I.

PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Klasifikasi bakteri secara filogenetik dapat dilakukan melalui analisis
taksonomi molekular (Sembiring, 2010). Data yang digunakan adalah sekuens gen
yang mengkode 16S rRNA (16S rDNA) pada masing-masing strain yang akan
diklasifikasikan. Woese pada tahun 1980-an telah dapat menyimpulkan bahwa
perbandingan filogenetik berdasarkan bagian conserved dari genom lebih stabil
daripada klasifikasi berdasarkan pada sifat-sifat fenotipik (Woese, 1987). Oleh
karena

itu,

penggunaan

molekul

rRNA disebarluaskan

untuk

pembuatan

perbandingan filogenetik, dan gen 16S rRNA (1650 bp) adalah marker yang paling
umum digunakan dalam bidang sistematika mikrobia (Prakash et al., 2007).
Molekul 16S rRNA terdiri atas daerah variabel dan daerah conserved, dan
primer universal untuk amplifikasi gen 16S rRNA biasanya dipilih dari daerah
conserved sedangkan daerah variabel digunakan untuk taksonomi perbandingan.
Langkah awal dalam klasifikasi filogenetik adalah mengisolasi dan memurnikan
DNA kromosomal dari masing-masing strain.

Gen 16S RNA selanjutnya

diamplifikasi dengan teknik PCR (polymerase chain reaction) dari masing-masing

sampel DNA kromosomnya.

Hasil amplifikasi tersebut dimurnikan untuk

disekuensing (Prakash et al., 2007).

Analisis

filogenetika,

kelompok

outgroup

sangat

dibutuhkan

dan

menyebabkan polarisasi karakter atau ciri, yaitu karakter apomorfik dan

plesiomorfik. Karakter apomorfik adalah karakter yang berubah dan diturunkan dan
terdapat pada ingroup, sedangkan karakter plesiomorfik merupakan karakter
primitive yang terdapat pada outgroup. Karakter sinapomorfik adalah karakter yang
diturunkan dan terdapat pada kelompok monofiletik. Karakter morfologi telah lama
digunakan dalam banyak penelitian filogenetika. Dengan pesatnya perkembangan
teknik-teknik di dalam biologi molekuler penggunaan sekuen DNA dalam penelitian
filogenetik telah meningkat pesat dan telah dilakukan pada semua tingkatan
taksonomi,

misalnya

famili,

marga,

dan

spesies.

Filogenetik

molekuler

mengombinasikan teknik biologi molekuler dengan statistik untuk merekonstruksi

hubungan filogenetika (Hillis et al., 1996).
Menurut Prakash (2007) Klasifikasi filogenetik dilakukan melalui konstruksi
phylogeny tree. Phylogeny tree yang diperoleh merupakan hasil klasifikasi yang

menunjukkan

hubungan

filogenetik

masing-masing

strain

bakteri

yang

diklasifikasikan. Terdapat 4 tahapan dalam mengkonstruksi phylogeny tree yang

didasarkan atas data sekuens 16S rDNA, yaitu:
a.
b.
c.
d.

Preparasi sekuens 16S rDNA

Aligment sekuens 16S rDNA
Konstruksi phylogeny tree
Konstruksi matriks similaritas dan perbedaan nukleotida 16S rRNA.
B. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah mengetahui cara dan tahapan analisis

kekerabatan bakteri dengan metode filogenetik molekuler.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi

Alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini antara lain sekuesn
nukleotida mikroba yang diujikan, dan komputer yang memiliki program PFE,
MVSP, ClustalX, MEGA dan Ms.Words.
B. Metode
Metode yang digunakan dala praktikum taksonomi numerik-fenetik adalah
sebagai berikut :
a. Koleksi data
1. Data sekuens 16S rRNA dari 15 isolat Flavobacetrium sp. dan satu isolat
2.

Pseudomonas sp. (outgroup) di download dari situs ncbi.

