1|Analisis bahan kimia dalam bahan pangan(mikro)

MAKALAH
ANALISIS TERAPAN
ANALISIS BAHAN KIMIA DALAM BAHAN PANGAN (MIKRO)

DISUSUN OLEH
KELOMPOK V

TRI WANA A 251 18 007

PUTRI MELENIA KRISTI ROMON A 251 18 027
NUR AMALIA A 251 18 049
SAIFUL A 251 18 098

PROGRAM STUDI S1 PENDIDIKAN KIMIA

JURUSAN PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN

UNIVERSITAS TADULAKO

2021
2|Analisis bahan kimia dalam bahan pangan(mikro)

KATA PENGANTAR

Puji syukur alhamdulillah kita panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa,
karena telah melimpahkan rahmat-Nya berupa kesempatan dan pengetahuan sehingga
makalah ini bisa selesai tepat pada waktunya. Makalah ini berjudul “Analisis Bahan
Kimia Dalam Bahan Pangan (Mikro)”. Penulisan makalah ini merupakan suatu
usaha untuk memenuhi tugas dari mata kuliah analisis terapan.
Penyusun berharap semoga makalah ini bisa menambah pengetahuan para
pembaca. Namun terlepas dari itu, kami memahami bahwa makalah ini masih jauh
dari kata sempurna, sehingga kami sangat mengharapkan kritik serta saran yang
bersifat membangun demi terciptanya makalah selanjutnya yang lebih baik lagi.

Palu, 9 April 2021

Tim Penyusun
Kelompok V
3|Analisis bahan kimia dalam bahan pangan(mikro)

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ............................................................................................ 1

KATA PENGANTAR ......................................................................................... 2

DAFTAR ISI......................................................................................................... 3

BAB I PENDAHULUAN.................................................................................. 4
1.1 LatarBelakang.................................................................................. 4
1.2 Rumusan Masalah............................................................................ 5
1.3 Tujuan.............................................................................................. 5

BAB II PEMBAHASAN..................................................................................... 6
2.1 Metode Analisis Vitamin................................................................. 6
2.2 Metode Analisis Mineral.................................................................. 11
2.3 Metode Analisis Enzim.................................................................... 14

BAB III PENUTUP...............................................................................................17

3.1 Kesimpulan......................................................................................17
3.2 Saran................................................................................................17

DAFTAR PUSTAKA
4|Analisis bahan kimia dalam bahan pangan(mikro)

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Pangan merupakan salah satu kebutuhan primer dari manusia selain sandang
dan papan. Pangan memegang peranan penting dalam kehidupan manusia, oleh
karena itu dibutuhkan suatu jaminan bahwa pangan yang dikonsumsi sehari-hari oleh
manusia memiliki tingkat keamanan yang tinggi, sehingga manusia dapat bebas dari
serangan penyakit atau bahaya yang berasal dari makanan. Pemerintah menyadari
pentingnya keamanan pangan yang dikonsumsi oleh manusia sehingga menetapkan
Undang-Undang Nomor 18 tahun 2012 yang mengatur pangan di Indonesia.
Disamping itu terdapat Peraturan Pemerintah Nomor 28 Tahun 2004 tentang
keamanan, mutu dan gizi pangan, memberikan wewenang kepada Badan POM untuk
melakukan pengawasan keamanan, mutu dan gizi pangan yang beredar.
Ketentuan mengenai keamanan pangan meliputi sanitasi pangan, bahan
tambahan pangan, rekatasa genetika dan iridiasi pangan, kemasan pangan, jaminan
mutu dan pemeriksaan laboratorium, dan pangan tercemar. Selain hal tersebut,
didalam peraturan yang sama juga disebutkan bahwa setiap orang dilarang
mengedarkan pangan yang mengandung bahan beracun, berbahaya, yang dapat
merugikan atau membahayakan kesehatan atau jiwa manusia. Kasus keamanan yang
banyak dijumpai adalah keracunan pangan, dimana salah satu sumber pangan yang
menyebabkan keracunan adalah makanan jajanan.
Perkembangan makanan jajanan di Indonesia yang berbasis home industry
telah semakin maju, hal ini dapat dilihat dengan semakin beragamnya makanan
jajanan yang ditawarkan disetiap sekolah oleh para pedagang makanan jajanan.
Semakin beragamnya makanan jajanan tersebut, mendorong timbulnya kebiasaan
mengkonsumsi makanan jajanan pada anak sekolah, terutama pada jeda jam
istirahat sekolah. Namun kebiasaan mengkonsumsi makanan jajanan sehat masih
belum banyak dimiliki oleh anak sekolah.
5|Analisis bahan kimia dalam bahan pangan(mikro)

1.2 Rumusan Masalah

Dari latar belakang diatas, didapat rumusan masalah sebagai berikut :

1. Bagaimana metode analisis dari vitamin?

2. Bagaimana metode analisis dari mineral?
3. Bagaimana metode analisis dari enzim?

1.3 Tujuan

Dari rumusan masalah diatas, didapat tujuan sebagai berikut :

1. Mengetahui metode analisis dari vitamin

2. Mengetahui metode analisis dari mineral
3. Mengetahui metode analisis dari enzim
6|Analisis bahan kimia dalam bahan pangan(mikro)

BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Metode analisis vitamin

Vitamin dapat dibedakan antara yang larut dalam air dan larut dalam lemak.
Vitamin yang larut dalam air yaitu vitamin B kompleks dan C sedangkan vitamin
yang larut dalam lemak yaitu A, D, E dan K. Vitamin C atau asam askorbat adalah
vitamin yang mudah larut dalam air dengan rumus molekul C6H8O6 dengan titik cair
190-192oC, bersifat mudah teroksidasi, tidak tahan panas dan stabil dalam kondisi
asam. Vitamin C dapat berbentuk sebagai asam L-askorbat dan asam L-
dehidroaskorbat; keduanya mempunyai keaktifan sebagai vitamin C.

