PENGGUNAAN

SPEKTROFOTOMETER
UV-VIS DALAM ANALISIS
PANGAN
 PENGERTIAN
• Spektrofotometer UV-Vis adalah pengukuran energi
cahaya oleh sistem kimia pada panjang gelombang
tertentu.
• Sinar UV mempunyai panjang gelombang (λ) antara 200-
400nm, dan sinar tampak (visible) mempunyai panjang
gelombang 400-750 nm.
• Pengukuran spektrofotometer melibatkan energi
elektronik yang cukup besar pada molekul yang
dianalisis, sehingga lebih banyak dipakai untuk analisis
kuantitatif dibandingkan kualitatif.
• Spektrum UV-Vis sangat berguna untuk
pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari
analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan
mengukur absorban pada panjang gelombang
tertentu menggunakan hukum Lambert-Beer.
• Spektrofotometer uv vis merupakan alat analisis
sampel dengan menggunakan prinsip-prinsip
absorpsi radiasi gelombang elektromagnetik oleh
bahan untuk panjang gelombang sinar UV sampai
dengan sinar tampak. Alat ini digunakan untuk
menentukan kandungan zat organik/anorganik
dalam larutan.
KOMPONEN PENYUSUN
• Sumber radiasi UV-VIS
• Monokromator
• Wadah sampel (kuvet)
• Detector
 SUMBER RADIASI
• Sumber tenaga radiasi terdiri dari benda
yang tereksitasi hingga ke tingkat tenaga
yang tinggi oleh sumber listrik bertegangan
tinggi atau oleh pemanasan listrik.
• Benda atau materi yang kembali ke tingkat
tenaga yang lebih rendah/ke tingkat
dasarnya, melepaskan foton dengan
perbedaan tenaga antara tingkat
tereksitasi dan tingkat dasar rendah.
 SUMBER RADIASI
• Sumber radiasi ideal untuk pengukuran
serapan harus menghasilkan spektrum
kotinu dengan intensitas yang seragam
pada keseluruhan kisaran panjang
gelombang.
• Sumber radiasi terdiri dari sumber radiasi
ultraviolet dan sumber radiasi sinar
tampak.
 SUMBER RADIASI UV
• Sumber radiasi ultraviolet yang sering
digunakan adalah lampu hidrogen dan
deuterium karena bersifat stabil. Lampu
xenon bersifat kurang stabil.
• Kedua lampu ini terbuat dari sepasang
elektroda yang terselubung dalam tabung
gelas dan diisi gas hidrogen atau deuterium
pada tekanan rendah.
 SUMBER RADIASI UV
• Bila tegangan tinggi dikenakan pada elektroda,
maka akan dihasilkan elektron yang
mengeksitasikan elektron lain dalam molekul
gas ke tingkatan tenaga yang tinggi.
• Bila elektron kembali ke tingkat dasar mereka
melepaskan radiasi dalam daerah sekitar 180
dan 350 nm yang menjadi patokan dasar dari
panjang gelombang.
SUMBER RADIASI TERLIHAT
• Sumber radiasi terlihat dan radiasi infra
merah dekat yang biasa digunakan
adalah lampu filament tungsten.
• Filament dipanaskan oleh sumber arus
searah (DC), atau oleh baterai.
• Filament tungsten menghasilkan radiasi
kontinu dalam daerah antara 350 dan
2500 nm.
 MONOKROMATOR
• Dalam spektrofotometer, radiasi yang
polikromatik harus diubah menjadi radiasi
monokromatik.
• Ada 2 jenis alat yang digunakan untuk
mengurai radiasi tersebut yaitu penyaring dan
monokromator.
• Penyaring dibuat dari benda khusus yang hanya
meneruskan radiasi pada daerah panjang
gelombang tertentu dan menyerap radiasi dari
panjang gelombang yang lain.
 MONOKROMATOR
• Monokromator ialah serangkaian alat
optic yang menguraikan radiasi
polikromatik menjadi jalur-jalur yang
efektif/panjang gelombang tunggalnya
dan memisahkan panjang gelombang
tersebut menjadi jalur yang sangat sempit.
WADAH SAMPEL (KUVET)
• Sampel yang akan dipelajari pada daerah
ultraviolet atau terlihat berupa gas atau larutan
ditempatkan dalam sel atau cuvet.
• Untuk daerah ultraviolet biasanya digunakan
Quartz atau sel dari silika yang dilebur,
sedangkan untuk daerah terlihat digunakan
gelas biasa atau Quartz. Tebal cuvet bervariasi
dari 1-10 cm.
WADAH SAMPEL (KUVET)
• Sebelum cuvet dipakai, bilaslah dengan akuades atau
dicuci dengan larutan deterjen/asam nitrat panas.
