Spektrofotometri

TUJUAN

 Mengetahui cara penggunaan alat-alat photometer

 Mengetahui bagian-bagian dan fungsi alat

LANDASAN TEORI
Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan
cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau kuarsa
yang disebut kuvet. Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai
absorbansi dari cahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam
kuvet.
sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer.
Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan
fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Jadi
spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika energi tersebut
ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang.
Kelebihan spektrofotometer dibandingkan fotometer adalah panjang gelombang dari
sinar putih lebih dapat terseleksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma, grating
ataupun celah optis. Pada fotometer filter, sinar dengan panjang gelombang yang diinginkan
diperoleh dengan berbagai filter dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan
trayek panjang gelombang tertentu.
Pada fotometer, filter tidak mungkin diperoleh panjang gelombang yang benar-benar
monokromatis, melainkan suatu trayek panjang gelombang 30-40 nm. Sedangkan pada
spektrofotometer, panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh dengan
bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber
spektrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorpsi untuk larutan sampel atau
blangko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorpsi antara sampel dan blangko ataupun
pembanding.

Panjang gelombang yang digunakan untuk melakukan analisis adalah panjang gelombang
dimana suatu zat memberikan penyerapan paling tinggi yang disebut λ maks. Hal ini disebabkan jika
pengukuran dilakukan pada panjang gelombang yang sama, maka data yang diperoleh makin
akurat atau kesalahan yang muncul makin kecil.

Berdasarkan hukum Beer absorbansi akan berbanding lurus dengan konsentrasi, karena b
atau l harganya 1 cm dapat diabaikan dan ε merupakan suatu tetapan. Artinya konsentrasi makin
tinggi maka absorbansi yang dihasilkan makin tinggi, begitupun sebaliknya konsentrasi makin
rendah absorbansi yang dihasilkan makin rendah. (Hukum Lamber-Beer dan syarat peralatan
yang digunakan agar terpenuhi hukum Lambert-Beer
Hal-hal yang harus diperhatikan :
 Larutan yang dianalisis merupakan larutan berwarna. Apabila larutan yang akan dianalisis
merupakan larutan yang tidak berwarna, maka larutan tersebut harus diubah terlebih dahulu
menjadi larutan yang berwarna. Kecuali apabila diukur dengan menggunakan lampu UV.
 Panjang gelombang maksimum. Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang
gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Hal ini dikarenakan pada panajgn
gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang gelombang tersebut,
perubahan absorbansi untuk tiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar. Selain itu
disekitar panjang gelombang maksimal, akan terbentuk kurva absorbansi yang datar sehingga
hukum Lambert-Beer dapat terpenuhi. Dan apabila dilakukan pengukuran ulang, tingkat
kesalahannya akan kecil sekali.
 Kalibrasi Panjang gelombang dan Absorban. Spektrofotometer digunakan untuk mengukur
intensitas cahaya yang dipancarkan dan cahaya yang diabsorbsi. Hal ini bergantung pada
spektrum elektromagnetik yang diabsorb oleh benda. Tiap media akan menyerap cahaya
pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawa yang terbentuk. Oleh karena itu
perlu dilakukan kalibrasi panjang gelombang dan absorban pada spektrofotometer agar
pengukuran yang di dapatkan lebih teliti.
jenis – jenis spektrofotometer
Spektrofotometri terdiri dari beberapa jenis berdasar sumber cahaya yang digunakan. Diantaranya
adalah sebagai berikut:
1. Spektrofotometri Vis (Visible)
Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya
tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap
oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga
semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama
ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible).
Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten.
Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol
W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding
logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu. Sample yang
dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilii warna. Hal ini menjadi
kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk sample
yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan
reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna.

2. Spektrofotometri UV (Ultra Violet)

Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi
sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai
sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Dia
merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan daratan. Inti
atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogen hanya
 memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa
Yunani, deuteros, yang berarti ‘dua’, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel.
Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap
sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.
Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan
reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun
perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip
dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna.

3. Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible.
Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya
visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber
sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.
Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan.
Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk
sample tak berwarna.
4. Spektrofotometri IR (Infra Red)
Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometri ini berdasar pada
penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah terbagi menjadi infra
merah dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada spektrofotometri adalah infra merah
jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 μm. Pada spektro IR
meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun biasanya lebih kepada analisa
kualitatif. Umumnya spektro IR digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu
senyawa, terutama senyawa organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu
menggambarkan adanya suatu gugus fungsi spesifik.

PRINSIP KERJA
mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang
yang dimulai dengan dihasilkannya cahaya monokromatik dari sumber sinar. Cahaya tersebut
kemudian menuju ke kuvet (tempat sampel/sel). Banyaknya cahaya yang diteruskan maupun yang
diserap oleh larutan akan dibaca oleh detektor yang kemudian menyampaikan ke layar.

CARA KERJA
1. Spektrophotometer
 Nyalakan alat
 Biarkan alat warming selama 15-20 menit

Pengukuran Absorbance dan % Transmiten

 Pilih program A (absorbence)/ % T (transmitten) dengan menekan tombol REDOUT

sampai huruf yang muncul “A” / ”% T”
  Atur panjang gelombang dengan menekan tombol REDOUT juga, gunakan tombol
PLUS/MINUS untuk menaikturunkan panjang gelombang
 Masukkan blanko ke dalam beam kemudian tutup.
 Tekan tombol ZERO untuk mengenolkan
 Setelah keluar hasil (0,00 A / 100,0 % T) Kelurkan blanko danMasukkan sampel yang akan
diukur ke dalam beam kemudian tutup.
 Baca hasil pengukuran pada layar.

