetis Enterococcus faecalis . Terjemahan
konseptual dari ORF293A menghasilkan sebuah protein dengan moderat tingkat dari kesamaan
dengan protein dengan aktivitas PLA2. Selain itu, pencarian BLAST mengidentifikasi domain
fosfolipase yang dilestarikan (PLA2_plant, PLA2_bee_venom_like, Phospholip_A2_2,
PLA2c, dan PLA2_ like) yang cocok dengan C-terminal 30% dari P293A. Dalam satu cahaya
dari hasil sebelumnya menunjukkan aktivitas fosfolipase dari dimurnikan megacin A-216 (28,
39), deteksi kesamaan
urutan ke protein dengan fosfolipase aktivitas menyarankan bahwa ORF293A adalah gen
encoding megacin A-216. P62, ditentukan
oleh para berikutnya ORF, menunjukkan sangat rendah tingkat dari kesamaan ke hipotetis prot
ein dari beragam sumber dan sebuah media tingkat dari kesamaan
dengan sebuah hipotetis protein dari para taksonomi erat terkait B. thuringiensis . Gen tetangga
(ORF85) mengkodekan suatu pro Tein dengan tingkat menengah kesamaan dengan
glutaredoxins dan ulang lated protein. Pencarian BLAST juga mengidentifikasi domain yang
dilestarikan NrdH di P85. Produk prediksi ORF berikutnya (ORF293B) memiliki identitas
urutan tinggi dengan sejumlah besar protease serine. Produk ORF188 diduga adalah sangat
mirip dengan RNA polimerase faktor sigma bakteri con- taining yang Sigma70_r4 dilestarikan
domain. Awal translasi titik dari P188 adalah agak ambigu, karena ada adalah sebuah di-frame
ATG 9 bp hulu dari ATG di 3361. Namun,
ada yang tidak tepat diposisikan ribosom mengikat situs di

 
 
 ARA. 2. Pemetaan fungsional wilayah MEGA . Batang horizontal menunjukkan segmen
DNA yang ada di plasmid. Situs pembatasan yang digunakan untuk menghapus segmen DNA
tertentu ditampilkan. ORFs hadir dalam insert pMGC3 dan dibiarkan utuh dalam derivatif
penghapusan ditunjukkan dengan horisontal
diisi panah, dan yang diduga tRNA Cys gen yang ditunjukkan oleh seorang kosong panah. No
mor di bawah
ini yang panah di dalam top baris menunjukkan yang panjang yang ORF di amino asam, dan n
ama-nama di
atas yang panah menunjukkan yang diduga fungsi berasal dari BLAST pencarian dan fungsion
al analisis. Gltrdx , ORF encoding sebuah glutaredoxin-
seperti protein; reg , ORF encoding sebuah diduga peraturan protein bermain sebuah peran dal
am megacin ekspresi. The kapasitas untuk memproduksi megacin A-
216 (MEGA kolom), imunitas untuk megacin A-216 (MEGA imm kolom), dan inducibility da
ri megacin produksi oleh UV light
(UVind. Kolom) yang ditunjukkan oleh + , sedangkan yang kurang dari ini fitur ini ditunjukka
n dengan - . Sebuah rendah tingkat dari megacin produksi yang ditunjukkan oleh ± . pMGC24
*, masukkan dengan orientasi berlawanan .
 

 
depan kodon start upstream; dengan demikian, ATG 3361 (Tabel 1) adalah lebih mungkin untuk
menjadi kodon inisiator untuk protein ini. Hipo- terjemahan thetical dari ORF berikutnya
(ORF73) menghasilkan protein
 menampilkan sebuah rendah tingkat dari kesamaan ke hipotetis protein dari berbagai Bacillus s
pesies. Akhirnya, para diprediksi ORF185 -produk SLT sangat mirip dengan beberapa bakteri
hidrolase dinding sel dengan N -acetylmuramoyl- L amidase -alanine aktivitas.
Bakteri gram positif dicirikan oleh tempat ikatan ribosom yang kuat (24, 25, 31). Urutan
terletak immedi- dalamnya luar biasa hulu dari para ORFs yang disaring untuk diduga Shine-
Dalgarno urutan. Semua ORFs memiliki urutan sebelumnya dengan kemiripan dengan
konsensus Bacillus ribosomal mengikat situs (34) dan urutan konsensus disimpulkan dari
3 ' ujung B. megaterium 16S rRNA (Tabel 2). The ribosom berpotensi
kuat mengikat situs (menunjukkan yang tertinggi kesamaan untuk para konsensus urutan) yang 
terdeteksi sebelum ORF293A, ORF91, dan ORF293B (Tabel 2). Sebuah konsensus bersinar-
Dalgarno se quence itu terdeteksi sebelum ORF59, tapi yang jarak antara “inti” GGAGG motif
dan kodon start mungkin terlalu panjang untuk fungsi efisien (24, 25).
Pencarian BLASTN mengidentifikasi daerah pendek, kira - kira 70-bp , terletak antara posisi
nukleotida 4279 dan 4345, yang menunjukkan kemiripan
yang kuat dengan gen tRNA Cys dari bakteri gram positif. Kesamaan urutan tertinggi
(94%) terdeteksi

dengan para tRNA Cys  gen dari Bacillus thuringiensis serovar konkukian ketegangan 97-
27 (NC_005957, posisi 969.811 ke 969.884) dari para B. thuringiensis genom. Sebuah terbalik 
ulangi itu ditemukan antara nukleotida 4488 dan 4521 (dalam ORF185).
Kandungan GC dari wilayah sekuensing adalah 30,85%, lebih rendah dari rata-rata
kandungan GC DNA B. megaterium (37%)
(29) dan lebih rendah dari dua megaterium B. plasmid,
pBM300 (35,2%) dan pBM400 (36,5%), yang urutan telah menjadi tersedia baru-baru ini
(21, 34).
Sepengetahuan kami, sinyal transkripsi B. megaterium belum dianalisis secara sistematis,
sehingga sulit
untuk menentukan tugas promotor . Sebuah urutan menyerupai yang B. subtilis sigma Urutan
promotor konsensus TTGACA
( - 35), TATAAT ( - 10) (11), telah ditemukan untuk mendahului ORF91.
Pemetaan
fungsional wilayah MEGA . Deteksi suatu lestari PLA2 domain sangat menyarankan bahwa O
RF293A adalah gen struktural megacin A-216. Untuk
menguatkan ini tugas dan mengidentifikasi lainnya gen yang mungkin memainkan suatu peran 
dalam megacin A-216 produksi dan kekebalan, turunan penghapusan pMGC3 dibangun
dengan menghapus fragmen restriksi atau dengan subcloning fragmen dari insert HindIII asli
dalam pHY301. Plasmid dibuat di E. coli dan kemudian dimasukkan ke dalam B.
megaterium THT untuk menguji MegA

 
 Tabel 1. Hasil amino pencarian kesamaan asam dengan protein yang disandikan
oleh mega wilayah suatu
Karakteristik protein dengan kemiripan
urutan tertinggi a
ORF Mulaila Berhen Domain ID databa
Pr Organ Nil
no. h ti yang se
ote isme ai
koordin koordi disimpan
in E.
at nat dengan
kesamaan
tertinggi b
59 259 80 Tidak Protein hipotetis 1679374 Bacillus 9e-
ada 49 cereus AH1134 13
BcerAH1_14544
91 396 671 Tidak Protein hipotetis 2937516 Enterococcus 1.2
ada EF0543 1 faecalis
293 1593 712 PLA2_pl Protein hipotetis 1679564 Bacillus cereus W. 1e-
A ant 69 05
BcerW_26065

62 1885 1697 Tidak ada Protein hipotetis                                                       
BT9727_0866

49477018 Bacillus thuringiensis serovar             
regangan konkukian 97–27

5e-06

85 2145 1888 NrdH Glutaredoxin 169824245 Finegoldia
magna ATCC                                                                                   
29328

4e-11

293B 3158 2277 Peptidase_S8 Kemungkinan serin intraseluler                                                    
   
protease
188 3361 3927 Sigma70_r4 Kemungkinan RNA terarah DNA                                                      
 
 polimerase sigma subunit FliA
73 3971 4192 Tidak Ada Protein hipotetis                                                       
BSG1_14318
185 4381 4938 Amidase_3 Putative N -acetylmuramoyl-                                                       
L- alanina di tengah

167937446 Bacillus cereus AH1134 3e-68 167937451 Bacillus cereus AH1134 6e-36             
                                          
 
149183037 Bacillus sp. strain SG-1 9e-06 148747751 Geobacillus virus E2 9e-42                    
                                   

sebuah ORFs mulai dengan ATG, lebih lama dari 50 amino asam, dan tidak tumpang

tindih dengan lainnya ORFs yang ditampilkan. ORFs yang diidentifikasi oleh para jumlah dari 
yang dikodekan amino asam dan yang terdaftar di mereka agar dari lokasi dari kiri ke kanan se
perti
yang ditunjukkan pada Gambar. 2. Mulai dan berhenti koordinat menentukan nukleotida posisi 
dalam satu sequencing 5494-bp fragmen. Protein
yang dikodekan oleh ORF91 hingga ORF185 memiliki pengidentifikasi GenBank ABS44966 
hingga ABS44973.
b Diidentifikasi dengan pencarian BLAST dari database protein nonredundan (Maret 2008).
 

fenotipe. Perpanjangan penghapusan dan efek fenotipiknya ditunjukkan pada Gambar. 1 dan 2.

Dengan Sehubungan dengan megacin produksi, pMGC1 dan yang derivatif penghapusan
dapat diklasifikasikan menjadi empat jenis. (i) Klon B. megaterium THT yang menyimpan
pMGC1 dengan sisipan PstI ~ 10 kb menghasilkan zona hambatan pertumbuhan yang sempit,
yang meningkat secara substansial setelah penyinaran sinar UV . Ini jenis fenotipe mirip
dengan yang ada pada orangtua B. megaterium 216 regangan (Gambar. 1). (ii) pMGC3
mengusung sequencing 5.5-kb HindIII fragmen dan turunannya penghapusan nya (pMGC21,
pMGC20, dan pMGC23), di mana hanya ORF293B atau ORF185 itu tidak aktif baik sendiri
atau dalam kombinasi, menghasilkan sebuah zona hambat yang lebih luas di sekitar koloni
uninduced dari pMGC1 ( Gambar 1 dan 2). Diameter zona hambat di sekitar koloni yang
diradiasi UV serupa dengan di sekitar koloni terinduksi yang menyimpan
pMGC1. The efek sinar UV adalah espe- secara
resmi jelas ketika sampel dari muda budaya yang diuji dan sel-sel, kering ke permukaan
lempeng
 agar, yang diperbolehkan untuk tumbuh untuk hanya satu pendek periode dari waktu (2 jam) se
belum itu
 
TABEL 2. Tempat pengikatan ribosom diduga
 

ORF no. Urutan Shine-Dalgarno a              
 

59 AAGGAGGTGATcgtactg ATG             
91 GGAGGaGAttttta ATG             
293A diAGGAGGaGAaat ATG             
62 ttGGAGtattaagt ATG             
85 AagGGtGaaGtcta ATG             
293B gaGAGGTGAaaaag ATG             
188 AAGGAatgtATgta ATG             
73 tgGGAGGaaAagtt ATG             
185 agAAGGtGaaagat ATG             
 

a The ATG mulai kodon yang ditampilkan di cetak tebal. Nukleotida yang
cocok dengan konsensus B . megaterium urut (5 ' -AAGGAGGTGAT) berasal dari dua 
GenBank entri (DQ660362 dan AY180964) untuk 16S rRNA yang dicetak di ibukota huruf.

