Spektrofotometer UV-VIS

Lecture by : Iga Mayola Pisacha.,M.Si

 SPEKTROFOTOMETER UV-Visible
Spektrofotometer UV/Vis alat analisis sampel dengan
menggunakan prinsip-prinsip absorpsi radiasi gelombang
elektromagnetik oleh bahan untuk panjang gelombang sinar UV
sampai dengan sinar tampak.

Guna UV/Vis spektrofotometer

untuk menentukan kandungan zat organik/anorganik dalam
larutan.

Komponen-komponen spektrofotometer yang penting yaitu:

Sumber energi radiasi yang stabil
Monokromator (celah, lensa, cermin, dll.)
Wadah sampel transparan (cuvet)
Detektor radiasi yang dilengkapi recorder.
UV mini-1240 SHIMADZU
Hitachi dual-beam uv-vis spectrophotometer
 Skema susunan UV/Vis spektrofotometer

Sb. radiasi Monokromator sampel detektor recorder

Sumber radiasi
Terdiri atas bahan yang dapat tereksitasi ke tingkat energi yang
tinggi melalui:
a. proses pemanasan dengan bantuan arus listrik
b. proses pelepasan elektron pada beda tegangan yang tinggi.
Ketika kembali ke tingkat energi yang lebih rendah, bahan akan
melepaskan sejumlah foton.
Sumber radiasi
Panjang gelombang yang dihasilkan beragam pada daerah pita energi
yang luas.
Intensitas radiasi yang dihasilkan harus sama dan tetap sehingga
tidak ada beda Po pada saat standarisasi dengan Po pada saat
pengukuran Penting untuk model single-beam.
Pada double-beam, setiap saat Po dan P selalu diukur dan
dibandingkan secara simultan sehingga kestabilan sumber radiasi tidak
terlalu penting.
Sumber radiasi UV:
Lampu hidrogen
Lampu deutorium
Radiasi yang dihasilkan mempunyai panjang gelombang 180-350 nm.
Tungsten lamp
Lampu xenon menghasilkan radiasi UV dengan intensitas
yang lebih tinggi tetapi tidak sestabil lampu hidrogen.
Lampu pijar tungsten panjang gelombang pada
daerah sinar tampak dan near infrared (panjang gelombang
350-2500 nm)
Monokromator
Fungsi :
untuk memecah radiasi polikromatis dengan pita energi yang
lebar yang dihasilkan sumber radiasi menjadi radiasi dengan
pita energi yang lebih sempit atau menjadi radiasi
monokromatis.
Keuntungan radiasi dengan lebar pita (band width) yang sempit
adalah:
•Batas daerah  yang terabsorpsi sangat berdekatan sehingga
kecepatan hasil pengukuran absorbansi menjadi tinggi.
•Sensitivitas meningkat karena pengukuran dapat dilakukan
tepat pada absorpsi maksimum.
•Kecenderungan mengikuti hukum Beer lebih besar karena yang
terukur betul-betul hanya yang dapat terabsorpsi.
Monokromator mampu menghasilkan radiasi dengan lebar pita
efektif sebesar 35 - 0,1 nm.
Lebar pita efektif yaitu kisaran panjang gelombang dimana nilai
transmitansi minimal ½ dari nilai maksimalnya.
Komponen –komponen monokromator
Celah untuk masuknya radiasi polikromatis dari
sumber radiasi.
Lensa/cermin untuk menyerap cahaya
Pendispersi cahaya yang berupa prisma atau grating
yang dapat memecah radiasi menjadi komponen-
komponen panjang gelombang.
Lensa/cermin pemfokus cahaya
Celah keluar
Monochromator
Wadah sampel (cuvet)
Cuvet terbuat dari kuarsa atau silika untuk radiasi UV
dan gelas biasa atau kuarsa untuk radiasi sinar tampak.
Tebal cuvet bervariasi dari 1-10 cm.
Cuvet ditempatkan setelah monokromator supaya
kemungkinan terjadinya dekomposisi/fluorescence oleh
panjang gelombang berenergi tinggi yang masih ada di
dalam radiasi polikromatis dapat diminimalkan.
Posisi permukaan cuvet tegak lurus datangnya radiasi
sehingga kehilangan radiasi akibat pantulan/ refraksi dapat
dikurangi.
Detektor
Fungsinya adalah mengabsorpsi foton yang menumbuknya dan
mengubahnya menjadi kuantitas yang dapat diukur seperti arus listrik atau
perubahan suhu.
Sebagian besar detektor modern mengubah energi foton menjadi sinyal
listrik yang segera mengaktifkan meteran/recorder.
Syarat detektor:
Sensitivitas tinggi sehingga daya radiasi yang kecil dapat terdeteksi.
Waktu response yang singkat
Stabil.
Sinyal elektronik yang dihasilkan mudah diperkuat sehingga dapat
dipakai untuk mengoperasikan alat pembaca hasil pengukuran
Contoh: Photoelectric detector (Jumlah arus listrik yang dibangkitkan
berbanding lurus dengan daya radiasi foton yang terabsorpsi)
Operasi single-beam dan double-beam
Single-beam
Radiasi dari monokromator yang masuk didispersikan oleh prisma/
grating. Ketika alat pendispersi dirotasikan, berbagai pita radiasi yang
telah terpecah difokuskan pada celah keluar. Radiasi dilewatkan
sampel dan diterima detektor.
Double-beam
Sinar dari monokromator diarahkan ke sel blangko dan sel
sampel dengan bantuan beam splitter (chopper). Kedua sinar
dibandingkan terus menerus/ bergantian secara berulang-
ulang.
Fluktuasi pada intensitas sumber cahaya respon detektor
dan hasil penguat sinyal dikompensasi dengan mengamati
perbandingan sinyal antara blangko dengan sampel.