Sumber vitamin C adalah buah-buahan seperti jeruk, jambu biji, mangga, dan
lain-lain. Selain itu juga terdapat pada sayuran terutama yang berdaun hijau. Pada
buah yang segar (tidak di masak) kandungan vitamin C lebih tinggi dibandingkan
dengan buah yang dimasak. Untuk mengetahui kandungan vitamin C pada bahan
pangan dapat dilakukan dengan metode penentuan vitamin C dengan 2,6 D (Na-
dikhlorofenol) dan titrasi iodin.

Vitamin adalah senyawa-senyawa organik yang dibutuhkan untuk

pertumbuhan normal dan mempertahankan hidup manusia, yang secara alami tidak
mampu mensintesis senyawa – senyawa tersebut. Vitamin ada 2 macam yaitu larut
dalam lemak (A,D,E dan K) serta vitamin yang larut dalam air (B kompleks dan C)
yang masing-masing memiliki peranan penting.

Saat ini banyak sekali produk vitamin yang beredar di pasaran diantaranya
adalah vitamin B1, B2 dan B6. Vitamin B1 mengandung seyawa thiamin atau dalam
bentuk murninya adalah thiamin hidroklorida. Vitamin tersebut dapat mencegah
7|Analisis bahan kimia dalam bahan pangan(mikro)

penyakit beri-beri dan berperan sebagai koenzim. Vitamin B2 dan B6 pada dasarnya
memiliki fungsi yang tidak jauh berbeda, yakni berperan penting dalam metabolisme
pembentukan energi yang diperlukan sel-sel otak.

Kesadaran masyarakat akan kebutuhan vitamin semakin meningkat, sehingga

alternative yang digunakan oleh masyarakat selain mengkonsumsi buah dan sayur,
yaitu dengan mengkonsumsi sediaan vitamin, sehingga mengakibatkan banyaknya
produsen farmasi mengembangkan produk-produk yang berhubungan dengan
vitamin, baik dalam bentuk obat-obatan, makanan, maupun minuman bervitamin.
Oleh karena itu, pengawasan merupakan salah satu bentuk upaya untuk melindungi
masyarakat atau konsumen dari informasi label yang tidak benar, sehingga perlu
dikakukannya analisis untuk mengidentifikasi kemurnian dan stabilitas senyawa
dalam suatu formulasi.

Perkembangan zaman telah menuntut untuk semakin cepat dalam hal

kecepatan analisis. Seiring berjalannya waktu setiap orang, perusahaan, atau badan
penelitian selalu mencari metode yang lebih cepat, tepat, dan efisien untuk suatu
pemeriksaan.

Kromatografi pada awalnya hanya digunakan untuk pemeriksaan kualitatif,

tetapi saat ini kromatografi telah berkembang digunakan untuk analisis kuantitatif.
Seperti analisis menggunakan kromatografi laspis tipis (KLT) yang pada awalnya
hanya untuk kualitatif, Kromatografi memiliki kelebihan yaitu waktu analisis singkat
dan ketajaman pemisahan yang tinggi, dapat menggunakan kolom lebih panjang
untuk menghasilkan efisiensi pemisahan yang tinggi, sedangkan kekurangannya
adalah untuk teknik pemisahan secara kromatografi gas terbatas untuk zat yang
mudah menguap.

Pengembangan metode kromatografi dalam menganalisis vitamin B1, B2 dan

B6 sudah banyak dilakukan. Pengembangan metode yang sudah pernah dilakukan
8|Analisis bahan kimia dalam bahan pangan(mikro)

yaitu Novi Yantih (2009) melakukan analisis pemisahkan delapan vitamin larut air
secara kromatografi pasangan ion; Ahmet Hasimoglu, dkk, (2018) melakukan analisis
KCKT fase terbalik untuk menentukan vitamin B1, B2, B3, B6 dan C dalam sedeiaan
bubuk oral yang dikonsumsi hewan; Ni Luh Kasih Ariani , dkk, (2015) melakukan
analisis dengan membandingkan analisis KCKT eluasi gradien dengan isokratik
dalam menentukan vitamin B1, B2 dan B6 pada sediaan sirup multivitamin secara
simultan; Syeda Kiran Shahzadi, dkk, (2018) melakukan analisis vitamin B1, B2, B6
dan asam folat dalam sediaan multivitamin secara KCKT fase terbalik; dan Devi
Velmurugan, dkk, (2018) melakukan analisis mengembangkan metode KLTKT yang
sederhana untuk estimasi simultan formulasi vitamin larut air B1, B2 dan B6 dalam
bentuk sediaan tablet kombinasi dan memvalidasi metode sesuai pedoman ICH.
Suatu pengembangan metode perlu dilakukan uji validasi, metode baru yang
dihasilkan bisa digunakan jika hasil uji validasi yang dilakukan memenuhi
persyaratan. Parameter yang perlu dilakukan meliputi uji linieritas, uji presisi, uji
akurasi, LOD dan LOQ.

A. Analisis kualitatif
 KLTKT (kromatografi lapis tipis kinerja tinggi)

Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi (KLTKT) merupakan suatu istrumen

pengukur densitas bercak hasil pemisahan yang dilengkapi dengan suatu perangkat
optik, sumber cahaya dan detektor seperti halnya dengan spektrofotometer (Hayun et
al, 2007). Metode Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi (KLTKT) ini dipilih
karena memiliki kemampuan reability, reproducibility, simplisity, kecepatannya,
sangat ekonomis karena hanya membutuhkan bahan dan pelarut dalam jumlah minim
serta waktu analisis yang cukup cepat. Hal ini melatarbelakangi peneliti tertarik untuk
menentukan evaluasi penggunaan KLTKT densitometri silika gel 60 F254 pada
penentuan kadar vitamin C yang terdapat pada daging buah naga ungu.
9|Analisis bahan kimia dalam bahan pangan(mikro)

Analisis Kualitatif dengan KLTKT terlebih dahulu chamber dijenuhkan

dengan larutan pengelusi dengan cara masukkan kertas saring dengan tinggi dan
lebarnya yang sama dengan bejana kromatografi. Tutup kedap dan biarkan hingga
kertas saring basah seluruhnya. Larutan pengelusi yang digunakan adalah etanol :
asam asetat (9,5 : 0,5). Plat KLTKT yang digunakan plat KLTKT Silika gel 60 F254
(Gandjar & Rohman, 2008).

