1.

Dalam kebanyakan kasus kanker kolorektal sporadis, tumorigenesis adalah proses multistep,
yang melibatkan perubahan genomik secara paralel dengan perubahan morfologi. Selain itu,
akumulasi bukti menunjukkan bahwa mikrobioma usus manusia terkait dengan perkembangan
kanker kolorektal. Di sini kami melakukan studi metagenomik dan metabolomik tinja pada
sampel dari kohort besar 616 peserta yang menjalani kolonoskopi untuk menilai karakteristik
taksonomi dan fungsional mikrobiota usus dan metabolit. Pergeseran mikrobioma dan
metabolom terlihat pada kasus adenoma polipoid multipel dan karsinoma intramukosa, selain
lesi yang lebih lanjut. Kami menemukan dua pola elevasi mikrobioma yang berbeda. Pertama,
kelimpahan relatif Fusobacterium nucleatum spp. secara signifikan (P < 0,005) meningkat terus
menerus dari karsinoma intramukosa ke stadium yang lebih lanjut. Kedua, Atopobium parvulum
dan Actinomyces odontolyticus, yang terjadi bersamaan pada karsinoma intramukosa,
meningkat secara signifikan (P < 0,005) hanya pada beberapa adenoma polipoid dan/atau
karsinoma intramukosa. Analisis metabolisme menunjukkan bahwa asam amino rantai cabang
dan fenilalanin meningkat secara signifikan (P < 0,005) pada karsinoma intramukosa dan asam
empedu, termasuk deoksikolat, meningkat secara signifikan (P < 0,005) pada adenoma polipoid
multipel dan/atau karsinoma intramukosa. Kami mengidentifikasi penanda metagenomik dan
metabolomik untuk membedakan kasus karsinoma intramukosa dari kontrol yang sehat. Data
multi-omik kohort besar kami menunjukkan bahwa pergeseran mikrobioma dan metabolom
terjadi sejak tahap awal perkembangan kanker kolorektal, yang kemungkinan penting secara
etiologis dan diagnostik.
2. Kanker kolorektal (CRC) mempengaruhi lebih dari seperempat juta orang setiap tahun di seluruh
dunia1. Sebagian besar CRC sporadis berkembang melalui pembentukan adenoma polipoid dan
didahului oleh karsinoma intramukosa (adenoma displastik derajat tinggi), yang dapat
berkembang menjadi bentuk ganas2. Proses ini dikenal sebagai urutan adenoma-karsinoma,
yang terjadi melalui mekanisme multilangkah yang melibatkan mutasi spesifik2. Karena
dibutuhkan beberapa dekade sebelum keganasan akhir berkembang3, deteksi dini kanker dan
pengangkatan endoskopi adalah prioritas untuk pengendalian kanker. Perubahan dalam
ekosistem usus telah terlibat dalam perubahan kesehatan dan penyakit manusia, termasuk
CRC4. Metagenomics tinja adalah alat yang berguna untuk kuantifikasi mikrobioma usus dan
memiliki potensi diagnostik yang mungkin5. Secara khusus, F. nucleatum telah dikaitkan dengan
CRC6,7; mekanismenya sedang diklarifikasi pada mouse8. Metabolit usus, termasuk asam amino
dan metabolit bakteri (misalnya, asam empedu dan asam lemak rantai pendek), juga telah
dikaitkan dengan kondisi kanker di usus9,10. Oleh karena itu, analisis metagenomik dan
metabolomik yang komprehensif dapat memberikan pendekatan alternatif untuk memahami
perkembangan CRC melalui perubahan terkait dalam lingkungan usus. Kami telah melakukan
metagenomik senapan seluruh genom dan elektroforesis kapiler time-of-flight mass
spektrometri (CE-TOFMS) berbasis metabolomik pada sampel tinja yang diperoleh dari pasien
dengan berbagai tahap neoplasia kolorektal untuk mendapatkan bukti fenotipe spesifik tahap
yang berbeda dari mikroorganisme tinja dan metabolit. Data metagenomik dan metabolomik
masing-masing dikumpulkan dari 616 dan 406 subjek (Tabel Tambahan 1 dan Data Diperluas
Gambar 1). Klasifikasi menjadi sembilan kelompok dilakukan
3. keluar menurut temuan kolonoskopi dan histologis: (1) normal (tidak ada temuan kolonoskopi
yang luar biasa); (2) beberapa polip (hingga dua polip kecil (<5 mm)); (3) adenoma polipoid
multipel dengan displasia derajat rendah (MP, lebih dari tiga adenoma, sebagian besar lebih dari
 lima adenoma); (4) karsinoma intramukosa (adenoma polipoid dengan displasia derajat tinggi),
stadium 0/pTis CRC (S0); (5) KHA tahap I; (6) KHA tahap II; (7) KHA tahap III; (8) CRC stadium IV
berdasarkan Klasifikasi Tumor Ganas Union for International Cancer Control (UICC) kedelapan.