• Cuvet ditempatkan setelah monokromator supaya
kemungkinan terjadinya dekomposisi oleh panjang
gelombang berenergi tinggi yang masih ada di dalam
radiasi polikromatis dapat diminimalkan.
• Posisi permukaan cuvet tegak lurus datangnya radiasi
sehingga kehilangan radiasi akibat pantulan/ refraksi
dapat dikurangi.
 DETECTOR
• Peranan detector penerima adalah memberikan
respon terhadap cahaya pada berbagai panjang
gelombang.
• Pada spektrofotometer, setiap detector menyerap
tenaga foton yang mengenainya dan mengubah
tenaga tersebut untuk dapat diukur secara kuantitatif
sepertisebagai arus listrik atau perubahanperubahan
panas.
• Kebanyakan detector menghasilkan sinyal listrik yang
dapat mengaktifkan pencatat.
 DETECTOR
• Setiap pencatat harus menghasilkan sinyal yang secara
kuantitatif berkaitan dengan tenaga cahaya yang
mengenainya.
• Fungsinya adalah mengabsorpsi foton yang
menumbuknya dan mengubahnya menjadi kuantitas
yang dapat diukur sepertiarus listrik atau perubahan
suhu.
• Sebagian besar detektor modern mengubah energi
foton menjadi sinyal listrik yang segera mengaktifkan
meteran/recorder.
 DETECTOR
• Syarat detektor:
• Sensitivitas tinggi sehingga daya radiasi
yang kecil dapat terdeteksi.
• Waktu response yang singkat
• Stabil.
• Sinyal elektronik yang dihasilkan mudah
diperkuat sehingga dapat dipakai untuk
mengoperasikan alat pembaca hasil
pengukuran
• Contoh: Photoelectric detector (Jumlah arus
listrik yang dibangkitkan berbanding lurus
dengan daya radiasi foton yang terabsorpsi)
 PRINSIP KERJA
• Cahaya polikromatis diteruskan melalui
lensa menuju monokromator dan filter
cahaya pada fotometer.
• Monokromator akan mengubah cahaya
polikromatis menjadi cahaya
monokromatis.
• Berkas cahaya dengan panjang tertentu
akan dilewatkan pada sampel yang
mengandung suatu zat dalam
konsentrasi tertentu.
 PRINSIP KERJA
• Ada cahaya yang diserap dan ada yang
dilewatkan.
• Cahaya yang dilewatkan ini kemudian di
terima oleh detector. Detector
kemudian akan menghitung cahaya
yang diterima dan mengetahui cahaya
yang diserap oleh sampel.
 PRINSIP KERJA
• Cahaya yang diserap sebanding dengan
konsentrasi zat yang terkandung dalam
sampel sehingga akan diketahui konsentrasi
zat dalam sampel secara kuantitatif.
• Cahaya yang diserap diukur sebagai
absorbansi (A) sedangkan cahaya yang
hamburkan diukur sebagai transmitansi (T).
 CARA KERJA
Cara kerja spektrofotometer yaitu :
• Tempatkan larutan pembanding, misalnya blangko
dalam kuvet pertama dan larutan yang akan dianalisis
pada kuvet kedua.
• Pilih foto sel yang cocok 200nm-650nm (650nm-
1100nm) agar daerah panjang gelombang (λ) yang
diperlukan terliputi.
• Dengan ruang foto sel dalam keadaan tertutup “nol”
galvanometer didapat dengan menggunakan tombol
dark-current.
 CARA KERJA
• Pilih h yang diinginkan, buka foto sel dan lewatkan
berkas cahaya pada blangko dan “nol” galvanometer
didapat dengan memutar tombol sensitivitas.
• Dengan menggunakan tombol transmitansi, kemudian
atur besarnya pada 100%.
• Lewatkan berkas cahaya pada larutan sampel yang
akan dianalisis.
• Skala absorbansi menunjukkan absorbansi larutan
sampel.
 CARA KERJA
Cara pembuatan larutan, yaitu :
• Larutan selalu dibuat dengan cermat. Larutan standar
dibuat dalam labu ukur, konsentrasi biasanya sekitar
0,1%.
• Untuk pekerjaan yang memerlukan ketelitian semua
alat standar harus mempunyai kualitas analitis yang
tinggi.
• Jika pengenceran dilakukan harus dikerjakan dalam
volume yang dapat diukur dengan teliti; karena
perbedaan volume yang sangat kecil akan dapat
menyebabkan kesalahan.
PELARUT YANG DIGUNAKAN
Pelarut-pelarut yang digunakan
spektrofotometer harus:
• Melarutkan cuplikan
• Meneruskan radiasi dalam daerah panjang
gelombang yang sedang dipelajari.
• Pelarut yang dipakai tidak mengandung
sistem ikatan rangkap terkonjugasi pada
struktur molekulnya dan tidak berwarna
PELARUT YANG DIGUNAKAN
• Tidak terjadi interaksi dengan molekul senyawa yang
dianalisis.