Perawatan UV . (iii) Klon milik untuk yang ketiga kelas di beberapa
eksperimen menghasilkan sebuah sempit jelas zona sekitar yang koloni. Ini adalah lebih sering 
terdeteksi dengan pMGC6 dan pMGC10, dibandingkan dengan pMGC24, tapi fenomena itu,
secara umum, tidak ulang producible. UV iradiasi tidak tidak meningkatkan megacin produc-
tion (Gbr. 1). Plasmid ini (pMGC6, pMGC10, dan pMGC24) dilakukan lebih
pendek atau lebih besar penghapusan mempengaruhi beberapa gen yang terletak di 5,5 kb
HindIII fragmen,
tapi ORF293A adalah selalu utuh (Gbr. 2). (iv) Klon dikategorikan di dalam keempat kelas itu 
tidak menunjukkan megacin produksi. Beberapa dari para plasmid milik kelas ini (pMGC26,
pMGC17, dan pMGC30) kekurangan utuh ORF293A, sementara yang
lain (pMGC28, pMGC4, dan pMGC29) memiliki utuh ORF293A tapi dilakukan penghapusan 
mempengaruhi ORF73 dan tRNA Cys gen (pMGC28, pMGC4, dan pMGC29 ) (Gbr. 2).
Megacin kekebalan itu diuji oleh sebuah piring assay menggunakan sebuah tinggi ekstrak
sel titer dibuat dari B. megaterium 216. Sebuah besar penghapusan menghapus semua ORFs
tapi ORF91 dan ORF59 (pMGC30) tidak kekebalan megacin Merusak, sedangkan dele- tions
menonaktifkan ORF91 (pMGC24, pMGC17,
dan pMGC40) menyebabkan untuk kehilangan dari megacin kekebalan, menunjukkan bahwa y
ang 91-asam amino diduga protein adalah bertanggung jawab untuk yang relatif tahan dari
strain produser untuk megacin A-216.
 Analisis fenotip turunan
penghapusan Al lowed kami untuk tes apakah, di samping untuk ORF293A dan ORF91, gen
lain memiliki peran dalam megacinogeny. Kurangnya fenotip perubahan typic terkait dengan
penghapusan ORF293B dan ORF185 (lihat di atas) menyarankan bahwa baik
diduga pro menggoda maupun amidase dinding sel berperan dalam megacin pro duksi. Sebuah
penghapusan memperluas ke ORF188 menyebabkan parah pengurangan (pMGC6), sedangkan
penghapusan ORF73 dan para tRNA Cys gen saja (pMGC28), atau dalam
kombinasi dengan ORF188 (pMGC4 dan pMGC29), dihapuskan megacin produc-
tion. Semua penghapusan mempengaruhi ORF188 atau ORF73 / tRNA Cys dipimpin untuk

 
 

ARA. 3. Pemurnian megacin A-216 dari B. megaterium THT (pMGC3) dan B.

megaterium 216. Tampil adalah hasil dari SDS gel
elektroforesis dari protein sampel diperoleh di berbagai tahap dari Pu- rification. M, penanda
massa molekul (Fermentas); jalur 1, lisat; jalur 2, setelah kromatografi DEAE-
selulosa dan Sephacryl-S 200 ; jalur 3, lisat; jalur 4, setelah pengendapan amonium
sulfat, pengendapan streptomisin-sulfat dari asam
nukleat, dan dialisis; jalur 5, setelah kromatografi selulosa
DEAE ; jalur 6, setelah kromatografi hidroksiapatit.
 
 
kehilangan dari UV inducibility dari megacin produksi. Ini tions
observa- menunjuk ke yang penting peran dari para diprediksi sigma faktor-seperti protein
(P188) di megacin ekspresi dan terutama dalam ekspresi tingkat tinggi setelah pengobatan
UV. ORF73 dan /
atau yang tRNA Cys gen tampaknya untuk menjadi bahkan lebih penting, karena mereka inakti
vasi memiliki lebih drastis efek dari penghapusan ORF188. Penghapusan yang tersedia tidak
memungkinkan pengujian terpisah dari ORF73 dan gen tRNA Cys . Puzzlingly, pMGC10
dan, dalam beberapa tes, pMGC24, yang kurang baik ORF188 dan ORF73 / tRNA Cys ,
menunjukkan tanda-tanda produksi megacin lemah, tapi induc- ibility hilang juga dalam
ini kasus.
 Puriftcation dan analisis dari para megacin A-216 protein dalam vitro. Analisis urutan D
NA dan pemetaan penghapusan yang dijelaskan
di atas mengidentifikasi sebuah gen tunggal (ORF293A) yang mengkode mega- cin A-216. Ini 
Temuan itu mengejutkan di dalam cahaya dari hasil
sebelumnya, yang menunjukkan para kehadiran dari dua yang berbeda subunit di dimurnikan
megacin A-216 persiapan (39). Untuk mengatasi ini pertanyaan, megacin A-
216 telah dimurnikan dari lisat dari mitomy- cin C-
diinduksi budaya dari B. megaterium 216 dan B. megaterium THT (pMGC3). Estimasi
menggunakan uji biologis puncak- kasikan bahwa aktivitas megacin di lysates dari host
asli adalah sekitar 100 kali lipat lebih tinggi daripada di lysates dari re- clone
combinant. Sediaan megacin dianalisis dengan SDS-PAGE. B. megaterium 216 lysates berisi
tiga domi- band nant dengan mobilitas sesuai dengan ~ 40, 30,
dan 15 kDa (Gambar. 3). The 30- dan 15-kDa polipeptida muncul untuk menjadi hadir dalam
jumlah molar yang sama, sedangkan jumlah 40-kDa spesies bervariasi dalam lisat yang
berbeda. Selama pemurnian yang sama , intensitas relatif band tidak berubah. The 30- dan 15-
kDa polipeptida berhubungan dengan yang satu dan þ subunit dijelaskan sebelumnya (39). Dala
m satu sama studi, penulis juga menemukan sebuah 40-kDa polipeptida, yang copurified
dengan megacin A-216, tapi ini lagi polipeptida adalah sebuah kecil komponen dari mereka di
murnikan megacin persiapan dan itu tidak dianggap untuk menjadi bagian dari yang megacin A
-216 sistem (39). Dalam kami tangan, protein 40-kDa, yang ditunjuk μ polipeptida,
adalah sebuah utama komponen dari yang dimurnikan persiapan, ketika tion purifica- dimulai
dari B. megaterium 216 ekstrak. Selain
itu, ini protein adalah yang tunggal dominan protein di lysates dari B. mega terium THT
(pMGC3) dan komponen utama dari dimurnikan megacin diperoleh dari klon rekombinan
(Gambar. 3).

Untuk mempelajari mereka hubungan, tak terpecah tryptic digest dari tiga protein dimurnikan

dari B. megaterium 216 lisat menjadi sasaran analisis MALDI-TOF MS. Diukur massa yang
dibandingkan dengan massa dihitung dari tryptic
diprediksi peptida disimpulkan dari satu urutan dari ORF293A,
-293B, -191 (188), dan -185. Peptida terdeteksi di 30-kDa bagian sampel cocok babak N-
terminal P293A urutan, sedangkan peptida dari yang 15-kDa sampel cocok dengan bagian C-
terminal P293A (Gambar. 4). The tak terpecah tryptic
mencerna dari yang protein dengan yang jelas molekul massa dari ~ 40 kDa ditampilkan
peptida tryptic karakteristik untuk
kedua pendek protein. Namun, sebuah berlimpah komponen dengan MH + di m /
z 2,501.7, tidak cocok setiap diprediksi peptida, yang terdeteksi hanya dalam 15-kDa sampel
(Gambar. 4). Data ini menunjukkan bahwa semua tiga protein persiapan megacin yang
dimurnikan adalah produk dari gen yang sama (ORF293A) dan menyarankan
bahwa suatu dan þ polipeptida rantai yang pembelahan produk dari para full-length μ rantai.
Dalam spektrum massa MALDI-TOF dari mencerna tryptic dari protein 40- dan 30-kDa,
massa yang mewakili peptida [1-14] dan [2-
14] dari P293A yang terdeteksi, yang menunjukkan bahwa residu metionin memulai adalah
pascatranslasi ex - cised dari sebuah fraksi dari yang molekul. MALDI-TOF KASIH ukur
yang menghasilkan suatu rata-rata molekul massa dari 11.832 Da untuk yang utuh þ rantai (dat
a tidak ditampilkan). Dengan
 asumsi bahwa para C terminus yang peptida adalah utuh, ini nilai menyarankan bahwa para þ r
antai dimulai di Val-186. Massa yang dihitung untuk 108 asam amino polipeptida
yang dimulai dengan Val-186 dan diakhiri dengan Met-293 adalah 11.855,
yang hanya berbeda 0,2% dari nilai percobaan. MH diprediksi +
(VKLPVPCFNNSTGCCTFSN NGK) dari yang unik tryptic peptida ( m /
z 2,501.7, dengan carbam-
idomethyl Cys) itu memang terdeteksi di dalam tryptic mencerna dari para þ rantai. Identitasny
a dikonfirmasi oleh analisis PSD dari peptida (Gbr. 5). Data ini menunjukkan
bahwa polipeptida a dan þ adalah produk pembelahan proteolitik antara Gln-185 dan Val-186
dari rantai μ panjang penuh .
The dihitung molekul massa (32.855, 21.018 dan 11.855 Da untuk yang μ , sebuah , dan þ ra
ntai, masing-masing) yang lebih rendah dibandingkan dengan nilai-nilai yang berasal dari
SDS-PAGE ( ~ 40, ~ 30, dan ~ 15 kDa, masing-masing). Tidak ada tanda-tanda
posttranslational fi kasi kation lain dari yang penghapusan dari para N-
terminal metionin. Analisis dari para amino acid urutan menunjukkan bahwa megacin A-216 
adalah sebuah hidrofilik molekul dan bahwa para μ rantai mungkin terdiri dari dua yang
berbeda domain, dengan mereka batas di dalam tempat pembelahan ical hypothet-
antara seorang dan þ rantai. The sebuah rantai adalah kaya di asam residu, sehingga dalam sebu
ah dihitung pI dari 3,92, sedangkan yang þ rantai mengandung banyak residu Lys dan Arg dan
memiliki pI teoritis 9,05.
Berat molekul asli megacin A-216
adalah esti- dikawinkan dengan gel filtrasi pada sebuah Sephacryl S-200 kolom. Megacin A-
216 dielusi dalam pecahan yang sesuai dengan 66-68
kDa (tidak ditampilkan), yang merupakan di sesuai dengan sebelumnya perkiraan (39). Untuk 
menguji dengan komposisi dari asli megacin, dimurnikan megacin itu dielektroforesis dalam s
ebuah 12% poliakrilamida gel bawah turing
nondena- dan nonreducing kondisi. Dua band mayor , band yang lebih intens, band bergerak
lambat dan band yang tidak terlalu intens, band bergerak cepat, terdeteksi (Gbr. 6A, jalur 1 dan
2). Protein dari kedua pita dielektroelusi, dan dianalisis dengan SDS-PAGE (Gambar
6B). Bagian atas (lambat) Band berisi semua tiga rantai
terdeteksi di dalam dimurnikan megacin persiapan, sedangkan yang

 
 ARA. 4. Spektrum MALDI-TOF MS dari digesti triptik tak terpecah dari protein 40-kDa (a),
30-kDa (b), dan 15-kDa (c). Peptida yang dikonfirmasi oleh analisis PSD diberi label dengan
tanda bintang. Massa peptida terminal-N yang diprediksi digarisbawahi.
 

pita bawah hanya berisi sebuah rantai. Dalam tes aktivitas

biologis, hanya satu sampel diambil dari yang lambat band
yang memiliki mega cin aktivitas. Jika 2-mercaptoethanol telah ditambahkan ke megacin sam- 
prinsip keuangan sebelum ke elektroforesis di dalam nondenaturing gel, yang lambat pita
menghilang (Gambar. 6A, jalur 3 dan 4), menunjukkan bahwa penduduk
asli megacin berisi intrachain disulfida obligasi karakter-istic untuk fosfolipase 2 enzim, dan
obligasi ini dapat menjadi penting untuk menjaga strukturnya. The seorang rantai tidak tidak

mengandung Cys residu, yang dapat menjelaskan mengapa pengurangan tidak tidak memiliki
besar efek pada mobilitasnya. The þ rantai, dipisahkan oleh perlakuan 2-mercaptoethanol dari
sisa molekul megacin, mungkin tidak tidak masuk dalam gel karena yang pI adalah lebih
tinggi (9.05) daripada pH gel penyangga. Hal ini kurang jelas
mengapa μ rantai menghilang setelah pengobatan dengan yang mengurangi agen. Sebuah penje
lasan yang mungkin adalah bahwa gangguan dari disulfida obligasi menghasilkan populasi
yang heterogen molekul dengan yang berbeda

 
 

ARA. 5. PSD spektrum dari yang diprediksi N-terminal peptida (MH + = 2,501.7) dari para þ 
subunit. PSD segmen yang dihaluskan dan dasar dipasang
sebelum penggabungan. Untuk kesederhanaan, hanya satu y dan b ion yang diberi
label (nomenklatur sesuai dengan referensi 4). Residu Cys adalah karbamidometilasi.

