PRAKTIKUM BIOKIMIA

Bioinformatika

Modul 4

Oleh:
Jonathan : 11218017

Tanggal Percobaan : 3 April 2020

Tanggal Pengumpulan : 11 April 2020

PROGRAM STUDI REKAYASA HAYATI

SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2020
I. Tujuan Percobaan
1. Menentukan motif khas pada sekuens α-amylase dari 11 spesies Bacillus
melalui software ClustalW
2. Menentukan kekerabatan amilase baqA dengan 10 spesies Bacillus dari
analisis pohon filogenetik.
3. Menentukan desain primer yang sesuai untuk amplifikasi gen baqA melalui
software Primer-blast.

II. Teori Dasar

Bioinformatika merupakan kajian yang mengintegrasikan disiplin biologi,
statistika dan teknik informasi (TI). Ilmu ini didefinisikan sebagai aplikasi dari alat
komputasi dan analisa untuk menangkap dan menginterpretasikan data-data biologi
molekuler. Pada awalnya, bidang kajian ini muncul atas inisiatif para ahli biologi
molekul dan ahli statistik, berdasarkan pola pikir bahwa semua gejala yang ada di
alam ini bisa diilustrasikan secara artificial melalui simulasi dari data-data yang ada.
Pada bidang Bioinformatika, data-data genetika menjadi inti pembentukan simulasi.
Pada saat ini, Bioinformatika ini mempunyai peranan yang sangat penting,
diantaranya adalah untuk manajemen data-data biologi molekul, terutama sekuen
DNA dan informasi genetika. Perangkat utama Bioinformatika adalah software dan
didukung oleh kesediaan internet seperti layanan software berbasis internet ClustalW
dan Primer-Blast (Chen et al., 2017).

Informasi genetika dalam bioinformatika dapat berupa sekuen asam amino

maupun sekuen basa nitrogen. Sekuen tersebut dapat digunakan dalam berbagai
aplikasi, seperti analisis dari suatu gen spesifik, penentuan kekerabatan antar
organisme serupa hingga pembentukan suatu gen spesifik yang diinginkan melalui
PCR. Umumnya PCR dilakukan setelah memiliki primer, primer dapat didesain
dengan software Primer-Blast sehingga produk yang dihasilkan sesuai dengan produk

2
yang ditargetkan. Primer yang dipilih sangat berpengaruh terhadap produk yang
dihasilkan (Ye et al., 2012).

PCR adalah metode yang umumnya digunakan dalam biologi molekuler untuk
menghasilkan jutaan hingga miliaran salinan sampel DNA spesifik dalam waktu
singkat, sehingga memungkinkan para ilmuwan untuk mengambil sampel DNA yang
sangat kecil dan memperbanyaknya ke jumlah yang cukup besar untuk dipelajari
secara terperinci. Dengan menggunakan PCR, salinan sekuens DNA dalam jumlah
sangat kecil secara eksponensial diperbanyak dalam suatu rangkaian atau siklus
perubahan suhu. PCR sekarang merupakan teknik umum dan seringkali sangat
diperlukan yang digunakan dalam laboratorium medis dan penelitian laboratorium
klinis untuk berbagai aplikasi termasuk penelitian biomedis dan forensik criminal
(Saiki et al., 1988)

3
III. Data Pengamatan

4
5
Gambar 3. 1 Hasil Multiple Alignment α-amylase spesies Bacillus dan baqA.
Prediksi motif khas ditandai dalam kotak hitam.

6
 Gambar 3. 2 Pohon filogenetik spesies Bacillus melalui software FastTree

Gambar 3. 3 Pohon filogenetik spesies Bacillus melalui software PhyML bootstrap

7
Gambar 3. 4 Hasil Desain Primer baqA melalui software Primer-Blast

8
IV. Pembahasan
Untuk dapat membandingkan sekuens amilase antar spesies Bacillus
diperlukan software untuk membantu alignment sekuens. Pada percobaan ini
digunakan software ClustalW untuk membandingkan sekuens antar spesies Bacillus.
Spesies Bacillus yang dibandingkan adalah B. marisflavi, B. vietnamensis, B.
salacetis, B. firmus, B. oleivorans, B. anthracis, B. albus, B. amyloliquefaciens, B.
licheniformis, B. aerius, dan B. aquimaris (baqA). Semua data sekuens didapat dari
website http://www.uniprot.org/.

Alignment sekuens asam amino seluruh amilase dari spesies Bacillus pada
software ClustalW menghasilkan beberapa kemiripan sekuens yang ditandai dengan
tanda (*), (:), dan (.). Tanda (*) menunjukan asam amino yang konsevatif sehingga
tidak ditemukan perbedaan pada urutan asam amino. Tanda (:) menunjukan asam
amino yang telah mengalami mutasi minor (conservative mutation) pada urutan asam
amino. Tanda (.) menunjukan asam amino yang telah mengalami mutasi (semi-
conservative mutation) pada urutan asam amino dan pada bagian yang tidak memiliki
tanda sama sekali menunjukan asam amino telah mengalami mutasi yang cukup
signifikan (non-conservative mutation). Pada percobaan ini, hasil alignment
menunjukan beberapa bagian dengan kemiripan sekuens yang berdekatan, ditandai
dengan kotak hitam pada Gambar 3.1, bagian tersebut diprediksi menjadi motif yang
khas pada alpha-amilase dari spesies Bacillus.

