1.

Konsep Dasar
Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada
pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada
panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi
difraksi dengan detektor fototube. Benda bercahaya seperti matahari atau bohlam
listrik memancarkan spektrum yang lebar terdiri atas panjang gelombang. Panjang
gelombang yang dikaitkan dengan cahaya tampak itu mampu mempengaruhi
selaput pelangi mata manusia dan karenanya menimbulkan kesan subyektif akan
ketampakan (vision). Dalam analisis secara spektrofotometri terdapat tiga daerah
panjang gelombang elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV (200 – 380
nm), daerah visible (380 – 700 nm), daerah inframerah (700 – 3000 nm)
(Khopkar 1990).
Menurut Cairns (2009), spektrofotometer adalah alat untuk mengukur
transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Tiap
media akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada
senyawaan atau warna terbentuk. Spektrofotometri terdiri dari beberapa jenis
berdasar sumber cahaya yang digunakan. Diantaranya adalah sebagai berikut:
A. Spektrofotometri Visible (Spektro Vis)\

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi

adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum
elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang
sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat
oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh
mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible).
 Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah
lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan
unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih
yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia
digunakan sebagai sumber lampu. Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini
hanya sample yang memilii warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari
metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk sample yang tidak
memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent
spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan
harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain
itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar
stabil.
Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble
protein). Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu,
larutan ini harus dibuat berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa
digunakan adalah reagent Folin. Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin
dalam suasana sedikit basa, ikatan peptide pada protein akan membentuk senyawa
kompleks yang berwarna biru yang dapat dideteksi pada panjang gelombang sekitar
578 nm. Semakin tinggi intensitas warna biru menandakan banyaknya senyawa
kompleks yang terbentuk yang berarti semakin besar konsentrasi protein terlarut
dalam sample.
B. Spektrofotometri UV (ultraviolet)
 Memiliki nama lain Spektrofotometer UV(Ultra Violet), pada
spektrofotometer jenis ini menggunakan sumber cahaya Ultra Violet dengan kisaran
panjang gelombang antara 190 – 380nm. Lampu yang digunakan pada
spektrofotometer jenis ini adalah deuterium lamp. Sifat sinar Ultra Violet tidak bisa
terdeteksi oleh mata manusia. Senyawa yang dapat menyerap sinar ini pada umumnya
tidak boleh bening atau transparan.
C. Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah suatu instrument yang digunakan untuk

mengukur absorban suatu sampel pada panjang gelombang tertentu. Spektrofotometer
EMC-11-UV yang ada di Laboratorium Kimia Dasar Terpadu UII dapat digunakan
untuk mengukur absorbansi pada panjang gelombang di daerah uv (200-400 nm) dan
daerah visible (400-800 nm). Sampel yang dapat diuji dengan alat ini adalah sampel
cair yang didalamnya mengandung senyawa yang bergugus kromofor dan dapat juga
digunakan untuk sampel berwarna. Alat ini merupakan jenis spektrofotometer uv-vis
single beam atau hanya memiliki satu berkas sinar. arena dilengkapi dengan berbagai
fitur seperti:

 LCD screen (128x64)

 Pengaturan panjang gelombang melalui papan tombol
 Kompartemen sampel untuk pemegang sel yang khusus
 Penyimpan hasil hingga 200 metode dan 200 kurva standar, dll
D. Spektrofotometri IR (Infra Red)

Sering disebut juga Spektrofotometer IR(Infra Red), berbeda dengan ketiga

jenis spektrofotometer sebelumnya, jenis spektrofotometer infra red ini didasarkan

pada penyerapan panjang gelombang infra merah. Hasil analisa yang didapat

biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensitas infra merah terhadap

panjang gelombang. Proses identifikasi dilakukan dengan cara membandingkan

antara signal sample dengan signal standar(blank).

Blog diagram umum spektrofotmetri.