ARA. 6. (A) Elektroforesis megacin A-216 dalam gel poliakrilamida tidak mendenaturasi
12% pada pH 8.8. Jalur 1 dan 2, dua fraksi megacin A-216
yang dimurnikan setelah kromatografi hidroksiapatit ; jalur 3 dan 4, sampel dari yang sama frak
 si setelah pengurangan dengan etanol 2-mercapto-; S, band yang bermigrasi lambat; F, band
yang bermigrasi cepat. (B) SDS-
HALAMAN analisis dari protein electroeluted dari yang lambat dan cepat band dalam gel
nondenaturing. Lane M, penanda berat molekul; jalur P, dimurnikan megacin A-
216 persiapan setelah Sephacryl-S 200 raphy
chromatog-; lane S, protein diekstraksi dari yang lambat pita; jalur F, protein yang
diekstrak dari jalur cepat . (C) Skema menggambarkan beberapa fitur
penting dari yang megacin A-216 protein. Diisi horisontal bar, segmen 1-185 sesuai
dengan sebuah rantai; kosong bar, segmen 186-
293 cor- menanggapi untuk para þ rantai dengan yang dilestarikan PLA2-seperti domain
superfamili. Protease tempat pembelahan antara residu Gln-185 dan Val-
186 yang ditunjukkan oleh sebuah panah, dan posisi dari sistein residu ditunjukkan
dengan lolipop.
 
 
tersier struktur dan dengan demikian dengan berbeda elektroforesis mo- tanggung.
The dimurnikan megacin persiapan adalah aktif pada protoplas dari sensitif ketegangan B.
megaterium KM, sedangkan B. megaterium 216 kebal terhadap persiapan kami
(data tidak ditampilkan). Biologis aktivitas dari para persiapan tidak tidak menurun setelah 1   ja
m inkubasi pada 65 ° C, sesuai dengan pengamatan sebelumnya menunjukkan stabilitas panas
dari megacin A-216 (14, 28).
 
DISKUSI
Sebelumnya penelitian dijelaskan beberapa aspek dari megacinogeny di B. megaterium 216
ketegangan, termasuk mikrobiologi fenomena dari megacin A-
216 produksi dan lokasi dari para MEGA gen pada salah satu plasmid besar hadir di strain host
(14, 17, 19, 28 , 30, 32, 39–41). Tujuan utama dari
ini pekerjaan adalah yang kloning dan karakterisasi dari yang gen yang
terlibat dalam megacin A-216 produksi dan kekebalan. Jenis
fenotip (megacin produksi dan efek dari UV iradiasi) dari yang utama clone membawa para rek
ombinan plasmid pMGC1 yang mirip dengan yang diamati dengan para orangtua B. megateriu
m 216 regangan (Gambar. 1). The B. megaterium clone (pMGC3) membawa para 5494-bp
HindIII subfragment asli 10 kb insert mantan hibited sebuah lebih
luas penghambatan zona sekitar noninduced koloni. Ini masih harus ditentukan apakah
perbedaan ini disebabkan oleh gen hadir di dalam PstI fragmen tapi hilang dari yang lebih
pendek

Fragmen HindIII atau ke nomor salinan pMGC3 yang lebih tinggi . Pengamatan bahwa kedua

pMGC1 dan pMGC3 menyatakan megacin juga dalam E. coli mendukung penafsiran
bahwa semua gen
memainkan sebuah peran dalam megacinogeny yang hadir di dalam HindIII fragmen. Sebuah 
ORF encoding sebuah 293-asam amino protein (ORF293A) diidentifikasi sebagai gen
encoding megacin A-216. Ini tugas itu berdasarkan pada tiga baris dari bukti:
(i) penghapusan pemetaan, yang menunjukkan bahwa penghapusan dari ORF293A selalu
menghasilkan mega - fenotipe; (ii)
 amino acid urut kesamaan antara para protein dikodekan oleh ORF293A dan beberapa protein
yang dikenal dengan aktivitas PLA2; dan (iii) analisis MS dari peptida triptik yang diperoleh
dari megacin A-216 yang dimurnikan.
Megacin persiapan dimurnikan dari B. megaterium 216 con tained dua utama protein dengan 
jelas molekul massa dari 30 dan 15 kDa dan copurifying protein 40-kDa. Hasil
ini di sesuai dengan sebelumnya pengamatan (39). Analisis MS membuktikan bahwa ketiga
polipeptida dikodekan oleh ORF293A dan ada hubungan produk-prekursor di antara
mereka. Protein terbesar (disebut μ chain) adalah yang full-
length produk dari ORF293A, sedangkan yang lebih
pendek sebuah dan þ rantai muncul untuk menjadi produk dari proteolitik pembelahan antara 
Gln-185 dan Val-186 dari yang μ rantai. The dihitung massa
molekul dari yang μ , sebuah , dan þ rantai (32.855, 21.018, dan 11.855 Da, masing-
masing) yang secara substansial menurunkan daripada yang nilai disimpulkan dari mobilitas
elektroforesis di denaturasi gel. Alasan yang
mungkin dari yang anomali migrasi, di setidaknya di dalam kasus dari yang satu dan μ rantai,
adalah komposisi yang sangat asam (pI 3,92 dan 4,51, masing-masing).
Sediaan megacin kami yang dimurnikan
berisi ketiga rantai. The seorang dan þ subunit yang selalu hadir di kira--kira sama jumlah, sed
angkan yang jumlah dari yang μ rantai adalah variabel. Dalam sediaan yang dimurnikan dari
strain induk B. megaterium 216, dua rantai yang lebih pendek lebih melimpah, sedangkan
sediaan yang dimurnikan dari B. megaterium THT (p- MGC3) didominasi oleh rantai μ (Gbr.
3). Biologis aktif megacin berlari dalam satu band poliakrilamida
asli gel dan mengandung semua tiga rantai. The paling mungkin interpretasi dari hasil ini
adalah bahwa protein full-length,
serta para pembelahan produk, dapat membentuk aktif megacin A-216. The massa molekul asli
megacin A-216 diperkirakan oleh filtrasi gel ( ~ 66 kDa) konsisten dengan sebuah 2 þ 2 , aþμ ,
atau μ 2 komposisi. Protease hipotetis membelah produk
utama telah tidak telah diidentifikasi. Ini juga masih untuk harus ditentukan apa peran protease
pembelahan memiliki di megacin A-216 kegiatan. Nary
Prelimi- pengamatan menunjukkan bahwa para spesifik aktivitas dari megacin dimurnikan dari 
B. megaterium 216 adalah lebih tinggi daripada yang dari megacin dimurnikan dari B.
megaterium THT (pMGC3), menunjukkan bahwa spesifik protease pembelahan mengarah ke
peningkatan aktivitas tertentu.
Dalam ketiga C-terminal dari P293A, sekitar corre- sponding ke þ rantai, sebuah  domain
PLA2 itu  diprediksi oleh pencarian domain dilestarikan. Sebuah PLA2
katalitik motif, CCCnHDkC, diakui oleh PROSITE pencarian. Pra
dicted PLA2 domain, dengan para kehadiran dari semua dilestarikan cata- litik residu, adalah d
i perjanjian dengan para PLA2 aktivitas diukur dalam megacin A-
216 persiapan (28, 39) dan dengan pengamatan menunjukkan bahwa megacin A-216 ikut
campur dengan membran integ - rity (13, 19, 28). Karakteristik motif pengikatan kalsium
untuk Ca-dependent phospholipases atau suatu sinyal urutan karakter-

 
 ARA. 7. Perbandingan wilayah megacin B. megaterium 216 dan wilayah B.
thuringiensis serovar konkukian strain 97-27 genom
(NC_005957). ORFs dengan prediksi protein produk, yang dalam sebuah berpasangan perband
ingan pangsa amino acid urut kesamaan antara yang dua strain,
yang ditunjukkan oleh diisi panah. Sesuai ORF pasangan yang ditunjukkan oleh para sama no
mor di bawah ini anak
panah. Nomor di kurung merujuk ke panjang dari yang protein dalam amino asam. RefSeq gi n
omor untuk para B. thuringiensis hipotetis protein yang 49477011 melalui 49477019 dan berla
ku
untuk yang ORFs di dalam peta dari kiri ke kanan. The genomik lokasi dari para B. thuringiens
is tRNA Cys gen adalah 969.811 ke 969.884.
 

istic untuk disekresikan phospholipases telah tidak telah terdeteksi di dalam megacin A-
216 urutan.
Pencarian BLAST dari database nonredundan dari semua organisme menghasilkan protein
dengan tingkat kemiripan yang rendah dengan megacin A-
216. Kebanyakan dari mereka adalah phospholipases atau hipotetis pro teins, dan para kesamaa
n yang sebagian besar dibatasi untuk para C- terminal daerah dari P293A, di
mana para PLA2 domain yang terletak. Ini adalah yang pertama kasus, untuk kami pengetahua
n, di mana para se- quence dari PLA2 bakteri dengan aktivitas
antibakteri memiliki be- datang dikenal. Hal ini diketahui bahwa beberapa eukariotik PLA2 enz
im menampilkan bakterisida aktivitas. Juga, ada yang bakteri PLA2 protein yang memiliki sebu
ah peran dalam virulensi (profag terkait SLA protein di Streptococcus pyogenes strain dan
ExoU di Pseudo Monas strain) (lihat pada referensi di referensi 35). Dalam bakteri, hanya sebu
ah beberapa protein dengan PLA2 kegiatan telah telah ditemukan begitu jauh. Baru-baru
ini, banyak hipotetis protein urutan di bakteri genom proyek telah telah diprediksi untuk menga
ndung dengan PLA2 domain. P293A memberikan yang tertinggi BLAST skor dengan seperti h
y- pothetical protein dan dengan para kelompok A Streptococcus pro
protein PLA2 terkait fag.
Protein bakteri hipotetis dengan yang terbaik BLAST skor berbagi organisasi umum megacin
A-216: the C-terminal bagian yang
mengandung yang diprediksi PLA2 domain yang didahului oleh sebuah lagi bagian yang
kaya di asam residu. Salah satu dari mereka adalah hipotetis protein 248-residu panjang
BT9727-0864 dari para Bacillus thuringiensis serovar konkukian 97-27 ketegangan. Antar- 
estingly, dalam hal ini kasus, yang kesamaan meluas ke beberapa protein yang disandikan oleh
daerah megacin (Gbr. 7). Enam protein diprediksi lainnya dikodekan oleh, sekitar wilayah 5-kb
yang
sama dari para B. thuringiensis genom berbagi urut kesamaan dengan re- masing- protein dikod
ekan oleh para B. megaterium megacin wilayah. Di samping itu, yang wilayah
berisi sebuah tRNA Cys gen yang memiliki identitas 94% dengan tRNA yang
diprediksi Cys gen di wilayah megacin. Namun, yang pengaturan dari ini gen yang berbeda
dalam B. megaterium dan di B. thuringiensis . Perbandingan dari yang dua daerah genom
menunjukkan bahwa kelompok ini gen mungkin pindah melalui transfer lateral yang antara dua
spesies dan kemudian berevolusi dengan rekombinasi peristiwa.
Penghapusan pemetaan dari para kloning fragmen juga diidentifikasi dengan gen yang
bertanggung jawab untuk kekebalan megacin. Gen
ini (ORF91 [ MEGA imm ]), terletak adjacently untuk para MEGA gen, mengkodekan suatu

