LAB ANFAR

Judul 1: Penetapan Kadar Parasetamol Menggunakan Sepektrofotometri UV

Spektrofotometri: merupakan metode untuk menentukan konsentrasi suatu senyawa berdasarkan
pengukuran sinar yang diserap atau dilewatkan (ditransmisikan) oleh suatu larutan dengan alat
spektrofotometer.
Spektrofotometri: cara atau metode pengukurannya
Spektrofotometer: alatnya
Spektrofotometri UV-Vis: ada dua cahaya dalam satu alat.
Panjang gel. UV: 200-400 nm
Panjang gel. Visible (sinar tampak): 400-800 nm
Prinsip penggunaan alat spektro: Cahaya dari sumbernya ditembakkan. Cahaya yg ditembakkan
namanya polikromatis. Cahaya yang ditembakkan/ polikromatis akan didispersi di
monokromator. Monokromator akan memecah atau memfilter cahaya polikromatis menjadi
monokromatis. Cahaya monokromatis masuk ke kuvet dan menimbulkan 3 hal (apa yang terjadi
bilamana sinar mengenai materi?): diserap/disabsorpsi (cahaya yang tadi ditembakkan akan
terserap ke senyawanya, jadi di dalam kuvet ada senyawa obat yang akan terabsorpsi ke gugus
fungsi), ditransmisikan (kalau cahaya tidak terabsorbsi maka cahaya akan diteruskan/ dilewatkan
melalui kuvetnya), dipantulkan/ dihamburkan, dll (cahaya tidak dapat masuk ke dalam kuvetnya
sehingga cahaya keluar/ ditembakkan kembali atau cahaya tidak terabsorpsi dalam kuvetnya dan
tidak bisa keluar lagi maka terhamburkan)
Parasetamol:
• Suasana asam: pada panjang gel 245 nm A11 688 a pada pelarut HCl 0,1 N
• Suasana akali: pada panjang gel 257 nm A11 715 a pada belarut NaOH 0,1 N
• Struktur molekul parasetamol yang mempunyai gugus kromofor yaitu ikatan rangkap
terkonjugasi dan adanya gugus auksokrom (-OH) yang tersubstitusi pada gugus kromofor
dan elektron non bonding yang dapat meningkatkan efek delokalisasi elektron phi pada
inti benzen sehingga senyawa ini dapat menyerap radiasi pada daerah ultraviolet
(Batokromik efek)
• PCT bisa diukur pakai spektro UV karena struktur molekulnya ada gugus kromofor atau
ikatan rangkap terkonjugasi (C=C)
Penetapan kadar PCT:
Bahan PCT, Baku Pembanding FI (BPFI) PCT (serbuk PCT yang murni, tidak ada pengotor lain
selain PCT nya kalau ada pengotor mungkin hanya 1%), Pelarut NaOH 0,1N
Pembuatan LIB:
BPFI PCT ditimbang secara kuantitatif 50mg lalu dilarutkan secara kuantitatif ke dalam labu
ukur 50ml lalu diadkan dengan NaOH secara kuantitatif (dapat konsentrasi 1000g/ml disebut
LIB I). Dilanjutkan dengan pembuatan LIB II dengan cara mengambil 5ml dari LIB I secara
kuantitatif dan dimasukkan ke dalam labu kedua 50ml (konsentrasi 100g/ml)
Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum:
Harus cari tahu berapa spektrum serapan maksimum teoritisnya dengan cara menghitung
konsentrasi larutan menggunakan Hukum Lambert-Beer. Setelah dapat konsentrasi 6 (g/ 100ml)
maka kita pipet 1,5 ml dari labu kedua tadi dan campurkan ke dalam 25 ml (pake rumus
pengenceran)

A = Absorbansi
A11 = ketetapan absorbsivitas
b = tebal kuvet
c = konsentrasi (g/ 100ml atau %b/v)
Kenapa A yang digunakan 0,434? → terkait dengan kesalahan pada analisis spektrofotometri.
0,434 merupakan kesalahan yang paling minimal
Upaya untuk meminimalkan kesalahan analisis spektrofotometri di 0,434

Pembuatan Spektrum Serapan Baku Berbagai Konsentrasi (Kurva Kalibrasi):

Setelah dapat konsentrasi serapan maksimum maka buat Serapan Baku Berbagai Konsentrasi.
Kurva kalibrasi didapat dari LIB II lalu dipipet masing” ke labu pertama 1,5ml ; 2ml ; 3ml ;
3,5ml ; 4ml. Kita menentukannya harus KPK/ berkelipatan agar dapat regresi orde satu/ lurus/
linear

Penentuan Kadar Parasetamol:

20 tablet ditimbang secara kuantitatif lalu digerus dan ambil 10mg berat setara dari gerusan tadi
lalu campurkan ke labu 100ml (konsentrasi 1000 ppm/ LIB I) lalu dipipet 1 ml dari LIB I
masukkan ke labu 50ml (konsentrasi 100 ppm/ LIB II). Setelah itu diencerkan lagi seperti
mengukur panjang gelombang maksimum pada konsentrasi 6ppm tadi (ambil 1,5ml) lalu ukur
pada kuvet

VIDEO LAB:
Prosedur kerja spektrofotometri Uv-Vis:
− Dibilas kuvet dengan pelarut (NaOH)
− Dibuang limbah dan diisi kembali sampai batas. Kuvet ada 2 sisi, yang kasar (tempat
memegang kuvet) dilap dengan tissue, yang bening dilap dengan tissue lensa. Sinar
ultraviolet akan menembus bagian dari sisi bening
− Dimasukkan kuvet pada bagian atas ujung
− Dibilas kembali kuvet kedua dengan NaOH (karena mau membuat baseline), dibuang,
diisi kembali dengan NaOH sampai tanda batas. Pengisian kuvet tidak terlalu penuh.
Dilap kembali seperti kuvet pertama
 − Dimasukkan ke spektrofotometer
− Diatur webscan pada komputer. Pilih no. 8 (informasi baseline), ditekan sistem, dienter
dan akan terbaseline secara otomatis
Pembuatan larutan LIB I PCT:
− Ditimbang PCT BPFI 50 mg
− Dimasukkan ke labu tentukur 50 ml menggunakan corong
− Dilarutkan sampel yang tersisa pada perkamen dengan pelarut
− Dihomogenkan
− Dicukupkan sampai garis tanda dengan pelarut. Saat mendekati garis tanda dengan pipet
tetes agar tidak melewati garis batas
− Dihomogenkan = LIB I
Pembuatan larutan LIB II:
− Dipipet 5 ml LIB I mengunakan volume pipet sampai garis batas
− Dimasukkan ke labu tentukur kedua
− Dicukupkan dengan pelarut sampai batas tanda
− Dihomogenkan = LIB II
Pembuatan Larutan Panjang Gelombang Maksimum PCT:
− Diambil larutan 3 ml dari LIB II PCT dengan matt pipet. Ketika mengambil larutan
dengan matt pipet harus mencapai skala 0 terlebih dahulu lalu dibuang larutan ke labu
tentukur sebanyak 3 ml
− Dimasukkan ke labu tentukur 50 ml dan dicukupkan dengan pelarut sampai garis tanda
− Dihomogenkan
− Larutan siap diukur dengan spektrofotometer
Pengukuran Panjang Gelombang Maksiumum PCT:
− Setelah melakukan baseline, ambil kuvet kemudian dibilas dengan larutan panjang
gelombang PCT
− Diisi kuvet dengan larutan panjang gelombang PCT
− Dilap kuvet dengan tissue
− Dimasukkan kuvet dalam alat
Panjang gelombang PCT pada alat: 255 nm (MEMENUHI)
Panjang gelombang PCT pada literatur: 257 nm
Pembuatan Larutan Kurva Kalibrasi PCT:
− Diambil dari larutan LIB II menggunakan rumus pengenceran (C1.V1 = C2.V2), dimana
konsentrasi LIB II adalah c1. Pada percobaan ini digunakan konsentrasi yang berbeda
yaitu 3, 4, 6, 7, 8 ppm
− Dilakukan pengukuran kalibrasi dengan menggunakan spektrofotometri Uv-vis

− Disetting nama: PCT Unit Label dalam satuan ppm, ambil sample ID sejumlah sample
yang akan dianalisis, curve data menjadi 0, 3, 4, 6, 7, 8 ppm
− Dimasukkan larutan kurva kalibrasi PCT dengan konsentrasi yang berbeda ke dalam
kuvet dan dilakukan pengukuran
Hasil:

Persamaan regresi: 0,0998 (MEMENUHI SYARAT)

Pembuatan Larutan Sampel PCT:
− Ditimbang 20 tablet PCT dalam cawan porselen dengan neraca analitik sehingga
diperoleh bobot 20 tablet
− Dimasukkan ke lumpang dan digerus sampai halus
− Ditimbang berat setara sebanyak 120 mg
− Dimasukkan sampel PCT ke labu tentukur 100 ml, dibilas perkamen agar serbuk PCT
larut
− Dicukupkan sampai garis batas
− Dilakukan penyaringan dimana 10 ml filtrat pertama dibuang
− Disaring kembali untuk dilakukan pengukuran
Pengukuran Kadar Parasetamol:
− Dibilas kuvet lalu diisi kembali
− Dilap kuvet dengan tissue
Hasil:
Baseline: harus baseline dulu absorbansinya supaya tidak menganggu pengotor atau pelarut yang
kita gunakan nanti
Penyaringan filtrat pertama dibuang karena isinya bukan PCT melainkan talkum atau bahan”
pengikat atau pengotor dari tablet tersebut karena PCT larut dalam pelarut NaOH sehingga yang
tersaring bukan PCT yang mau kita ukur
PCT bisa larut di suasana asam maupun basa, di praktikum kali ini memakai suasana basa
karena NaOH lebih banyak di lab, lebih murah juga
Gugus auksokrom : gugus yang mempunyai elektron sunyi, gugus jenuh yg dpt terikat dengan
kromofor shg dpt mengubah pjg gelombang dan intensitas dari serapan maksimalnya
Gugus kromofor : gugus yg tak jenuh
Hiksokromik/ blue shift : pergeseran pjg gel maksimal ke arah pjg gel yg lbh rendah
Batokromik/ red shift : pergeseran pjg gel maksimal ke arah pjg gel yg lbh panjang
Hiperkormik : peningkatan harga absorbansinya
Hipokromik : penurunan harga absorbansinya
Pjg gelombang Spektrofotometer UV : 200-400 nm
Pjg gelombang spektrofotometer visible : 400-800 nm
Hukum lambert beer : Bila radiasi monokromatis melalui larutan dengan ketebalan b maka
sebagian energi radiasi akan diserap oleh molekul dalam larutan
FP = Vol labu yang dipakai / vol labu yang dipipet
Judul 2: Penentuan kadar sulfametoksazol dalam tablet yang mengandung trimetoprim
secara spektrofotometri sinar tampak
Visible : sinar tampak, mengukur panjang gelombang pada gelombang 400-800 nm
Analisis spektrofotometri : analisis senyawa obat secara spektrofotometri dengan rentang
pengukuran serapan di wilayah sinar tampak (visible) pada panjang gelombang 400-800 nm
3 dasar langkah pengukuran:
1. Adanya senyawa lain yang menganggu di wilayah UV
2. Membentuk senyawa derivate yg berwarna khas menggunakan reaksi kimia
3. Senyawa derivate berbentuk terkonjugasi yang menaikkan absorptivitas molar dan
kepekaan metode
Beberapa senyawa dengan gugus fungsinya:

Akan fokus kepada amin primer aromatic karena sampel yg digunakan adalah golongan sulfa
yaitu sulfametoksazol. Pereaksi yang digunakan asam nitrit
Dasar analisis : hukum lambert-beers dengan syarat larutan berwarna yang sudah dibentuk
tersebut harus jernih (kalau tdk jernih tdk bs di analisis dengan spektro-vis) → Senyawa yg tdk
berwarna diubah menjadi senyawa yang berwarna dengan pereaksi kimia (reaksi kromogenik) →
Senyawa yg baru terbentuk dapat dengan segara mantap atau mungkin baru mantap setelah
beberapa waktu → Operating time (waktu yang tepat) dimana absorbansinya tidak naik turun/
sudah stabil → Bagaimana caranya? Biasanya melakukan pengukuran absorbansi senyawa yang
telah ditambahkan pewarna tersebut selama 30 menit – 60 menit dimana absorbansinya diukur
setiap menit untuk melihat apakah absorbansinya sudah stabil. Cara melihat absorbansi stabil :
melihat angka absorbansi (nilai absorbansi tidak naik turun)
Penentuan kadar sulfametoksazol dalam tablet yang mengandung trimetoprim
Absorbansi maksimum sulfametoksazol : sekitar 258
Tetapi karena ada trimetorpim yang memberikan absorbansi (walaupun absorbansinya di 288)
tetapi di wilayah maksimum absorbansi sulfametoksazol, trimetorpim juga memberikan serapan
sehingga akan menambah serapan dari sulfametoksazol sehingga tidak memungkinkan untuk
memeriksa senyawa sulfametoksazol pada wilayah UV dengan metode biasa

Struktur sulfametoksazol

Bagaimana cara untuk memberikan pewarnaan? Melakukan reaksi diazotasi : NaNo2 (natrium
nitrit) + HCl → asam nitrit sehingga gugus amin akan berubah menjadi garam diazonium. Garam
diazonium akan bereaksi dengan NED dan membentuk senyawa yang lebih kompleks. Senyawa
kompleks ini akan memberikan warna di daerah visible / bergeser ke wilayah visible yang
awalnya berada di daerah UV / batokromik
Absorbansi Sulfametoksazol
Sulfametoksazol ketika belum ditambahkan pewarna absorbansinya berada di 258 nm (yang
mana spektro UV 200-400 nm). Ketika ditambahkan pewarna maka bergeser ke wilayah Vis
dimana absorbansi nya sekitar 520-an (akan terlihat pada demo). Ketika sudah di wilayah Vis
maka trimetorpim tidak akan menganggu aborbansi dari sulfametoksazol karena absorbansi
trimetorpim terdapat di 288 nm

Prosedur Video
− Dibilas kuvet dengan pelarut yang digunakan
− Dimasukkan pelarut dalam kuvet sampai garis batas
− Dikeringkan dengan tisu wajah pada sisi buram dan tisu lensa pada sisi bening
− Dipastikan kuvet dalam keadaan bening
− Dimasukkan kuvet pada bagian depan dan belakang
− Dilakukan baseline pada alat spektro vis
− Diatur panjang gelombang 400-800 nm
− Diketik sampel yang digunakan pada alat spektrofotometer vis
− Pilih 1. System, maka alat akan melakukan proses baseline
 − Disiapkan Sulfametoksazol BPFI 50 mg [Sampel : 20 tablet cotrimoxazole (kandungan
sulfametoksazol 400 mg dan trimetoprim 80 mg)]

Pembuatan LIB I – Sulfametoksazol

− Dipersiapkan labu dan corong
− Ditimbang sulfametoksazol BPFI 50 mg
− Dimasukkan ke dalam labu tentukur menggunakan corong
− Diambil larutan 25 ml HCl 1 N
− Dibilas sisa serbuk yang menempel dikertas perkamen dengan HCl 1 N
− Dicukupkan dengan HCL 0,1 N sampai garis tanda labu
− Digunakan pipet tetes sampao garis tanda
− Diperoleh LIB I – Sulfametoksazol

Pembuatan LIB II – Sulfametoksazol

− Dipipet 5 ml dari LIB I sampai garis tanda
− Dimasukkan ke dalam labu LIB II
− Dicukupkan dengan HCl 0,1 N sampai garis tanda
− Diperoleh LIB II – Sulfametoksazol

− Dipipet 1 ml dari LIB II

− Dipipet 1 ml pereaksi NaNO2
− Ditambahkan 1 ml pereaksi NaNO2 ke dalam labu tentukur kemudian diamkan 3 menit
− Dipipet 1,5 ml larutan amonium amidosulfonat 1%
− Ditambahkan 1,5 ml larutan amonium amidosulfonat 1% dan dihomogenkan
− Dipipet 2,5 ml larutan N-(1- Naphtyl etilendiamine) 0,2%
− Ditambahkan 2,5 ml larutan N-(1- Naphtyl etilendiamine) 0,2% ke dalam labu
− Larutan akan mengalami perubahan warna
− Dicukupkan dengan HCl 0,1 N sampai garis tanda
− Diperoleh larutan panjang gelombang maksimum
− Dibuang larutan bekas baseline
− Dimasukkan larutan panjang gelombang ke dalam kuvet
− Dibilas terlebih dahulu
− Dimasukkan kembali sampai mendekati garis tanda
− Dikeringkan kuvet
− Dimasukkan ke dalam alat
− Diatur settingan pada alat
− Dilakukan pengukuran dengan menekan auto zero
− Diperoleh kurva panjang gelombang maksimum
Pembuatan Larutan OT (selama 20 menit pada panjang gelombang
− Dilakukan pemipetan 1 ml LIB II masukkan ke dalam labu tentukur 50 ml
− Dimasukkan 1 ml dalam labu OT
− Diambil 1 ml pereaksi NaNO2
− Dimasukkan 1 ml dalam labu OT
− Dipipet 2,5 ml larutan N-(1- Naphtyl etilendiamine) 0,2%
− Dimasukkan 2,5 ml larutan N-(1- Naphtyl etilendiamine) 0,2%
− Larutan menjadi berwarna dan catat waktunya
− Dicukupkan dengan HCl 0,1 N sampai garis tanda
− Diperoleh larutan OT

Pembuatan larutan linieritas kurva

− Dipipet larutan LIB II sebanyak 1,0 ml ; 1,5 ml ; 2,0 ml ; 2,5 ml dan 3,0 ml
− Dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml yang telah disiapkan 5 buah
− Ditambahkan 1 ml pereaksi Natrium nitrit 0,5%
− Diambil 1,5 ml larutan amonium amidosulfonat 1%
− Dimasukkan 1,5 ml larutan amonium amidosulfonat 1% ke dalam labu tentukur
− Diambil 2,5 ml larutan N-(1- Naphtyl etilendiamine) 0,2%
− Dimasukkan 2,5 ml larutan N-(1- Naphtyl etilendiamine) 0,2%
− Dicukupkan dengan HCl 0,1 N sampai garis tanda
− Dihasilkan larutan linieritas kurva dengan 6 konsentrasi berbeda dan siap dilakukan
pengukuran
− Diatur settingan pada alat
− Dibilas kuvet terlebih dahulu
− Diisi kuvet sampai garis tanda
− Dikeringkan kuvet
− Dimasukkan kuvet ke dalam alat
− Dilakukan pengukuran
 − Dikeluarkan kuvet dan dilakukan pengukuran konsentrasi lain dengan prosedur yang
sama
− Diperoleh hasil dari kurva linieritas

− Dihidupkan timbangan
− Dimasukkan kertas perkamen dan cawan porselen ke dalam timbangan
− Kemudian ditara timbangan
− Ditimbang 20 tablet cotrimoxazole (kandungan sulfametoksazol 400 mg dan trimetoprim
80 mg)
− Proses penimbangan memakai pinset
− Diperoleh bobot 20 dan dicatat
− Dimasukkan ke dalam lumpang dan digeruskan
− Dihitung serbuk setara dengan 25 mg sulfametoksazol kemudian ditimbang
− Dicatat hasil penimbangan
− Dibungkus perkamen

Penetapan sulfametoksazol dalam sampel

− Disiapkan 20 ml HCl 1 N
Pembuatan larutan sampel
− Dimasukkan sampel yang telah ditimbang ke dalam labu menggunakan corong
− Dibilas serbuk yang ada di perkamen dengan pelarut
− Dibilas sisi corong
− Disaring menggunakan kertas saring pada corong
− Dibuang 10 ml filtrat pertama
− Disaring kembali
− Dipipet 5 ml filtrat
− Dimasukkan ke dalam labu tentukur
− Diencerkan dengan HCl 0,1 N sampai garis tanda
− Dipipet 2 ml dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml
− Ditambahkan 1 ml pereaksi NaNO2 0,5%
 − Ditambahkan 1,5 ml larutan amonium amidosulfonat 1%
− Ditambahkan 2,5 ml larutan N-(1- Naphtyl etilendiamine) 0,2% (perubahan warna akan
terjadi)
− Dicukupkan dengan HCl 0,1 N sampai garis tanda
− Diperoleh larutan sampel
− Dibuat replikasi 6 labu dengan prosedur sama seperti sebelumnya
− Diukur serapan pada panjang gelombang maksimum dalam rentang operating time yang
diperoleh

Fungsi HCl 2 konsentrasi:

1 N : untuk melarutkan saja
0,1 N : untuk mencukupkan

Pengujian OT
Dalam kuvet itu diuji 60 menit tapi terakhir dibuang lalu diisi kembali

Hukum lambert beer

Bila radiasi monokromatis melalui larutan dengan ketebalan b maka sebagian energi radiasi akan
diserap oleh molekul dalam larutan

UV medium jernih, 200-400 (diperbolehkan + - 2), deuterium, tidak ada OT

Visible berwarna, 400-800 (diperbolehkan + - 3), tungsten, OT

Pada menit 1-5 blm stabil

6-15 serapannya 0,123
15-20 0,124
20-30 0,125
Yang paling banyak maka kita ambil OT (STABIL)

larutan amonium amidosulfonat : menghilangkan kelebihan NaNO2

Judul 3 : penentuan kadar asam salisilat secara spektrofotometri sinar tampak
Sampel : asam salisilat
Spektrofotometri salah satu metode untuk menentukan kualitatif dan kuantitatif suatu senyawa /
zat secara modern kalau volumetri secara klasik

Spektrofotometri UV-Vis adalah pengukuran absorbsi radiasi elektromagnetik (REM) suatu

senyawa didaerah UV pada panjang gelombang 200-400 nm dan sinar tampak 400-800 nm