Kelompok yang tersisa adalah (9) normal dengan riwayat operasi kolorektal (HS). Adenoma
polipoid di MP terbatas pada adenoma kolorektal konvensional yang terbukti secara patologis
(yaitu, adenoma tubular, adenoma tubulovil dan adenoma vili) dengan displasia tingkat rendah,
tidak termasuk adenoma bergerigi. Subyek dalam kelompok (1) dan (2) didefinisikan sebagai
kontrol yang sehat. CRC stadium I dan II digabungkan menjadi CRC stadium I/II (SI/II), dan CRC
stadium III dan IV digabungkan menjadi CRC stadium III/IV (SIII/IV) untuk dianalisis. Karakteristik
klinis untuk kelompok ditunjukkan pada Tabel Tambahan 1, 2 dan Data yang Diperluas Gambar.
2. Riwayat merokok (indeks Brinkman) berbeda di antara kelompok; pasien dengan stadium
yang lebih lanjut cenderung memiliki indeks Brinkman yang lebih rendah (yaitu, lebih sedikit
merokok) dibandingkan dengan pasien dengan stadium awal, dan pasien dengan HS bahkan
memiliki nilai yang lebih rendah. Data metagenom diperoleh sebelum dan sesudah operasi dari
28 pasien dengan stadium I-III CRC (Tabel Tambahan 1). Gambaran luas dari data taksonomi
kami dari 616 subjek dan data metabolomik dari 406 subjek diberikan pada Gambar. 1. Subjek
4. diperkaya dengan genus Bacteroides memiliki kelimpahan Prevotella yang rendah. Khususnya,
genus Megamonas terdeteksi sangat melimpah (dalam 10 genera paling melimpah) di 118 dari
616 pasien (19,2%) di semua kelompok, tetapi jarang terdeteksi di sisanya, menunjukkan
distribusi yang tidak umum dalam populasi. Megamonas sebelumnya tidak pernah dilaporkan
sebagai genus dominan dalam studi mikrobioma usus dengan subyek Eropa dan Amerika, tetapi
ditemukan dalam studi dengan individu Cina, yang menunjukkan bahwa genus ini mungkin
merupakan karakteristik populasi Asia11. Kandungan genom manusia secara signifikan lebih
tinggi dalam berbagai tahap CRC (S0, P = 0,00175; SI/II, P = 8,19 × 10−5; SIII/IV, P = 1,05 × 10−5;
uji Mann-Whitney U satu sisi ) daripada di kontrol yang sehat (Extended Data Gambar. 3).
Analisis komponen utama (PCA) mengidentifikasi dua kelompok paling variabel di semua mata
pelajaran (Gbr. 1b) dan di 251 kontrol sehat (Data Diperpanjang Gambar. 3b), Bacteroides dan
Prevotella, keduanya telah didefinisikan sebagai kontributor utama enterotipe usus manusia
5. Pemasangan menggunakan model campuran multinomial Dirichlet13 menghasilkan empat tipe
komunitas di antara 616 individu, salah satunya didominasi oleh genus Prevotella (Data
Diperpanjang Gambar 3e). Berkenaan dengan faktor risiko yang diketahui (indeks massa tubuh
(P = 0,8773), konsumsi alkohol (P = 0,2899) dan riwayat merokok (P = 0,3151), tidak ada
perbedaan signifikan (P <0,005) yang terdeteksi di antara empat tipe komunitas. Baik temuan
kolonoskopi (sehat, MP, S0, SI/II atau SIII/IV; P = 0,2864) maupun lokasi tumor (kolon kiri, kolon
kanan atau rektum; P = 0,5231) tidak terkait dengan tipe komunitas apa pun. Usia terdistribusi
secara berbeda (P = 7,80 × 10-10) dan kelompok Prevotella didominasi ditemukan pada laki-laki
(79,1%) (P = 6,82 × 10-8). Propionat dan butirat, sumber energi utama di usus besar14,
digolongkan sebagai dua metabolit paling melimpah. PCA menunjukkan variasi yang besar dalam
dihydrouracil dan urea selain propionat dan butirat dalam populasi (Gbr. 1b). Berdasarkan PCA,
tidak ada stadium, lokasi tumor, atau jenis kelamin yang dikaitkan dengan variasi profil
metabolit (Data Diperpanjang Gambar 4).