pendek, protein asam amino 91. Viabilitas sel menyimpan pMGC24, yang memiliki gen
megacin (ORF293A) tapi tidak
memiliki yang kekebalan gen (ORF91), adalah agak mengejutkan dan masalah.Safe_mode caka
p menunjukkan yang sangat rendah tingkat dari megacin ekspresi di dalam tidak adanya
ORF188 dan ORF73 (lihat di bawah) . Penelitian sebelumnya ditemukan di B. megaterium 216
inhibitor spesifik megacin A-216, yang menghambat kedua aksi bacteriocidic
dan yang aktivitas fosfolipase dan yang disarankan
untuk menengahi imunitas untuk megacin A-216 (26). Meskipun Ochi et al. tidak tidak
menentukan apakah yang hambat zat adalah suatu protein, kita menganggap bahwa itu adalah
identik dengan P91. Urutan ribo- somal mengikat situs sebelumnya ORF91 lebih mirip
dengan yang konsensus dari yang dari ORF293A (Tabel 2), menunjukkan bahwa para protein
kekebalan dinyatakan pada tingkat yang lebih tinggi dari megacin A-216.
Meskipun tujuan awal dari pekerjaan ini adalah
kloning dan karakterisasi MEGA dan mega imm gen, pemetaan
penghapusan mengungkapkan bahwa di setidaknya dua dari tiga lainnya gen terletak di
kloning 5,5 kb fragmen juga penting
untuk megacin produksi (Gambar. 1 dan 2 ). Dari yang tiga berdekatan gen, yang peran dari O
RF188 itu jelas ditunjukkan. Ini tetap untuk harus ditentukan mana dari yang dua lainnya gen (
ORF73 atau tRNA Cys ) diperlukan untuk ekspresi yang efisien dan induksi megacin A-
216. ORF188 dan ORF73 didahului oleh tempat pengikatan ribosom yang baik (terutama
ORF73 [Tabel 2]),
menunjukkan bahwa keduanya menyandikan protein. The diprediksi P188 protein saham sanga
t tinggi kesamaan urutan dengan beberapa faktor sigma dari Gram bakteri positif; dengan
demikian, perannya mungkin modifikasi spesifisitas inisiasi RNA polimerase ,
yang mengarah ke transkripsi gen megacin. Lemah kesamaan terdeteksi antara
P73 dan sebuah beberapa, sebagian besar hipotetis, bakteri protein tidak tidak
memungkinkan suatu mirip prediksi untuk nya fungsi. Meskipun ORF73 adalah lebih mungkin
diperlukan untuk ekspresi megacin dari para tRNA Cys gen, peran gen terakhir tidak dapat
dikesampingkan, mengingat konten Cys tinggi (14/293) dari megacin A-216
 protein. Dalam hal ini konteks, itu adalah layak menyebutkan bahwa yang halus perbedaan
fenotipik diamati antara pMGC10,
yang usu- sekutu menghasilkan beberapa pertumbuhan penghambatan sekitar yang koloni, dan 
pMGC29, yang selalu diuji negatif, menunjukkan bahwa para glu- taredoxin
seperti P85 mungkin juga memiliki beberapa peran dalam ekspresi megacin A-
216 . Hal ini menggoda untuk berspekulasi bahwa ini efek berkaitan dengan

aktivitas reduktase disulfida diduga dari P85 dan sejumlah besar sistein dalam protein megacin.
Urutan (AAAAAAAGTTGCCATTTGGTCAACTTT
TTTTCTTTT) menyerupai rho-independent transkripsi terminator (7) ditemukan hilir ORF73,
antara posisi 4191 dan 4226. Kurangnya urutan yang
sama antara ORF188 dan ORF73 menunjukkan bahwa para dua gen mungkin membentuk sebu
ah operon. Studi berfokus pada para genetik latar belakang dari megacinogeny dan pada
mekanisme aksi megacin dan kekebalan yang berlangsung di laboratorium kami.
 
UCAPAN TERIMA KASIH
Ini pekerjaan itu didukung oleh para Hungaria Ilmiah Penelitian Fund (OTKA) memberikan
T038343 dan T049096.
Kami berterima kasih kepada Tomoyuki Sako atas plasmid
pHY300PLK, Katalin Fodor untuk B. megaterium THT Kan r , dan Ibolya Anton dan Lilla Lip
pai Csa n ´ a d y fo r technica l bantuan . W e als o daripada k P ´ a l Venetiane r untuk menduk
ung G.B. selama satu saja dari ini proyek dan E '  va Hunyadi- Gul y ' a s sebuah d E '  va Kleme
nt untuk bantuan di dalam awal fase dari ini bekerja.
REFERENSI
1. Altschul, S. F., T. L. Madden, A. A. Schaffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller, dan D. J. 
Lipman. 1997. gapped BLAST dan PSI-BLAST: a baru generasi program database
pencarian protein. Res asam nukleat. 25: 3389–3402.  
2. Altschul, S. F., J. C. Wootton, E. M. Gertz, R. Agarwala, A. Morgulis, A. A. Schaffer, d
an Y. K. Yu. 2005. Pencarian basis data protein menggunakan matriks substitusi yang
disesuaikan komposisi . FEBS J. 272: 5101–5109.  
3. Balsinde, J., M. A. Balboa, P. A. Insel, dan E. A. Dennis. 1999. Peraturan dan penghamba
tan dari fosfolipase A2. Annu. Rev Pharmacol. Toksikol. 39: 175– 189.  
4. Biemann, K. 1990. Lampiran 5. Nomenklatur untuk ion fragmen peptida (ion
positif). Metode Enzymol. 193: 886–887.  
5. Cotter, P. D., C. Hill, dan R. P. Ross. 2005. Bakteriosin: mengembangkan kekebalan bawa
an untuk makanan. Nat. Pdt Microbiol. 3: 777–788.  
6. de Castro, E., C. J. Sigrist, A. Gattiker, V. Bulliard, P. S. Langendijk-
Genevaux, E. Gasteiger, A. Bairoch, dan N. Hulo. 2006. ScanProsite: detec- tion dari PRO
 SITE tanda tangan pertandingan dan ProRule terkait fungsional dan residu struktural dalam
protein. Res asam nukleat. 34: W362 – W365.  
7. de Hoon, M. J., Y. Makita, K. Nakai, dan S. Miyano. 2005. Prediksi dari terminator
transkripsi di Bacillus subtilis dan spesies terkait. PLoS Comput. Biol. 1: e25.  
8. Drider, D., G. Fimland, Y. H ´ e chard, L. M. McMullen, dan H. P r ´ e vost. 2006.
Kisah berkelanjutan bakteriosin kelas IIa. Mikrobiol. Mol. Biol. Wahyu 70: 564–582.  
9. Favret, M. E., dan A. A. Yousten. 1989. Thuricin: yang bakteriosin yang
dihasilkan oleh Bacillus thuringiensis . J. Invertebr. Pathol. 53: 206–216.  
10. Gillor, O., L. M. Nigro, dan M. A. Riley. 2005. Bakteriosin hasil rekayasa genetika dan
potensinya sebagai antimikroba generasi penerus. Curr. Pharm. Des. 11: 1067–1075.  
11. Helmann, J. D., dan C. P. Moran, Jr. 2002. RNA polimerase dan faktor sigma. p. 289–
312. Dalam AL Sonenshein, JA Hoch, dan R. Losick (ed.), Bacillus subtilis dan kerabat
terdekatnya: dari gen ke sel. ASM Press, Washington, DC.  
12. Heng, N. C. K., P. A. Wescombe, J. P. Burton, R. W. Jack, dan J. R. Tagg.  
2007. Keragaman bakteriosin dalam bakteri Gram-positif, hal. 45–92. Di
MA Riley dan MA Chavan (ed.), Bacteriocins: ekologi dan evolusi. Springer-Verlag, Berlin,
Jerman.
13. Holland, IB 1962. pengamatan lebih lanjut tentang sifat-sifat megacin, sebuah bakteriosin
yang dibentuk oleh Bacillus megaterium . J. Gen. Microbiol. 29: 603–614.  
14. Holland, I. B. 1961. The pemurnian dan sifat dari megacin, sebuah bakteriosin dari Bacillus
megaterium . Biochem. J. 78: 641–648.  
15. Holland, I. B., dan C. F. Roberts. 1964. Beberapa sifat dari suatu baru bakteriosin dibentu
k oleh Bacillus megaterium . J. Gen. Microbiol. 35: 271–285.  
16. Ishiwa, H., dan H. Shibahara-Sone. 1986. New shuttle vektor untuk Esche- richia
coli dan Bacillus subtilis . IV. Nukleotida urutan pHY300PLK
dan beberapa properti di kaitannya dengan transformasi. Jpn. J. Genet. 61: 515–528.  

17. Ivanovics, G., dan L. Alf o ¨ldi. 1954. Sebuah baru antibakteri prinsip: megacine. Sifat 17
4: 465.  
18. Ivanovics, G., L. Alf o ¨ldi, dan E. A ´  brah a ´m . 1955. Spektrum antibakteri dari  
megacine. Zentralbl. Bakteriol. 163: 274–280.
19. Ivanovics, G., L. Alf o ¨ldi, dan E. Nagy. 1959. Modus dari tindakan dari megacin.  
J. Gen. Microbiol. 21: 51–60.
20. Klaenhammer, T. R. 1993. Genetika dari bakteriosin
yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat . FEMS Microbiol. Wahyu 12: 39–85.  
21. Kunnimalaiyaan, M., dan P. S. Vary. 2005. Molekuler karakterisasi dari plasmid
pBM300 dari Bacillus megaterium QM B1551. Appl. Mengepung. Mi- crobiol. 71: 3068–
3076.  
22. Marchler-Bauer, A., dan SH Bryant. 2004. CD-
Search: penjelasan domain protein dengan cepat. Res asam nukleat. 32: W327 – W331.  
23. Marjai, E., dan G. Ivanovics. 1964. The efek dari berbagai antikanker agen pada sistem
diinduksi dari Bacillus megaterium . Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 11: 193–198.  
24. McLaughlin, J. R., C. L. Murray, dan J. C. Rabinowitz. 1981. Unik fitur di dalam ribos
om mengikat situs urut dari yang gram positif Staphylococcus aureus gen beta-laktamase. J.
Biol. Chem. 256: 11283–11291.  
25. Moran, C. P., N. Lang, S. F. LeGrice, G. Lee, M. Stephens, A. L. Sonenshein,  
J. Pero, dan R. Losick. 1982. nukleotida urutan yang sinyal yang inisiasi transkripsi dan
translasi dalam Bacillus subtilis . Mol. Gen. Genet. 186: 339–346.
26. Ochi, T., Y. Yanagase, Y. Higashi, K. Inoue, dan T. Amano. 1970. Sebuah spesifik inhi
bitor dari megacin A dari Bacillus megaterium memproduksi megacin A. Biken J. 13: 63-
76.  
27. Ochi, T., K. Yano, M. Ozaki, Y. Higashi, dan K. Inoue. 1971.
Studi tentang kekebalan ke megacin A: kerentanan dari fosfolipid untuk fosfolipase A aktivit
as dari megacin A. Biken J. 14: 29-36.  
28. Ozaki, M., Y. Higashi, H. Saito, T. An, dan T. Amano. 1966. Identitas dari megacin A d
engan fosfolipase A. Biken J. 9: 201-213.  
29. Priest, FG 1993. Sistematika dan ekologi Bacillus . p. 3–16. Dalam A. L. Sonenshein, JA
Hoch, dan R. Losick (ed.), Bacillus subtilis dan bakteri gram positif lainnya: biokimia,
fisiologi, dan genetika molekuler . Masyarakat Amerika untuk Mikrobiologi,
Washington, DC.  
30. Riabchenko, N. F., dan K. Rost a ´s . 1983. Penghapusan mutan dari megacinogenic pBM
309 plasmid dari Bacillus megaterium . Gen 25: 67–70.  
31. Rocha, E. P., A. Danchin, dan A. Viari. 1999. Terjemahan dalam Bacillus subtilis : peran 
dan tren dari inisiasi dan terminasi, wawasan dari sebuah genom anal- ysis. Res asam
nukleat. 27: 3567–3576.  
32. Rost sebuah ' s , K., S. V. Dobritsa, A. P. Dobritsa, C. Koncz, dan L. Alf o LDI. 1980.
Plasmid megacinogenic dari Bacillus megaterium 216. Mol. Gen. Genet. 180: 323–329.  
33. Sambrook, J., E. F. Fritsch, dan T. Maniatis. 1989. kloning Molekuler: a laboratorium
manual, 2nd ed. Press Laboratorium Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, NY.  
34. Scholle, M. D., C. A. White, M. Kunnimalaiyaan, dan P. S. Vary. 2003. Pengurutan dan
karakterisasi pBM400 dari Bacillus
megaterium QM B1551. Appl. Mengepung. Mikrobiol. 69: 6888–6898.  
35. Sitkiewicz, I., K. E. Stockbauer, dan J. M. Musser. 2007. Enzim fosfolipase A2 bakteri
yang disekresikan : hidup lebih baik melalui fosfolipolisis. Tren Microbiol. 15: 63–69.  
36. Stahl, S. 1989. Kegiatan bacteriocinogenic baru: megacin BII
dikodekan oleh plasmid PSE 203 di strain dari Bacillus megaterium . Lengkungan. Mikrobio
l. 151: 159– 165.  
37. Tatusova, T. A., dan T. L. Madden. 1999. BLAST 2 Urutan, sebuah baru alat untuk mem
bandingkan protein dan nukleotida urutan. FEMS Microbiol. Lett. 174: 247–250.  
38. Vary, P., R. Biedendieck, T. Fuerch, F. Meinhardt, M. Rohde, W.-D. Decker , dan D. 
Jahn. 2007. Bacillus megaterium —dari bakteri tanah sederhana menjadi inang produksi
protein industri. Appl. Mikrobiol. Biotechnol. 76: 957–967.  
39. Von Tersch, M. A., dan B. C. Carlton. 1983. Bakteriosin dari Bacillus megaterium ATC
C 19213: studi banding dengan megacin A-216. J. Bac- teriol. 155: 866–871.  
40. Von Tersch, M. A., dan B. C. Carlton. 1983. Megacinogenic plasmid dari  
Bacillus megaterium . J. Bacteriol. 155: 872–877.
41. Von Tersch, M. A., dan B. C. Carlton. 1984. Molekuler kloning dari struktural dan kekeb
alan gen untuk megacins A-216 dan A-19.213 di Bacillus megaterium . J.
Bacteriol. 160: 854–859.  
42. Vorobjeva, I. P., I. A. Khmel, dan L. Alf o ¨ldi. 1980. Transformasi dari Bacillus megate
rium protoplas oleh plasmid DNA. FEMS Microbiol. Lett. 7: 261–263.  
Teks asli
Purifted biologically active megacin A-216 prep- arations contained three proteins.
Sumbangkan terjemahan yang lebih baik
Biochem. J. (1961) 78, 641 641             