Pada spektrofotometri sinar tampak yang harus diperhatikan : sampel yg diperiksa harus
berwarna jernih, panjang gelombang yang dipakai 400-800 nm. Zat yang tidak berwarna dibuat
menjadi berwarna dengan penambahan pereaksi, operasionalnya memakai waktu kerja

Hukum lambert beer dpt juga digunakan untuk larutan yang berwarna asal jernih. Dalam analisa
suatu senyawa yg tdk berwarna memungkinkan diubah menjadi berwarna dengan penambahan
pereaksi

Untuk merubah suatu senyawa menjadi berwarna dpt dilakukan dengan bbrp cara:
1. Mereaksikan senyawa tersebut dengan pereaksi lain yang mempunyai kromofor atau
auksokrom sehingga hasil reaksi menyebabkan efek batokromik kearah sinar tampak.
Contoh: sulfadiazin dengan para DAB HCl → jingga
2. Mereaksikan dengan suatu ion logam yg dpt menerima pasangan elektron bebas dr
senyawa tsb, sehingga terbentuk suatu senyawa komplek yg berwarna. Cth : turunan
salisilat + ion feri → ungu
3. Dengan penambahan asam atau basa shg senyawa tersebut berwarna. Cth: phenolfthalein
dengan basa akan memberikan wrn merah krn terbentuk senyawa quinoid
4. Mereaksikan suatu senyawa shg akan dpt bereaksi dgn suatu kromofor. Cth: ion feri
direduksi menjd fero kemudian ditambahkan pereaksi alpa dipridil atau ortho
phenantrolin berwarna merah atau ungu

Umumnya wrna yg terbentuk segera stabil atau baru stabil bbrp waktu dan serapannya tetap dan
kemudian dpt turun naik lagi jd wrna yg stabil, tp tdk tahan lama. Oleh krn itu perlu waktu yg
tepat kapan absorbsinya tetap dan dapat dibaca maka perlu dicari waktu kerja / OT

Cara mencari OT : dengan menguji absorbansinya pada pjg gelombang maksimum dr larutan
hasil reaksi senyawa yg diuji yg disiapkan berdasarkan petunjuk kepustakaan. Kemudian dibuat
data dan kurva yg menyatakan hubungan waktu dalam menit / detik dengan absorbansinya
Contoh: asam salisilat + Fe terbentuk warna ungu lalu cari panjang gelombang maksimum. Dari
data ini terlihat bahwa absorbansi stabil / mantap pada menit ke 3-9. Setelah mengetahui OT
maka harus menentukan serapan maksimum dan linieritas kurva kalibrasi yg tdk boleh bekerja di
luar waktu yg ditentukan
Untuk sediaan yg sudah berwarna misalnya vitamin B12, B2, tetrasiklin, dll maka penentuan
kadarnya lgsg ditentukan scr spektro Vis dengan pelarut yg sesuai kemudian diukur pd pjg
gelombang maximum

Penentuan kadar salisilat dalam tablet

Senyawa salisilat yg mempunyai gugus -OH bebas seperti salisilamid dan asam salisilat jika
direaksikan dgn ion feri akan memberikan wrn ungu yg stabil. Untuk yang tdk mempunyai gugus
-OH bebas seperti asetosal tdk akan memberikan wrn ungu jd harus dihidrolisa dulu menjd asam
salisilat dan asam asetat lalu ditambahkan ion feri sehingga menghasilkan wrn ungu dan ukur
secara visible. Begitu juga dgn metilsalisilat diubah menjd asam salisilat

Tahap penentuan kadar asam salisilat:

1. Pembuatan LIB BPFI
2. Penentuan kurva serapan dan OT (BPFI)
3. Penentuan linieritas kurva kalibrasi dan persamaan regresi (BPFI)
4. Penentuan kadar sampel asam salisilat

Di literatur konsentrasi untuk mencari absorbsi maksimum 40 mcg/ ml dan panjang gelombang
maksimum 525 nm

Pada pembuatan LIB dibuat konsentrasi sedemikian rupa sehingga mudah untuk dipindahkan
larutannya dri dalam pipet. Pd salisilat untuk mencari absorbsi maksimum diliteratur pd
konsentrasi 40 mcg/ml, pakai rumus pengenceran

Ukur serapannya maka didapat pjg gelombang dialat yg diperbolehkan beda tambah kurang 3 nm
(kalau tidak sesuai maka dilakukan pengulangan, maksimal pengulangan 3x, apabila masi tidak
sesuai maka alat harus dikalibrasi). Setelah itu penetapan OT ulangi lagi seperti diatas ukur
serapannya (400-800 nm) krn diliteratur panjang gelombangnya sudah tertera dan dari warna
ungu yg didapat maka disingkat dari (460-560 nm)

Untuk kurva kalibrasi dibuat 6 konsentrasi (1 blanko) yg bervariasi diharapkan serapannya

menyebar 0,2-0,65 dimana konsentrasinya dibuat sedemikian rupa. Jdi pada salisilat pd
konsentrasi (0, 20, 30, 40, 50, 60 mcg/ ml)

Jika tidak menyebar serapannya maka diulangi lagi yg berdekatan sehingga koefisien korelasi
memenuhi syarat

Setelah didapat data kurva kalibrasi maka dapat dihitung persamaan regresi dan koefisien
korelasi

Untuk mengukur sampel maka dibuat dengan 2 cara:

1. Perlakuannya sama dengan mencari panjang gelombang maksimum dianggap
konsentrasinya 40 mcg lalu ukur serapannya yg hrs masuk didaerah kalibrasi
 2. Timbang sejumlah tertentu sampel kemudian buat konsentrasinya diarahkan ke 40
mcg/ml kemudian diukur larutannya yg harus masuk di daerah kurva kalibrasi. Jika diluar
kurva kalibrasi maka diulang lagi, dipekatkan atau diencerkan

Untuk tablet, perhitungan kembalikan keberat rata” 1 tablet jika dalam bentuk tablet

Konsentrasi cuplikan (x) pada persamaan garis regresi masukkan rumus y = ax + b.

Konsentrasi cuplikan untuk berdasarkan pendekatan pakai rumus perbandingan A1/C1 = A2/C2
sebagai pembanding diambil absorban yg terdekat pd data kurva kalibrasi

Prosedur video
− Dibilas kuvet dengan pelarut yang digunakan
− Dimasukkan pelarut ke dalam kuvet sampai garis tanda
− Dilap kuvet dan pastikan dalam keadaan kering
− Dimasukkan ke dalam alat
− Dilakukan baseline pada alat
− Diatur panjang gelombang pada 400-800 nm
− Diketik sampel yang digunakan pada spektro uv-vis
− Pilih 1. System maka alat akan melakukan proses baseline

Penimbangan sampel bedak tabur

− Dimasukkan kertas perkamen dan ditara
− Dimasukkan sampel dan ditimbang, dicatat

LIB Asam salisilat BPFI

− Dipersiapkan BPFI asam salisilat 50 mg
− Dimasukkan ke dalam labu tentukur 100ml
− Dibilas perkamen dengan etanol 10ml
− Diambil larutan etanol 5 ml
− Dibilas pada sisi corong dengan etanol 5 ml
− Dihomogenkan larutan sampai larut sempurna
− Dicukupkan dengan akuades sampai garis tanda
− Dihomogenkan LIB asam salisilat
− Diperoleh LIB asam salisilat

Pembuatan larutan OT/ Panjang gelombang maksimum

− Dipersiapkan bola hisap dan matt pipet
− Diambil 4 ml dari LIB I (pastikan mencapai skala nol terlebih dahulu)
− Dimasukkan ke labu tentukur LIB II
− Dipipet ke labu tentukur dari skala 0-4 ml
− Dipersiapkan bola hisap dan matt pipet
− Diambil larutan 5ml FeCl3 dengan matt pipet
 − Dimasukkan 5 ml FeCl3 1% (larutan berubah warna : ungu kehitaman)
− Dicukupkan larutan sampai garis tanda menggunakan corong
− Dicukupkan dengan pipet tetes saat mendekati garis tanda
− Dihomogenkan larutan dan larutan siap untuk dilakukan pengukuran
− Didapatkan larutan OT/ panjang gelombang

Pengukuran larutan OT
− Dibilas kuvet dgn larutan yg akan diukur
− Dimasukkan larutan ke dlm kuvet sampai garis tanda
− Dilap kuvet
− Dimasukkan kuvet ke alat
− Dilakukan pengaturan pada alat
− Tekan start
− Diperoleh data OT

Pengukuran larutan panjang gelombang maksimum

− Dibilas kuvet dengan larutan panjang gelombang maksimum
− Dimasukkan ke dlm kuvet sampai garis tanda
− Dilap kuvet
− Dimasukkan kuvet ke dlm alat
− Ditekan start pd alat dan akan terbaca hasil pengukuran pd alat

Pembuatan larutan kurva kalibrasi dengan 5 konsentrasi berbeda (0, 20, 30, 40, 50, 60
ppm)
− Dipersiapkan bola hisap dan volume pipet
− Dipipet larutan LIB asam salisilat
− Dimasukkan ke dlm labu kurva kalibrasi I
− Dipersiapkan bola hisap dan matt pipet
 − Diambil larutan FeCl3 1%
− Dimasukkan ke dalam labu kurva kalibrasi (berubah warna : ungu kehitaman)
− Dicukupkan dengan akuades menggunakan corong
− Dihomogenkan dan larutan kurva kalibrasi siap diukur

Pembuatan larutan kurva kalibrasi dengan 5 konsentrasi berbeda (0, 20, 30, 40, 50, 60
ppm)
− Dipersiapkan bola hisap dan volume pipet
− Dipipet larutan LIB asam salisilat
− Dimasukkan ke dlm labu tentukur 50 ml
− Dipersiapkan bola hisap dan matt pipet
− Diambil 5 ml larutan FeCl3 1%
− Dimasukkan ke dalam labu kurva kalibrasi (berubah warna : ungu kehitaman)
− Dihomogenkan larutan
− Dicukupkan dengan akuades menggunakan corong sampai mendekati garis tanda lalu
lanjut menggunakan pipet tetes
− Dihomogenkan dan larutan kurva kalibrasi siap diukur
− Diperoleh pembuatan larutan kurva kalubrasi dengan konsentrasi 0, 20, 30, 40, 50, 60
ppm

Pengukuran kurva kalibrasi asam salisilat

− Dibilas kuvet dengan larutan labu 1
− Dimasukkan larutan labu 1 ke dalam kuvet sampai garis tanda
− Dilap kuvet
− Dimasukkan kuvet ke dalam alat
− Diubah panjang gelombang menjadi 524 nm
− Diubah nama sampel menjadi Salt (asam salisilat)
− Pilih bagian curve data
− Diubah konsentrasi menjadi 0, 20, 30, 40, 50, 60 ppm
− Diukur larutan kurva kalibrasi dengan 5 konsentrasi yg berbeda
− Dilakukan preparasi seperti sebelumnya pada konsentrasi lain
− Diperoleh kurva kalibrasi dengan 5 konsentrasi yg berbeda

Pembuatan larutan sampel

− Dipersiapkan sampel yg telah ditimbang scr seksama
− Dimasukkan sampel yg telah ditimbang scr seksama dgn bantuan corong ke labu tentukur
− Dibilas perkamen dengan etanol 10 ml
− Diitambahkan 5 ml etanol untuk membilas sisi corong
− Dihomogenkan larutan agar larut sempurna
− Ditambahkan akuades menggunakan corong dan saat mendekati garis tanda digunakan
pipet tetes
 − Dihomogenkan
− Disaring larutan sampel dengan kertas saring dan corong
− Dibuang 10 ml filtrat pertama
− Disaring kembali larutan sampel dengan kertas saring dan corong
− Disiapkan volume pipet dan bola hisap
− Diambil 10 ml larutan sampel yang telah disaring tadi
− Dimasukkan ke dalam labu tentukur
− Disiapkan matt pipet dan bola hisap
− Dipipet larutan FeCl3 1%
− Dimasukkan ke dalam labu larutan sampel (berubah warna : ungu kehitaman)
− Dihomogenkan agar larut sempurna
− Dicukupkan dengan akuades sampai mendekati garis tanda dan gunakan pipet tetes untuk
sampai garis tanda
− Dihomogenkan larutan sampel dan siap dilakukan pengukuran

Pengukuran larutan sampel

− Dibilas kuvet dengan larutan
− Dimasukkan larutan sampel 1 ke kuvet
− Dilap kuvet
− Dimasukkan kuvet ke dalam alat
− Dilakukan pengukuran
− Dilakukan perlakuan sama seperti prosedur sebelumnya
− Dihasilkan data hasil pengukuran larutan sampel

Kenapa ga makai LIB II?