Larutan vitamin C murni dan larutan ekstrak sampel, (1:1) ditotolkan dengan
pipet mikro 2 µL bersama-sama pada lempeng KLTKT dengan jarak 1,5 sampai 2 cm
dari tepi bawah lempeng KLTKT dan jarak rambat, beri tanda pada jarak rambat.
Setelah kering lempeng KLTKT dimasukkan ke dalam chamber yang berisi cairan
pengelusi etanol : asam asetat (9,5 : 0,5). Larutan fase gerak dalam bejana harus
mencapai tepi bawah lapisan penyerap, totolan jangan sampai terendam. Tutup bejana
diletakkan pada tempatnya dan biarkan sistem hingga fase gerak merambat sampai
batas jarak rambat. Lempeng dikeluarkan dan dikeringkan di udara, dan bercak
diamati dengan lampu UV 254 nm. Diukur dan dicatat tiap-tiap bercak dari titik
penotolan. Tentukan harga Retardation factor (Rf) dan harga Retardation relative (Rr)
(Kementrian Kesehatan Republik Indonesia, 2014).

 KCKT( Kromatografi cair kinerja tinggi)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan teknik pemisahan yang
luas digunakan untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel
baik di bidang farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri makanan
(Gandjar, 2012). KCKT adalah suatu teknik pemisahan dengan menggunakan padatan
sebagai fase diam (stationary phase) dan cairan sebagai fase gerak (mobile phase)

(USP XXX).
10 | A n a l i s i s b a h a n k i m i a d a l a m b a h a n p a n g a n ( m i k r o )

KCKT umumnya digunakan untuk pemisahan sejumlah senyawa organik,

anorganik, maupun senyawa biologis; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis
senyawa tidak menguap (non-volatil); penentuan molekul netral, ionik, maupun
zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa dengan struktur
hampir sama; pemisahan senyawa dalam jumlah sekelumit (trace elements), dalam
jumlah banyak, dan dalam skala industri. Metode KCKT tidak bersifat destruktif
sehingga cocok untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif (Gandjar, 2012).

Contoh penggunaan KCKT yaitu Penetapan Kadar INH dan Vit B6 dalam
Sediaan Sirup. Sampel sirup dipipet 1 mL setara dengan 20 mg INH dan 2 mg vit B6.
Sampel dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL, dilarutkan dengan fase gerak sampai
tanda. Kemudian larutan disonikasi selama 10 menit. Larutan sampel INH dan vit B6
disaring dengan nylon 0,45µm dengan bantuan pompa vakum kemudian diinjeksikan
sebanyak 20 µL ke sistem KCKT dan di deteksi pada panjang gelombang 280 nm
dengan laju alir 1,2 mL/menit kemudian dihitung kadarnya. Larutan dipipet 1 mL,
dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, diencerkan dengan fase gerak sampai garis
tanda. Larutan disonikasi selama 2 menit dan disaring dengan membran nylon,
kemudian diinjeksikan sebanyak 20 µL ke sistem KCKT dan dideteksi pada panjang
gelombang 280 nm dengan laju alir 1,2 mL/menit. Kemudian dihitung kadarnya.
Kadar INH dan vit B6 dalam sampel dapat dihitung degan mensubtitusikan luas area
sampel pada Y dari persamaan regresi : Y=bx+a. Penetapan kadar dilakukan replikasi
6 kali. Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap sampel B

 KPI (kromatografi pasangan ion)

Vitamin larut air memiliki karakteristik beragam, yaitu ada yang bersifat asam,
basa, dan netral, sehingga dalam larutan akan terdapat dalam bentuk molekul yang
netral atau ionik. Asam askorbat bersifat asam dan dalam larutan basa akan
terionisasi, sementara itu tiamin hidroklorida, nikotinamida, sianokobalamin, dan
piridoksin hidroklorida terionisasi dalam asam dengan karakteristik yang berbeda.
11 | A n a l i s i s b a h a n k i m i a d a l a m b a h a n p a n g a n ( m i k r o )

Pada sistem, senyawa ionik akan membentuk pasangan ion dengan pereaksi pasangan
ion dan akan terpartisi di antara fase gerak dan fase diam sebagai spesi netral. Bila
tidak ada pereaksi pasangan ion, senyawa ionik tidak diretensi oleh kolom fase balik
dan akan ter-elusi secara spontan atau kromatogramnya akan membentuk ekor.
Pemisahan dalam KPI sangat dipengaruhi oleh jenis dan konsentrasi pereaksi
pasangan ion yang digunakan. Pasangan ion golongan asam alkilsulfonat
(−SO3(CH2)nCH3) dengan n antara 4−7 dapat membentukpasangan ion dengan basa
kuat dan lemah Larutan natrium heksansulfonat dipilih sebagai pereaksi pasangan
ion karena selain dapat membentuk pasangan ion dengan kation kuarterner tiamin,
nikotinamida, dan piridoksin dalam larutan asam juga diharapkan memberikan waktu
retensi yang tidak terlalu besar (4,5). Tujuh vitamin larut air (asam askorbat, tiamin
hidroklorida, riboflavin, nikotinamida, piridoksin hidroklorida, asam folat, dan
menadion natrium bisulfit) telah berhasil dipisahkan menggunakan kolom fase balik
C8dengan fase gerak metanol-air (24,5:75,5)