6. Dibandingkan dengan kontrol yang sehat, kami menemukan pergeseran mikrobioma pada MP
dan S0, selain SI/II dan SIII/IV, yang sangat berbeda di seluruh tahapan. Sejumlah spesies dalam
filum Firmicutes, Fusobacteria dan Bacteroidetes secara dominan meningkat pada sampel dari
 S0, SI/II dan SIII/IV, meningkat dengan derajat keganasan. Spesies tinggi Fusobacteria muncul
setidaknya dalam dua tahap, sedangkan banyak spesies dari Firmicutes dan Bacteroidetes
adalah spesifik tahap. Dalam filum Proteobacteria, sejumlah besar spesies hanya meningkat
pada MP (Gbr. 2a). Genus Bifidobacterium telah habis terutama di S0. Kami mencatat dua pola
elevasi spesies yang signifikan (P <0,005): yang pertama meningkat pada tahap awal hingga
selanjutnya, sedangkan yang kedua hanya meningkat pada tahap awal. Yang pertama dicirikan
oleh F. nucleatum (misalnya, F. nucleatum ssp. nucleatum (S0, P = 7,64 × 10−5, q = 0,0492; SI/II,
P = 1,47 × 10−8, q = 5,63 × 10 5; SIII/IV, P = 6,93 × 10−11, q = 2,62 × 10−7)), Solobacterium
moorei (S0, P = 1,18 × 10−5, q = 0,0381; SI/II, P = 0,000601, q = 0,1355; SIII/IV; P = 5,91 × 10−5, q
= 0,0195), Peptostreptococcus stomatis (SI/II, P = 4,62 × 10−6, q = 3,22 × 10−3; SIII/IV, P = 1,98 ×
10−10, q = 3,75 × 10−7), Peptostreptococcus anaerobius (SI/II, P = 7,57 × 10−5, q = 2,90 × 10−3;
SIII/IV, P = 1,83 × 10−10, q = 3,75 × 10−7), Lactobacillus sanfranciscensis (S0, P = 0,000616, q =
0,118; SIII/IV, P = 0,00328, q = 0,101), Parvimonas micra (SI/II, P = 1,89 × 10−5, q = 1,04 × 10–3;
SIII/IV, P = 6,15 × 10−13, q = 4,66 × 10−9) dan Gemella morbillorum (S0, P = 0,000257, q =
0,0800; SI/II, P = 5,62 × 10−7, q = 6,15 × 10–4; SIII/IV, P = 1,79 × 10−9, q = 2,11 × 10−6). Pola
terakhir dicirikan oleh Atopobium parvulum (MP, P = 0,00338, q = 0,153; S0, P = 7,03 × 10−5, q =
0,0492), Actinomyces odontolyticus (S0, P = 0,000164, q = 0,0636), Desulfovibrio longreachensis
(S0, P = 0,00164, q = 0,188) dan Phascolarctobacterium succinatutens (S0, P = 0,00236, q =
0,242). Kelimpahan A. parvulum divalidasi menggunakan PCR kuantitatif (Extended Data
Gambar. 5). Selain itu, kami mengidentifikasi spesies baru yang berasosiasi dengan CRC, di
antaranya Colinsella aerofaciens (P = 0,000840, q = 0,0544), Dorea longicatena (P = 0,000925, q
= 0,0557), Porphyromonas uenonis (P = 0,000439, q = 0,0475), Selenomonas sputigena (P =
0,00369, q = 0,101) dan Streptococcus anginosus (P = 0,00177, q = 0,0788) meningkat secara
signifikan pada SIII/IV dengan keempat saluran analitik yang digunakan (lihat Metode). Sejalan
dengan penelitian sebelumnya5, dua produsen butirat, Lachnospira multipara (S0, P = 0,000596,
q = 0,585; SI/II, P = 0,000801, q = 0,725; SIII/IV, P = 0,000116, q = 0,877) dan Eubacterium eligen
(S0, P = 0,00147, q = 0,698), berkurang secara signifikan pada tahap CRC. Bakteri penghasil
sulfida, antara lain Desulfovibrio vietnamensis (SIII/IV, P = 0,00109, q = 0,0565), D.
longreachensis (S0, P = 0,00164, q = 0,188) dan Bilophila wadsworthia (SIII/IV, P = 0,00408, q =
0,101), meningkat.
7. Laju replikasi bakteri15 secara signifikan (P <0,005) lebih tinggi untuk G. morbillorum (SI/II, P =
0,000436; SIII/IV, P = 5,09 × 10−7), P. micra (SI/II, P = 0,000114; SIII /IV, P = 2,00 × 10−6) dan P.
stomatis (SI/II, P = 0,00424; SIII/IV, P = 8,07 × 10−6) untuk tahap yang ditunjukkan, dan tahap F.
nucleatum ssp. nucleatum (P = 0,000386) dan D. longicatena (P = 0,000246) secara signifikan
lebih tinggi pada SIII/IV, dibandingkan dengan kontrol yang sehat (Extended Data Gambar 6).