Cara kerjanya :

Cara kerja spektrofotometer dimulai dengan dihasilkannya cahaya monokromatik dari

sumber sinar. Cahaya tersebut kemudian menuju ke kuvet (tempat sampel/sel). Banyaknya
cahaya yang diteruskan maupun yang diserap oleh larutan akan dibaca oleh detektor yang
kemudian menyampaikan ke layar
/ Display.
Larutan yang akan diamati melalui spektrofotometer harus memiliki warna tertentu.
Hal ini dilakukan supaya zat di dalam larutan lebih mudah menyerap energi cahaya yang
diberikan. Secara kuantitatif, besarnya energi yang diserap oleh zat akan identik dengan
jumlah zat di dalam larutan tersebut. Secara kualitatif, panjang gelombang dimana energi
dapat diserap akan menunjukkan jenis zatnya.
Blog Diagram Khusus Spektrofotometri Eppendorf 6122

Di tinjau dari gambari diatas sebenarnya sudah ada nomornya masing-masing ada 7
bagian, yang pertama ada yang CPU memori kontrol, kedua ada bagian amplifier, ketiga ada
main power supply, yang keempat ada temperatur control, yang kelima filter control, keenam ada
lamp power supply atau bagian lampu dan terakhir ada di bagian mixer control.

Pada bagian blog pertama berfungsi untuk menyimpan semua database berupa hasil atau
program yang berfungsi untuk menjalankan alatnya. Di sini juga berfungsi untuk otak dari alat
karena semua perintah berawal dari sini. kita bisa memilih pilihan voltage-nya yang akan kita
gunakan, di sesuaikan sama kebutuhan listrik yang akan kita pakai, hal ini ada di bagian tiga
main power suply, di bagian 2 ada amplifire di sana ada yang namanya detector yang nanti akan
menangkap cahaya yang sudah di serap sama sampel yang nanti outputnya dari detektor itu akan
diteruskan ke amplifire sebelum dia tampil ke display atau sebelum diolah oleh micro controller
tersebut. Detektor di sini itu jenisnya yang detektor cahaya terus di bagian blog keempat
temperatur controler tersebut sudah disebutkan ada sensor PT 100 atau peltier 100 dan
temperatur kontrol fungsinya untuk mengontrol temperatur saat inkubasi. komponen ini adalah
sebuah elemen yang bisa menghasilkan suhu panas dan dingin. Dinginya bisa mencapai 25⁰ yang
paling panas 37⁰, dan settingan suhu pada alat ini ada 3 yakni 25⁰, 30⁰ dan 37⁰.
 Bagian kelima filter control cara kerjanya yakni, memilih filter terlebih dahulu yang akan
digunakan dan disesuaikan dengan sempel yang akan digunakan. Untuk eppendorf eqom 6122
ini kita masih belum bisa untuk mengecek satu sampel dengan hasil yang berbeda. Jadi, semisal
kita mengecek satu sampel maka hanya bisa di tujuan yang sama. Contoh, kalau kita mau ngecek
kolesterol maka, hanya bisa menampilkan hasil untuk kolesterol aja, atau gula darah ya gula
darah aja. kita bisa memilih filternya sesuai dengan range setiap reagen, kalau untuk range bisa
di lihat pada tabel. Untuk di alat Eppendorf ini ada 5 filter. Setelah memilih filter, cahaya yang
dari lampu akan melewati filter terlebih dahulu, kemudian diteruskan ke monochromator lalu
menabrak absorban pada cuvette setelah itu di lanut ke detector dan akan di teruskan di amplifier
untuk dikuatkan sinyalnya, terakhir di pembacaan hasil.

Bagian blog keenam ada lamp power supply dimana berfungsi untuk menyalakan atau
memberi daya sendiri kepada lampu agar tidak bergantung pada main power supply. Di samping
itu juga berfungsi untuk menjaga intensitas cahaya dari lampunya agar tetap stabil ketika ada
fluktuasi tegangan pada sumber PLNnya. Terakhir ada bagian blog mixer di sini berfungsi untuk
mencampur reagen dengan sample yang sudah di letakkan manual pada satu tempat yakni
cuvette, dimana bertujuan untuk mereaksikan dua cairan tadi sehingga dapat memunculkan
warna hasil dari reaksi tadi. Lalu, akan di baca oleh detector saat di sinari oleh cahaya

https://andarupm.co.id/spektrofotometer-di-laboratorium/