Double beam spectrophotometer

Pengukuran konsentrasi
Pengukuran konsentrasi zat dalam sampel dengan UV/Vis dapat
dilakukan untuk:
 Single komponen mengandung satu zat terlarut dan
pelarutnya.
 Multi komponen mengandung lebih dari 1 zat terlarut
dengan satu pelarut.

Sistem single komponen

Tahap penentuan konsentrasi meliputi
1. Penentuan  max (panjang gelombang yang terserap paling
banyak oleh sampel)
2. Penyiapan larutan standar dan sampel
3. Pembuatan kurva standar (kurva kalibrasi)
4. Pengukuran absorbansi sampel.
 Penentuan  max
Zat tertentu  max tertentu
Benzen :  max = 254 nm max

Data  max untuk beberapa zat tersedia di literatur.

Bila tidak ada data  max, maka harus dilakukan scanning
terhadap sampel yang akan ditentukan konsentrasinya.
A

Kurva standar
Untuk mengetahui hubungan konsentrasi dengan absorbansi
pada  max.
Untuk membuat kurva standard perlu larutan standar
(larutan yang konsentrasinya diketahui dengan pasti).
Dibuat larutan dengan konsentrasi nol (blangko) sampai
konsentrasi tertentu.
Pelarut harus dapat melarutkan sampel dengan sempurna
dan dapat menghantarkan gelombang dengan daerah panjang
gelombang yang dipakai pada analisis.
Contoh: pelarut air (200 nm)
pelarut metanol (215 nm)
pelarut etanol 95 % (205 nm)
Absorbansi untuk tiap konsentrasi diukur pada  max.
Bila larutan memenuhi hukum Beer maka kurva standar akan
berupa garis lurus.