Tingkat replikasi yang lebih tinggi dapat menjelaskan kelimpahan spesies yang lebih tinggi,
menunjukkan kemungkinan bahwa bakteri ini mungkin aktif secara metabolik. Khususnya, S.
moorei (MP, P = 0,000299) dan C. aerofaciens (S0, P = 0,000215) masing-masing menunjukkan
tingkat replikasi yang lebih tinggi secara signifikan pada MP dan S0, sebelum peningkatan
kelimpahan relatif pada tahap selanjutnya. Secara keseluruhan, temuan kami menunjukkan
bahwa perubahan mikroba dari sejumlah spesies mungkin terkait dengan perkembangan CRC
awal. Secara total, 65 metabolit menunjukkan perbedaan yang signifikan (P <0,005) dalam
setidaknya satu tahap dibandingkan dengan kontrol yang sehat (Data yang Diperluas Gambar 7
dan Tabel Tambahan 3). Asam empedu, asam lemak rantai pendek, asam amino dan elemen
 metabolisme karbon pusat menjadi fokus perhatian, karena mereka memiliki hubungan yang
erat dengan mikrobiota usus16 (Gbr. 2c dan Extended Data Gbr. 8). Dibandingkan dengan
kontrol yang sehat, kami menemukan peningkatan yang signifikan dalam konsentrasi
deoxycholate (DCA) di MP (P = 0,000118, q = 0,0503), dan glycocholate (P = 0,01000, q = 0,0508)
dan taurocholate (P = 0,00195, q = 0,0655) di S0. Selain itu, konsentrasi asam amino rantai
cabang (isoleusin (S0, P = 0,00124, q = 0,0508), leusin (S0, P = 0,000371, q = 0,00507; SIII/IV, P =
0,00314, q = 0,0931), valin (S0, P = 0,000483,
8. Karena DCA meningkat pada MP, kami mencari spesies yang mungkin berkorelasi dengan
metabolit ini. B. wadsworthia adalah satu-satunya spesies yang secara signifikan terkait dengan
DCA di MP (Gbr. 2d). Koefisien korelasi positif pada tahap lain tetapi tidak signifikan. B.
wadsworthia diketahui tumbuh dalam media yang mengandung taurocholate18, suatu bentuk
konjugat dari prekursor DCA, cholate. Mengingat bahwa A. parvulum meningkat secara
signifikan pada MP dan S0, dan telah dilaporkan merupakan hub jaringan bakteri penghasil H2 S
melalui hubungan ko-kejadian yang tinggi dengan Streptococcus pada pasien dengan penyakit
radang usus19, kami memeriksa korelasi kelimpahan ini spesies dengan spesies lain. Jumlah
bakteri yang berkorelasi dengan Atopobium meningkat secara nyata pada S0 pada tingkat genus
dan spesies (Gbr. 2e,f). Ada korelasi yang kuat antara A. parvlum dan A. odontolyticus, S.
anginosus, S. moorei dan G. morbillorum, di mana kelimpahan relatif meningkat pada S0
dan/atau pada tahap selanjutnya. Peningkatan Atopobium bahkan pada tahap awal CRC
menunjukkan bahwa hal itu dapat memiliki pengaruh yang kuat pada komunitas bakteri
penghasil H2 S. Sebanyak 1.243 Gen ortologi Gen dan Genom Kyoto (KEGG) ortologi (gen KO)
menunjukkan peningkatan yang signifikan (P <0,005) dan 96 penipisan yang signifikan dalam
setidaknya satu tahap, dibandingkan dengan kontrol yang sehat. Karena konsentrasi asam
amino tinja sangat berubah dari S0 (Gbr. 2c), kami memeriksa kelimpahan gen mikroba untuk
memeriksa peran mikroorganisme dalam metabolisme asam amino (Gbr. 3a).
9. Perubahan dalam kelimpahan gen ditunjukkan dalam representasi jalur (Gbr. 3b dan Data yang
Diperluas Gbr. 8b). Modul jalur, yang menetapkan batas untuk biosintesis dan degradasi bakteri,
dibuat secara manual dengan memodifikasi peta jalur KEGG yang mengacu pada 'Metabolisme
mikroba di lingkungan yang beragam' (map01120) atau literatur20-23. Di antara jalur yang
paling banyak berbeda, metabolisme asam amino aromatik dan jalur penghasil sulfida
ditemukan terkait dengan CRC. Gen yang terlibat dalam biosintesis fenilalanin dan tirosin
meningkat secara signifikan, di antaranya pheC (P = 1,94 × 10−5, q = 0,0297 dalam S0)
diidentifikasi sebagai penanda skor tertinggi untuk membedakan kasus S0 dari kontrol yang
sehat (Gbr. 4b dan Extended). Data Gambar 9). Dalam jalur katabolik, gen yang terlibat dalam
degradasi fenilalanin melalui produksi fenilasetat24-26 toksik meningkat terutama pada MP.
