Gambaran Infiltrasi Sel Inflamatori Paru dan Aktivitas Enzim Superoksida Dismutase

(SOD) pada Hewan Model Tikus (Rattus norvegicus) Asma yang Terpapar
Lipopolisakarida

Lung Inflammatory Cells Infiltration and Superoxide Dismutase (SOD) Enzyme

Activity in Asthma Rat (Rattus norvegicus) Model Exposed by Lypopolysaccharide

Galuh P. Prameswari, Aulanni’am, Dyah K. Wuragil

Program Studi Pendidikan Dokter Hewan, Program Kedokteran Hewan,
Universitas Brawijaya
galuh.prameswari@rocketmail.com, aulanibiochem@yahoo.com

ABSTRAK

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui tingkat keparahan asma hewan model tikus (Rattus
norvegicus) yang diinduksi lipopolisakarida (LPS) berdasar gambaran infiltrasi sel inflamatori
histopatologi paru dan aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD). Penelitian ini menggunakan tiga
kelompok tikus, yang masing-masing terdiri dari 6 ekor tikus, yaitu kelompok kontrol, kelompok
asma, dan kelompok asma yang terpapar LPS. Sensitisasi alergi dilakukan dengan injeksi
intraperitonial OVA sebanyak 10 µg/ml yang diemulsi di dengan 1,5 mg AlOH 3, dilanjutkan dengan
nebulasi 1 mg/ml OVA selama 20 menit. Paparan LPS dilakukan dengan cara menginjeksikan 1
µg/ml LPS bakteri Phorpyromonas ginggivalis pada sulkus gingiva tikus. Gambaran infiltrasi sel
inflamatori pada histopatologi paru diamati secara kualitatif menggunakan mikroskop BX51
sedangkan aktivitas enzim SOD diukur menggunakan SOD Activity Assay Kit. Hasil penelitian
menunjukkan terjadi peningkatan infiltrasi sel inflamatori secara kualitatif. Aktivitas enzim SOD
menurun signifikan (p<0,05) pada kelompok asma yang terpapar LPS (98,17±0,48 U/ml) dan
kelompok asma (100,74±1,06 U/ml), dibandingkan dengan kelompok normal (109,17±1,85 U/ml).
Kesimpulan dari penelitian ini yaitu, paparan LPS secara intrasulkular mampu meningkatkan infiltrasi
sel inflamatori dan menurunkan aktivitas SOD yang mengindikasikan adanya keparahan asma yang
disebabkan oleh paparan LPS akibat interaksi molekul radikal bebas yang semakin reaktif.

Kata Kunci : Asma, LPS, SOD, infiltrasi sel inflamatori

ABSTRACT

This research was conducted to determine asthma severity in the rat model (Rattus norvegicus)
which exposed by Lypopolysaccharide (LPS) in oral cavity based on inflammatory cells infiltration of
airway histopathology and Superoxide Dismutase (SOD) enzyme activity. Three groups of rat (Rattus
norvegicus), each groups contain six rats, were used in this research which were control group,
asthma group, and exposed LPS asthma group. Allergy sensitization was conducted by intraperitonial
injection of 10 μg/ml ovalbumin (OVA), emulsified in 1,5 mg AlOH3, followed by 20min 1mg/ml
OVA by nebulizer. LPS exposure was conducted by injection of 1µg/ml Phorpyromonas ginggivalis
LPS in rat’s gingival sulcus. Inflammatory cells infiltration was observed qualitatively by Olympus
BX51 microscope and SOD activity was assessed by SOD Activity Assay Kit. The result showed,
infiltration of inflammatory cells was increased qualitatively in LPS asthma group and asthma group.
The activity of SOD enzyme was decreased significantly (p<0,05) in LPS asthma group (98,17±0,48
U/ml) and asthma group (100,74±1,06 U/ml), compared with normal group (109,17±1,85 U/ml). In
conclusion, intrasulcullary LPS exposure increased inflammatory cells infiltration and decreased SOD
activity, indicates that LPS exposure contributes in asthma severity because of free radical molecules
interaction reactively.