Pengukuran Konsentrasi menggunakan Faktor

 Pilih program F (faktor) dengan menekan tombol REDOUT sampai huruf yang muncul F
 Atur panjang gelombang dengan menekan tombol REDOUT juga, gunakan tombol
PLUS/MINUS untuk menaikturunkan panjang gelombang
 Tekan tombol SET C/F untuk memasukkan nilai Faktor yang akan digunakan, atur
desimal dengan menekan tombol “Sample DEC SHIFT ”
 Kunci angka yang telah ditulis dengan menekan tombol SET C/F lagi
 Ganti program ke C (concentration) dengan menekan tombol READOUT lagi
 Masukkan blanko, tekan “ZERO”
 setelah hasil muncul pada layar, keluarkan blanko dan masukkan sampel
 Baca hasil pengukuran pada layar

2. Spektrofotometer
 Nyalakan alat
 Biarkan alat warming selama 15-20 menit
Pengukuran Absorbance /A
 Atur program yang akan digunakan yaitu A (Absorbance) dengan menekan tombol “
A/T/C ” sampai yang keluar di layar huruf A
 Atur panjang gelombang yang akan diguanakan dengn menekan tombol “segitiga nm
“
 Masukkan blanko, dan tekan tombol “0 Abs 100 %T” , untuk mengnolkan
 Jika masih tidak nol maka ditekan lagi, sampai nol yang keluar dilayar (0,00 A)
 keluarkan blangko dan masukkan sampel (kuvet dengan dinding permukaan halus
menghadap depan)
 baca hasil pada layar

Pengukuran % Transmiten/ %T
Cara yang dilakukan sama dengan pengukuran Absorbance hanya mengganti A dengan % T

Pengukuran Konsentrasi (C)

1. faktor (F)
 Atur program yang akan digunakan yaitu C (concentration) dengan menekan pada
tombol “ A/T/C ”
  Atur panjang gelombang yang akan digunakan dengan menekan tombol “segitiga
nm “
 Pilih “F”
 Atur faktor yang akan digunakan
 Masukkan blanko dan tekan tombol “0 Abs 100 %T” , untuk mengnolkan
 Jika masih tidak nol maka ditekan lagi, sampai nol yang keluar dilayar (0,00 A )
 keluarkan blangko dan masukkan sampel (kuvet dengan dinding permukaan halus
menghadap depan)
 baca hasil pada layar

2. Standar (Std)
 Atur program yang akan digunakan yaitu C (concentration) dengan menekan pada
tombol “ A/T/C ”
 Atur panjang gelombang yang akan digunakan dengan menekan tombol “segitiga
nm “
 Pilih “ Std ”
 Atur
 Masukkan blanko dan tekan tombol “0 Abs 100 %T” , untuk mengnolkan
 keluarkan blangko
 Masukkan larutan standar, atur standar yang akan digunakan , tekan set C
 masukkan standar (kuvet dengan dinding permukaan halus menghadap depan)
 masukkan sampel (kuvet dengan dinding permukaan halus menghadap depan)
 baca hasil pada layar

KALIBRASI ALAT SPEKTROFOTOMETER

Kalibrasi yang dimaksud ini adalah men-seting blank alat spektrofotometer, sebelum
digunakan untuk analisis. Secara umum sbb:
1. Nyalakan alat spektrofotometer
2. Isi kuvet dengan larutan blanko (aquades)
3. Diseting/diatur panjang gelombang untuk kalibrasi.
4. ->keterangan: 0%T itu diukur saat kuvet dalam keadaan kosong. 100%T itu diukur saat kuvet
dalam keadaan terisi larutan.
5. Kuvet berisi larutan blanko dimasukkan ke spektrofotometer
6. lalu tekan tombol 0 ABS 100%T, tunggu sampai keluar kondisi setting blank (dalam bentuk
teks)
CARA PERAWATAN SPEKTROFOTOMETER
Cara Perawatan dan Penyimpanan Alat :
1. Sebelum digunakan, biarkan mesin warming-up selama 15-20 menit.
2. Spektrofotometer sebisa mungkin tidak terpapar sinar matahari langsung, karena cahaya dari
matahari akan dapat mengganggu pengukuran.
3. Simpan spektrofotometer di dalam ruangan yang suhunya stabil dan diatas meja yang
permanen.
4. Pastikan kompartemen sampel bersih dari bekas sampel.
5. Saat memasukkan kuvet, pastikan kuvet kering.
6. Lakukan kalibrasi panjang gelombang dan absorban secara teratur.
HASIL PRAKTIKUM
Nilai absorbant serta grafik yang diperoleh pada tiap panjang gelombang yang digunakan
No. Panjang gelombang (nm) Absorbent
1 370 2,076
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

KESIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang dilakukan pada beberapa panjang gelomnbang ditemukan
panjang gelombang maksimum sampel 390 nm dengan nilai absorbant 2,530.
PEMBAHASAN
Pada praktikum ini dilakukan percobaan menggunakan alat spektrofotometer. Dilakukan
penghitungan absorbent sampel pada bermacam- macam gelombang untuk mencari panjang
gelombang maksimum dari sampel. Dalam penggunaan alat spektrofotometer, hal pertama yang
dilakukan adalah menghidupkan alat, memanaskan alat lk. 15 menit. Sementara itu sampel
disiapkan. Setelah semua siap pemeriksan dilakukan. Alat di seting/diatur (program (A/absorbent)
, panjang gelombang yang akan digunakan). Setelah itu, blanko dimasukkan lalu tekan tombol “ 0
abs, 100 % T “ untuk meng-nolkan blanko. Setelah itu blanko dikeluarkan dan sampel dimasukkan.
Maka hasil akan keluar di layar.
Berdasarkan pemeriksaan yang dilakukan dalam 13 kali pengerjaan pada panjang gelombang
yang bebeda (meningkat) diperoleh panjang gelombang maksimum 390 nm.