B. Analisis Kuantitatif
Beberapa metode yang cocok digunakan untuk analisa kuantitatif vitamin A
adalah dengan menggunakan metode spektrofotometri UV- Vis, metode kolorimetri
dan metode Kromatografi. Untuk penelitian ini peneliti menggunakan metode
Spektrofotometri UV- Vis. Vitamin A dapat di analisa kuantitatif dengan metode
spektrofotometri UV-Vis karena mempunyai absorbansi maksimal pada panjang
gelombang antara 325 nm sampai 328 nm dalam berbagi pelarut. Cara penetapan
harus dilakukan secepat mungkin dan terlindung dari cahaya (Sudjadi dan Rohman,
2008).
Bahan-bahan yang diperlukan dalam penelitian kali ini adalah Vitamin A yang
beredar di wilayah kabupaten kendal, kloroform dan bahan atau cairan lain yang
diperlukan. Alat- alat yang digunakan adalah Peralatan yang digunakan dalam
penelitian kali ini adalah Spektrofotometer ultraviolet visibel (Cary 60), Komputer,
cuvet (quartz cell), labu takar 50 ml dan 100 ml (Pyrex), pipet volum, 5, 10, 25 ml
12 | A n a l i s i s b a h a n k i m i a d a l a m b a h a n p a n g a n ( m i k r o )

(Pyrex), pipet mikro, timbangan elektrik (Pioneer), beaker glass 100, 250, 500 ml
(Pyrex), mortir, stamper dan peralatan lain yang digunakan. Jenis penelitian yang
digunakan untuk penyusunan dan penulisan Karya Tulisi Ilmiah ini adalah analisa
kuantitatif tablet retinol (vitamin A) yang beredar di wilayah kabupaten Kendal
secara spektrofotometri UV-Vis.
Uji kuantitatif vitamin C dilakukan dengan penetapan kadar secara
spektorofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 570 nm dengan menggunakan
ammonium molibdat sebagai senyawa yang mampu memberikan warna pada vitamin
C sehingga absorbannya dapat terukur di daerah visible. Pada uji ini, digunakan
vitamin C baku sebagai pembanding dan ekstrak daun kelor (Moringa oleifera Lam.)
sebagai sampel uji, dimana untuk pembanding dibuat 7 seri konsentrasi (20, 30, 40,
50, 60, 70 dan 80 ppm). Masing-masing konsentrasi ditambahkan 4 mL asam sulfat
5%. Penambahan asam sulfat bertujuan untuk memberikan suasana asam pada saat
reaksi pembentukan warna, lalu dicukupkan volumenya dengan ammonium molibdat
5% sampai batas tanda. Kemudian diinkubasi selama 30 menit. Hal ini dilakukan agar
selama masa inkubasi, terjadi reaksi yang sempurna antara vitamin C dan ammonium
molibdat. Setelah itu dilakukan pengukuran dengan spektofotometri UV-Vis pada
panjang gelombang 570 nm diperoleh persamaan regresi linier yaitu y = 0,0949x +
0,1621 dengan nilai koefisien determinasi 0,9905.
Uji kuantitatif β-karoten dilakukan dengan penetapan kadar secara
spektorofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 450 nm. Pada uji ini, digunakan
β-karoten baku sebagai pembanding dan ekstrak daun kelor (Moringa oleifera Lam.)
sebagai sampel uji, dimana untuk pembanding dibuat 5 seri konsentrasi (25, 30, 35,
40, 45 dan 50 ppm). Masing-masing konsentrasi dilakukan pengukuran dengan
spektofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 450 nm. Diperoleh persamaan
regresi linier yaitu y = 0,0901x + 0,1908 dengan nilai koefisien determinasi 0,9939.

Setelah itu dilakukan pengukuran β-karoten, ditimbang 10,0 mg ekstrak daun

kelor (Moringa oleifera Lam.), kemudian dilarutkan dengan eter dalam labu ukur 10
13 | A n a l i s i s b a h a n k i m i a d a l a m b a h a n p a n g a n ( m i k r o )

mL (1000 ppm). Dari konsentrasi 1000 ppm, diencerkan sampai 100 ppm dengan
cara dipipet 1 ml, lalu dimasukkan dalam labu ukur 10 mL, lalu dicukupkan
volumenya sampai batas tanda dengan eter (dilakukan replikasi 3 kali).Diukur
serapannya pada panjang gelombang 450 nm dan diperoleh kadar rata-rata β-karoten
yaitu 3,31mg/g.

2.2 Metode analisis Mineral

Mineral dalam tubuh manusia mempunyai peranan penting guna pemeliharaan

fungsi tubuh secara keseluruhan, baik tingkat sel, jaringan, maupun organ (Almatsier,
2004). Salah satu makromineral yang memiliki peran penting dalam pertumbuhan
tubuh manusia adalah kalsium yaitu untuk memperkuat gigi dan menjaga
pertumbuhan tulang guna mencegah resiko osteoporosis (Sciarappa, 2004). Selain
kalsium, magnesium juga merupakan mineral yang bermanfaat bagi tubuh karena
terlibat dalam lebih 300 reaksi metabolik esensial yang diperlukan untuk metabolisme
energi, sintesis protein, penggunaan glukosa, kontraksi otot, sintesis dan pemecahan
asam lemak, terlibat dalam hampir seluruh reaksi hormonal, serta menjaga
keseimbangan ionik seluler (Gums, 2004). Oleh karena itu, kebutuhan kalsium dan
magnesium dalam tubuh harus dijaga keseimbangannya agar tidak menimbulkan
beberapa permasalahan kesehatan.
Kekurangan kalsium (hipokalsemia) saat masa pertumbuhan dapat menimbulkan
gangguan pertumbuhan seperti tulang rapuh, kurang kuat, dan mudah bengkok,
sedangkan kelebihan kalsium dalam tubuh (hiperkalsemia) dapat menyebabkan
gangguan ginjal atau batu ginjal, konstipasi atau susah buang air besar, dan sering
menyebabkan gejala kelainan fungsi otak seperti gangguan emosi, kebingungan,
halusinasi, dan delirium (penurunan kesadaran) (Almatsier, 2004). Selain itu,
defisiensi magnesium dapat mengakibatkan terjadinya kontraktilitas dan
berkurangnya relaksas pembuluh darah sebagai respon terhadap unsur neurohormonal
(prostaglandin dan amina beta adrenergik). Jika kadar magnesium ekstraseluler
14 | A n a l i s i s b a h a n k i m i a d a l a m b a h a n p a n g a n ( m i k r o )