Karena konsentrasi LIB I sudah kecil dan sudah cukup juga

Kadar asam salisilat : Tidak kurang dari 90% dan tidak lebih dari 110%
JUDUL 4 : Penentuan kadar sulfametoksazol dan trimetoprim dalam tablet secara
multikomponen dan matrik dengan spektrofotometri UV

Analisis Multikomponen : pengukuran dua atau lebih senyawa obat scr bersama” dgn cara
spektrofotometri uv-vis dmn msg” komponen tdk saling mengganggu atau gangguan dari
komponen sangat kecil
Multi : banyak atau lebih
Komponen : senyawa obat

Dasar analisis : hukum lambert beer yg dikenal sifat penambahan (aditif) → absorbansi pada
panjang gel tertentu = jumlah absorbansi semua komponen pd pjg gel tersebut
Jadi, dalam suatu analisis (kalau campuran), ada 2 kemungkinan:
1. Absorbansi tidak saling tumpang tindih
2. Saling tumpang tindih / menganggu (maka perlu menggunakan analisis multikomponen)

Contoh:
Tablet kortimoksazol yang mengandung sulfametoksazol dan trimetorpim. Dilakukan penetapan
panjang gelombang. Ketika mengukur pada panjang gel maks pada sulfa ada absorbansi dari
trimetoprim. Ketika mengukur pada panjang gel maks pada trimetoprim ada absorbansi dari
sulfa. Jadi, ketika ukur absorbansi dari kortimoksazol tanpa pemisahan maka absorbansi yg
didapatkan saling menganggu sehingga perlu dilakukan analisis multikomponen

Cara analisis multikomponen:

− Pengukuran absorbansi pjg gel maks pada sulfametoksazol (258 nm) / bisa bergeser 1-2
nm
− Pengukuran absorbansi pjg gel maks pada trimetoprim (288 nm)
− Penentuan nilai absorptivitas (a) sulfametoksazol pd panjang gel 258 nm dan 288 nm.
Ukur absorbansi sulfa pada 258 nm dan 288 nm dengan konsentrasi yang sama sehingga
nanti didapatkan a sulfa 258 = A sulfa 258 / C sulfa ; a sulfa 288 = A sulfa 288 / C sulfa
− Penentuan nilai absorptivitas (a) trimetoprim pd panjang gel 258 nm dan 288 nm. Ukur
absorbansi trimetoprim pada 258 nm dan 288 nm dengan konsentrasi yang sama sehingga
nanti didapatkan a tprim 258 = A tprim 258 / C tprim ; a tprim 288 = A tprim 288 / C
tprim
− Rumus pada abs pd panjang gelombang 258 nm
 Ax : absorbtivitas sulfa
Cx : konsentrasi sulfa
Ay : absorbtivitas tprim
Cy : konsentrasi tprim
− Rumus pada abs pd panjang gelombang 288 nm

Ax : absorbtivitas sulfa
Cx : konsentrasi sulfa
Ay : absorbtivitas tprim
Cy : konsentrasi tprim
− Penetapan kadar tablet campuran → dengan mengukur sampel pada panjang gel 258 nm
(sulfa) dan ukur sampel pada panjang gel 288 nm

− Rumus penetapan kadar

Prosedur Video
− Dilakukan baseline pada alat spektro dengan pelarut NaOH 0,1 N
Pembuatan LIB Sulfametoksazol BPFI
− Disiapkan 15 ml etanol sbg pelarut sulfametoksazol BPFI
− Pembuatan LIB 1 sulfametoksazol bpfi dlm labu 50 ml
− Dimasukkan 50 mg sulfametoksazol bpfi yg telah ditimbang sebelumnya
− Dimasukkan ke dlm labu menggunakan corong
− Dibilas sisa serbuk pada perkamen dengan etanol
− Dibilas corong scr merata dmn memastikan tdk terdpt sisa serbuk yg melekat pd corong
− Dicukupkan dengan NaOH 0,1 N
− Dihomogenkan LIB 1
− Diperoleh LIB I (C = 1000 mcg/ ml)
− Dipersiapkan bola hisap dan volume pipet 5 ml
− Dipipet 5 ml larutan dari LIB I (pastikan sampai garis tanda)
− Dimasukkan ke dlm labu 50 ml yg kedua
− Dicukupkan dengan NaOH 0,1 N sampai garis tanda dan dihomogenkan
− Diperoleh LIB II (C = 100 mcg/ ml)
Pembuatan LIB I Trimetoprim pada labu 50 ml (prosed sama spt sebelumnya)
− LIB I Trimetorpim (C = 1000 mcg/ ml)
Pembuatan LIB II Trimetoprim pada labu 50 ml (prosed sama spt sebelumnya)
− LIB II Trimetorpim (C = 100 mcg/ ml)
Pembuatan larutan pjg gel maks sulfametoksazol
− Dipersiapkan LIB II sulfa dan labu 50 ml
− Dipasang bola hisap dan matt pipet 5 ml
− Diambil 3 ml LIB II sulfa
− Dimasukkan 3 ml ke labu panjang gel maks
− Dicukupkan dengan NaOH 0,1 N sampai garis tanda
− Dihomogenkan
Pembuatan larutan pjg gel maks trimetorpim (prosed sama spt sebelumnya)
− Yang membedakan larutan yg diambil 8,5 ml LIB II trimetoprim
Pengukuran panjang gel maksimum
− Dilakukan penyetinggan alat
− Dimasukkan larutan sulfametoksazol dlm kuvet, dibilas, dimasukkin lagi
− Dikeringkan kuvet
− Dimasukkan ke dlm alat spektro vis
− Diukur pd spektro spt pd teknis
− Diperoleh kurva pjg gel maks sulfa (254 nm)
− Dikeluarkan kuvet
− Dilakukan preparasi panjang gel maks trimetoprim
− Dimasukkan ke dlm kuvet, dibilas, dimasukkan lagi
− Dikeringkan kuvet
− Dimasukkan ke dlm alat spektro vis
− Ditekan tombol start
− Diperoleh pjg gel trimetoprim dan sulfa
− Diperoleh kurva overlay dr pjg gel maks sulfa dan tprim
 − Disiapkan larutan absorptivitas trimetoprim dan sulfa (prosedur sesuai dengan penuntun)
− Diatur pengaturan pada alat spektro
− Dgn panjang gel sulfa 254 nm dan trimetoprim 286 nm
− Dilakukan pengukuran absorptivitas trimetoprim
− Dimasukkan ke dlm kuvet, dibilas, dimasukkan lgi sampai garis tanda
− Dikeringkan
− Dimasukkan ke dlm alat dan dilakukan pengukuran
− Diperoleh absorptivitas trimetoprim
− Dilakukan preparasi spt sebelumnya
− Diperoleh hasil absorptivitas

Penetapan kadar sampel

− Sampel yang telah ditimbang berat setara 0,0374 gr
− Dimasukkan ke dlm labu dgn bantuan corong
− Dibilas perkamen dengan etanol
− Dibilas sisi corong dengan NaOH 0,1 N
− Dicukupkan dengan NaOH 0,1 N sampai garis tanda
− Disaring menggunakan kertas saring, 10 ml filtrat pertama dibuang
− Disaring kembali
− Disiapkan bola hisap dan volume pipet 1 ml
− Dipipet 1 ml filtrat dan dimasukkan ke dlm labu tentukur 50 ml
− Dicukupkan dgn NaOH 0,1 N sampai garis tanda menggunakan corong
− Dipipet 1 ml filtrat dan masukkan ke dlm labu tetukur 50 ml NaOH 0,1 N
− Dibuat replikasi menjadi 6 labu (prosed sama seperti sebelumnya)
− Dilakukan pengaturan pada alat (diatur pjg gel yg telah diukur sebelumnya)
− Diperoleh hasil multikomponen
Sulfa ada gugus amin primer. Ada gugus maka bisa azotasi dgn kasi nano2 shg membentuk
garam diazonium dan kasi warna NED (wrna ungu) → untuk ukur sulfa dengan Vis
UV : gdk wrna / gdk OT
Di judul ini gak ada pergeseran, dua” dibaca dan dihitung
Bisa 3 sampel? Bisa, karena multikomponen. Multi : banyak
Sebelum ditimbang baku BPFI harus dikeringkan selama 4 jam pd suhu 105 derajat lalu
ditimbang baru lanjut prosed
Absorbansi / A tergantung pada konsentrasi karena dikali C (ingat rumus). Misalnya kita ukur
suatu zat masuk ke dlm kuvet, satu kuvet itu kita ukur
Absorptivitas / a11 tdk tergantung pd konsentrasi, merupakan per satu konsentrasi, merupakan
ketetapan. Tergantung pada pelarut, suhu, strukturnya
Ada 2 : 960, 480 dosis kecil. Rasionya selalu 5:1. Sulfanya yang besar (5), trimet (1). Kalau
kortimoksazol 960 maka 800 : 160
Kadar menurut bpom : tidak lebih dari 93 persen dan tidak kurang dari 107 persen
Misalnya, Dipipet 2 ml dalam labu 100 maka FP = 50 kali
Untuk percobaan kali ini : spektrum tumpang tindih
Multikom : bisa tumpang tindih (satu arah dua arah), bisa juga untuk tidak tumpang tindih
Nama lain multikom : metode spektro derivatif (tidak tunggal, dua yang muncul)
Sebelumnya, itu tunggal, kita pisahkan atau kita geser
JUDUL 5 : Validasi metode penentuan kadar PCT dalam tablet secara spektrofotometer
UV

Validasi metode spektrofotometri UV

Pengertian validasi metode analisis
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penelitian terhadap parameter tertentu
berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi
persyaratan untuk penggunaannya

Kenapa perlu di validasi?