Gen yang terlibat dalam biosintesis triptofan berkurang secara signifikan (P <0,005) di SIII/IV.
Dissimilatory sulfate reductase subunit A (dsrA), yang bertanggung jawab untuk produksi
genotoksik hidrogen sulfida27, meningkat secara signifikan pada SIII/IV (P = 0,00499, q = 0,0729)
(Gbr. 3b
10. dsrA ditemukan aktif dalam sejumlah bakteri pereduksi sulfat termasuk Desulfovibrio spp.28
dan — misalnya, Desulfovibrio piger (P = 0,0178, q = 0,226) — secara substansial tinggi pada
SIII/IV. Sebagian besar lesi S0 dapat disembuhkan dengan pendekatan endoskopi dan ada
peluang yang luas untuk deteksi3. Untuk menyelidiki potensi parameter metagenomik dan
metabolisme usus untuk bertindak sebagai penanda diagnostik, kami membuat pengklasifikasi
 regresi logistik hutan acak dan LASSO untuk membedakan kasus S0 dan SIII/IV dari kontrol yang
sehat. Empat jenis model dibangun berdasarkan spesies saja, gen KO saja, data metabolit saja
atau kombinasi dari ketiganya. Perbandingan potensi klasifikasi di antara empat model
menghasilkan kinerja yang lebih baik dari model kombinasi dibandingkan model individu dalam
klasifikasi S0 dan SIII/IV (Gbr. 4b,c). Pengklasifikasi hutan acak mencapai area di bawah kurva
receiveroperating Characteristic (ROC) (AUC) 0,78 dan 0,85 untuk mendeteksi pasien dengan
CRC S0 dan SIII/IV. Hasil yang diperoleh dengan menggunakan pengklasifikasi regresi logistik
LASSO ditunjukkan pada Extended Data Gambar. 9.
11. Dalam klasifikasi S0, fitur berperingkat tinggi terutama adalah gen KO, termasuk pheC (yang
mengkode sikloheksadienil dehidratase). Fitur lain termasuk D. longreachensis, S. moorei, leusin,
valin, fenilalanin dan suksinat (Gbr. 4b), yang terdeteksi sebagai terdistribusi secara berbeda
(Gbr. 2b,c). Fitur peringkat teratas dari klasifikasi SIII/IV termasuk anaerob oral, seperti P. micra,
P. stomatis, F. nucleatum dan P. anaerobius, yang sebelumnya telah diidentifikasi sebagai
spesies penanda untuk CRCs5,29,30 (Gbr. 4b). Data metagenom diperoleh dari 28 pasien dengan
CRC (SI/II dan SIII/IV) sebelum dan sekitar 1 tahun setelah perawatan bedah. Kelimpahan relatif
P. stomatis, P. anaerobius, P. micra, P. uenonis dan D. longicatena di antara 22 spesies yang
dibahas pada Gambar 2b berkurang setelah pengangkatan tumor (Gambar 4d,e). Perbandingan
kelima spesies ini dengan sampel feses dari subjek HS tidak menunjukkan perbedaan yang
signifikan (Gbr. 4f). Hasil utama yang diperoleh dalam penelitian ini ditunjukkan pada Gambar.
4a. Studi saat ini tentang hubungan antara ekosistem usus dan tumorigenesis multistep
menghasilkan informasi tentang mikroorganisme dan profil metabolit turunan mikroorganisme
di CRC. Hasil kami menunjukkan bahwa pergeseran mikrobioma dan metabolom pada MP dan
S0 terjadi, di samping tahap yang lebih lanjut. Pergeseran yang sangat berbeda di seluruh tahap.
Dua pola elevasi spesies ditemukan: yang pertama terdiri dari peningkatan terus menerus dari
tahap awal dan seterusnya, sedangkan yang lain menunjukkan elevasi hanya pada tahap awal.