rendah maka akan meningkatkan influks kalsium dan terjadi peningkatan

kontraktilitas pada otot polos (Lestari, 2010).
Sumber kalsium dan magnesium dalam bahan pangan yang umum dikonsumsi
oleh masyarakat salah satunya adalah kacang kedelai (Suhaeni, 2007). Kedelai
(Glycine max (L.) Merill) merupakan salah satu jenis kacangkacangan yang
dimanfaatkan sebagai sumber protein, lemak, vitamin, mineral, dan serat. Tanaman
kedelai mudah dibudidayakan baik di lahan sawah, lahan kering, maupun ladang.
Mineral yang terkandung dalam kacang kedelai diantaranya fosfor, besi, kalsium, dan
magnesium (Suprapti, 2003). Kandungan gizi kalsium dalam kacang kedelai cukup
tinggi yaitu sebesar 227 mg/100 g bahan (Suprapti, 2003), sedangkan kandungan
magnesium dalam kacang kedelai menurut Aparicio et al. (2008) yaitu sebesar 280
mg/100 g bahan. Oleh karena itu, diperlukan metode penetapan kadar kalsium dan
magnesium pada kacang kedelai agar asupan kedua mineral tersebut dapat terpenuhi
sesuai kebutuhan.
A. Analisis Kualitatif
Beberapa metode analisis telah dikembangkan untuk menetapkan kadar
kalsium dan magnesium pada sampel yang bervariasi. Metode yang dapat digunakan
untuk analisis kalsium dan magnesium dalam kacang kedelai antara lain dengan
titrasi kompleksometri, gravimetri, dan spektroskopi serapan atom. Titrasi
kompleksometri yaitu metode titrasi berdasarkan pembentukan kompleks antara
kation dan zat pembentuk kompleks. Untuk kalsium dapat menggunakan indikator
Na-EDTA dan kalkon, sedangkan untuk magnesium dapat menggunakan indikator
EBT (Erichrome Black-T). Metode titrasi tersebut kurang efektif karena
membutuhkan waktu yang lama, kurang sensitif, dan kurang spesifik dalam
pelaksanaannya (Mirna, 2009; Miefthawati dan Gusrina, 2013; Toledo, 2009).
Metode lain yang digunakan adalah metode spektroskopi serapan atom menggunakan
ICP-AES (Inductively Coupled Plasma-Atomic Emmision Spectroscopy) (Bakken,
15 | A n a l i s i s b a h a n k i m i a d a l a m b a h a n p a n g a n ( m i k r o )

2010). Peralatan tersebut relatif mahal dan sedikit dimiliki oleh laboratorium
pengujian di Indonesia, sehingga tidak bisa diaplikasikan bila harus melakukan
analisis yang rutin dan berulang.
Untuk mengatasi kekurangan di atas, maka diperlukan penelitian tentang
pengembangan metode analisis penetapan kadar kalsium dan magnesium secara
simultan dalam kacang kedelai (Glycine max (L.) Merill). Metode yang dapat
digunakan adalah metode spektrofotometri UV-Vis derivatif karena mempunyai
beberapa keuntungan, yaitu relatif lebih sederhana, alat dan biaya operasional yang
lebih murah, dan waktu analisisnya lebih cepat. Serta dapat memberikan hasil dengan
akurasi dan presisi yang baik (Hayun et al., 2006). Kelebihan utama dari metode
spektrofotometri derivatif yaitu kemampuannya dalam meningkatkan pemisahan pita
serapan dari spektrum yang tumpang tindih, mendeteksi dan menentukan panjang
gelombang yang dapat memisahkan senyawa sasaran dari spektrum yang kompleks,
dan mengurangi gangguan yang disebabkan penghamburan dan serapan senyawa lain
(Popovic et al., 2000). Oleh karena itu, diperlukan penelitian mengenai validasi
metode spektrofotometri UV-Vis derivatif sebagai metode penetapan kadar kalsium
dan magnesium secara simultan dalam kacang kedelai. Dengan parameter validasi
yakni selektif, linear, akurat, presisi, dan sensitif.

B. Analisis kuantitatif
Uji kuantitatif menggunakan metode spektrofotometri serapan atom. Metode
spektrofotometri serapan atom memiliki beberapa keuntungan antara lain
pelaksanaannya relatif cepat, kecepatan analisisnya tidak memerlukan pemisahan
pendahuluan dan dapat menentukan konsentrasi unsur dalam jumlah yang sangat
rendah (Khopkar, 2003, Rohman, 2007, Christian, 1996).

a. Pembuatan Linieritas Kurva Kalibrasi

16 | A n a l i s i s b a h a n k i m i a d a l a m b a h a n p a n g a n ( m i k r o )