• Hasilnya tepat, teliti
• Dapat dipertanggung jawabkan
• Memberikan hasil yg sama jika dilakukan beda org, beda laboratorium maupun beda
waktu
Parameter” yg harus dipenuhi oleh validasi / Memenuhi persyaratan:
• Farmakope indonesia
• GLP (Good laboratory practices)
• GCP (good clinical practices)
• FDA (Food and drug administration)
• EPA (Enviromental protection agency)
• ISO 17025
Kapan dilakukan validasi dan verifikasi?
Validasi → pengembangan metode, metode baku yang dimodifikasi (ada suatu metode yg sudah
baku misalnya tercantum di buku resmi, namun dilakukan modifikasi misalnya menggunakan
pelarut yg lain atau perbandingan yg berbeda), metode yg tdk baku
Verifikasi → metode baku dan resmi yg diadopsi (semua prosedur diadopsi, tidak ada yg
berubah), compendial metod : metode” yg terdapat di dalam buku” resmi (FI, USP, AOAC, ISO,
dll)

Parameter validasi dlm farmakope amerika

Validasi metode → akurasi (ketepatan), presisi (ketelitian), linieritas, limit deteksi (LOD), limit
kuantitasi (LOQ), spesifitas, ketangguhan (ruggedness), ketahanan (robutness)
Yang dilakukan dalam praktikum : akurasi (ketepatan), presisi (ketelitian), linieritas, limit
deteksi (LOD), limit kuantitasi (LOQ)

Akurasi (tepat, cermat)

Kecermatan adalah ukuran yg menunjukkan kedekatan hasil analisis yg diperoleh dgn kadar
analit yg ditambahkan (baku pembanding). Akurasi dinyatakan dengan % recovery yaitu % nilai
yg diperoleh terhadap nilai sebenarnya

Akurasi dpt ditentukan dgn dua cara, yaitu :

 1. Metode simulasi (spike placebo recovery)
Sejumlah analit baku pembanding ditambahkan ke dalam campuran bahan pembawa
sediaan farmasi (placebo) lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan
dengan kadar analit baku pembanding yg ditambahkan (kadar sebenarnya)
Bila tidak memungkinkan membuat sampel plasebo krn matriksnya tdk diketahui spt
obat” paten atau krn analitnya berupa suatu senyawa endogen misalnya metabolit
sekunder maka dpt dipakai metod penambahkan baku (adisi)
2. Metode penambahan baku (standard adition method)
Sampel obat tentukan kadarnya → diperoleh A unit analit
Sampel obat ditambahkan baku pembanding analit (C*A), tentukan kadarnya →
diperoleh kadar total (F unit analit), hitung % recovery
𝐶𝑓−𝐶𝐴
% recovery = 𝐶∗𝐴 𝑥 100%
CF : konsentrasi total analit yg ditambahkan ke dalam sampel
CA : konsentrasi analit dlm sampel (tidak ditambahkan baku)
C*A : konsentrasi analit yg ditambahkan
Persyaratan % recovery = 98% - 102% (tergantung dari metode dan tergantung dari
konsentrasi analit dalam sampel/ SSA 80-120 persen)
Pada metode penambahan baku:
Analit baku pembanding yg ditambahkan minimum dgn 3 konsentrasi pd rentang spesifik : 80,
100, 120 % dan setiap rentang spesifik dilakukan 3 replikasi

Menurut ICH (International conference on harmonization)

Pengumpulan data untuk uji akurasi dilakukan,
• Pengujian minimal 9 kali penetapan kadar
• Minimal 3 kali konsentrasi yg berbeda
• Tiap 1 konsentrasi 3 kali replikasi (pengulangan)
Presisi (teliti, seksama)
Presisi adalah ukuran yg menunjukkan kedekatan dari hasil uji analisis yg diperoleh, jika
prosedur dilakukan secara berulang pada sampel yg diambil dari campuran yg homogen
Presisi dinyatakan dengan simpangan baku relativ/ relative standard deviation (RSD)/ Koefisien
variasi (CV)
Σ (𝑋−𝑥)2
SD = √ 𝑛−1
𝑆𝐷
RSD = 𝑥 100%
𝑥̄
RSD = Relatif standar deviasi (%)
SD = standar deviasi
x̄ = kadar rata-rata
persyaratan penerimaan RSD ≤ 2%

Tahap” penentuan validasi metode spektrofotometri pada penentuan kadar PCT Tablet
1. Pembuatan LIB baku pembanding
50 mg PCT BPFI ditimbang secara seksama ; masukkan ke labu tentukur 50 ml + 20 ml
NaOH 0,1 N ; kocok ; NaOH 0,1 N sampai garis tanda ; LIB I (1000 mcg / ml)
Pipet 0,5 ml LIB I masukkan ke dalam labu tentukur 50 ml + NaOH 0,1 N sampai garis
tanda ; LIB II (100 mcg/ ml)
2. Penentuan panjang gelombang maksimum
Menentukan konsentrasi pengukuran yg memberikan serapan (A = 0,434) yaitu serapan
dgn kesalahan fotometrik terkecil dgn menggunakan hukum lambert beert
Diketahui : PCT dlm pelarut NaOH 0,1 N, panjang gelombang : 257 nm, A11 : 715
(Clarke’s)

Pipet 3 ml dari LIB II (konsentrasi 100 mcg/ ml) masukkan ke labu tentukur 50 ml +
NaOH 0,1 N sampai garis tanda (konsentrasi 6 mcg/ ml) ; ukur serapan pd panjang
gelombang 200-400 nm

3. Pembuatan kurva kalibrasi

Pipet 1,5 ; 2 ; 3 ; 3,5 ; 4 dari IB II (konsentrasi 100 mcg/ ml) masukkan ke labu tentukur
50 ml + NaOH 0,1 N sampai garis tanda (konsentrasi 3, 4, 6, 7, 8 mcg/ ml) ; ukur serapan
pd panjang gelombang maksimum → didapatkan kurva kalibrasi (kurva yg
menghubungkan antara konsentrasi dan serapan / garis linear)
4. Perhitungan penimbangan serbuk untuk validasi
• PCT tablet mengandung 500 mg PCT
• Perhitungan dibuat pd rentang spesifik : 80, 100, 120 %
• Pada setiap rentang spesifik mengandung : 70% analit dan 30% baku pembanding
 5. Prosedur penentuan kadar rentang spesifik 80%
Tanpa penambahan baku:
• Timbang 20 tablet dan serbukkan, timbang serbuk 392 mg (setara 280 mg PCT)
masukkan ke labu tentukur 100 ml + NaOH 0,1 N sampai garis tanda
• Pipet filtrat 1,5 ml masukkan ke dalam labu tentukur 50 ml + NaOH 0,1 N sampai
garis tanda
• Larutan ini dipipet 2 ml masukkan ke dalam labu tentukur 50 ml + NaOH 0,1 N
sampai garis tanda
• Ukur serapan pd pjg gel maks (dilakukan 3 replikasi)
Dengan + baku (80%)
• Timbang serbuk tablet 392 mg (setara 280 mg PCT) + baku PCT 120 mg
masukkan ke dlm labu tentukur 100 ml + NaOH 0,1 N sampai garis tanda
• Pipet filtrat 1,5 ml masukkan ke dalam labu tentukur 50 ml + NaOH 0,1 N sampai
garis tanda
• Larutan ini dipipet 2 ml masukkan ke dalam labu tentukur 50 ml + NaOH 0,1 N
sampai garis tanda
• Ukur serapan pd pjg gel maks (dilakukan 3 replikasi)
Rentang spesifik 100%
Tanpa penambahan baku : SAMA SAJA PROSED (bedanya timbang serbuk tablet 490
mg setara 350 mg PCT)
Dengan baku : SAMA SAJA PROSED (bedanya timbang serbuk tablet 490 mg setara
350 mg PCT+ baku PCT 150 mg)
Rentang spesifik 100%
Tanpa penambahan baku : SAMA SAJA PROSED (bedanya timbang serbuk tablet 588
mg setara 420 mg PCT)
Dengan baku : SAMA SAJA PROSED (bedanya timbang serbuk tablet 588 mg setara
420 mg PCT+ baku PCT 180 mg)

Limit deteksi (LOD) dan limit kuantitasi (LOQ)

Limit deteksi (LOD) → konsentrasi analit terendah yg msih dideteksi oleh metode analisa namun
tdk perlu terkuantisasi sbg nilai yg tepat
Limit kuantitasi (LOQ) → konsentrasi analit terendah yg msih dideteksi secara kuantitaif dgn
akurasi dan presisi yg masih dpt diterima
Prosedur video
− Baseline dengan NaOH 0,1 N
− Dimasukkan NaOH 0,1 N ke dlm kuvet sampai garis tanda
− Dikeringkan kuvet
− Dimasukkan kuvet ke dlm alat
− Dilakukan pengaturan pd alat spektrofotometer UV
− Baseline dengan NaOH 0,1 N
Pembuatan LIB I PCT
− Dipersiapkan PCT BPFI 50 mg
− Dimasukkan ke labu tentukur 50 ml menggunakan corong
− Dibilas sampel yang tersisa pada perkamen dengan NaOH 0,1 N
− Dihomogenkan larutan agar sempurna
− Dicukupkan sampai garis tanda dengan NaOH 0,1 N, digunakan pipet tetes saat
mendekati garis tanda
− Dihomogenkan LIB I PCT (C = 1000 mcg/ ml)
Pembuatan LIB II PCT
− Diambil 5 ml dari LIB I dengan volume pipet
− Dimasukkan ke dlm labu tentukur 50 ml
− Dicukupkan sampai garis tanda dengan NaOH 0,1 N, digunakan pipet tetes saat
mendekati garis tanda
− Dihomogenkan LIB II PCT (C = 100 mcg/ ml)
Pembuatan larutan panjang gelombang maks PCT
− Diambil larutan 3 ml dari LIB II PCT dengan matt pipet
− Dimasukkan ke dlm labu pjg gel maks
− Dicukupkan sampai garis tanda dengan NaOH 0,1 N, digunakan pipet tetes saat
mendekati garis tanda
− Dihomogenkan larutan
− Diperoleh larutan panjang gel PCT
Pengukuran pjg gel maks PCT
− Dibilas kuvet
− Dimasukkan larutan pjg gel maks PCT ke dlm kuvet
− Dikeringkan kuvet
− Dimasukkan kuvet ke dlm alat spektro UV
− Dilakukan pengaturan pd alat
− Diperoleh pjg gel maks PCT 255 nm
Pembuatan larutan kurva kalibrasi PCT
− Diambil LIB II berturut-turut 1,5 ; 2 ; 3 ; 3,5 ; 4 (untuk mendapatkan konsentrasi 3, 4, 5,
6, 7, 8 mcg/ ml) dengan matt pipet
− Dimasukkan ke dlm labu tentukur 50 ml
 − Dicukupkan sampai garis tanda dengan NaOH 0,1 N, digunakan pipet tetes saat
mendekati garis tanda
− Dihomogenkan
− Diperoleh larutan kurva kalibrasi
Pengukuran larutan kurva kalibrasi PCT
− Dilakukan pengaturan alat pd spektro UV
− Dilakukana pengukuran kurva kalibrasi
− Diperoleh hasil larutan kurva kalibrasi dgn konsentrasi 3, 4, 5, 6, 7, 8 mcg/ ml dgn
konsentrasi 0,998