Motif khas diprediksi berdasarkan kemiripan sekuens yang dimiliki berbagai

spesies Bacillus, pada bagian yang ditandai kotak hitam. Sekuens B. aquimaris
(baqA) pada kotak hitam menunjukan urutan ‘GFTAIWLTPVFDN’ dan
‘HKRDMKVVLDFVVN’. Sekuens dari seluruh spesies memiliki kemiripan yang
cukup dekat walaupun tidak semuanya sama persis. Adanya perbedaan urutan asam
amino ini dapat menyebabkan perbedaan sifat asam amino pada aspek kepolaran dan
muatan. Urutan ‘GFTAIWLTPVFDN’ memiliki residu asam amino yang bersifat
nonpolar karena sebagian besar asam amino pembentuknya bersifat nonpolar dan

9
memiliki 1 asam amino yang bermuatan negatif, sebagian memiliki sifat kepolaran
dan muatan yang sama dan sebagian spesies lainnya seperti Bacillus marisflavi
memiliki sifat asam amino yang lebih polar dari baqA namun tidak ada perubahan
muatan total. Urutan ‘HKRDMKVVLDFVV’ memiliki residu asam amino yang
bersifat nonpolar karena sebagian besar asam amino pembentuknya bersifat nonpolar
dan memiliki total muatan +2, sebagian memiliki sifat kepolaran dan muatan yang
sama dan sebagian spesies lainnya seperti Bacillus salacetis memiliki sifat asam
amino dengan kepolaran sama dengan kepolaran baqA namun terdapat perubahan
muatan total sehingga bermuatan lebih negatif. Sekuens pada kotak hitam tersebut
merupakan bagian dari motif khas enzim alpha amylase pada database NCBI.

Gambar 4. 1 Hasil Motif Finder α-amylase pada Bacillus aquimaris

Pohon filogenetik spesies Bacillus dapat dibuat berdasarkan hasil alignment
asam amino yang telah dilakukan. Pohon filogenetik digunakan untuk menentukan

10
nenek moyang dari suatu organisme serta menganalisis kekerabatan antar spesies
organisme tersebut. Percobaan ini berusaha membandingkan pohon filogenetik yang
didapatkan dari dua software yang berbeda yaitu FastTree dan PhyML bootstrap.
Terdapat sedikit perbedaan dari pohon filogenetik yang dihasilkan software FastTree
dan PhyML bootstrap yaitu berbedanya urutan dari spesies pada tampilan pohon
filogenetik namun kekerabatan antar spesies tidak berubah. Serta terdapat sedikit
perbedaan angka pada cabang filogenetik yang ditampilkan pada pohon filogenetik,
angka tersebut berkorelasi dengan waktu evolusi dari masing-masing spesies. Hal ini
dapat disebakan oleh perbedaan algoritma yang digunakan pada masing masing
software. Perbedaan algoritma ini juga adalah alasan yang menjelaskan perbedaan
waktu yang dibutuhkan untuk menghasilkan pohon filogenetik. FastTree mampu
menghasilkan pohon filogenetik lebih cepat daripada PhyML bootstrap.

Bacillus aquimaris (baqA) yang terdapat pada pohon filogenetik teridentifikasi

memiliki kekerabatan yang dekat dengan spesies Bacillus vietnamensis dan disusul
oleh Bacillus marisflavi. Hal ini dibuktikan dengan hasil alignment yang menunjukan
kesamaan sekuens diatas 70%

11
 Gambar 4. 2 Alignment α-amylase spesies B. vietnamensis, B. marisflavi dan baqA
Percobaan ini juga bertujuan untuk menentukan desain primer untuk PCR.
Penentuan primer memiliki beberapa kriteria untuk mendapatkan produk yang
diinginkan. Kriteria primer yang baik adalah primer yang memiliki panjang 18-22
nukleotida, memiliki GC% content sebanyak 50-60%, memiliki klem GC berupa
setidaknya 1 buah basa nitrogen G/C pada 5 basa nitrogen terakhir pada ujung 3',
memilki titik leleh di kisaran 59 °C - 65 °C, primer tidak memliki bagian yang

12
berulang-ulang seperti GCGCGCGC maupun GTTTT, memiliki angka komplemen
diri dan komplemen diri 3' yang rendah (Handoyo et al., 2000).