Keywords: Asthma, LPS, SOD, inflammatory cells infiltration

1
PENDAHULUAN
Asma merupakan sindrom pernapasan
yang kompleks yang ditandai dengan
mast, dan limfosit, serta diikuti dengan
hiperesponsivitas, hipersekresi mukus,
edema dinding saluran pernapasan,
deskuamasi epitel, dan remodelling dari
saluran pernafasan (Busse & Lemanske,
2001; Barnes et al., 2003; National Heart,
Lung, Blood Institute, 2007).
Beberapa data terbaru dari hasil studi
epidemiologi menyebutkan bahwa
lipopolisakarida (LPS) dari bakteri Gram
negatif merupakan faktor resiko yang
menyebabkan keparahan asma dan
peningkatan jumlah LPS pada lingkungan
memiliki korelasi positif dengan
peningkatan kejadian dan keparahan asma
(Strohmier et al., 2001). Utomo (2006),
salah satu sumber LPS yang dapat
menginduksi respon imun sistemik adalah
dari bakteri Phorpyromonas ginggivalis
penyebab periodontitis, namun hubungan
infeksi mulut dan asma belum banyak
dibahas.
Paparan LPS pada penderita asma akan
mengakibatkan peningkatan respon imun
tubuh berupa peningkatan aktivasi
produksi sel dan mediator inflamasi,
diikuti dengan pembentukan molekul
radikal bebas. Aktivitas molekul radikal
bebas yang semakin reaktif menyebabkan
kondisi tubuh mengalami kondisi stres
oksidatif, ditandai dengan inaktivasi enzim
antioksidan seperti enzim superoksida
dismutase (SOD). Perubahan struktur
saluran pernapasan, seperti infiltrasi sel
inflamatori pada saluran pernapasan juga
mempengaruhi inaktivasi enzim SOD
(Caramori & Papi, 2004; Comhair et al.,
2005). Oleh karena itu, pada penelitian ini
dipelajari mekanisme keparahan asma
berdasarkan aktivitas antioksidan
enzimatis yaitu SOD dalam fungsinya
sebagai scavenger radikal bebas dan
keparahan jaringan paru akibat proses
inflamasi berdasarkan gambaran infiltrasi
sel inflamatori pada histopatologi paru
tikus (Rattus norvegicus) model asma.
2
obstruksi saluran napas, inflamasi kronis
saluran pernafasan yang ditandai dengan
aktivasi dan degranulasi eosinofil, sel
MATERI DAN METODE
Perlakuan Hewan Coba
Hewan model asma yang digunakan
adalah tikus (Rattus norvegicus) jantan
strain Wistar yang diperoleh dari Unit
Pengembangan Hewan Percobaan (UPHP)
UGM Yogyakarta dengan umur 8-12
minggu dan berat badan antara 150-250
gram serta sudah mendapatkan sertifikat
laik etik dari Komisi Etik Penelitian
Universitas Brawijaya No. 77-KEP-UB.
Tatalaksana Sensitisasi Alergi
Sensitisasi alergi pada tikus dilakukan
pada hari ke-1 dan ke-14 dengan injeksi
ovalbumin (Sigma-Aldrich, Nomer
Katalog: A5503) 10 μg/ml secara
intraperitoneal dalam AlOH3 dalam PBS
(phosphate buffer saline). Inhalasi tikus
dilakukan pada hari ke-21 dalam tabung
transparan yang dihubungkan dengan
Nebulizer. Perlakuan pemicu asma
dilakukan dengan nebulasi OVA dalam
NaCl steril dengan dosis dari 1 mg/ml
selama 20 menit.
Tatalaksana Injeksi Lipopolisakarida
(LPS)
Injeksi LPS intrasulkuler dilakukan pada
hari ke-10 dan ke-11 dengan dosis 1 μg/ml
pada sulkus gingiva molar rahang atas kiri
tikus. LPS yang digunakan adalah
LPS1435/1449 dari Porphyromonas gingivalis