Masing-masing dicopykan ke program Words atau Notepad. Data tersebut
berupa text file dan disimpan sebagai file.

b. Preparasi sekuens 16S rRNA

1. Data sekuens di atas selanjutnya dibuka dengan PFE (Programmer File
Editor) dan sekuens dari masing-masing isolat diberi kode nama pada bagian
depan sekuens (misal flav 1, flav 2 dan seterusnya).
2. Selanjutnya di depan kode sekuens diberi tanda fasta format (>), hal ini agar
dapat dibaca oleh program yang untuk melakukan alignment yaitu
CLUSTALX.
3. Selanjutnya file disimpan dan diberi kode nama (save as), file ini sudah
dalam bentuk fasta format file yang siap diload ke dalam CLUSTALX untuk
dilakukan alignment.
c. Alignment sekuens 16S rDNA (ClustalX)
1. Data sekuens dari masing-masing strain (Cara kerja b) di load ke dalam
program CLUSTALX untuk di align. Alignment bertujuan untuk menata
sekuens agar satu sama lain diletakkan sesuai dengan posisi homologi antar
sekuens. Artinya, daerah homolog harus diletakkan pada posisi yang sama
(conserved region dengan conserved region, variable region dengan variable
region).

Dengan alignment antar sekuens gen 16S rRNA dari masing-

masing strain dapat dibandingkan. Semua sekuens yang dialignment ditata

dalam satu file oleh program ClustalX sebagai output file dalam beberapa
pilihan format. Agar file hasil alignment dapat dibaca oleh program MEGA
dan PHYLIP yang digunakan untuk mengkonstruksi phylogeny tree
berdasarkan sekuens tersebut, maka file ini dibuat dalam phylip format (file

name.phy). Hal ini dapat dilakukan dengan memilih format output file pada
waktu melakukan alignment dalam CLUSTALX.
2. Output file ini disimpan dalam direktori

CLUSTALX

(Misal

C:\ClustalX\Flav.phy), sehingga setelah alignment dapat dicari hasil

alignment berupa file yang diberi nama seperti contoh, dalam direktori
ClustalX.
3. File ini selanjutnya digunakan untuk mengkonstruksi phylogeny tree dengan
program MEGA atau PHYLIP.
d. Konstruksi Phylogeny Tree
Program MEGA 3.0.1
Seluruh sekuens 16S

rDNA

hasil

alignment

digunakan

untuk

mengkonstruksi phylogeny tree dengan program Mega 3.0.1.

1. Program Mega 3.0.1 dibuka, pilih alighment, lalu alighment explorer,
kemudian pilih retrieve.
2. Selanjutnya mengambil file dengan format .aln hasil dari Clustalx.
Klik file, lalu pilih Export alighment, pilih Mega format, dan save.
Close, kemudian ketik 16S lalu OK, kemudian no dan pilih close.
3. Selanjutnya muncul perintah open data in mega? Pilih yes, lalu
minimize.
4. Pilih phylogeny, Construct phylogeny, pilih Neighbor Joining, lalu Test
phylogeny, Bootstrap dengan replikasi 1000. Selanjutnya pilih compute.

II.

HASIL DAN PEMBAHASAN

A.Hasil

99
29

fl4
fl12
fl14

51

fl9
87

45

fl10
fl1

24
52

fl11
fl2

30
90

fl5
xant
fl7

65

fl3

64
96

fl8
fl6

46

fl13
al15

Gambar 1. Hasil Dendogram Isolat Flavobacterium sp.

B. Pembahasan
Filogeni berasal dari bahasa Yunani yaitu Phylon yang artinya tribe atau
clan dan Genesis yang berarti origin. Filogeni merupakan sejarah mengenai evolusi
dari makhluk hidup yang digambarkan dalam bentuk pohon yang terdapat
percabangan. Percabangan tersebut menggambarkan adanya divergensi. filogeni
secara molekuler menggambarkan hubungan antar organisme berdasarkan susunan
gennya dengan menggunakan sekuens DNA ataupun protein. Adanya ketidaksamaan
dari sekuens genetik menggambarkan hasil divergensi atau adanya evolusi dari