Pada percobaan ini, didapatkan data primer-primer untuk amplifikasi gen

pengode baqA yang dihasilkan dari software Primer-Blast. Primer yang paling baik
untuk digunakan pada proses amplifikasi gen pengode amilase baqA adalah primer no
5 dengan sekuens forward 5' CATGGCTGTATGGCCTTCCT 3' dan sekuens reverse
5' CGATAACCGTCGACATCCGT 3'. Primer ini dipilih karena memenuhi kriteria
lebih baik dibandingkan primer yang tersedia pada Primer-Blast, dengan rendahnya
nilai komplemen diri dan tidak adanya bagian yang berulang-ulang, begitu juga
dengan nilai GC% content yang optimum pada primer forward dan reverse berturut-
turut 50% dan 55% serta titik leleh 59°C menjadikan primer no 5 sesuai untuk
dijadikan sebagai primer untuk amplifikasi gen pengode amilase baqA.

V. Kesimpulan
Dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa motif khas alpha amilase yang
didapat dari software ClustalW berupa sekuens asam amino dengan urutan
‘GFTAIWLTPVFDN’ dan ‘HKRDMKVVLDFVVN’ merupakan motif khas yang
terdapat pada 11 spesies Bacillus termasuk B. aquimaris (baqA). Berdasarkan pohon
filogenetik, kekerabatan B. aquimaris (baqA) dekat dengan spesies B. vietnamensis
dan B. marisflavi karena memilki percabangan yang sama. Primer yang sesuai dalam
amplifikasi gen pengode amilasi baqA ditentukan dari Primer-Blast adalah primer no
5 dengan sekuens forward 5' CATGGCTGTATGGCCTTCCT 3' dan sekuens reverse
5' CGATAACCGTCGACATCCGT 3'.

13
VI. Daftar Pustaka
Chen, C., Huang, H., & Wu, C. H. (2017). Protein bioinformatics databases and
resources. In Protein Bioinformatics (pp. 3-39). Humana Press, New York,
NY.

Handoyo, D., & Rudiretna, A. (2000). Prinsip umum dan pelaksanaan polymerase
chain reaction (PCR)[general principles and implementation of polymerase
chain reaction]. Unitas, 9(1), 17-29.

Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., ... &
Erlich, H. A. (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a
thermostable DNA polymerase. Science, 239(4839), 487-491.

Ye, X. Y., Ming, X., Zhang, Y. L., Xiao, W. Q., Huang, X. N., Cao, Y. G., & Gu, K.
D. (2012). Real-time PCR detection of enteric viruses in source water and
treated drinking water in Wuhan, China. Current microbiology, 65(3), 244-
253.

http://www.genome.jp/tools/clustalw/

https://www.genome.jp/tools/motif/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

http://www.uniprot.org/

14
VII. Lampiran

A. Penyejajaran urutan (Multiple sequence alignment) dan penentuan

kekerabatan melalui pendekatan pohon filogenetik

Jawaban

1. Dari percobaan ini didapat motif khas alpha amilase dari software ClustalW berupa
dengan urutan ‘GFTAIWLTPVFDN’ dan ‘HKRDMKVVLDFVVN’. sekuens
tersebut merupakan motif khas yang terdapat pada 11 spesies Bacillus termasuk B.
aquimaris (baqA).

2. Terdapat sedikit perbedaan dari pohon filogenetik yang dihasilkan software

FastTree dan PhyML bootstrap yaitu berbedanya urutan dari spesies pada tampilan
pohon filogenetik namun kekerabatan antar spesies tidak berubah. Serta terdapat
sedikit perbedaan angka pada cabang filogenetik yang ditampilkan pada pohon
filogenetik, angka tersebut berkorelasi dengan waktu evolusi dari masing-masing
spesies. Hal ini dapat disebakan oleh perbedaan algoritma yang digunakan pada
masing masing software. Perbedaan algoritma ini juga adalah alasan yang
menjelaskan perbedaan waktu yang dibutuhkan untuk menghasilkan pohon
filogenetik. FastTree mampu menghasilkan pohon filogenetik lebih cepat daripada
PhyML bootstrap.

3. Berdasarkan pohon filogenetik, kekerabatan B. aquimaris (baqA) dekat dengan

spesies B. vietnamensis dan B. marisflavi karena memilki percabangan yang sama

15
B. Desain Primer

Jawaban

1. Kriteria primer yang baik adalah sebagai berikut:

- Memiliki panjang 18-22 nukleotida

- Memiliki GC% content sebanyak 50-60%

- Memiliki klem GC berupa setidaknya 1 buah basa nitrogen G/C pada 5 basa
nitrogen terakhir pada ujung 3'

- Memilki titik leleh di kisaran 59 °C - 65 °C

- Primer tidak memliki bagian yang berulang-ulang seperti GCGCGCGC maupun

GTTTT

- Memiliki angka komplemen diri dan komplemen diri 3' yang rendah.

2. Desain primer untuk amplifikasi gen pengode amilase baqA adalah primer dengan
sekuens forward 5' CATGGCTGTATGGCCTTCCT 3' dan sekuens reverse 5'
CGATAACCGTCGACATCCGT 3'

16