Pola terakhir adalah fokus utama dari penelitian ini, mengingat kemungkinan bahwa perubahan
keadaan mikrobioma usus mempengaruhi individu untuk mengembangkan CRC. Secara khusus,
hasil kami menunjukkan bahwa kelimpahan F. nucleatum dan S. moorei meningkat pada S0,
yang mungkin mengindikasikan kontribusi spesies ini pada kejadian awal tumorigenesis, selain
hubungan yang diketahui dengan CRCs5,31 lanjut. Khususnya, A. parvulum dan A. odontolyticus
menunjukkan peningkatan yang signifikan hanya pada MP dan/atau S0. Analisis jaringan kami
menunjukkan kemunculan bersama dari dua spesies di S0 dan korelasi kuat A. parvulum dengan
Streptococcus spp., yang dikenal sebagai produsen H2 S32. A. parvulum telah terbukti
merupakan pusat jaringan bakteri penghasil H2 S melalui hubungan co-kejadian yang tinggi
dengan Streptococcus pada pasien dengan penyakit radang usus19. A. odontolyticus sering
hadir di rongga mulut dan saluran pencernaan manusia sehat dan, khususnya, telah terbukti
menjadi salah satu spesies Actinomyces yang dominan dalam mengembangkan biofilm pada
permukaan gigi33. Sebelumnya telah dilaporkan bahwa keberadaan A. odontolyticus dalam
sampel tinja pasien dengan karsinoma pada adenoma, meskipun ukuran sampelnya kecil34.
Studi lebih lanjut akan diperlukan untuk mengklarifikasi mekanisme yang tepat dimana bakteri
ini dapat berkontribusi pada tumorigenesis.
12. Konsentrasi DCA meningkat secara signifikan pada pasien dengan MP. DCA diketahui
menyebabkan peningkatan kerusakan DNA dan mutasi35. Dalam penelitian pada hewan,
pemberian asam empedu menghasilkan insiden tumor yang lebih tinggi di usus36. B.
 wadsworthia, yang pertumbuhannya dirangsang oleh empedu18, adalah satu-satunya spesies
yang secara signifikan berkorelasi dengan DCA dalam penelitian ini (Gbr. 2d). Konsentrasi asam
empedu terkonjugasi (taurocholate dan glycocholate) juga meningkat pada S0. Kuesioner kami
menunjukkan bahwa B. wadsworthia berkorelasi positif dengan asupan protein makanan (P =
0,00278) dan daging (P = 0,00248) di S0 (Data Diperpanjang Gambar 10). B. wadsworthia,
kerabat dekat spesies Desulfovibrio, diketahui menyebabkan peradangan, tetapi belum
dipelajari secara intensif terkait dengan karsinogenesis29, meskipun sering dibahas dalam
konteks disbiosis9,18. Meskipun mikroorganisme ini adalah bagian normal dari ekosistem usus,
bakteri yang berlebihan dan metabolitnya di kolorektum dapat menyebabkan peradangan dan
kerusakan DNA.
13. Keterbatasan berikut harus dipertimbangkan dengan penelitian kami. Pertama, meskipun studi
ini mencakup kohort CRC yang besar, kohort validasi diperlukan di masa mendatang. Kedua,
kami tidak menentukan jumlah sel total dalam sampel tinja dan laporan terbaru menunjukkan
bahwa beban mikroba adalah pendorong utama perubahan yang diamati pada mikrobiota pada
beberapa penyakit37. Kelimpahan absolut daripada relatif mungkin merupakan indikator yang
lebih baik dari karsinogenesis CRC multilangkah. Ketiga, meskipun metode kami (yaitu, sampel
tinja yang dikumpulkan segera saat buang air besar pertama setelah memulai pemberian agen
pembersih usus secara oral) tampaknya sesuai untuk mengumpulkan dan membekukan bahan
dari subjek yang menjalani kolonoskopi di rumah sakit, ada kekurangan yang serupa. laporan
studi untuk perbandingan. Selain itu, efek pembersihan usus pada data metabolisme yang
dihasilkan dalam kasus dengan CRC masih harus diselidiki. Oleh karena itu, penelitian lebih
lanjut diperlukan untuk memvalidasi protokol pengambilan sampel kami.
14. Dalam penelitian ini, kami tidak dapat mengklarifikasi potensi keterlibatan mikroba secara
bertahap sebelum pembentukan adenoma dan kausalitas yang lebih rinci antara mikrobioma
dan/atau metabolom dan tumor. Oleh karena itu, kami mengumpulkan sampel biopsi tinja dan
jaringan secara prospektif dari individu yang menjalani kolonoskopi secara berkala untuk analisis
mikrobioma di masa mendatang dengan kemungkinan komponen longitudinal. Selain itu,
klarifikasi hubungan antara mikrobioma usus dan karakteristik molekul tumor pada masing-
masing pasien dengan CRC akan diperlukan untuk memahami peran mikrobioma dalam
karsinogenesis CRC. Kasus yang memiliki penyakit keturunan atau diduga penyakit keturunan
dikeluarkan dalam penelitian ini. Adenoma terbatas pada adenoma kolorektal tipe konvensional,
tidak termasuk lesi bergerigi. Baru-baru ini, telah dilaporkan bahwa yang terakhir ini mungkin
terkait dengan bakteri jaringan38-40. Data metagenomik dan metabolomik yang berasal dari
sampel feses dan/atau jaringan dari pasien dengan penyakit herediter atau diduga penyakit
herediter dan pasien dengan lesi bergerigi dapat memperjelas aspek lain tumorigenesis CRC.