Larutan standard kalium (1000 mcg/ml), larutan standard natrium

(1000 mcg/ml), larutan standard kalsium (1000 mcg/ml), larutan standard
magnesium (1000 mcg/ml) dipipet masing-masing sebanyak 10 ml,
dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml dan dicukupkan hingga garis
tanda dengan akuabides diperoleh konsentrasi 100 mcg/ml. Masing- masing
larutan baku (100 mcg/ml) dipipet sebanyak 10 ml, dimasukkan ke dalam
labu ukur 100 ml kemudian dicukupkan sampai garis tanda dengan
akuabides diperoleh konsentrasi 10 mcg/ml.
Larutan untuk kurva kalibrasi kalium dibuat dengan memipet 5; 10;
20; 30 dan 40 ml dari larutan baku 10 mcg/ml, masing-masing dimasukkan
ke dalam labu tentukur 100 ml dan dicukupkan hingga garis tanda dengan
akuabides (larutan ini mengandung 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 dan 4,0 mcg/ml) dan
diukur pada panjang gelombang 769,9 nm dengan tipe nyala udara-asetilen.
Larutan untuk kurva kalibrasi natrium dibuat dengan memipet 2; 4; 6;
12 dan 14 ml dari larutan baku 10 mcg/ml, masing-masing dimasukkan ke
dalam labu tentukur 100 ml dan dicukupkan hingga garis tanda dengan
akuabides (larutan ini mengandung 0,2; 0,4; 0,6; 1,2 dan 1,4 mcg/ml) dan
diukur pada panjang gelombang 589,6 nm dengan tipe nyala udara-asetilen.
Larutan untuk kurva kalibrasi kalsium dibuat dengan memipet 5; 10;
20; 30 dan 40 ml larutan baku 10 mcg/ml, masing-masing dimasukkan ke
dalam labu tentukur 100 ml dan dicukupkan hingga garis tanda dengan
akuabides (larutan ini mengandung 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 dan 4,0 mcg/ml) dan
diukur pada panjang gelombang 422,7 nm dengan tipe nyala udara-asetilen.
Larutan untuk kurva kalibrasi magnesium dibuat dengan memipet 5; 10; 20;
30 dan 40 ml larutan baku 10 mcg/ml, masing-masing dimasukkan ke
dalam labu tentukur 100 ml dan dicukupkan hingga garis tanda dengan
akuabides (larutan ini mengandung 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 dan 4,0 mcg/ml) dan
diukur pada panjang gelombang 202,6 nm dengan tipe nyala udara-asetilen.
b. Analisis logam dalam sampel
17 | A n a l i s i s b a h a n k i m i a d a l a m b a h a n p a n g a n ( m i k r o )

Larutan sampel hasil destruksi yang mengandung logam K, yang telah

dilarutkan dipipet sebanyak 1 ml lalu di encerkan dengan akuabides sampai
500 ml. Kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan
spektrofotometer serapan atom pada panjang gelombang 769,9 nm
Larutan sampel hasil destruksi yang mengandung logam Na, yang
telah dilarutkan dipipet sebanyak 10 ml lalu di encerkan dengan akuabides
sampai 100 ml. Kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan
spektrofotometer serapan atom pada panjang gelombang 589,6 nm.
Larutan sampel hasil destruksi yang mengandung logam Ca, yang
telah dilarutkan dipipet sebanyak 1 ml lalu di encerkan dengan akuabides
sampai 250 ml. Kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan
spektrofotometer serapan atom pada panjang gelombang 422,7 nm.
Larutan sampel hasil destruksi yang mengandung logam Mg, yang
telah dilarutan dipipet sebanyak 2 ml lalu diencerkan dengan akuabides
sampai 100 ml. Kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan
spektrofotometer serapan atom pada panjang gelombang 202,6 nm.
Analisis data secara statistik Kadar kalium, natrium, kalsium, besi dan magnesium
yang diperoleh dari hasil pengukuran masing-masing larutan sampel dianalisis
dengan metode standar deviasi dengan rumus (Sudjana, 2005):
(Xi−X ) 2
SD =√
n−1
Keterangan : Xi = Kadar sampel
X = Kadar rata-rata sampel
n = jumlah perulangan
SD = Standar Deviasi
Untuk mencari thitung digunakan rumus:
x−x
thitung =
SD / √ n
18 | A n a l i s i s b a h a n k i m i a d a l a m b a h a n p a n g a n ( m i k r o )

dan untuk menentukan kadar logam di dalam sampel dengan interval kepercayaan
95%,
α = 0.05, dk = n-1, dapat digunakan rumus:
Kadar Logam : µ = X ± (t(α/2, dk) x SD / √n )

2.3 Metode analisis Enzim

Penggunaan enzim dalam industri pangan dilakukan karena enzim merupakan alat
ideal untuk memanipulasi bahan-bahan biologis. Beberapa keuntungan penggunaan
enzim dalam pengolahan pangan adalah aman terhadap kesehatan karena bahan
alami, mengkatalisis reaksi yang sangat spesifik tanpa efek samping, aktif pada
konsentrasi yang rendah, dapat diinaktivasi, dan dapat digunakan sebagai indikator
kesesuaian proses pengolahan. Walaupun demikian,dari ribuan enzim yang
ditemukan ahli biokimia, hanya sebagian kecil enzimdapat dimanfaatkan dalam
industri pangan. Hal ini disebabkan oleh ketidaksesuaian kondisi reaksi enzim,
ketidakstabilan enzim selama pengolahan,atau karena biaya yang terlalu mahal untuk
menggunakan enzim dalam pengolahan pangan.
Salah satu pertimbangan enzim dalam industri pangan, adalah pemanfaatan enzim
tersebut dapat memberikan keuntungan secara komersial. Enzim bermanfaat pada
konversi bahan baku menjadi bahan yang lebih mudahdiolah. Selain untuk
pengolahan yang lebih efisien dan aman, enzim dalam industri pangan dapat
dimanfaatkan untuk mendesain produk pangan yang lebih mudah dicerna saat
dikonsumsi. Degradasi makromolekul menjadi senyawa yang lebih sederhana dan
mudah diserap di dalam saluran pencernaan sangat diperlukan oleh orang yang
bermasalah dengan produksi enzim-enzim pencernaan.
Keterlibatan enzim dalam pengolahan pangan tidak semua menguntungkan.
Enzim yang merugikan dapat menyebabkan kerusakan pangan seperti pembusukan,
perubahan flavor, warna, tekstur dan kandungan gizi pangan. Dalam pengolahan
pangan, inaktivasi enzim yang tidak menguntungkan tersebut perlu dilakukan. Namun
beberapa enzim alami pada makanan apabila dikonsumsi segar dapat membantu kerja
19 | A n a l i s i s b a h a n k i m i a d a l a m b a h a n p a n g a n ( m i k r o )

pencernaan dan kerja pankreas. Bahan pangan yang melalui pemasakan (pemanasan)
akan menginaktifkan enzim-enzim alami pada makanan segar. Konsumsi makanan
yang dimasak dalam waktu lama, akan menyebabkan kekurangan enzim secara kronis
(chronic enzyme deficiency) yang memberi kecenderungan pada penyakit kanker.