Konsentrasi,ppm

Penyiapan larutan sampel

Komponen-komponen yang akan ditentukan konsentrasinya pada
daerah UV/Vis sering menunjukkan nilai absorptivitas molar yang
tinggi pada absorbansi max.
Konsentrasi tinggi % transmitansi rendah
Keakuratan hasil pengukuran yang terbaik diperoleh pada
% transmitansi 36,8 %.
Hasil pengukuran dengan tingkat keakuratan yang masih
dapat diterima yaitu pada % transmitansi 15 % - 65 %.
Pada % transmitansi < 15 % maka ketidakpastian hasil
pengukuran sangat tinggi. Oleh karena itu sampel harus
diencerkan sampai memberikan % transmitansi pada
kisaran yang diinginkan.
Pelarut yang dipakai harus sama dengan yang dipakai
pada pembuatan kurva standar.
Pengukuran absorbansi larutan sampel dan larutan
standar harus dengan cara dan alat yang sama.
Berdasarkan absorbansi sampel konsentrasi sampel
dibaca pada kurva standar.
Contoh analisis kadar amonia dalam sampel dengan UV Vis
Cara analisis
a. Siapkan 7 buah labu takar 50 mL yang sudah dibersihkan.
b. Ambil dengan teliti menggunakan pipet volume larutan standar ammonia
10 mg/L NH3-N dengan volume berturut turut 0 mL, 1 mL, 2 mL, 5 mL, dan
10 mL kemudian masukkan ke dalam labu takar 50 mL.
c. Ambil dengan teliti secara duplo (dua kali) menggunakan pipet volume
sampel yang akan diuji sebanyak 5 mL dan masukkan ke dalam masing-
masing dua buah labu takar 50 mL.
d. Tambahkan sedikit aquades menggunakan botol semprot kira-kira 10 mL
pada masing-masing labu takar, kemudian homogenkan pelan-pelan.
e. Tambahkan larutan zinc sulfate (ZnSO4) sebanyak 0,5 mL
menggunakan pipet mikro, lalu homogenkan.
f. Tambahkan sedikit aquades menggunakan botol semprot kira-kira 10 mL
pada masing-masing labu takar, kemudian homogenkan pelan-pelan.
g. Tambahkan 5 mL reagen nessler B menggunakan pipet volume ke dalam
masing-masing larutan standar, blanko, dan sampel.
h. Tambahkan sedikit aquades menggunakan botol semprot kira-kira 10 mL
pada masing-masing labu takar, kemudian homogenkan pelan-pelan.
i. Tambahkan 2 tetes larutan rochelle salt, kemudian homogenkan.
j. Tambahkan 1 mL reagen nessler A menggunakan pipet mikro ke dalam
masing-masing larutan standar, blanko, dan sampel. Encerkan dengan
aquades sampai 50 mL (tanda garis).
k. Gojog larutan hingga homogen, dan diamkan ± 30 menit. Gojog lagi agar
tetap homogen.
l. Ukur nilai absorbansi masing-masing larutan dengan alat spektrofotometer
UV-Vis pada panjang gelombang 430 nm. Lakukan kalibrasi zero dengan
larutan blanko yang dibuat.
m. Catat hasil pengukuran dalam lembar kerja dan lakukan perhitungan
kadar amonia dalam sampel.
Sistem multi komponen
Pada sistem multi komponen, lebih dari 1 komponen
terlarut yang mengabsorpsi radiasi.
Tiap komponen dianggap tidak saling mempengaruhi
absorbansi satu sama lain dan absorbansinya bersifat
aditif.
Pada absorbansi maksimum komponen I, 1, komponen II
juga punya absorbansi dalam jumlah yang berarti. Pada
absorbansi maksimum komponen II,  2, komponen I juga
menyerap radiasi.
Spektrum absorpsi untuk campuran I dan II merupakan
jumlah dari masing-masing kurva individual.
 I + II