Sebagai kesimpulan, kami mengamati perubahan dinamis dalam komposisi mikroba, kelimpahan
gen dalam mikrobiota usus dan metabolit selama perkembangan CRC multilangkah. Meskipun
tidak jelas apakah spesies dan metabolit ini secara langsung menyebabkan tumorigenesis,
perubahan struktural pada mikrobiota usus dapat menyebabkan perubahan pada lingkungan
mikro onkogenik. Lebih lanjut, penelitian ini menyoroti bahwa perkembangan CRC dapat
dipengaruhi oleh hasil metabolisme seluruh mikrobiota, serta adanya organisme terkait kanker.
Kami percaya bahwa CRC pada dasarnya bukan hanya penyakit genetik tetapi juga penyakit
mikroba
Metode
Subyek studi dan pengumpulan sampel. Penelitian ini dilakukan dengan subjek yang menjalani
kolonoskopi total di National Cancer Center Hospital, Tokyo, Jepang. Sampel dan informasi klinis
yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dalam kondisi informed consent dan dengan
persetujuan dewan peninjau kelembagaan dari masing-masing lembaga yang berpartisipasi
(Pusat Kanker Nasional, 2013–244; Institut Teknologi Tokyo, 2014018). Sampel tinja
dikumpulkan segera pada buang air besar pertama setelah memulai pemberian oral agen
pembersih usus di rumah sakit dan disimpan beku di es kering. Kami sebelumnya menunjukkan
koefisien korelasi Pearson berpasangan yang tinggi untuk profil taksonomi dan tidak ada
perbedaan signifikan dalam kelimpahan taksonomi dari 20 genera dominan antara jenis sampel
ini dan contoh tinja beku yang diambil satu hari sebelum kolonoskopi (sampel standar)41.
Subyek diberikan diet rendah residu komersial yang sama sehari sebelum prosedur kolonoskopi.
Data gaya hidup, termasuk kebiasaan diet, diperoleh dengan kuesioner rinci (475 item
pertanyaan, 25 halaman), berdasarkan contoh yang digunakan dalam studi prospektif berbasis
Pusat Kesehatan Masyarakat Jepang42. Kasus yang memiliki penyakit herediter atau diduga
penyakit keturunan (misalnya, poliposis adenomatosa familial, kanker kolorektal non-poliposis
herediter, ketidakstabilan mikrosatelit-tinggi), penyakit radang usus, riwayat bedah perut atau
sampel tinja yang tidak cukup untuk pengumpulan data adalah dikeluarkan dari penelitian.
Distribusi antar kelompok (sehat, MP, S0, SI/II, SIII/IV dan HS) indeks massa tubuh (IMT),
konsumsi alkohol (gram per hari) dan kebiasaan merokok (indeks Brinkman) dianalisis
menggunakan Kruskal– Tes peringkat-jumlah Wallis. Distribusi gender antarkelompok dianalisis
menggunakan uji 2 Pearson dengan d.f. = 5.

ekstraksi DNA. DNA diekstraksi dari sampel tinja beku dengan metode pemukulan manik-manik
seperti yang dijelaskan sebelumnya43 menggunakan Kit Isolasi DNA GNOME (MP Biomedicals).
Kualitas DNA dinilai dengan Agilent 4200 TapeStation (Agilent Technologies). Setelah
pengendapan akhir, sampel DNA disuspensikan kembali dalam buffer TE dan disimpan pada
suhu -80 ° C sebelum analisis lebih lanjut.
Urutan senapan seluruh genom. Pustaka pengurutan dibuat dengan Kit Persiapan Sampel DNA
Nextera XT (Illumina). Kualitas perpustakaan dikonfirmasi dengan Agilent 4200 TapeStation.
Pengurutan sampel feses seluruh genom shotgun dilakukan pada platform HiSeq2500 (Illumina).
Semua sampel dipasangkan dan diurutkan dengan panjang baca 150-bp ke ukuran data yang
ditargetkan 5,0 Gb.
Kontrol kualitas. Sebanyak 31.797.649.036 (rata-rata 49.375.231) pembacaan berpasangan,
mencakup 4.772.084.552.120 (rata-rata 7.410.069.180) pasangan basa, menjalani kontrol
kualitas sebagai berikut. Bacaan mentah yang mengandung huruf 'N' (pasangan basa tidak
diidentifikasi) dibuang. Bacaan yang mengandung sekuens DNA bakteriofag phiX diidentifikasi
dengan memetakannya terhadap bacaan menggunakan Bowtie 2 (versi 2.2.9)44 dengan opsi
yang telah ditetapkan dalam '–fast-local' dan dibuang. Pembacaan dipangkas untuk urutan
adaptor dan urutan primer menggunakan cutadapt (versi 1.9.1)45 yang menggunakan opsi
berikut ('-a CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC -O 33 -q 17' untuk urutan primer
maju; '-a CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA -O 32 -q 17' untuk urutan primer terbalik).