organisme tersebut. Filogenik klasik hanya menggambarkan karakter morfologi dari

suatu organisme. Analisis secara morfologi dapat dilihat dari sekuens DNA, sekuens
RNA dan sekuens protein (Patwardhan, 2014).
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam filogeni molekuler menurut
Patwardhan (2014) diantaranya:
1. Kladogram merupakan pohon filogenetik yang menggambarkan adanya evolusi
dari organisme.
2. Hompolasy merupakan sekuens yang sama akibat hasil konvergensi tetapi tidak
menggambarkan adanya evolusi secara langsung.
3. Internal Transcribed Spacers (ITS) yaitu rRNA akan ditranskripsi menjadi single
transcript oleh ITS ini.
4. Monofiletik yaitu taxa dalam pohon filogenetik mempunyai satu nenek moyang
yang sama.
5. Outgroup suatu taxa yang menjadi karakter pembanding dalam pembuatan
pohon filogenik.
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) dari NCBI ialah program yang
berfungsi mencari program database urutan biologis. Program ini menggunakan
algoritma untuk membandingkan antara DNA sekuens protein untuk query database.
BLAST merupakan perangkat bioinformatika yang berkaitan erat dengan
penggunaan pangkalan data sekuens biologi. Penelusuran BLAST (BLAST search)
pada pangkalan data sekuens memungkinkan ilmuwan untuk mencari sekuens baik
asam nukleat maupun protein yang mirip dengan sekuens tertentu yang dimilikinya.
Hal ini berguna untuk menemukan gen sejenis pada beberapa organisme, memeriksa
keabsahan hasil sekuensing, atau untuk memeriksa fungsi gen hasil sekuensing.
Algoritma yang mendasari kerja BLAST adalah penyejajaran sekuens (Rizki, 2008).
Proses

analisis

filogenik

molekuler

dibutuhkan

beberapa

software,

diantaranya:
1. Programmer File Editor (PFE) (Felsenstein, 1993)
Merupakan program yang berguna untuk menata data sekuen DNA sehingga
sesuai dengan bentuk data yang dapat dibuka pada program ClustalX.
2. MEGA / Phylip (Felsenstein, 1993)
Merupakan program yang digunakan untuk mengkonstruksi Phylogeny tree
sesuai dengan algoritma evolusi sehingga dapat divisualisasikan dengan jelas.
3. ClustalX (Felsentein, 1993)

Merupakan program yang diperlukan untuk menata (alignment) data sekuen dari
berbagai strain organisme sehingga dihasilkan pasangan sekuen antar strain
dimana daerah conserved akan mengumpul dan daerah variabel juga saling
mengumpul. Output dari program ini berupa file dalam format .*aln, .*GDE dan
*.phy.
4. Phydit (Chun, 1999)
Merupakan program yang digunakan untuk mengolah data sekuen yang
kemudian akan di align untuk mendapatkan data berupa matriks similaritas
nukleotida dan perbedaan nukleotida. Matriks yang dihasilkan program Phydit
dapat dilihat di program NotePad dan dipindah dalam program Microsoft Excel.
Tahapan dalam analisis karakter mikroba menggunakan filogenik molekuler
yang pertama adalah pengkoleksian data dengan mencari sekuens 16S rRNA dari 15
isolat yang sudah ditentukan, misalnya Flaboctarium sp. dan Pseudomonas sp.
sebagai outgroup yang di download dari situs ncbi kemudian dicopykan ke dalam
notepad. Langkah selanjutnya melakukan preparasi sekuens 16S rRNA dengan
menggunakan PFE (Programmer File Editor) dan sekuens dari masing-masing isolat.
Selanjutnya,

tahap

alignment

sekuens

16S

rRNA menggunakan

software

CLUSTALX. Alignment bertujuan untuk menata sekuens agar satu sama lain
diletakkan sesuai dengan posisi homologi atau sekuens. File disimpan dalam format
.phy agar dapat dibaca oleh program MEGA. Langkah selanjutnya adalah konstruksi
Phylogeny Tree menggunakan program MEGA dengan memilih Construct
phylogeny, kemudian Neighbor Joining, lalu Test phylogeny, Bootstrap dengan
replikasi 1000. Selanjutnya pilih compute. Langkah terakhir adalah konstruksi
matriks similaritas dan perbedaan nukleotida 16S rRNA menggunakan aplikasi
PHYDIT (Rizki, 2008).
Isolat yang dipakai dalam praktikum kali ini adalah 15 isolat Flavobacterium
sp. berbagai strain dengan outgroup berupa Pseudomonas sp. didapat hasil bahwa
strain fl4 dan fl12 mempunyai nilai similaritas yang tinggi dengan nilai 99% artinya
kedua strain ini mempunyai kekerabatan yang dekat. Strain yang memiliki
kekerabatan yang dekat terlihat pada fl2 dengan fl5 dengan indeks kesamaan 90%.
Strain fl3 dan fl8 mempunyai nilai kesamaan 96%. Strain fl6 dan strain fl13
mempunyai indeks similarias sebesar 46% artinya kedua strain tersebut berbagi
karakter sehingga nilai kesamaan tidak terlalu tinggi. Strain fl1 dan fl11 mempunyai
indeks kesamaan sebesar 52%. Indeks similaritas paling kecil terlihat pada strain fl9