− Dilakukan penimbangan 20 tablet

− Dibersihkan timbangan menggunakan kuas
− Disambungkan adapter timbangan ke stop kontak
− Dihidupkan timbangan
− Dimasukkan cawan datar dlm timbangan dan ditara
− Dimasukkan 20 tablet dgn pinset
− Ditimbang dan dicatat hasilnya
− Dimasukkan 20 tablet yg telah ditimbang ke dlm lumpang dan digerus dgn alu
Pembuatan larutan rentang spesifik 80% (tanpa baku)
− Ditimbang serbuk 392 mg (setara 280 mg PCT)
− Dimasukkan ke dlm labu dgn menggunakan corong
− Dibilas serbuk yg menempel pd kertas perkamen dgn NaOH 0,1 N
− Dibilas sisi corong dengan NaOH 0,1 N
− Ditambahkan larutan NaOH 0,1 N
− Dihomogenkan larutan
− Dicukupkan dengan NaOH 0,1 N sampai garis tanda
− Dicukupkan dengan pipet tetes
− Dipastikan sejajar dgn garis tanda
− Dihomogenkan
− Dibuang 10 ml filtrat pertama dgn menyaring menggunakan kertas saring
− Dituang 10 ml larutan utk membersihkan kertas saring
− Disaring larutan dgn kertas saring utk diambil filtratnya
− Dipipet 1,5 ml filtrat menggunakan matt pipet
− Dimasukkan ke dlm labu tentukur 50 ml
− Ditambahkan larutan NaOH 0,1 N ke dalam labu dengan bantuan corong
− Dihomogenkan larutan
− Ditambahkan kembali dgn larutan NaOH 0,1 N
− Dicukupkan sampai garis tanda dengan menggunakan pipet
− Dihomogenkan larutan
− Dipipet 2 ml larutan dan dimasukkan ke labu tentukur 50 ml
 − Ditambahkan NaOH 0,1 N
− Dihomogenkan
− Dicukupkan sampai garis tanda dengan menggunakan pipet
− Dihomogenkan larutan
− Diperoleh larutan rentang spesifik 80% (tanpa baku). Dilakukan 3 x replikasi
Pembuatan larutan rentang spesifik 100% (tanpa baku)
− Ditimbang serbuk 490 mg (setara 350 mg PCT)
− SAMA SAJA PROSED
− Diperoleh larutan rentang spesifik 100% (tanpa baku). Dilakukan 3 x replikasi
Pembuatan larutan rentang spesifik 120% (tanpa baku)
− Ditimbang serbuk 588 mg (setara 420 mg PCT)
− SAMA SAJA PROSED
− Diperoleh larutan rentang spesifik 120% (tanpa baku). Dilakukan 3 x replikasi
Pengukuran rentang spesifik 80% (tanpa baku)
− Dipengukuran rentang spesifik 80% (tanpa baku). Dilakukan replikasi sebanyak 3x
− Dimasukkan larutan rentang spesifik 80% ke dlm kuvet
− Dikeringkan kuvet
− Dimasukkan kuvet ke dlm spektro uv
− Diperoleh hasil rentang spesifik 80%
Pengukuran rentang spesifik 100% (tanpa baku)
− Dipengukuran rentang spesifik 100% (tanpa baku). Dilakukan replikasi sebanyak 3x
− Dimasukkan larutan rentang spesifik 100% ke dlm kuvet
− Dikeringkan kuvet
− Dimasukkan kuvet ke dlm spektro uv
− Diperoleh hasil rentang spesifik 100%
Pengukuran rentang spesifik 120% (tanpa baku)
− Dipengukuran rentang spesifik 120% (tanpa baku). Dilakukan replikasi sebanyak 3x
− Dimasukkan larutan rentang spesifik 120% ke dlm kuvet
− Dikeringkan kuvet
− Dimasukkan kuvet ke dlm spektro uv
− Diperoleh hasil rentang spesifik 120%

− Dipersiapkan sampel dan BPFI PCT untuk rentang spesifik 80, 100, 120%
Pembuatan larutan rentang spesifik 80% (dengan baku)
− Dipersiapkan serbuk sampel 392 mg (setara 280 mg PCT) dan BPFI PCT 120 mg
− Dimasukkan serbuk tablet yg telah ditimbang dlm labu dgn corong
− Dibilas sisa serbuk yg melekat kertas perkamen dgn NaOH 0,1 N dan sisi corong
− Dimasukkan serbuk BPFI PCT
 − Dibilas sisa serbuk yg melekat kertas perkamen dgn NaOH 0,1 N dan sisi corong
− Ditambahkan larutan NaOH 0,1 N
− Dihomogenkan
− Dicukupkan dengan NaOH 0,1 N sampai garis tanda
− Dihomogenkan
− Disaring dengan kertas saring
− Dibuang 10 ml filtrat penyaringan pertama agar menghilangkan kotoran yg melekat pd
kertas saring
− Disaring dan diambil filtrat
− Dipipet 1,5 ml dari filtrat
− Dimasukkan ke dlm labu 50 ml
− Ditambahkan larutan NaOH 0,1 N
− Dihomogenkan
− Dicukupkan dengan NaOH 0,1 N sampai garis tanda
− Dihomogenkan
− Dipipet 2 ml dari larutan dengan volume pipet
− Dimasukkan ke dlm labu 50 ml
− Ditambahkan larutan NaOH 0,1 N
− Dihomogenkan
− Dicukupkan dengan NaOH 0,1 N sampai garis tanda
− Dihomogenkan
− Diperoleh larutan rentang spesifik 80% (dengan baku) dibuat replikasi 3x
Pembuatan larutan rentang spesifik 100% (dengan baku)
− Dipersiapkan serbuk serbuk 490 mg (setara 350 mg PCT) dan BPFI PCT 150 mg
− SAMA SAJA PROSED
− Diperoleh larutan rentang spesifik 100% (dengan baku) dibuat replikasi 3x
Pembuatan larutan rentang spesifik 120% (dengan baku)
− Dipersiapkan serbuk serbuk 588 mg (setara 420 mg PCT) dan BPFI PCT 180 mg
− SAMA SAJA PROSED
− Diperoleh larutan rentang spesifik 120% (dengan baku) dibuat replikasi 3x
Pengukuran rentang spesifik 80% (dengan baku)
− Dipengukuran rentang spesifik 80% (dengan baku). Dilakukan replikasi sebanyak 3x
− Dimasukkan larutan rentang spesifik 80% ke dlm kuvet
− Dikeringkan kuvet
− Dimasukkan kuvet ke dlm spektro uv
− Diperoleh hasil rentang spesifik 80%
Pengukuran rentang spesifik 100% (dengan baku)
− Dipengukuran rentang spesifik 100% (dengan baku). Dilakukan replikasi sebanyak 3x
− Dimasukkan larutan rentang spesifik 100% ke dlm kuvet
 − Dikeringkan kuvet
− Dimasukkan kuvet ke dlm spektro uv
− Diperoleh hasil rentang spesifik 100%
Pengukuran rentang spesifik 120% (dengan baku)
− Dipengukuran rentang spesifik 120% (dengan baku). Dilakukan replikasi sebanyak 3x
− Dimasukkan larutan rentang spesifik 120% ke dlm kuvet
− Dikeringkan kuvet
− Dimasukkan kuvet ke dlm spektro uv
− Diperoleh hasil rentang spesifik 120%
Judul 6 : HPLC

Pada praktikum digunakan HPLC tipe Agilent 1220 infinity LC

KCKT/ HPLC termasuk kromatografi cair-cair
Klasifikasi kromatografi berdasarkan fase gerak : kromatografi gas (gas padat, gas cair) dan
kromatografi cair (kromatografi cair-padat dan kromatografi cair-cair)
Kromatografi absorbsi, penukar ion, afinitas, fase terbalik → ?
Prinsip pemisahan HPLC berdasarkan kepolaritasnya
Rekorder : mengambil sinyal listrik dari detektor dan ubah dalam bentuk kromatogram
HPLC dpt diuji scr kualitatif dan kuantitatif, faktor mana yg mempengaruhi pengujian kualitatif?
→ waktu retensi : waktu yg dibutuhkan senyawa bergerak melalui kolom menuju detektor
Syarat untuk waktu retensi : lbh kecil dr 10 menit
Faktor yg mempengaruhi analisa kuantitatif : membandingkan waktu retensi dan komponen
cuplikan analisis
Resolusi : membandingkan dua waktu retensi kromatogram yg berdekatan
Faktor yg mempengaruhi waktu retensi : laju alir, komposisi fase gerak yg dipakai, suhu pd
kolom, tekanan pd kolom
Proses elusi dan pembagian elusi : isokratik (untuk 1 atau lebih fase gerak dgn perbandingannya
yg sama) dan gradien (kebalikkan dari isokratik)

Bagian dari sistem HPLC (fase gerak, pompa, injektor, kolom, detektor, tempat pembuangan
limbah → urutan)
1. Fase gerak/ eluen
Pada praktikum digunakan 2 eluen berbeda metanol dan akuabides
Fase gerak akan mengalir pada sistem HPLC
2. Pompa/ Pump HPLC
Membantu memberikan tekanan sehingga fase gerak akan bergerak atau mengalir
memasuki sistem
3. Kolom HPLC (kolom C-18)
Sebagai fase diam
4. Injektor
Berfungsi menginjeksi sampel yang akan dialirkan menuju kolom
5. Detektor
Berfungsi mendeteksi keberadaan komponen yang telah melewati kolom dan
memberikan sinyal elektronik pada pengolah data
6. Tempat pembuangan limbah

Pembuatan Fase gerak

Fase gerak metanol dan air
Alat: beaker, filter, klem, vakum, kertas filter metanol (PTFE) dan air (selulosa nitrat)
A. Metanol
- rangkai alat
- gunakan filter metanol (PTFE)
- pada proses gunakan vakum
- bilas terlebih dahulu filter dengan pelarut metanol
- pasang kembali alat
- lakukan proses penyaringan dengan vakum
- Metanol yang digunakan khusus untuk hplc
- jika sudah selesai dibuka alatnya
- tuang hasil ke dalam wadah fase gerak dan tutup dengan alumnium foil

B. Air
- rangkai alat
- pasangkan filter selulosa nitrat 0,45 µm
- bilas terlebih dahulu
- lakukan proses penyaringan air dengan vakum
- hasil dimasukkan ke dalam wadah fase gerak