Bacaan yang mengandung nilai kualitas 17 atau kurang berturut-turut dipotong di ujung 3′
dalam program cutadapt. Selanjutnya, bacaan dengan panjang kurang dari 50 pasangan basa
dibuang. Pembacaan nilai kualitas rata-rata 25 atau kurang akan dibuang. Selanjutnya,
pembacaan dipetakan terhadap genom manusia (nomor 24 gi: dari 568336000 hingga
568336023, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/568336023/, GRCh38) menggunakan
Bowtie2 (versi 2.2.9). Mereka yang dipetakan dianggap berasal dari genom manusia dan
dibuang. Akhirnya, bacaan yang tidak berpasangan dibuang. Akibatnya, total 28.482.269.496
(rata-rata 44.227.127) pembacaan berpasangan dengan 4.114.878.107.497 (rata-rata
6.389.562.279) pasangan basa secara total (disebut sebagai 'pembacaan berkualitas tinggi'
selanjutnya) (Tabel Tambahan 6) digunakan untuk analisis berikut.

Profil taksonomi. Bacaan berkualitas tinggi disejajarkan dengan set data unit taksonomi
operasional (OTU) yang telah dihitung sebelumnya yang disimpan di VITCOMIC246
menggunakan BLAST+ (versi 2.2.30)47 (batas: E < 1 × 10−8) sehingga pembacaan disaring untuk
sekuens rRNA 16S bakteri dan archaeal, sedangkan sekuens tRNA, 23S rRNA dan internal
transscribed spacer (ITS) dikeluarkan. Ada sejumlah strategi referensi yang berlaku untuk
penetapan taksonomi untuk data metagenom. Kami menggunakan Proyek Pohon Hidup Semua
Spesies (LTP) dari database SILVA karena dua alasan. Pertama, ia memiliki keuntungan bahwa
basis data lokus tunggal berisi lebih banyak entri taksonomi daripada yang mencakup banyak
lokus atau genom lengkap. Kedua, gen referensi dalam database ini hanya terdiri dari jenis galur
yang telah diisolasi dan oleh karena itu dapat dibiakkan dalam kondisi tertentu dan relatif
mudah dimanipulasi dalam percobaan hewan. Pembacaan yang difilter disejajarkan dengan LTP
database SILVA (versi 123)48 menggunakan BLASTn (cut-off: E <1 × 10−8, identitas urutan > 97%,
cakupan penyelarasan > 80%, skor bit > 70)48 ,49. Hanya hit teratas yang dipilih. Hasilnya, total
8.367 spesies dan 1.941 genera berhasil diidentifikasi. Kelimpahan relatif suatu spesies dihitung
per sampel, yang didefinisikan sebagai jumlah bacaan yang ditetapkan untuk spesies dibagi
dengan jumlah total bacaan yang selaras dalam sampel. Jika pembacaan disejajarkan dengan
lebih dari satu urutan taksonomi dalam database dengan skor penyelarasan yang sama,
taksonomi ini diberi nilai 1 dibagi dengan jumlah taksonomi sehingga mereka dapat 'berbagi'
pembacaan. Kelimpahan Obat Alam relatif dari genus dihitung sebagai jumlah semua spesies
yang termasuk dalam genus. Profil yang dihasilkan selanjutnya disebut sebagai profil spesies'
dan 'profil genus' (Tabel Tambahan 7). Untuk memvalidasi jalur pembuatan profil spesies kami,
kami menggunakan tiga jalur pipa lainnya untuk mendapatkan profil tingkat spesies. Kami
menggunakan bacaan berkualitas tinggi di atas untuk mendapatkan OTU metagenomik tingkat
spesies (mOTU) dari profil taksonomi oleh profiler mOTU50. Basis data profiler ini didasarkan
pada sepuluh gen penanda salinan tunggal universal. Gen penanda ini terdiri dari contoh yang
diturunkan dari genom dan metagenom referensi. Kami menggunakan dua database; dengan
dan tanpa OTU yang diturunkan dari data metagenome. Profil yang dihasilkan mengkodekan
651 spesies dan 838 spesies (Tabel Tambahan 8). Pembacaan berkualitas tinggi juga digunakan
untuk mendapatkan profil taksonomi tingkat spesies oleh MetaPhlAn251 (versi 2.6.0) dengan
parameter default, yang menghasilkan 623 spesies (Tabel Tambahan 9). MetaPhlAn2 didasarkan
pada gen penanda spesifik spesies.