(Astarte Biologics, Nomer Katalog: 7010)
yang berfungsi sebagai agen infeksi
rongga mulut dan memodulasi respon
imun.
Pengukuran Aktivitas Superoksida
Dismutase (SOD)
Pengukuran aktivitas SOD menggunakan
Superoxide Dismutase Assay Kit (Bio
Vision, Nomer Katalog: K335-100) dan
dihitung dengan rumus berikut :
 (Ablank1-Ablank3) – (Asampel-Ablank2)
Aktivitas SOD =
(Ablank1-Ablank3)
Pengamatan Gambaran Infiltrasi Sel
Inflamatori
Organ paru tikus diambil untuk dibuat
preparat dengan metode parafin dan
menggunakan pewarnaan hematoksilin
HASIL DAN PEMBAHASAN
Gambar 1. Gambar infiltrasi sel inflamatori pada histopatologi paru tikus
Gambar 1.a merupakan gambaran
bronkiolus tikus normal yang terdiri atas
gambaran normal lapisan epitel semu
silindris bersilia, lamina propria tipis, dan
selapis otot polos. Gambar 1. juga
menunjukkan adanya perbedaan gambaran
histopatologi tikus asma tanpa paparan
LPS (b) dan tikus asma yang terpapar LPS
(c). Kelompok tikus asma tanpa paparan
LPS menunjukkan adanya infiltrasi sel
inflamatori di area parenkima peribronkial.
Sel inflamatori tersebut diduga adalah
eosinofil yang terlihat berbentuk bulatan
x 100
eosin (HE). Gambaran infiltrasi sel
inflamatori diamati secara kualitatif
menggunakan mikroskop Olympus BX51
dengan perbesaran lemah (100x) hingga
perbesaran kuat (400x).
Keterangan.
Struktur Histologi bronkiolus tikus (200x);
kontrol negatif asma (a); asma tanpa paparan
LPS (b), dan asma dengan paparan LPS (c);
daerah infiltrasi sel inflamatori (tanda panah
merah), insert (b’ dan c’) infiltrasi
inflamatori (tanda panah hitam) (400x); bar
50μm.
dengan sitoplasma berwarna merah muda
dan inti berwana ungu kebiruan. Inti sel
terlihat memiliki dua lobi yang dipisahkan
oleh bahan inti sebagai benang seperti
yang terlihat pada gambar insert (gambar
1. b’ dan c’). Hal tersebut sesuai dengan
penelitian Palmans et al. (2002) yang
menyebutkan bahwa tikus yang
disensitisasi dengan cara injeksi dan
inhalasi ovalbumin mengalami
peningkatan jumlah eosinofil di
peribronchial dan perubahan struktur
seperti hiperplasia sel goblet dan deposisi
3
febronektin. Filipović & Cekić (2001)
menambahkan bahwa peningkatan
eosinofil sudah dapat terlihat 7 jam setelah
paparan alergen.
Eosinofil teraktivasi yang bermigrasi ke
saluran pernapasan, seperti yang terlihat
pada gambaran histopatologi bronkiolus
tikus (Gambar 1.b) mengandung protein
sitotoksik, sitokin, mediator lipid, dan
molekul oksigen reaktif. Gambaran
tersebut sesuai dengan hasil penelitian
Infiltrasi eosinofil tersebut akan terlihat
semakin banyak pada gambaran bronkiolus
tikus asma yang terpapar LPS (Gambar
1.c), sesuai dengan gambaran histopatologi
yang dikemukakan oleh Yong et al. (2006)
bahwa terjadi peningkatan infiltrasi
eosinofil pada mencit asma yang dipapar
LPS.
Paparan LPS pada tikus asma akan
direspon oleh Toll-Like Receptor-4 (TLR-
4) dan protein ekstraseluler, yaitu LPS
Binding Protein (LBP), CD-14, dan
Myeloid Differentiation Protein (MD-2).
Interaksi tersebut akan mengakibatkan