Tes enzim adalah metode laboratorium untuk mengukur aktivitas enzimatik . Mereka
sangat penting untuk mempelajari kinetika enzim dan penghambatan enzim .

Semua pengujian enzim mengukur konsumsi substrat atau produksi produk dari
waktu ke waktu. Ada banyak metode berbeda untuk mengukur konsentrasi substrat
dan produk, dan banyak enzim dapat diuji dengan beberapa cara berbeda. Ahli
biokimia biasanya mempelajari reaksi yang dikatalisis oleh enzim menggunakan
empat jenis eksperimen:

A. Analisis kualitatif
 Eksperimen tingkat awal .

Ketika enzim bercampur dengan substrat yang berlebihan, perantara

enzim-substrat menumpuk dalam transien awal yang cepat. Kemudian
reaksi mencapai kinetika kondisi-mapan di mana zat antara substrat enzim
tetap kira-kira konstan dari waktu ke waktu dan laju reaksi berubah relatif
lambat. Tarif diukur untuk waktu yang singkat setelah pencapaian kondisi
kuasi-mapan, biasanya dengan memantau akumulasi produk dengan
waktu. Karena pengukuran dilakukan untuk waktu yang sangat singkat
dan karena kelebihan substrat yang besar, perkiraan bahwa jumlah substrat
bebas kira-kira sama dengan jumlah substrat awal yang dapat dibuat.
Percobaan laju awal adalah yang paling sederhana untuk dilakukan dan
dianalisis, karena relatif bebas dari komplikasi seperti reaksi balik dan
degradasi enzim. Oleh karena itu sejauh ini merupakan jenis percobaan
yang paling umum digunakan dalam kinetika enzim.
20 | A n a l i s i s b a h a n k i m i a d a l a m b a h a n p a n g a n ( m i k r o )

 Eksperimen kurva kemajuan

Dalam percobaan ini, parameter kinetik ditentukan dari ekspresi konsentrasi

spesies sebagai fungsi waktu. Konsentrasi substrat atau produk dicatat dalam
waktu setelah transien cepat awal dan untuk periode yang cukup lama untuk
memungkinkan reaksi mendekati kesetimbangan. Percobaan kurva kemajuan
banyak digunakan pada periode awal kinetika enzim, tetapi sekarang kurang
umum.

 Eksperimen kinetika transien

Dalam eksperimen ini, perilaku reaksi dilacak selama transien cepat awal saat
perantara mencapai periode kinetika kondisi-mapan. Eksperimen ini lebih
sulit dilakukan daripada salah satu dari dua kelas di atas karena eksperimen
tersebut memerlukan teknik khusus (seperti fotolisis flash senyawa sangkar)
atau pencampuran cepat (seperti aliran terhenti , aliran yang dipadamkan, atau
aliran kontinu).

 Eksperimen relaksasi

Dalam percobaan ini, keseimbangan campuran enzim, substrat dan produk

terganggu, misalnya oleh suhu , tekanan atau lompatan pH, dan kembalinya
kesetimbangan dimonitor. Analisis eksperimen ini membutuhkan
pertimbangan reaksi yang sepenuhnya dapat dibalik. Selain itu, eksperimen
relaksasi relatif tidak sensitif terhadap detail mekanistik dan oleh karena itu
biasanya tidak digunakan untuk identifikasi mekanisme, meskipun
eksperimen tersebut dapat dilakukan dalam kondisi yang sesuai.

Pengujian enzim dapat dibagi menjadi dua kelompok sesuai dengan metode
pengambilan sampelnya: pengujian kontinu , di mana pengujian tersebut memberikan
pembacaan aktivitas secara terus menerus, dan pengujian terputus – putus , di mana
21 | A n a l i s i s b a h a n k i m i a d a l a m b a h a n p a n g a n ( m i k r o )

sampel diambil, reaksi dihentikan dan kemudian konsentrasi substrat / produk

ditentukan.

B. Analisis kuantitatif

Protease adalah enzim yang dapat menghidrolisis protein menjadi senyawa-

senyawa yang lebih sederhana seperti peptida kecil dan asam amino. Enzim protease
merupakan enzim penting dan memiliki nilai ekonomi yang tinggi karena aplikasi-
nya yangsangat luas. Contoh industri pengguna enzim protease antara lain industri
deterjen, kulit, tekstil, makanan, pengolahan susu, farmasi, bir dan limbah (Chu,
2006). Dimana metode yang digunakan pada analisis kuantitatif enzim yaitu
Spektrofotometer UV-Mini.

a. Uji kuantitatif aktivitas proteolitik

Produksi protease dilakukan dengan metode Cappucino dan Sherman
(1983) yang dimodifikasi dengan menginokulasikan isolat bakteri PrTK 02
sebanyak 1 ose ke dalam 30 ml media produksi (2% susu skim dan 0.5%
pepton) dengan pH 7 dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 2 hari di atas
pengocok (shaker) inkubator dengan kecepatan 120 rpm. Sampel
disentrifugasi dengan kecepatan 10.160 xg pada suhu 4°C selama 5 menit.
Supernatan yang dihasilkan dianggap sebagai ekstrak kasar enzim protease.
Pengujian aktivitas proteolitik secara kuantitatif dilakukan dengan
metode yang dijelaskan oleh Leewit dan Pornsuksawang (1988) dengan
modifikasi. Sebanyak 1 ml ekstrak kasar enzim protease dicampur 2 ml
larutan kasein 0.5% dengan 0.5 ml larutan buffer fosfat pH 7 lalu didiamkan
selama 10 menit pada suhu 37°C. Reaksi dihentikan dengan menambahkan
2.5 ml TCA 5% lalu diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang. Larutan
disentrifugasi 4000 rpm selama 20 menit. Diambil 1 ml filtrat dan diencerkan
sampai 5 ml. Hasil pengenceran diukur absorbansinya dengan UV pada
panjang gelombang 275 nm.
22 | A n a l i s i s b a h a n k i m i a d a l a m b a h a n p a n g a n ( m i k r o )