dan fl10. Flavobacterium sp. mempunyai karakter berbentuk basil, Gram negatif,
fakultatif anaerob. Saat kondisi aerob bakteri ini mampu mengoksidasi asam amino,
sedangkan pada kondisi anaerob bakteri ini dapat melakukan fermentasi.
Flavobacterium sp. mempunyai range suhu dan pH yang luas. Suhu flavobacterium
sp. dapat tumbuh adalah 10-400C (Bergeys Manual, 2010).

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil dan pembahasan maka dapat disimpulkan bahwa :
1. Langkah yang digunakan dalam analisis filogenetik molekuler yaitu koleksi data
dari ncbi, preparasi sekuens 16S rRNA menggunakan PFE, alignment sekuens
16S rRNA menggunakan ClustalX, konstruksi phylogeny tree menggunakan
MEGA 3.0.1 dan langkah terakhir adalah konstruksi matriks similaritas
menggunakan PHYDIT.

2. Hasil dari analisi molekuler dengan isolat Flavobacetrium sp. berbagai strain
didapat data strain fl4 dan fl12 mempunyai nilai similaritas yang paling tinggi
99%, dan indeks similaritas paling kecil terlihat pada strain fl9 dan fl10 dengan
nilai similaritas 45%.

B. Saran
Jurnal yang dipakai untuk praktikumnya mungkin lebih baik jika 1 kelompok
1 jurnal tidak 1 orang 1 jurnal agar lebih efisien dalam pengerjaannya tidak memakan
waktu yang lama. Terima kasih sudah membagi ilmunya, semoga lebih baik lagi di
praktikum selanjutnya.

DAFTAR REFERENSI
Chun, J.. 1999. Phylogenetic Editor (PHYDIT) Windows Version. New York Press,
New York.
Felsenstein, J.. 1993. Phylogeny Inference Package version 3.5 c.London.
Hillis, D.M., C. Moritz, and B.K. Mable. 1996. Molecular Systematic. 2nd Ed.
Massachusetts: Sinauer Assocites.
Patwardhan et al. 2014. Phylogenetics & Evolutionary Biology Molecular Markers in
Phylogenetic Studies A Review. J., Phylogen Evolution Biol, 2 (2) : 2-9.
Prakash, O., Verma, M., Sharma, P., Kumar, M., Kumari, K., Singh, A., Kumari, H.,
Jit, S., Gupta, S.K., Khanna, M. and Lal, R. 2007. Polyphasic approach of
bacterial taxonomy. Second edition. Chapman & Hall, London.

Rizki, S. 2008. Bioteknologi Tanaman. Universitas Brawijaya Press, Malang.

Schleifer, K.H. 2009. Classification of Bacteria and Archaea: past, present and
future. Systematic and Applied Microbiology 32: 533-542.
Sembiring, L.. 2010. Sistematika molekular (BIO 765), Petunjuk Praktikum.
Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi UGM, Yogyakarta.
Woese, C.R. 1987. Bacterial evolution. Microbiol Rev. 51: 221-272.

KLASIFIKASI MIKROBA (Flavobacterium sp.) DENGAN METODE

FILOGENETIK MOLEKULER

Oleh :
Nama
NIM
Kelompok
Rombongan
Asisten

: Silviyatun Nimah
: B1J013016
:1
:I
: Hedi Susanto

LAPORAN PRAKTIKUM SISTEMATIKA MIKROBA

KEMENTERIAN RISET TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2015