• Kemurniannya harus tinggi, atau derajat untuk analisis
tinggi.
• Polaritas pelarut mempengaruhi pergeseran
spektrum yang dianalisis. Pelarut yang dapat
digunakan : aseton, benzena, karbon tetraklorida,
kloroform, dioksan, sikloheksan, isopropanol,
diklorometan, 95% etanol, etil, eter, methanol, air, dan
sebagainya
 LARUTAN STANDAR
• Larutan standar adalah larutan yang mendapat
perlakuan yang sama dengan sampel dan
mengandung komponen sampel dengan
konsentrasi yang sudah diketahui.
• Larutan standar terdiri dari  beberapa tingkat
konsentrasi dan digunakan untuk membuat
kurva standar atau kurva kalibrasi sehingga
akan diperoleh panjang gelombang maksimum
dari larutan standar tersebut.
 KURVA STANDAR
• Kurva standar merupakan kurva yang
dibuat dari sederetan larutan standar
yang linier sehingga dapat
diregresilinierkan.
• Kurva standart menunjukkan
hubungan antara konsentrasi larutan
( sumbu-x) dengan absorbansi larutan
(sumbu-y).
• Dari kurva standar akan dihasilkan
suatu persamaan yang
diregresilinierkan , yaitu persamaan y =
mx + c, dengan m : kemiringan garis,
dan c: konstanta.
 KURVA STANDAR
• Kurva standar digunakan untuk
menunjukkan besarnya konsentrasi
larutan sampel dari hasil
pengukuran.
• Kurva standar harus dibuat pada
setiap kali melakukan analisis
sampel karena waktu analisis yang
berbeda akan menghasilkan
pembacaan absorbansi yang
berbeda sehingga kurva standar
yang diperoleh juga akan berbeda .
 LIMITASI
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam
penggunaan spektrofotometer adalah
sebagi berikut :
• Konsentrasi larutan
• Perbedaan kuvet
• Panjang gelombang dalam
pengukuran absorbansi
KONSENTRASI LARUTAN
• Pada konsentrasi yang terlalu pekat, kurva
deret standar menjadi tidak linier.
• Hal ini karena pada konsentrasi yang tinggi,
jarak antar partikel zat menjadi sangat rapat
yang akan mempengaruhi distribusi muatan,
dan mengubah cara molekul melakukan
serapan.
• Pada pembuatan deret standar, absorbansi
dianjurkan tidak melebih 1. Jadi absorbansi
deret standar ada di dalam range 0-1.
 PERBEDAAN KUVET
• Perbedaan kuvet sangat berpengaruh.
• Harap selalu gunakan satu kuvet yang
sama untuk mengukur absorbansi.
• Apabila terdapat banyak sampel dan
menggunakan kuvet disposable, gunakan
kuvet maksimal tiga kali pemakaian.
Setelah itu gantilah kuvet dengan yang
baru.
PANJANG GELOMBANG
• Terkadang sampel mengalami reaksi kimia
yang lambat dan memerlukan waktu untuk
mencapai kesetimbangan. Hal ini
menyebabkan penyimpangan yang
signifikan bila pembacaan absorbansi tidak
dilakukan bersamaan.
• Lakukan pengukuran absorbansi pada
panjang gelombang maksimal. Carilah
terlebih dulu panjang gelombang maksimal
untuk memberikan absorbansi maksimal.
 MASALAH YANG TIMBUL DALAM
PENGUKURAN

• Masalah 1 : Nilai absorbansi terukur

negatif
• Disebabkan karena cuvet untuk
pengukuran sampel dan blangko
berbeda.
• Oleh karena itu selalu gunakan cuvet
yang sama untuk semua pengukuran
agar nilai absorbansinya sesuai.
• Masalah 2 : Nilai absorbansi terukur > nilai
sebenarnya
• Disebabkan karena cuvet pengukuran
sampel dan blangko berbeda, dinding cuvet
tidak bersih, dan cuvet dipakai mengukur
konsentrasi yang lebih pekat.
• Diatasi dengan menggunakan 1 cuvet untuk
semua pengukuran , dinding cuvet yang
dilewati sinar jangan disentuh dengan jari,
dan cuvet dicuci dengan pelarut yang
dipakai untuk membuat sampel benar-benar
bersih.
• Masalah 3 : Nilai absorbansi terukur <
nilai sebenarnya
• Disebabkan karena titik nol yang tidak
stabil, sumber radiasi tidak stabil, dan
adanya noise pada alat penguat sinyal.
• Oleh karena itu perlu dilakukan
pengecekan terhadap titik nol setiap
kali pengukuran.
TERIMA KASIH
ATAS
PERHATIANNYA