b. Penentuan waktu optimum produksi protease

Bakteri PrTK 02 diinokulasi sebanyak 1 ose pada media Nutrient Broth (NB).
Prekultur dilakukan pada suhu 37°C selama 48 jam dengan kecepatan agitasi
120 rpm. Media NB diambil 10% dari jumlah media kemudian ditambah pada
media Skim Milk Broth (SMB) dengan komposisi susu skim 2% dan pepton
0.5% sebagai untuk memproduksi protease 82 (Soeka dan Sulistiani, 2014).
Ekstraksi enzim protease dilakukan dengan cara sentrifugasi media
pertumbuhan bakteri dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit pada suhu
4°C. Sel akan mengendap oleh adanya gaya gravitasi sedangkan enzim tetap
terdapat di dalam supernatan. Supernatan sebagai sampel diuji aktivitas
protease dan kadar proteinnya (Baehaki at al., 2011).
c. Pengujian aktivitas protease
Pengukuran aktivitas protease dilakukan menggunakan metode Enggel et al
(2004). Sebanyak 0.1 ml larutan ekstrak kasar enzim protease ditambahkan
dengan 0.1 ml larutan 0.05 M buffer fosfat pH 7, dipreinkubasi selama 5
menit pada suhu 37°C. Selanjutnya ditambahkan 0.1 ml substrat (2% kasein
dalam 0.05 M buffer fosfat pH 7), diinkubasi selama 10 menit pada suhu
37°C. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 0.2 ml asam trikloroasetat
(TCA) 0.4 M dan disentrifus. Sebanyak 0.2 ml filtrat hasil sentrifus
ditambahkan dengan 1 ml natrium karbonat 0,5 M, dipreinkubasi selama 10
menit dan kemudian ditambahkan 1 ml reagen ninhidrin dan didiamkan
selama 30 menit. Absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 578 nm. Aktivitas proteolitik enzim dihitung dengan
rumus :
[ tirosin ] × V
Aktivitas protease =
( p × q ) × FP
Keterangan : [tirosin] : konsentrasi tirosin yang terbentuk
V : volume total sampel pada tiap tabung (ml)
p : jumlah enzim (ml)
23 | A n a l i s i s b a h a n k i m i a d a l a m b a h a n p a n g a n ( m i k r o )

q : waktu inkubasi (menit)

Fp : faktor pengenceran
d. Pengukuran kadar protein
Kadar protein ditentukan dengan metode biuret yang dimodifikasi.
Pengukuran kadar protein menggunakan Bovine Serum Albumine (BSA)
sebagai standar protein. konsentrasi yang digunakan dalam pembuatan standar
protein yaitu 0-1000 mg/L. Selanjutnya memipet larutan sampel dalam tiap
tabung sebanyak 0.1 ml dan diencerkan kedalam 10 ml akuades. Hasil
pengenceran diambil 1 ml dan ditambahkan 1 ml reagen biuret serta
dihomogenkan. Diamkan selama 10 menit dan sampel diukur pada panjang
gelombang 480 nm. konsentrasi protein ditentukan dengan menggunakan
kurva standar (Yuliani, 2018).
e. Penentuan aktivitas spesifik protease
Aktivitas spesifik enzim diperoleh menggunakan rumus :
aktifitas protase U / ml
Aktivitas spesifik ((Unit/mg protein) (Ramadhani at al.,
kadar protein gr /ml
2015)

BAB III
PENUTUP
24 | A n a l i s i s b a h a n k i m i a d a l a m b a h a n p a n g a n ( m i k r o )

3.1 Kesimpulan
Pangan merupakan salah satu kebutuhan primer dari manusia selain sandang dan
papan. Pangan memegang peranan penting dalam kehidupan manusia, oleh karena itu
dibutuhkan suatu jaminan bahwa pangan yang dikonsumsi sehari-hari oleh manusia
memiliki tingkat keamanan yang tinggi, sehingga manusia dapat bebas dari serangan
penyakit atau bahaya yang berasal dari makanan.

3.2 Saran
Berdasarkan makalah yang dibuat ini, penulis berharap agar makalah ini dapat
dijadikan acuan dalam belajar dan penulis selaku penyusun menyadari bahwa
makalah ini belum sepenuhnya sempurna. Oleh sebab itu penulis mengharapkan agar
pembuatan makalah berikutnya yang hampir sama dengan ini diharapkan lebih baik.

DAFTAR ISI
25 | A n a l i s i s b a h a n k i m i a d a l a m b a h a n p a n g a n ( m i k r o )

Budiarti, A., & Herdiyanti, N. Y. (2018). VALIDASI METODE PENETAPAN

KADAR ISONIAZID DAN VITAMIN B6 MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI
CAIR KINERJA TINGGI SERTA APLIKASINYA DALAM SEDIAAN SIRUP
OBAT TUBERKULOSIS. CENDEKIA EKSAKTA, 3(2).
Komite Nomenklatur Persatuan Internasional Biokimia (NC-IUB) (1979). “Unit
Aktivitas Enzim”. Eur. J. Biochem . 97 (2): 319-20. Doi : 10.1111 / j.1432-
1033.1979.tb13116.x

Passonneau, JV; Lowry, OH (1993). Analisis Enzimatis. Panduan Praktis . Totowa

NJ: HumanaPress. Hlm. 85–110.

Tischer W & Wedekind F. 1999. Immobilized enymes: method and

applications.Top Curr Chem. 200:95-126.

Wirahadikusuma M. 1989. Biokimia: protein, enzim dan asam nukleat. Penerbit

ITB. Bandung

Yuniati, R, Nugroho, T.T dan Puspita, F. (2015). Uji Aktivitas Enzim Protease dari
Isolat Bacillus sp. Galur Lokal Riau. JOM FMIPA. 1(2): 116-122.