Pemurnian dan Sifat Megacin, Bakteriosin dari

Bacillus megaterium
OLEH 1. B. HOLLAND
Unit ARC untuk Mikrobiologi, Departemen Mikrobiologi,
Universitas, Sheffield 10
(Diterima 26 Agustus 1960)

Banyak strain dari spesies Enterobacteriaceae, Pseudomonas / uoræcens dan Pasteurella pesti8 menghasilkan agen
antibakteri yang dapat difusi, larut dalam air, dan untuk zat seperti protein ini telah diberikan nama kelompok
bakteriosin (lih. Jacob & Wollman, 1959). Kemampuan untuk menghasilkan bakteriosin dan kepekaan terhadapnya
berada di bawah kendali genetik. Bakteriosin paling aktif melawan strain produsen atau spesies terkait dan memiliki
pengaruh yang kecil pada spesies lain. Alföldi & Ivánovics (1954) memberi nama megacin untuk agen antibakteri
yang dibebaskan oleh beberapa strain Bacillu8 megaterium. Sejumlah kecil megacin diproduksi oleh kultur tumbuh
dari strain pembentuk megacin. Namun, jika biakan diiradiasi dengan dosis optimal sinar ultraviolet, semua sel
tampaknya diinduksi untuk mensintesis megacin dan akhirnya lisis massa biakan terjadi dengan munculnya megacin
dalam jumlah besar dalam filtrat biakan. Sifat dan cara pembentukan zat ini membuat Ivánovics & Alföldi (1957)
menyimpulkan bahwa megacin adalah bakteriosin. Bakteriosin yang paling banyak dipelajari adalah agen
antibakteri atau kolisin yang diproduksi oleh Escherichia coli (lihat Fredericq, 1957). Seperti bakteriofag, kolisin
teradsorpsi ke situs reseptor spesifik pada permukaan sel sensitif, tetapi karena tidak bereproduksi dalam sel
tersebut, kolisin dibedakan dengan jelas dari bakteriofag (Fredericq, 1957). Colicin K, yang dibentuk oleh E. coli K
235, telah dimurnikan dan preparasi yang tampaknya homogen mengandung protein yang berhubungan erat dengan
antigen O bakteri (Goebel & Barry, 1958).
Modus aksi bakteriocing, termasuk megacin, tidak diketahui. Ivánovics, Alföldi & Nagy (1959), menggunakan
preparat yang dimurnikan sebagian, memperoleh beberapa bukti bahwa megacin bekerja pada membran sitoplasma
sel sensitif. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi sediaan megacin yang sangat dimurnikan dan untuk
menyelidiki sifat fisikokimia dan akhirnya sifat biologisnya.
41
MATERIAL DAN METODE
Organisme. Strain B. megaterium yang memproduksi megacin 216 dan B. megaterium 207 .m yang sangat sensitif
terhadap megacin diperoleh dari koleksi Profesor Ivánovics dan Dr Alföldi di Universitas Kedokteran, Szeged,
Hongaria.
Medium. Strain 216 ditumbuhkan di media, awal pH 7 • 0, yang mengandung 1  /0 (w / v) Oxoid tryptone, 0 • 5  /0
0  0 

(w / v) ekstrak Difco ragi dan 0 • 5  /0 (w / v) Lab Lemco. Media piring untuk tes megacin dan jumlah yang layak terdiri
0 

1  /0 (w / v) Oxoid tryptone, 1  /0 (w / v) ekstrak ragi (Yeatex), 1  /0 (w / v) NaCl dan 2% (w / v) agar, pada pH 7 • 2.

0  0  0 

Uji Megacin. Sampel diuji untuk kandungan megacin dengan teknik yang pada dasarnya sama seperti yang dijelaskan
oleh Ivánovics & Alföldi (1957). Suspensi dicuci dari regangan 207. m dalam kaldu dari 14 jam. subkultur disesuaikan
dengan kepunahan (E) sebesar 610 mg. Dari suspensi ini saya ml. dicampur dengan ml. dari agar kaldu leleh [0 • 7  (w /
0/0 

v) agar] dan dituangkan di atas permukaan piring agar-agar. Tetes standar pengenceran serial dari larutan yang diuji
ditempatkan pada pelat unggulan dengan loop platina yang dilas menghasilkan kira-kira 0 • 02 ml. Setelah inkubasi
semalaman pada 37  , pelat ditempatkan untuk pemeriksaan pada layar kaca tanah yang diterangi dari
0 

bawah. Pengenceran tertinggi yang memberikan area pertumbuhan terhambat yang terlihat jelas ditentukan. Kebalikan
dari pengenceran menghasilkan titer megacin dalam unit / ml. Dalam mempersiapkan pengenceran serial, langkah
pengenceran sepuluh dan lima kali lipat digunakan pada awalnya dan langkah 1 • 25 hingga 2 kali lipat di daerah titik
akhir. Solusi dari aktivitas yang diketahui disertakan dalam setiap seri pengujian.
Pertumbuhan strain 216 dan induksi pembentukan megacin. Organisme ini tumbuh pada suhu 37  di 2 • 41. botol kaca
0 

berisi I l. dari kaldu nutrisi dan diinokulasi dengan 16 jam. subkultur (700 pg. berat kering sel / botol). Setiap botol
dilengkapi dengan sistem aerasi paksa dan pengurangan busa dengan penambahan 5 ml. dari emulsi antifoam silikon F
(dipasok oleh Hopkin dan Williams Ltd.) diencerkan dengan 3 vol. air. Udara terkompresi dipanaskan sampai
37  dengan melewati silinder kaca yang dikemas dengan manik-manik kaca dan diikat dengan pita pemanas listrik yang
0 

diatur. Udara dijenuhkan dengan air melalui saluran melalui botol pencuci dan kemudian disterilkan melalui saluran a
filter kapas-wol. Dengan menggunakan manifold, lima botol bisa diangin-anginkan secara bersamaan. Pertumbuhan
organisme diikuti dengan pengukuran perubahan kekeruhan. Saat kultur memasuki fase pertumbuhan eksponensial
(E610 mg
0 • 25), 200 ml. sampel telah dihapus secara berturut-turut dan
Bioch. 1961, 78
diradiasi selama 60 detik. dalam piring enamel steril (35 cm. x 30 cm.; kedalaman cairan 2 mm.) ditempatkan 50
cm. dari lampu uv. Selama iradiasi, kultur diangin-anginkan dengan mengayun perlahan baki, dan setelah 60
detik. eksposur setiap sampel dengan cepat dipindahkan ke labu steril. Seluruh kultur yang diradiasi akhirnya diganti
dalam botol pertumbuhan dan inkubasi dilanjutkan. Prosedur inkubasi dan iradiasi dilakukan pada suhu ruangan
konstan 37  untuk menghindari kejutan suhu. Setelah iradiasi, sel terus berkembang selama 80-90 menit. dan kemudian
0 

terjadi lisis cepat dengan pelepasan megacin secara bersamaan (Gbr. l). Puing bakteri dan sel utuh yang tersisa
dihilangkan dari lisat dengan sentrifugasi kecepatan rendah pada suhu 4  . Supernatan bening merupakan bahan awal
0 

untuk prosedur pemurnian dan biasanya mengandung 40.000—80.000 unit aktivitas megacin / ml.
Sumber sinar ultraviolet. Kromatolit Hanovia rendah. Lampu merkuri bertekanan digunakan tanpa filter dan
ditempatkan 50 cm. di atas suspensi bakteri. Energi yang dipancarkan oleh lampu pada jarak ini dalam sumbu yang
diterapkan secara nominal berjumlah x 10  erg / cm.  , dan setidaknya 75  /0 dari total emisi berada di 2537Å (data yang
8  2  0 

disediakan oleh Hanovia Ltd).

Spektrofotometri. Kekeruhan (E) suspensi dan kultur bakteri ditentukan pada 610 mg dengan spektrofotometer
Unicam SP. 600 dengan I cm. sel kaca. Estimasi asam nukleat dan spektrum serapan protein ditentukan dengan
spektrofotometer Unicam SP. 500 dengan I-cm. sel silika.
Aktivitas tertentu. Aktivitas spesifik dari semua sediaan didefinisikan sebagai unit aktivitas megacin / mg. protein.
Protein. Ini ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu yang dijelaskan oleh Layne (1957 a). Pengukuran dilakukan
pada 500 mg dan standarnya adalah kristal sapi

              200 240 280 320 360 400440             

Waktu (menit)
Gambar l. Induksi pembentukan megacin. E610mu dari kultur B. megaterium strain 216 sebelum dan sesudah iradiasi
dengan sinar uv. Lisat terakhir mengandung 80.000 unit megacin / ml. Kultur kontrol non-iradiasi tidak lisis dan
supernatan tidak mengandung megacin. A, Kontrol; O, budaya iradiasi.
fraksi albumin plasma V (Armor Laboratories). Zat yang mengganggu selalu dihilangkan dengan dialisis di antara perkiraan.
Asam nukleat. E dan larutan ditentukan 260 mu, dan kandungan asam nukleat dihitung dengan metode Warburg & Christian
seperti yang dijelaskan oleh Layne (1957 b).                           
Nitrogen dan fosfor. Nitrogen ditentukan dengan  teknik mikro-Kjeldahl dan fosfor dengan metode Berenblum & Chain
(1938).
Karbohidrat. Sediaan megacin dihidrolisis selama 2 jam. pada 100  dalam 2N-H2S04, dan hidrolisat diaplikasikan pada kolom
0 

kecil (5 cm.) dari resin Dowex-50 (bentuk X8; H +) seperti yang dijelaskan oleh Weibull & Bergström (1958). Gula netral
dielusi dengan air dan diperkirakan dengan metode anthrone (Scott & Melvin, 1953).
Buffer fosfat. Buffer fosfat yang digunakan seluruhnya dibuat dari larutan-M NaH2PO, dan N½HPO ,.
Diethylaminoethylcelhdose. Waa ini dibuat dari bubuk selulosa SolkaFloc SWB (Sober & Peterson, 1956). Selulosa yang telah
disiapkan disesuaikan dengan pH dengan penambahan M-NaH2P04 dan kemudian dicuci bersih dengan buffer 5 mMphosphate,
pH 7 • 0. Kolom yang disiapkan seperti dijelaskan oleh Sober & Peterson pertama kali dicuci dengan penyangga awal dan
dibiarkan menyeimbangkan pada 4  sebelum digunakan. Elusi dilakukan pada suhu 4  dan dengan kecepatan 12 ml. eluate / jam.
0  0 
 Elektroforesis. Ini dilakukan dengan peralatan Perkin-Elmer, Model 38 A, dengan 3 ml. sel, 66 mM-buffer fosfat, pH 6 • 8,
dan potensi 170v pada 12 • 5 mA. Proses elektroforesis juga dilakukan di peralatan mikroelektroforesis Kern, Model LK 30,
yang dilengkapi dengan sistem optik interferensi Jamin yang dimodifikasi (dipasok oleh Kern dan Co Ltd, Aarau, Swiss). Proses
diselesaikan pada beberapa nilai pH, dengan buffer O • 02M-fosfat dan pada tegangan yang diberikan IOv / cm. Foto dari
anggota tubuh yang turun digunakan untuk interpretasi, dan posisi pinggiran diukur dengan mikrokomparator. Sebelum semua
elektroforesis, larutan protein didialisis dengan buffer yang sesuai selama 16 jam.
Ultrasentrifuging. Sampel megacin dalam buffer M-fosfat, pH 7 • 0, diperiksa dalam ultrasentrifuge analitik Model Spinco
pada suhu kamar. Koefisien sedimentasi dihitung dari ordinat maksimum kurva gradien menurut Schachman (1957) dan
dikoreksi menjadi nilai S20 w. Karena konsentrasi-ketergantungan S ditemukan minimal koefisien difusi semu, D, dihitung dari
pola kecepatan sedimentasi menurut Lamm (1929), di mana