Setelah diperoleh hasil penyaringan dengan menggunakan filter dilanjutkan dengan melakukan
proses sonikasi dengan ultrasonikator.
Cara penggunaan alat ultrasonikator:
- hidupkan alat dengan cara tekan tombol on
- atur waktu pada timer 30 menit
- kemudian ok
Fungsi alat ultrasonikator adalah menghilangkan gelembung-gelembung udara yang mungkin
terperangkap pada fase gerak yang digunakan

Pembuatan LIB PCT

− Dibersihkan timbangan
− Diletakkan perkamen diatas timbangan dan ditara
− Ditimbang LIB PCT sebanyak 25 mg
− Dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml (C = 500 ppm) (dapat menggunakan corong
jika perlu)
− Ditambahkan larutan metanol sampai mendekati leher labu
− Dilakukan sonikasi selama 5 menit (Sonikasi dilakukan agar sampel larut dengan
sempurna)
− Ditambahkan lagi metanol sampai garis tanda
− Diperoleh LIB PCT

Pembuatan Larutan Deret Larutan Standar PCT

− Diambil LIB PCT (C = 500ppm) untuk membuat deret larutan dengan konsentrasi 25, 50,
75, 100, 125 ppm dalam labu tentukur 10 ml
− Dipipet LIB sebanyak 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 ml dan dimasukkan ke labu tentukur 10 ml
− Ditambahkan metanol sampai mendekati leher labu
− Dilakukan sonikasi selama 5 menit
 − Ditambahkan metanol sampai garis tanda dan dihomogenkan
− Disaring semua larutan dengan menggunakan membran PTFE
− Ditempatkan hasil saringan ke dalam vial tertutup sudah diberi label dan lakukan
degassing selama 5 menit
− Diperoleh larutan standar PCT dengan 5 konsentrasi yang berbeda

Pembuatan Larutan Sampel PCT

− Ditara terlebih dahulu
− Digunakan tablet pct berdosis tunggal generik sebanyak 20 buah tablet dan ditimbang
satu per satu
− Dicatat pada tabel yang tertera
− Ditimbang 20 tablet PCT secara keseluruhan dan dicatat berat seluruh tablet
− Digerus sampai halus
− Ditimbang serbuk dengan setara 12.5 mg PCT dengan neraca analitik
− Dilakukan 3 kali replikasi
− Dimasukkan serbuk PCT ke dalam labu tentukur 25 ml
− Ditambahkan metanol mendekati leher labu
− Dilakukan sonikasi selama 5 menit
− Ditambahkan larutan metanol sampai garis tanda
− Dihomogenkan
− Dipipet 1 ml larutan sampel dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml
− Diencerkan dengan metanol sampai garis tanda
− Dihomogenkan
− Dispuit dari larutan sampel terakhir
− Disaring larutan sampel dengan menggunakan membran PTFE
− Ditampung dalam vial tertutup, lakukan degassing selama 5 menit
− Sampel siap untuk diinjeksikan

Proses pengoperasian alat HPLC

Proses purging untuk menghilangkan gelembung-gelembung udara pada selang. Tujuannya
memastikan agar fase gerak yang kita alirkan benar” fase gerak yang kita gunakan.
Cara melakukan proses purging → Putar katup ke sebelah kiri sampai longgar, nyalakan pompa
untuk menjalankan fase geraknya. Fase gerak tidak akan mengalir ke detektor melainkan
mengalir ke tempat pembuangan limbah. Jadi kalau ada gelembung udara maka gelembung akan
terbuang. Biasanya proses purging 5 menit. Apabila purging sudah selesai maka katup ditutup
kembali.
Pengaturan kondisi analisis HPLC
− Sampler mengatur jumlah volume sampel yang ingin diinjeksikan. Volume injeksi 5
mikroliter (6 vial)
− Grad pump (pompa) A (30,0) ; B (70,0) : pengaturan laju alir dari fase yang digunakan
− Kolom oven : 27-24 derajat celcius
Berfungsi mengatur suhu tertentu dalam proses pemisahan yang akan dilakukan
 − VWD : 243 nm (terkait detektor)
− Letakkan kursor pada kotak → klik kanan → method (Volume injeksi 5 mikroliter) →
OK
− Letakkan kursor pada kotak → klik kanan → control (menghidupkan pompa/ ON) → OK
− Letakkan kursor pada kotak → klik kanan → method → Solvent/ Fase gerak A 30%
Aquabidest dan B 70% Metanol → atur laju alir/ Flow = 0,8 mL/ menit. Dalam menjalan
pompa dimulai dari terendah ke tinggi 0.1 mL/ menit. → stoptime : menentukan berapa
lama waktu yang dibutuhkan setiap penginjeksian (5 menit) → OK
− Pompa : 0.1 mL/ menit (berjalan) dengan fase gerak B 70% Metanol A 30% Aquabidest
− Oven Kolom : klik kanan → method → temperature : not controlled. Analisis akan
dipengaruhi oleh temperatur ruangan
− VWD : pengaturan detektor. klik kanan → control → ON (menghidupkan lampu).
Apabila sudah hidup lampunya maka lanjutkan klik kanan → method → signal (panjang
gelombang PCT 243 nm) → OK
− Grad Pump/ Pompa dinaikkan kembali secara perlahan sampai 0,8 mL/ menit dengan
memperhatikan tekanan. Perhatikan tekanan maksimal (tekanan tidak boleh melebihi
kolom). Tekanan maksimal : 400 bar
− Disimpan method sebagai method yang digunakan untuk analisis. Caranya : File → Save
as → Nama file → OK
− Dilakukan penginjeksian sampel. Ada dua hal yang harus dilakukan, yang pertama
pengaturan dimana hasil analisis akan disimpan/ pembuatan folder file tempat
menyimpan hasil analisis. Caranya : klik sequence → sequence parameters → nama
folder → nama operator → OK
− Diatur pengaturan letak sampel yang akan diinjeksi. Caranya : klik sequence → sequence
table. 5 vial : Larutan standar dengan konsentras berbeda dan 1 sampel PCT. Insert :
menambahkan kolom. Konsentrasi : 25, 50, 75, 100, 125 ppm. Inj/ Vial : menunjukkan
pengulangan injeksi tiap sampel. Sample type : Calibration (5 konsentrasi berbeda),
Sample (sampel PCT). Jika sudah selesai klik OK
− Warna kuning : 5 konsentrasi larutan standar berbeda dan warna hitam : sampel PCT
− Dimasukkan vial HPLC ke dalam plate autosampler (sesuai dengan yang di monitor)
− Proses baseline (15 sampai 30 menit) dilakukan untuk background stabil
− Dilakukan penginjeksian dengan cara klik runcontrol → run sequence
− Penginjeksian larutan standar konsentrasi 25 ppm dilakukan

Proses analisis hasil

− Membuat kurva kalibrasi dari 5 larutan standar yang sudah diinjeksi. Caranya : buka
instrument 1 (offline) → file → load signal → pilih folder analisis yang tadi digunakan
→ klik satu per satu. Akan muncul peak” kecil (pengotor), untuk menghilangkan
pengotor klik integration → auto integrate kemudian klik integration → integration
events → bagian area reject diisi dengan nilai luas area yang lebih besar dari semua peak
pengotor tapi harus dibawah nilai luas area peak sampel → OK (maka peak kecil akan
hilang dan hanya tersisa satu peak). Untuk memperbesar peak caranya klik graphics →
 signal options → response range diperbesar dan time range diisi dengan waktu yang
digunakan yaitu 5 menit (peak semakin besar)
− Hasil analisis HPLC berupa kromatogram dimana waktu yang diperlukan dari titik awal/
waktu pertama kali diinjeksikan sampai muncul satu peak dengan waktu 1,204 maka
disebut waktu retensi atau retention time. Waktu retensi untuk PCT adalah sekitar 1,2
menit
− Membuat kurva kalibrasi. Klik Callibration → new callibration table → default amount
(isi konsentrasi yang pertama kali dibuat, misalnya level 1 maka default amount 25 ppm,
dst) → OK → YES. Di input nama zat aktif/ standar yang dianalisis pada bagian
compound (Paracetamol) → OK (maka akan muncul peak dengan nama Parasetamol)
− HPLC bisa digunakan dalam analisis kualitatif dimana kalau misalnya standar dirunning
dengan metode tertentu kemudian ada sampel yang dirunning dengan metode yang sama
dan ternyata muncul peak dengan waktu retensi yang sama maka secara kualitatif sampel
tadi mengandung PCT
− Larutan standar yang kedua, klik file → load signal → pilih folder analisis yang tadi
digunakan → klik yang kedua. Kemudian klik callibration → add level (diisi level 2
default amount 50 ppm)
− Dilakukan proses yang sama ini untuk larutan standar 75, 100, 125 ppm
− Didapatkan kurva kalibrasi dengan koefisien korelasi
− Dilakukan pencetakkan dalam bentuk pdf dengan cara klik file → print → calib table +
curves
− Disimpan dalam folder yang diinginkan
− Setelah mendapatkan kurva kalibrasi dan persamaan regresi maka selanjutnya ditentukan
berapa konsentrasi sampel yang telah dianalisis. Caranya klik file → load signal → pilih
sampel. Maka akan muncul peak sampel dan muncul waktu retensi (1,154 menit). Waktu
retensi yang muncul hampir sama dengan waktu retensi larutan standar PCT maka secara
otomatis peak sampel langsung dibaca sebagai Parasetamol. Kemudian ubah hasil sampel
menjadi pdf dengan cara klik logo printer
− Tailing dikatan baik apabila dibawah 2%

Proses mencuci kolom dan mematikan alat HPLC

− Setelah penggunaan HPLC tidak boleh langsung dimatikan alatnya, ada beberapa hal
yang harus dilakukan terlebih dahulu dan yang paling penting adalah proses mencuci
kolom
− Proses pencucian kolom dengan cara mengalirkan fase gerak atau pelarut ke dalam kolom
dan sistem HPLC dengan beberapa pelarut yang dibuat rasionya berbeda” sehingga
menghasilkan tingkat kepolaran yang berbeda”. Misalnya dimulai dari air dulu (rasionya
diatur 100%). Selama proses pencucian kolom detektor tidak diperlukan maka dimatikan
saja (klik kanan → control → OFF). Proses pencucian kolom dengan akuades biasanya
10 menit. Tetapi tergantung dari sampel yang mau dianalisis, misalnya menggunakan
fase gerak buffer fosfat maka sangat disarankan saat pencucian kolom akuades 100%
dibuat dalam waktu lebih lama minimal 1 jam. Setelah proses pencucian akuades 100%
selesai, maka dibuat metanol 50% dan air 50%, dibiarkan selama 15 menit. Setelah
selesai, maka dibuat metanol 100%, dibiarkan selama 15 menit.
− Selama mau mematikan HPLC diusahakan HPLC dan sistemnya tidak teraliri oleh air
saja karena misalnya HPLC tidak digunakan selama berhari” atau berminggu” sedangkan
di kolom hanya dialiri air maka akan rentan ditumbuhi oleh mikroba/ jamur. Jadi
amannya aliran yang terakhir metanol 100% atau menyesesuaikan dengan spesifikasi
yang diminta oleh kolom yang digunakan
− Setelah selesai pencucian kolom maka mematikan instrumen HPLC dengan cara matikan
aliran fase gerak dengan cara mengurangi laju alir perlahan-lahan dan dibiarkan hingga
tekanan turun menuju nol
− Setelah tekanan menjadi nol, matikan pompa, matikan software, matikan tombol OFF
pada instrumen HPLC
Judul 7 : Analisis kadar besi dalam sampel kemasan air minum menggunakan aas