A
I
I
II

1 2

1 Panjang gelombang 2
Dengan:

A 1 dan A 2 : Absorbansi campuran yang teramati

berturut-turut pada λ1 dan λ2.
 2
AI 1 dan AI : Absorbansi komponen I dalam
campuran pada λ1 dan λ2.
1 2
AII dan AII : absorbansi komponen II dalam
campuran pada λ1 dan λ2.
1 2 1 2
 I ,  I ,  II ,  II :Molar absorbtivity komponen
I dan II pada λ1 dan λ2.
c I dan c II : konsentrasi komponen I dan
II dalam campuran
Absorptivitas molar tiap komponen ditentukan
secara terpisah dengan melakukan pengamatan
terhadap spektrum absorpsi dari larutan yang
telah diketahui konsentrasinya. Jadi nilai cI dan
cII dapat dihitung dari persamaan (1) dan (2)
berdasarkan data pengukuran A campuran pada
λ1 dan λ2.
Secara umum bila ada n komponen dalam
campuran, absorbansi total pada panjang
gelombang λ memenuhi persamaan:
 
A   An  b  n c n


n n
Pada prinsipnya pengukuran n absorbansi pada n
panjang gelombang yang berbeda diperlukan untuk
menentukan konsentrasi n komponen di dalam
campuran maka ada n persamaan simultan
dengan n besaran yang tidak diketahui.
Bila mungkin, pilih panjang gelombang sehingga
hanya 1 komponen yang dapat menyerap panjang
gelombang itu.
Pilih panjang gelombang yang memberikan nilai
absortivitas komponen-komponen dalam campuran
yang jauh berbeda satu sama lain.
Masalah yang sering timbul pada pengukuran
•Nilai absorbansi terukur negatif
cuvet untuk pengukuran sampel dan blangko berbeda selalu
menggunakan cuvet yang sama untuk semua pengukuran.

•Nilai absorbansi terukur > nilai sebenarnya

ocuvet untuk pengukuran sampel dan blangko berbeda
odinding cuvet tidak bersih (tersentuh jari pemakai)
ocuvet baru saja dipakai mengukur konsentrasi larutan yang lebih
pekat.
Oleh karena itu maka:
•1 cuvet untuk semua pengukuran
•dinding cuvet yang dilewati sinar jangan disentuh dengan jari
•setiap selesai mengukur absorbansi suatu larutan, cuvet dicuci
dengan pelarut yang dipakai untuk membuat sampel sampai benar-
benar bersih
•Nilai absorbansi terukur < nilai sebenarnya
sama dengan atas.
•Titik nol yang tidak stabil
-sumber radiasi tidak stabil
-adanya noise pada alat penguat sinyal

cek titik nol setiap kali pengukuran

Latihan !
Larutan standar dibuat dengan cara
menimbang kafein sebanyak 20 mg kemudian
di larutkan dengan aquadest dan dimasukkan
pada labu ukur 100 ml sampai tanda batas
hingga diperoleh larutan baku induk. Pada
larutan tersebut dipipet masing-masing
sebanyak 5,10,15, dan 20 ml kedalam labu
ukur 100 ml sampai tanda batas.tentukan
konsentrasi masing-masing larutan standar.
PR
Analisis nitrat dalam air dilakukan dengan metode Brucine dengan menggunakan
spektrofotometer UV-Vis. Mula-mula dibuat dulu kurva standard dengan cara
membuat larutan standard nitrat dengan berbagai konsentrasi yaitu dengan cara
mengambil larutan yang mengandung nitrat 10 ppm yaitu berturut-turut 0,5; 1; 2,5;
5, dan 10 mL ditambah dengan aquades, brucine dan asam sulfat pekat dengan
volume tertentu. Campuran didiamkan selama waktu tertentu dalam ruang gelap
selanjutnya ditambah aquades, dibiarkan lagi selama waktu tertentu dan terakhir
diencerkan sampai 50 mL (disebut dengan standard 1, 2, 3, 4 dan 5). Masing-
masing larutan standard diukur absorbansinya pada panjang gelombang 410 nm
dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Sampel air sejumlah 5 mL
diperlakukan sama dengan larutan standard. Pembacaan absorbansi dengan UV-
Vis dapat dilihat pada tabel berikut:
Absorbansi
Blangko 0,0
Standard 1 0,01
Standard 2 0,03
Standard 3 0,13
Standard 4 0,28
Standard 5 0,52
Sampel 0,46

Buatlah kurva standardnya! Berapa konsentrasi nitrat dalam sampel air?