(1 -  st),
a 

dan akhirnya dikoreksi menjadi nilai D20 w. Jejak yang diperbesar (x lima) dari pola pelarut dan larutan yang sebanding
ditumpangkan, dan garis dasar digambar di bawah puncak schlieren. Ketinggian ordinat maksimum, Hmax., Ditentukan, area, A,
diukur dengan planimeter dan nilai yang diperoleh dikoreksi untuk pengenceran radial (Svedberg & Pedersen, 1940). Momenta
kedua, c, dari kurva gradien dihitung dan dikoreksi menurut Hall & Ogston (1956).
Enzim. Kristal pepsin, tripsin dan kimotripsin diperoleh dari Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ, USA
Ribonuclease diperoleh dari Sigma Chemical Co., St Louis 13, Mo., USA, dan deoxyribonuclease dari L. Light and Co. Ltd.,
Colnbrook  Bucks.
HASIL
Aktivitas lisat awal dipertahankan selama beberapa bulan pada suhu 4  , dan produk kering beku yang diperoleh
0 

dari lisat tetap aktif selama beberapa bulan jika disimpan pada suhu -22  . Seluruh sediaan kering larut dalam kaldu
0 

atau buffer fosfat (O • 02M, pH 7 • 0). Dalam lisat asli, megacin stabil selama beberapa jam sepanjang kisaran pH
pada 4  . Prinsip aktif, bagaimanapun, diendapkan antara pH 4 dan tetapi dilarutkan lagi dengan penambahan asam
0 

atau alkali (Gbr. 2).

Pemurnian megacin
Presipitasi isoelektrik. Akumulasi lisat (kira-kira 501.) didinginkan sampai 8  dan disesuaikan dengan pH dengan
0 

penambahan hati-hati, dengan pengadukan, N-HCI (kira-kira 40 ml./l. Lisat dibutuhkan). Endapan berat terbentuk,
dan, setelah 10 menit. pengadukan lebih lanjut, endapan dikumpulkan dengan menggunakan sentrifus Kecepatan
Tinggi Servall aliran kontinu (tipe SS-I) pada 200 ml./min. (15.000 putaran / menit, 30.000 g). Supernatan yang
tidak aktif dibuang, endapan dilarutkan dalam 4 • 21. buffer O • 02M-fosfat, pH 7 • 0, dan larutan diklarifikasi
dengan sentrifugasi berkecepatan tinggi. Jelas

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
Gambar 2. Kelarutan megacin pada nilai pH yang berbeda. Sampel dari lisat mentah diatur ke pH yang sesuai pada 4  , disimpan
0 

selama 10 menit, dan endapan apapun dihilangkan dengan sentrifugasi. Supernatan dibawa ke pH sebelum diuji aktivitas
megacin (O) dan protein
Larutan mengandung 83% aktivitas megacin awal dengan peningkatan aktivitas spesifik "kali lipat" (Tabel
1). Larutan akhirnya didialisis selama 30 jam terhadap 50 vol. buffer fosfat pada 4  . 0 
 Fraksinasi amonium sulfat. Larutan yang didialisis dibawa ke saturasi 50%  pada suhu 4  , dan pH
0 

dipertahankan dengan penambahan larutan NHS encer. Campuran ini

diaduk selama 10 menit. dan kemudian dibiarkan selama 30 menit. untuk memungkinkan endapan halus
mengendap. Endapan mengandung sedikit aktivitas megacin dan dihilangkan dengan sentrifugasi pada
3000g selama 20 menit. pada 0  . Supernatan kemudian dibawa ke 60  /0 kejenuhan dan prosedur yang
0  0 

sama diikuti. Endapan, yang berisi sebagian besar megacin, dikumpulkan dengan sentrifugasi dan
dilarutkan dalam 400 ml. dari O • dapar 02M-fosfat, pH 7 • 0. Supernatan dibuang. Pada tahap ini persiapan
berisi 52  dari aktivitas awal dengan peningkatan dua kali lipat dalam aktivitas spesifik (Tabel
0/0 

1). Solusinya kemudian didialisis terhadap 100 vol. buffer fosfat dan akhirnya dibekukan menjadi padatan
kuning.
Kromatografi pada diethylaminoethylcelluloæ. Sediaan pada tahap ini masih mengandung sejumlah besar
asam nukleat, yang dihilangkan dengan kromatografi pada dietilaminoetilselulosa (DEAE-selulosa). Bahan
kering dilarutkan dalam air dan didialisis terhadap buffer 5 mM-fosfat, pH 7 • 0. Dalam percobaan awal 
ml. (45 mg. Berat kering protein) diaplikasikan ke dalam 2 g. kolom dan dicuci dengan beberapa volume
buffer. Kolom dipasang di atas pengumpul fraksi yang dioperasikan dengan penghitung tetes dan fraksi 90
tetes (4 • 5 ml.) Dikumpulkan. Protein dielusi secara bertahap dengan 20 ml. volume dari 5 111Mphosphate
buffer, pH 7 • 0, mengandung peningkatan jumlah NaCl. Munculnya protein dan asam nukleat dalam eluat
diikuti sebagai fungsi dan aktivitas Megacin dikaitkan dengan dua puncak protein utama (Gbr. 3). Kemudian
ditemukan bahwa jika penambahan O • 35M-NaCl tertunda dan elusi dilanjutkan dengan O • 3M-NaCl,
puncak yang lebih kecil dieliminasi dan protein dan megacin dielusi sebagai puncak tunggal. Dalam
percobaan skala besar (Gbr. 4) dengan 30 g. Kolom DEAE-selulosa, 100-drop fraksi (5 ml.) Dikumpulkan:
elusi kembali secara bertahap dan megacin dielusi dengan 300 ml. dari M-NaCl. Fraksi aktif, yang
terkandung dalam tabung 160—198, dikumpulkan, didialisis terhadap 0 • 02 M-buffer fosfat, pH 7 • 0, dan
dikering-bekukan menjadi bubuk putih yang bebas dari asam nukleat. Fraksi 199-210 hanya berisi 1  /0 dari0 

kegiatan awal dan dibuang. Fraksi asam nukleat dielusi pada konsentrasi garam yang lebih tinggi (Gbr. 3)
memberikan reaksi Folin negatif dan tidak menunjukkan aktivitas megacin. Itu
41-2
pemulihan total megacin yang diterapkan ke kolom adalah 84% dengan peningkatan dua kali lipat
dalam aktivitas spesifik .
Prosedur pemurnian lengkap menghasilkan pemulihan keseluruhan 42  / megacin yang awalnya ada,
0 

dengan peningkatan aktivitas spesifik 21 kali lipat (Tabel 1).

Pemurnian lebih lanjut. Beberapa upaya dilakukan untuk memurnikan megacin lebih lanjut; ini termasuk
elusi gradien dari DEAE-selulosa dengan berbagai gradien NaCl, adsorpsi diferensial dan elusi dari gel
kalsium fosfat (Tigelius & Swingle, 1951) dan fraksinasi lebih lanjut dengan  Semua metode ini gagal
menghasilkan sediaan dengan peningkatan aktivitas spesifik.

Asam
nukleat
 10 26 50 58
34 4
Fraksi no.
M
03M 0-4M 0-8M
8-5

80

7-5

20

1-5

10

O • 25M 035M 0-5M

Concn. dari NaC1
Gambar. 3. Elusi megacin dari a 2 g. kolom DEAEcellulose; muatan kolom 45 mg. wt kering. protein (dalam 
ml.). Aktivitas Megacin; bahan menyerap pada 280 mg.                           
Bukti homogenitas preparasi megacin, dan beberapa properti fisikokimia8
Elektroforesis. Preparat megacin yang telah dimurnikan dielektroforesis pada pH 6 • 1, dan  dalam alat mikro-
elektroforesis Kern. Dalam setiap kasus, persiapan menunjukkan hanya satu kelompok pinggiran yang bermigrasi
dengan cepat menuju anoda (Gbr. 5). Pengukuran dilakukan dari foto-foto yang diperoleh dan perpindahan setiap
pinggiran diplot dengan nomor pinggiran. Untuk setiap nilai pH, hasilnya adalah kurva sigmoid simetris tunggal
atau hampir simetris, yang merupakan karakteristik dari sistem satu komponen. Tidak mungkin untuk
menyelesaikan proses pada nilai pH yang lebih rendah karena megacin dengan cepat mengendap di bawah pH 5 •
5. Elektroforesis juga dilakukan dengan peralatan Perkin — Elmer

30

2-0
 1-5

10

8114 130 146 162 178 194

210
Pecahan
tidak.
              0-25 juta O • 35 juta             
Concn. dari NaC1
Gambar 4. Elusi megacin dari 30 g. kolom DEAEcellulose; muatan kolom 1 • 29 g. wt kering. protein (34 ml.). Elusi bahan
yang hanya menyerap 280 mg diukur.

Tabel 1. Pemurnian megacin

Pemulihan total
10—4 x Konsentrasi Kegiatan. Aktivitas Faktor Spesifik Protein (mg./ml.) Aktivitas
7-5
              10 81 1-52 33                                         
9 50 71                                                
10 51 38-0 75                                                           
              42 14-0 160                           

Lisat mentah 6
Residu yang diolah dengan 49
ha
50-60  /0 
0 
fraksi 270
Bahan kering beku 2800
DEAE-selulosa diobati 23.00
(unit / ml.)
645

(b)

Gambar 5. Pola elektroforesis diperoleh dengan peralatan mikro-elektroforesis Kern. Jalur selnya 3 cm. ; anggota badan
turun hanya ditunjukkan: (a) 0 • 7  /0 (w / v) larutan protein, pH 6 • 1, gambar setelah 14 menit .; (b) (w / v) larutan protein,
0 

pH 7 • 1, setelah 15 menit; (c) 0 • 5  (w / v) larutan protein, pH 7 • 9, setelah 18 menit.