teraktivasinya faktor transkripsi dan sinyal
transduksi yang akan merangsang ekspresi
sel dan mediator inflamatori. Sel
inflamatori teraktivasi akan memasuki
saluran pernapasan melalui migrasi yang
dinisiasi oleh faktor kemoatraktan serta
melalui mekanisme seluler yang spesifik
c b
Gambar 2. Perbandingan rata-rata nilai aktivitas SOD (U/ml) pada kelompok tikus
percobaan
4
dan terkoordinasi di setiap tahapan
ekstravasasi termasuk adesi, kemotaksis,
dan aktivasi. Sel inflamatori, khususnya
eosinofil, akan melepaskan molekul
radikal bebas eosinofil peroksidase (EPO)
dan myeloperoksidase (MPO) dan protein
toksik yaitu major basic protein (MBP)
eosinophil cationic protein (ECP),
eosinophil-derived neurotoxin (EDN), dan
eosinophil peroxidase (EPO), LTC 4, dan
platelete activating factor (PAF) sehingga
terjadi kerusakan epitel saluran napas serta
degranulasi basofil dan sel mast. Radikal
bebas tersebut akan berinteraksi dengan
molekul radikal bebas yang terbentuk saat
proses inflamasi akibat pemberian OVA.
Interaksi antar molekul radikal bebas
menimbulkan molekul radikal bebas yang
semakin reaktif, seperti nitrogen dioksida
dan peroksinitrit sehingga menyebabkan
saluran pernapasan mengalami kondisi
stres oksidatif. Kondisi stres oksidatif
merupakan manifestasi dari tidak
seimbangnya molekul radikal bebas dan
enzim antioksidan karena enzim
antioksidan mengalami inaktivasi.
Berdasarkan hasil penelitian ini, inaktivasi
enzim antioksidan khususnya enzim SOD
dapat terlihat dari menurunnya aktivitas
enzim SOD seperti yang terlihat pada
gambar dibawah ini:
a
 Kelompok tikus asma yang terpapar
LPS memiliki aktivitas SOD lebih rendah
(98,17±0,48 U/ml) daripada kelompok
tikus asma yang tidak terpapar LPS
(100,74±1,06 U/ml), sedangkan kedua
kelompok memiliki nilai aktivitas SOD
lebih rendah dibandingkan kelompok
kontrol (109,17±1,85 U/ml). Hasil uji
statistik (One-Way ANOVA) (Lampiran 9)
menggunakan SPSS 16.0 for Windows
nilai p-value (P<0,05) sebesar 0,000
menunjukkan adanya perbedaan yang
nyata antara kelompok kontrol dengan
kedua kelompok. Hal tersebut
menunjukkan bahwa paparan LPS pada
tikus asma dapat memperparah keadaan
asma yang ditandai dengan menurunnya
aktivitas SOD.
Berdasarkan data hasil penelitian ini
pemberian OVA sebanyak 10µg/ml
dengan ajuvan AlOH3 sebanyak 1,5 mg
secara intraperitonial yang dilanjutkan
secara inhalasi sebanyak 1 mg/ml akan
menghasilkan tikus asma dengan aktivitas
enzim SOD sebesar 100, 74 U/ml.
Aktivitas enzim SOD tersebut memiliki
nilai yang lebih rendah daripada kelompok
tikus kontrol yang tidak diberikan alergen
apa-apa yaitu sebesar 109, 17 U/ml.
Penurunan aktivitas enzim SOD tersebut
merupakan akibat dari inflamasi yang
ditimbulkan oleh pemberian OVA.
Keadaan tersebut sesuai dengan
pernyataan (Rifa’i, 2011) yang
menyebutkan bahwa OVA merupakan
protein yang berfungsi sebagai alergen
yang mampu mengaktifkan sitokin Th2
dan berikatan dengan MHC kelas II. Selain
itu, menurut Oosterhout et al.. (1998)
sitokin Th2 akan meningkat aktivasinya
apabila ditambahkan dengan ajuvan
AlOH3.