AAS (atomic absorption spectroscopy) : suatu teknik yg sangat umum untuk mendeteksi metal
dan metalloid dalam sampel
AAS dapat dipercaya dan mudah digunakan
AAS dapat menganalisis lebih dari 62 element
AAS dapat mengukur kadar atau konsentrasi metal dalam sampel

Sejarah:
AAS pertama kali dibuat oleh CSIRO scientist alan walsh pada 1954

Unsur-unsur yg dapat dideteksi oleh AAS:

Prinsip AAS:
− Teknik ini menggunakan prinsip dasar bahwa atom” bebas (gas) yang dihasilkan dalam
suatu atomizer dapat menyerap radiasi pada frekuensi yang spesifik.
− AAS bisa menghitung absorpsi dari atom keadaan dasar dalam bentuk gas.
− Atom” mengabsorpsi sinar ultraviolet/ visible dan membuat transisi pada tingkat/ level
energi elektronik yang tinggi. Konsentrasi analit ditentukan dari jumlah yang diabsorpsi.
− Pengukuran konsentrasi/ kadar biasanya ditunjukkan dari suatu kurva kalibrasi setelah
mengkalibrasi instrumen dengan konsentrasi yang sudah diketahui.
Teori:
AAS mempunyai lampu holow katoda, nebulizer, atomizer, monokromator, detektor
Diagram skematik AAS:

Sumber cahaya:
− Lampu hollow katoda adalah sumber radiasi yang paling umum dalam AAS.
− Lampu hollow katoda mengandung anoda tungsten dan katoda hollow cylindrical dibuat
dari unsur yang akan dideteksi.
− Lampu hollow katoda dan katoda hollow cylindrical dimasukkan ke dalam tabung gelas
yang diisi dengan gas (neon atau argon).
− Setiap unsur mempunyai lampunya sendiri yang harus digunakan untuk analisis.

Nebulizer:
− Menyedot cairan sampel pada keadaan yang terkontrol
− Membuat suatu larutan aerosol yang akan dimasukkan ke dalam nyala api
− Campuran aerosol, bahan bakar, oksidan dan dimasukkan ke dalam nyala api
Atomizer:
− Unsur” yg akan dianalisis perlu dibentuk dalam kondisi atom
 − Atomisasi adalah pemisahan partikel” menjadi molekulnya masing” dan memecahkan
molekul mendjadi atom. Ini bisa dikerjakan dengan mengekspos analit dalam temperatur
yang tinggi dalam nyala api atau tungku graphite
Atomisasi dengan nyala api (Flame atomizer):
− Untuk membuat nyala api, kita memerlukan campuran satu gas oksidan dan juga satu
bahan bakar gas
− Dalam banyak hal nyala asetil-udara atau nyala asetil-nitro oksida yg digunakan
− Sampel” dalam bentuk cair atau yg sudah dilarutkan adalah khas digunakan untuk
atomisasi dengan nyala api

Atomisasi dengan tungku graphite (graphite tube atomizer):

− Menggunakan tungku yg dilapisi graphite untuk menguapkan sampel
− Dalam GFAAS, sampel disimpan dalam tabung berlapis graphite kecil yang dapat
dipanaskan untuk menguapkan dan mengatomisasi analit
− Tabung berlapis graphite dipanaskan dengan mengunakan power supply yg tinggi
Monokromator:
− Merupakan suatu bagian yg paling penting dalam AAS, digunakan utk memisahkan
ribuan garis
− Monokromator digunakan untuk memilih panjang gel yg spesifik atau cahaya yg mana
diabsorpsi oleh sampel dan juga untuk mengecualikan panjang gelombang lainnya
− Pemilihan cahaya yg spesifik memungkinkan penentuan elemen yang dipilih di hadapan
yang lain
Detektor:
− Cahaya yg dipilih monokromator akan langsung menuju ke detektor yang biasanya
photomutiplier tube, fungsinya untuk mengubah signal cahaya menjadi signal elektrikal
yang proporsi dengan intensitas cahaya.
− Proses ini akan dipenuhi oleh signal amplifier. Signal dapat ditampilkan/ dibaca/
dimasukkan ke dalam data dan bisa langsung diprint.
Kurva kalibrasi:
− Suatu kurva kalibrasi yg digunakan utk menentukan kadar senyawa yg belum diketahui
dari suatu unsur dalam suatu larutan. Instrumen dikalibrasi menggunakan bbrp macam
larutan yg diketahui kadarnya. Absorbansi dari setiap larutan diukur dan kemudian suatu
kurva kalibrasi dari konsentrasi vs absorbansi diplotkan.
− Larutan sampel kemudian dimasukkan ke dalam instrumen dan absorbansi unsur dalam
larutan diukur. Konsentrasi yg tidak diketahui dalam unsur ini kemudian dihitung dari
kurva kalibrasi.
Applikasi:
− Penetapan kadar metal dalam jumlah yang kecil (timah, merkuri, kalsium, magnesium,
dll) :
− Studi lingkungan: air minum, air laut, tanah
− Industri makanan
− Industri farmasi
Tujuan:
1. Mempreparasi sampel air dalam kemasan yg akan ditetukan kadar besi dgn alat
spektrometer serapan atom
2. Menyiapkan larutan kerja dari larutan “stock” yg tersedia
3. Memahami prinsip penentuan kadar logam dlm suatu sampel menggunakan alat
spektrometer serapan atom
Prinsip dasar:
− Metode AAS adalah metode spektrometri yg didasarkan oleh adanya serapan/ absorpsi
cahaya ultraviolet (uv) atau visible (vis) oleh atom-atom suatu unsur dalam keadaan dasar
yg berada di dalam nyala api
− Cahaya UV atau vis yg diserap berasal dr energi yg diemisikan oleh sumber energi
tertentu
Prosedur video
Preparasi sampel
Destruksi basah
− Diambil sampel 30 ml dari beaker glass
− Dipindahkan ke dlm erlenmeyer
− Diambil 3 ml HNO3 (p)
− Ditambahkan HNO3 (p) ke dalam sampel
− Dipanaskan sampel di atas hotplate sampai sepertiga dari awal
− Dimasukkan sampel ke dlm labu tentukur 100 ml
− Dicukupkan dengan Aqua DM sampai garis tanda
− Disaring sampel dan dimasukkan ke dalam botol
Destruksi kering
− Dihaluskan sampel/ daun
− Sampel yang telah dihaluskan dimasukkan ke dalam kurs dan dipanaskan di atas hotplate
sampai menjadi arang
− Diabukan dalam tanur dengan suhu 500 derajat celcius selama kurang lebih 72 jam
− Dimatikan dan diambil kurs porselen
 − Dilarutkan dengan HNO3 (p) dan Aqua DM dgn perbandingan 1:10 dalam 10 ml
− Dimasukkan ke dalam labu tentukur dan dicukupkan dengan Aqua DM
− Disaring sampel ke dalam botol
Pengukuran menggunakan atomic absorption spectrophotometry (AAS):
− Dihubungkan dengan arus listrik
− Dihidupkan mesin air
− Diputar penutup tabung gas berlawanan arah jarum jam
− Dibuka penutup blower
− Dihidupkan mesin air
− Diputar saluran gas asetilan dan udara pd urutan 1 dan 3
− Dihidupkan instrumen AAS
− Dipastikan lampu katoda terpasang
− Diklik No. of STDs dan Conc. Sesuai dengan berapa banyak sampel yg akan diuji-Verify
− Diklik set condition dan tunggu hingga ready
− Ditekan flame hingga menyala
− Diukur larutan kalibrasi dan larutan sampel pada instrumen AAS
− Dipastikan untuk menekan autozero pada larutan blanko sebelum pengukuran dan ditekan
start
Judul 8 : GCMS

Komponen HPLC:
1. Monitor
2. GC (Gas chromatography)
3. MS (Mass spektro)
4. Injektor (berfungsi scr otomatis)
5. Fase gerak (yang sering digunakan gas helium. Gas tdk terdapat di dlm ruangan, terletak
di ruangan yg khusus/ instrumen. Gas dihubungkan dengan tubing/ kawat-kawat, tubing
akan mengalirkan gas helium dan masuk ke alat GC dan diteruskan ke MS)
6. Kolom (tipe kolom 1 MS *untuk sampel minyak atsiri*. Kolom mempunyai beberapa
tipe : 1MS, 23MS, 5MS. Tiap” tipe ditujukan untuk sampel yang berbeda-beda. Panjang
kolom hampir 30cm berupa kumparan” yg digulung sehingga proses pemisahan senyawa
bisa maksimal)
7. Oven (tempat memanaskan kolom)
8. Tempat sampel
Pemanfaatan GCMS : untuk senyawa” hidrokarbon yg mudah menguap seperti minyak atsiri,
senyawa” alkohol, senyawa yg stabil terhadap pemanasan

GC : hanya gas kromatografi saja. Lebih untuk analisa kuantitatif. Detektor : FIB, FID, dll.
GCMS : ada GC dan MS sehingga pemanfaatannya lebih maksimal shg bisa menentukan
struktur suatu senyawa. Lebih untuk analisa kualitatif. Detektor : MS.

Sampel diinjeksikan ke autoinjektor. Di dalam autoinjektor ada port injektor yang akan menuju
ke kolom. Di port terjadi pemanasan (untuk suhunya diatur dengan software). Setelah masuk ke
kolom maka akan terjadi proses pemisahan kemudian hasilnya akan diteruskan ke MS.
− Buka program GCMS
− Diklik vacum control (untuk menghilangkan udara yg ada di dlm alat GCMS krn kalau
ada udara proses fragmentasi dari sampel” yg sudah dipisahkan menggunakan GC akan
terhalangi sehingga tdk akan mendptkan modem fragmentasi dari senyawa yg mau
dianalisis)
− Diambil cuplikan minyak cengkeh masukkan ke vial sampel dan langsung dianalisis
menggunakan GCMS
Prosedur video
− Dihubungkan gas helium dengan alat
− Dihidupkan alat dengan cara menekan tombol power pada alat GC/MS
− Dihidupkan komputer dan buka software
− Dilakukan proses vakum dengan gas helium
− Dimasukkan sampel ke dalam vial dan diletakkan ke tempat sampel
− Dilakukan proses pengaturan software
Waktu retensi : waktu yg dibutuhkan senyawa tersebut terdeteksi oleh alat GCMS
Misalnya : eugenol terdeteksi pada menit 13
Jumlah sampel yg terdeteksi akan dipengaruhi oleh kondisi sampel yg dianalisis dimana kondisi
bisa dipengaruhi oleh banyak hal : suhu ataupun proses ekstraksi atau lingkungan, alat yg
digunakan dlm praktikum