0/0 

Gambar 6. Elektroforesis megacin (Perkin-Elmer apparatus). Larutan protein (0 • 74  , w / v) dalam 0 • 06 M-buffer fosfat, pH 6
0/6 

• 8, gambar setelah 34 menit; € menunjukkan tungkai turun dan menunjukkan tungkai menaik dari sel elektroforesis.

di  vH 6 • 8. Persiapan memberikan puncak simetris tunggal pada kedua tungkai menaik dan menurun (Gbr. 6)
l 

dengan mobilitas elektroforetik - 11 • 2 x 10—5 cm.  dtk. —Aku v — 1. Dari nilai mobilitas elektroforetik yang
2 

diperoleh sejauh ini (lihat Tabel 2) ekstrapolasi ke mobilitas nol memberikan nilai antara pH dan untuk titik
isoelektrik megacin.
Ultrasentrifuging. Sediaan megacin yang dimurnikan diperiksa dalam ultrasentrifuge analitik pada
konsentrasi protein yang berbeda. Sebelum disentrifugasi, sampel protein didialisis terhadap buffer M-fosfat,
pH 7 • 0. Terlepas dari konsentrasi protein, pola yang diperoleh identik, satu batas simetris diamati pada setiap
kasus (Gbr. 7). Laju sedimentasi hanya sangat sedikit bergantung pada konsentrasi protein, yang menunjukkan
bahwa sediaan, dalam kondisi ini, terdiri dari molekul yang relatif simetris. Nilai ekstrapolasi yang dikoreksi
untuk S adalah 4 • 35 x 10 —13 detik. Ketergantungan konsentrasi S minimal; Oleh karena itu, penajaman
sendiri batas sedimentasi diabaikan dan penyebaran batas dianalisis langsung dari koefisien difusi yang
tampak dan momen kedua dari kurva gradien. Sebagai uji lanjut homogenitas D dan dihitung pada berbagai
waktu selama kecepatan sedimentasi dijalankan. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 8, meningkat secara
linier dengan waktu sedangkan D menunjukkan sedikit penurunan. Kedua temuan ini konsisten dengan
kesimpulan bahwa persiapannya homogen (Baldwin, 1957 a, b; Hall & Ogston, 1956).
Berat molekul. Berat molekul megacin dihitung dari persamaan Svedberg (Svedberg & Pedersen,
1940). Nilai D pada waktu nol adalah 7 • 57 x 10—7 cm.  dtk. —I Dengan asumsi nilai 0 • 73 untuk volume
2 

spesifik parsial (õ) dan dengan v 4 • 35 x 10—18 detik, berat molekulnya adalah 51.000. Mengingat asumsi
yang dibuat untuk mendapatkan nilai tersebut untuk c dan D dan ketidakakuratan yang terlibat dalam
 menentukan D dengan metode kecepatan sedimentasi (lihat Baldwin, 1957 b), ini hanya bisa menjadi nilai
perkiraan.
Analisis asam amino. Sampel dari preparasi megacin dihidrolisis dalam 6N-HCl dalam vakum selama 40
jam, dan residu dianalisis dengan metode Moore & Stein (1954). Asam amino berikut diidentifikasi: asam
aspartat, treonin, serin, asam glutamat, prolin, glisin, alanin, valin, metionin, isoleusin, leusin, tirosin,
fenilalanin, histidin, lisin dan arginin dengan sedikit hidroksiprolin dan sistein. Asam aspartat dan asam
glutamat bersama-sama menyumbang hampir 30  /0 dari berat kering protein, sebuah temuan yang tidak
0 

terduga mengingat sifat asam dari megacin.

Properti. Spektrum absorpsi dari

Tabel 2. Mobilitas elektroforetik megacin pada nilai pH yang berbeda pada 0  0

Nilai mobilitas pada pH diperoleh dengan peralatan Perkin-Elmer pada 0  . Nilai yang tersisa, diperoleh dengan
0 

peralatan Kern pada suhu kamar, dibuat secara kasar sebanding dengan mengoreksi viskositas air pada suhu kamar.
Protein
              10  x Badan Molaritas Mobilitas .                           
5 

              (cm.  detik — IE  ) pH buffer             

2  l 

              -9-7 6-1 0-02 0-7                                         

              - 11-2 6-8 0-06 0-74                                         

              -13-1 7-1 0-02 0-5                                         

              - 13 • 7 7-9 0-02 0-5                                         

Gambar. 7. pola ultrasentrifus diperoleh dengan 0 • 68  solusi protein / 0. Kecepatan 56100 putaran / menit, sudut batang
0 

55  dan 35  , gambar pada menit 120 dan 136. masing-masing setelah mencapai kecepatan penuh. Arah sedimentasi ke
0  0 

kanan.
preparat yang dimurnikan adalah protein tipikal dengan 279 mg dan E 0 • 89. Tidak ada indikasi adanya asam
nukleat atau nukleotida. Persiapan megacin yang dimurnikan mengandung 15 • 4  /0 dari N, <P dan memberikan tes
0 

antron sangat lemah (<5 pg. Glukosa / mg. Protein). Analisis untuk P dan karbohidrat, meskipun positif, dilakukan
pada batas paling bawah dari prosedur analitis, dan, untuk nilai yang dapat diandalkan, sampel megacin yang lebih
besar daripada yang tersedia saat ini harus dianalisis. Jejak gula amino terdeteksi selama analisis asam amino.
Aktivitas sediaan yang dimurnikan tidak dipengaruhi oleh ribonuklease kristal atau
deoksiribonuklease. Mendidihkan selama 10 menit. menghancurkan aktivitas sepenuhnya, sedangkan pemanasan
pada 80  selama 20 menit. menurunkan aktivitas sebesar 90  . Megacin (0 • 64 mg. Berat kering / ml.) Diberikan
0  0/6 

7M-urea dalam buffer fosfat, pH 7 • 0, pada 37  dan setelah 6 jam. Kegiatan itu -decreased oleh 70  /6. Setelah
0  0 

diinkubasi dengan 7M-urea selama 24 jam. pada suhu kamar, 80% aktivitas awal hilang. Megacin, bagaimanapun,
resisten terhadap kristal pepsin pada pH dalam buffer glisin-HCl dan kristal tripsin dan kimotripsin pada pH dalam
buffer fosfat.
Aktivitas antibakteri dari sediaan yang dimurnikan.
Satuan di mana aktivitas megacin diukur

10

6
 5

4
              1 2 3 4                                         
10-4 (t -to)
Gbr. 8. Plot 0  (kor.) Melawan (t —to), di mana t adalah waktu dalam detik setelah mencapai kecepatan penuh, ke adalah waktu
2 

pemotretan pertama. Larutan protein dalam buffer bf-fosfat, pH 7 • 0, digunakan; kecepatan, 56100 putaran / menit.
oleh sistem pelat-assay cukup sewenang-wenang dan tidak memberikan indikasi jumlah sel sebenarnya yang
terbunuh oleh megacin. Dengan preparasi megacin yang homogen, aktivitas megacin dapat diukur dengan lebih
tepat. A 16 jam. kultur organisme indikator dicuci dan disuspensi kembali dalam kaldu sehingga E 'wag 0 • 67 (270
pg. berat kering sel / ml.). Sampel (1 • 0 ml.) Kemudian dicampur dengan volume yang sama dari 0 • 02 M-buffer
fosfat  pH 7 • O, yang mengandung konsentrasi megacin yang berbeda. Setelah 20 menit. pada 37  setiap sampel 0 

dengan cepat diencerkan 2500 kali ke dalam kaldu. Gula ini kemudian diencerkan lebih lanjut untuk menghasilkan
kira-kira 4 x 10  sel / ml., Dan ml. menyebar di permukaan nutrient agar. Setiap pelapisan diselesaikan dalam
8 

rangkap tiga dan koloni dihitung setelah inkubasi semalam pada 37  . Dengan larutan megacin yang sangat encer (5-
0 

50 pmg. Protein), diperoleh hubungan linier antara sel yang mati dan konsentrasi megacin (Gbr. 9). Pada konsentrasi
megacin yang lebih tinggi, konsentrasi sel tampaknya menjadi terbatas. Di mana aktivitas megacin sebanding
dengan membunuh aktivitas, agen antibakteri benar-benar menghambat pertumbuhan 50  /0 dari sel-sel yang layak
0 

pada konsentrasi 136 molekul / sel.

Protein (pmg./ml.)
Gambar 9. Viabilitas Bacillua megaterium 207. m terkena megacin pada 37  selama 20 menit. Konsentrasi sel, 135 pg. wt./ml
0 

kering .; efisiensi pelapisan, sel yang layak / jumlah sel total - 55  /. Konsentrasi megacin dinyatakan dalam protein kering
0 

wt./ml.
647

DISKUSI
Bacteriocing dibentuk oleh banyak spesies Enterobacteriaceae, oleh Pseudomonae fluorescene, Pa8teureUa
pesto dan B. megaterium. Meskipun ratusan strain penghasil bakteriosin telah diisolasi, sifat dan cara kerja
senyawa ini sebagian besar masih belum diketahui. Strain yang berbeda dari E. coli dan P8eudomonaa
/uoræcen.8 menghasilkan bakteriosin yang berbeda: khususnya banyak kolisin yang berbeda telah
diidentifikasi dan dalam kasus tertentu satu strain dapat menghasilkan beberapa kolisin yang berbeda
(Fredericq, 1946). Penting untuk ditekankan bahwa mega, cin yang dijelaskan di sini telah diisolasi dari satu
galur tertentu B. megaterium dan bahwa galur lain mungkin juga menghasilkan megacins lain.
 Telah lama disimpulkan bahwa kolisin adalah protein atau peptida; mereka umumnya labil terhadap panas,
tidak dapat didialisis dan dengan cepat dihancurkan oleh enzim proteolitik. Bukti yang lebih konklusif untuk
sifat protein mereka tersedia di mana pemurnian telah dicoba. Sediaan kolisin K yang sangat dimurnikan
diperoleh oleh Goebel & Barry (1958) mengandung kompleks protein-lipokarbohidrat. Aktivitas antibakteri
terbukti berada di bagian protein, meskipun disosiasi kompleks hanya dapat disebabkan oleh
pengobatan  untuk memecahkan ikatan kovalen (Goebel & Barry, 1958; Miyama, Ichikawa & Amano,
1959). Nüske, Hösel, Venner & Zinner (1957) menjelaskan pemurnian colicin yang dibentuk oleh E. coli SG
710; produk akhir adalah kompleks protein-lipocarbohydrate, mengandung 45-55  /0 dari protein. Dalam
0 

pemurnian parsial kolisin B (Cocito & Vandermeulen-Cocito, 1958) produk yang diperoleh adalah senyawa
yang tahan panas, tidak dapat didialisis, berat molekul tinggi yang diinaktivasi oleh tripsin dan papain. Dari
bukti yang dijelaskan di atas, dapat disimpulkan bahwa megacin adalah protein dengan berat molekul sekitar
50.000. Berbeda dengan colicin K, dan dengan colicin yang dimurnikan oleh Nüske dan rekan kerja, megacin
telah diisolasi bebas dari kompleks lipokarbohidrat . Dari data yang tersedia sejauh ini, megacin tampaknya
merupakan protein sederhana, meskipun keberadaan karbohidrat dan fosfor dalam jumlah yang sangat kecil
belum dapat sepenuhnya dikesampingkan. Jika pemurnian kolisin lain selanjutnya mengungkapkan hubungan
dekat  bakteriosin dengan kompleks lipokarbohidrat, ini dapat mencerminkan 8 perbedaan utama
dalam sifat dan cara kerja megacin dan kolisin.
Ekspresi megacinogeni oleh sel bakteri memanifestasikan dirinya dengan sintesis mematikan sejumlah
besar protein tertentu. Protein ini sangat asam (cf. perilaku elektroforetik dan konstitusi asam amino) dan oleh
karena itu, 648
terlepas dari sifat biologisnya yang unik, tidak seperti kebanyakan protein seluler lainnya. Pada saat lisis,
megacin tampaknya merupakan sekitar 5% dari total protein sel yang dapat larut, yang proporsinya sebanding
dengan jumlah enzim yang diinduksi dalam sel yang diinduksi sepenuhnya [lih. alkali fosfatase di E. coli,
Garen & Leventhal (1960)] atau dengan protein virus dalam sel yang terinfeksi fag.
Dimurnikan megacin adalah agen antibakteri yang sangat ampuh, 9 x 10  sel dari strain sensitif yang
7 

diberikan non-layak setelah paparan singkat untuk konsentrasi megacin kurang dari 10 PMG. dari protein /

RINGKASAN
1. Pembentukan megacin diinduksi oleh iradiasi ultraviolet dari kultur Bacillus megaterium 216. Kultur
tersebut mengalami lisis massa selama 90 menit. setelah iradiasi, dan megacin dilepaskan ke dalam
medium.                  
2. Sebuah metode untuk produksi lisat yang mengandung megacin dalam jumlah besar telah
dirancang.                  
3. Megacin diisolasi dari lisat dengan presipitasi isoelektrik, fraksi amonium sulfat dan kromatografi pada
dietilaminoetilselulosa.                   
4. Sediaan yang dimurnikan terbukti homogen dengan elektroforesis dan ultrasentrifuging. Dari percobaan
kecepatan sedimentasi diperoleh nilai 51.000 untuk berat molekul.                  
5. Megacin tampaknya merupakan protein sederhana. Ini didenaturasi oleh panas dan oleh 7M-urea tetapi
tahan terhadap serangan oleh pepsin, tripsin dan kimotripsin.                  
6. Megacin adalah agen antibakteri yang kuat dan mampu menghambat pertumbuhan sel-sel sensitif pada
konsentrasi 10 pmg./ml. atau 136 molekul megacin / sel yang diberi perlakuan.                  
Saya berhutang budi kepada Dr BA Fry atas nasihat dan dorongan terus-menerusnya, kepada Profesor SR Elsden atas
minat kritisnya dan kepada Dewan Riset Medis untuk Beasiswa Pelatihan. Saya juga sangat berterima kasih kepada Dr J.
Sykes yang mengawasi analisis ultrasentrifuge dan untuk fasilitas yang disediakan oleh Departemen Biokimia,
Universitas Iæeds, tempat analisis ini dilakukan; kepada Mr DF Elsden (Stasiun Penelitian Suhu Rendah ARC,
Cambridge) untuk melakukan analisis asam amino, dan kepada Dr A. Kleczkowski, Departemen Patologi Tanaman,
Stasiun Percobaan Rothamsted, untuk melaksanakan studi elektroforesis Perkin-Elmer. Nasihat yang diberikan oleh Dr.
T. Hofmann juga sangat kami hargai.

REFERENSI
Alföldi, G. & Ivánovics, L. (1954). Mikrobiol Acta. Acad.
Sci. digantung. 4, 333.
Baldwin, RL (1957 a). Biochem. J. 65, 401.
Baldwin, RL (1957b). Biochem. J. 65, 502.
 Berenblum, I. & Chain, E. (1938). Biochem. J.32, 295.
Cocito, C. & Vandermeulen-Cocito, J. (1958). G. Mikrobiol.
 6, 146.
Fredericq, P. (1946). Schweiz. Z. Path. 9, 385.
Fredericq, P. (1957). Annu. Pdt Microbiol. 11, 7.
Garen, A. & Leventhal, C. (1960). Biochim. biophY8. Acta, 88, 470.
Goebel, WF & Barry, GT (1958). J. exp. Md. 107, 185. Hall, JR & Octon, AG (1956). Biochem. J. 62, 401.
Ivánovics, G. & Alföldi, L. (1957). J. gen. Mikrobiol. 16,  522.
Ivánovics, G., Alföldi, L. & Nagy, E. (1959). J. gen. Mikrobiol. 21, 51.
Jacob, F. & Wollman, EL (1959). Bakteriofag, hal. 381.  Ed. oleh Adams, MH New York: Interscience Publishers
Inc.
Lamm, O. (1929). Tabut Mat. Astr. FYS. B, 21, tidak. 2.
Layne, E. (1957 a). Dalam Metode dalam Enzimologi, vol. 3, hal. 448. Ed. oleh Colowick, SP & Kaplan, NO New York:
Academic Press Inc.
Layne, E. (1957 b). Dalam Metode dalam Enzimologi, vol. 3,
p. 453. Ed. oleh Colowick, SP & Kaplan, NO New York: Academic Press Inc.
Miyama, A., Ichikawa, S. & Amano, T. (1959). Bikens J.
2, 177.
Moore, S. & stein, WH (1954). J. biol. Chem. 2M, 893.
Nüske, R., Hösel, G., Venner, H. & Zinner, H. (1957). Biochem. Z. 329, 346.
Schachman, HK (1957). Dalam Metode dalam Enzimologi, vol. 4, hal. 32. Ed. oleh Colowick, SP & Kaplan, NO New York:
Academic Press Inc.
Scott, TA & Melvin, EH (1953). Analyt. Chem. 25, 1656.
Sober, HA & Peterson, EA (1956). J. Amer. chem. Soc. 78, 751.
Svedberg, T. & Pedersen, KO (1940). Ultracentrifuge.
Oxford University Press.
Tiselius, A. & Swingle, S. (1951). Biochem. J.48, 171.
Weibull, C. & Bergström, L. (1958). Biochim. biophY8. Acta, 30, 340.
 Halaman 1

Megacins
IB Holland

IVANOVICS dan ALFOLDI (1954) adalah orang pertama yang mengamati pembentukan bakteriosin

di Bacillus megaterium. Kemudian IVANOVICS dan NAGY (1958) menggunakan tahan fag

strain indikator untuk mendeteksi strain megacinogenic (M +), ditemukan hampir setengahnya

200 strain yang diuji memang M + dan frekuensi yang sama dari strain M + juga

ditemukan oleh HOLLAND dan ROBERTS (1964). Megacin, seperti bakteriosin lainnya,

berperilaku seperti protein dan memiliki spektrum antibakteri yang sangat sempit

hampir terbatas pada strain B. megaterium lainnya. HOLLAND dan ROBERTS

(1964) mengusulkan klasifikasi megacins menjadi 3 jenis, A, B, C. Rumus-

klasifikasi mereka sangat bergantung pada karya IVANOVICS dan rekan kerja

dan didasarkan pada sifat umum dan cara produksi yang diketahui

megacins. Mutan yang resisten terhadap megacin sejauh ini terbukti tidak mungkin untuk diisolasi dan

karenanya klasifikasi tipe Fredericq tidak mungkin dilakukan. Namun demikian kelompoknya

yang muncul menunjukkan sifat kelompok yang sangat konsisten saat antibakteri

uji aktivitas pada pelat tusuk dilakukan terhadap berbagai macam indikator

organisme. Megacins C merupakan tampilan grup yang paling homogen

spektrum aktivitas identik tanpa aktivitas timbal balik antara produsen C yang berbeda.

Faktanya, 14 dari 15 strain non-megacinogenic ditemukan sensitif terhadap megacin C.

sedangkan semua strain M + resisten. Dengan 51 strain yang diuji HOLLAND dan

ROBERTS menemukan bahwa semua strain, termasuk produsen A lainnya, dihambat oleh

yang A megacins. Efek antibakteri universal megacin A pada B. megaterium

strain juga dicatat oleh IVANOVICS dan rekan kerja. Spektrum aktivitas file

B megacins jauh lebih sempit dengan strain tertentu yang menunjukkan sensitivitas

untuk semua grup B tetapi dari 51 strain yang diuji, 18, termasuk semua A yang memproduksi

strain benar-benar resisten. Dengan produsen B seperti strain A +, ada

aktivitas timbal balik yang cukup besar antara produsen dan mungkin tercermin
jenis kimia berbeda dari megacins A dan B. Perlu dicatat bahwa di semua

penelitian ini strain M + telah diisolasi pada awalnya hanya dengan bantuan

satu regangan indikator. Penggunaan indikator selektif lainnya pasti akan terlihat

tipe yang lain.

Contoh dari hanya 2 kelompok megacin, A dan C, sejauh ini telah dipelajari

dan mode tindakan masing-masing ini sekarang akan dipertimbangkan secara bergantian.

MegacinA

Megacin A sesuai dengan megacin pertama yang diamati oleh IVANOVICS dan

ALFOLDI dan merupakan satu-satunya megacin yang produksinya telah terbukti dapat diinduksi

oleh sinar ultra-violet. Anggota yang paling banyak dipelajari dari grup ini adalah megacin

diproduksi oleh B. megaterium 216, dan informasi berikut akan karenanya

merujuk hampir secara eksklusif pada jenis ini.

D. Gottlieb dkk. (eds.), Mekanisme Aksi

© Springer-Verlag Berlin · Heidelberg 1967

Halaman 2

Megacins

689

Seperti dijelaskan di atas, megacin A aktif melawan semua strain B. megaterium

bahkan termasuk strain penghasilnya sendiri meskipun dalam hal ini sensitivitasnya hanya

sedikit. Namun, kekebalan yang tidak lengkap terhadap bakteriosin homolog sering terjadi

ditemukan di antara bakteri bakteriosinogenik.

Meskipun kolisin satu partikel, setelah fiksasi ke reseptor tertentu di dalam sel

permukaan bakteri sensitif, mungkin cukup untuk membunuh satu sel (JACOB, SIMINO-

VITCH dan WOLLMAN, 1952) bagaimanapun juga, sel-sel sensitif membawa ribuan sel

situs reseptor (HELINSKI, DR, komunikasi pribadi). Adsorpsi

colicin oleh bakteri sensitif karena itu dapat diukur hanya dengan mencampurkan yang sensitif

bakteri dengan sediaan bakteriosin, dan kemudian dengan menguji residu super-
aktivitas natant setelah sentrifugasi ke bawah sel. Dalam kasus megacin A bagaimana-

pernah jumlah situs reseptor tampaknya relatif sedikit dan hanya sangat

uji sensitif dan dengan larutan encer megacin dapat digunakan. Tesnya

mengukur penurunan aktual dalam jumlah sel yang layak dari suspensi sensitif

sel yang diobati dengan megacin A. Dengan B. megateri ~ tm perawatan khusus juga harus dilakukan

dalam pengujian semacam ini untuk memastikan bahwa bakteri pada kenyataannya uniseluler dan memiliki

efisiensi pelapisan tinggi (> 70%). Dengan menggunakan uji seperti itu, adsorpsi mfLg

jumlah megacin A oleh bakteri sensitif dapat ditentukan. Sangat berbeda

jumlah bakteriosin dan bakteri pertama kali dicampur, disimpan pada suhu 37 ° selama 20 menit

lalu disentrifugasi. Suspensi sel kedua kemudian dirawat dengan

supernatan dan persentase pembunuhan ditentukan. Hasil penelitian menunjukkan megacin itu

sel sensitif dengan mudah menyerap bakteriosin, sedangkan sel resisten teradsorpsi

hanya buruk (HOLLAND, 1962). Sejak megacin A yang dimurnikan digunakan dalam

sen dan berat molekul diketahui itu mungkin untuk menghitung molekul

multiplisitas lar per sel dari bakteriosin yang ditambahkan. Dengan demikian dalam kondisi dimana

50% pembunuhan sel awal diperoleh, antara 100-150 molekul megacin /

sel teradsorpsi. Meskipun tidak ada proporsionalitas ketat yang ditetapkan dari

data terbatas yang diperoleh, ketika tingkat saturasi untuk adsorpsi ditentukan

mereka memang ditemukan dekat dengan tingkat bakteriosidal di bawah kondisi ini.

tions. Karena itu, tampaknya sel-sel sensitif rata-rata dapat menyerap hingga

sekitar 100 molekul megacin sebelum serangan mematikan terjadi. Ini agak

hasil yang tidak terduga sejak pembunuhan dalam suspensi sel oleh bakteriosin ini seperti pada

Bakteriosin lain menunjukkan kinetika hit tunggal.

Paradoks yang tampak ini telah dibahas oleh beberapa pekerja (LURIA, 1964;

NOMURA, 1964; REEVES, 1965) dan yang utama, tiga hipotesis alternatif

mungkin.

1. Galur B + menghasilkan populasi bakteriosin yang heterogen, sehingga hanya

fraksi yang relatif kecil, 1 / x, mampu fiksasi ke reseptor dan reseptor

mendorong pembunuhan setelah fiksasi itu.

2. Semua molekul bakteriosin setelah fiksasi memiliki persamaan, tetapi rendah, 1 / x,

kemungkinan mendorong pembunuhan.

3. Semua molekul bakteriosin memiliki probabilitas yang sama yaitu 1, untuk menginduksi

membunuh tetapi hanya 1 / x dari reseptor sel yang mampu, setelah fiksasi, mentransmisikan

efek mematikan ke target pembunuhan !. Hipotesis pertama adalah yang paling kecil kemungkinannya dan

mungkin didiskon. Dari bukti yang tersedia saat ini namun kami tidak dapat

untuk membedakan antara dua kemungkinan terakhir.

1  Untuk model lebih lanjut dari mekanisme kerja bakteriosin lihat NOMURA (1964).

44 Gottlieb / Shaw - Aksi

Teks asli
1. B+ strains produce heterogeneus populations of bacteriocin, so that only

Sumbangkan terjemahan yang lebih baik