Paparan LPS Porphyromonas
ginggivalis diberikan secara intrasulkular
pada sulkus gingiva molar rahang tikus
adalah untuk membuat keadaan infeksi
pada rongga mulut tikus sesuai dengan
penelitian Utomo (2006) yang
membuktikan adanya keparahan asma
5
pada pasien penderita periodontitis.
Keparahan tersebut diyakini berkaitan
dengan mekanisme penggantian
neurogenic (neurogenic switching
mechanism) yang dikemukakan oleh
Meggs yaitu mekanisme yang saling
mempengaruhi antara inflamasi
imunogenik dan neurogenik sehingga
rangsangan inflamasi pada jaringan
tertentu akan mengakibatkan inflamasi
pada jaringan lainnya (Utomo, 2006).
Hasil penghitungan aktivitas enzim
SOD pada kelompok tikus asma yang
terpapar LPS menunjukkan nilai yang
lebih rendah dari kelompok tikus asma
(100,74 U/ml) dan kelompok tikus kontrol
(109,17 U/ml), yaitu sebesar 98,17 U/ml.
Hal tersebut membuktikan pemberian LPS
bakteri gram negatif dengan dosis 1 μg/ml
terbukti dapat memperparah keadaan asma
ditandai dengan menurunnya aktivitas
SOD. Hal tersebut didukung oleh
pernyataan Yoon et al. (2007) dan
Eisenbarth et al. (2002) dalam
penelitiannya yang membuktikan bahwa
pada hewan coba yang sudah diinduksi
alergen, paparan LPS dosis rendah (0,1 μg
dan1 μg) akan memperparah asma tipe 2
yang ditandai dengan aktivasi sitokin Th2,
hiperesponsivitas saluran pernapasan,
inflamasi eosinofil, dan peningkatan
regulasi IgE spesifik alergen.
Penurunan SOD pada kelompok tikus
asma terpapar LPS terjadi karena LPS
mengaktivasi makrofag, neutrofil,
fibroblast, sel mast yang selanjutnya akan
melepaskan beberapa senyawa sitokin
yaitu tumor necrosis factor (TNF-α),
interleukin-1 (IL-1), IL-5, IL-8, α-
interferon dan prostaglandin. LPS juga
merupakan senyawa sitotoksik dan
memiliki potensi sebagai stimulator
produksi radikal bebas, diantaranya adalah
nitrat oksida (NO) yang selanjutnya
bereaksi dengan molekul radikal bebas
lainnya membentuk molekul radikal bebas
yang semakin reaktif, yaitu peroksinitrit.
Reaksi molekul radikal bebas yang
semakin reaktif menimbulkan keadaan
stres oksidatif pada sel sehingga akan
merusak sel epitel pada saluran
pernapasan, membentuk respon
proinflamatori, dan menurunkan aktivitas
antioksidan. Hal tersebut terjadi karena
kecepatan reaksi nitrit oxide dan
superoksida lebih besar dibandingkan
reaksi pembentukan H2O2 yang dikatalis
oleh SOD (Bowler & Crapo, 2002;
Kinnula & Crapo, 2003) sehingga SOD
kekurangan substrat dan menjadi inaktif.
KESIMPULAN
Terjadi peningkatan infiltrasi sel
inflamatori pada gambaran histopatologi
paru dan peningkatan aktivitas enzim SOD
pada hewan model tikus (Rattus
norvegicus) asma yang terpapar LPS. Hal
tersebut membuktikan bahwa paparan LPS
dapat memperparah keadaan asma.
UCAPAN TERIMAKASIH
Terimakasih kepada Direktorat Jendral
Pendidikan Tinggi (DIKTI) yang telah
mendanai penelitian ini sehingga
penelitian ini dapat selesai sesuai dengan
yang diharapkan. Terimakasih kepada
Prof. Dr. Aulanni’am, drh., DES dan Ibu
Dyah Kinasih Wuragil, S,Si., M.P., M.Sc,
Mas Hilman Fuadil Amin, serta staf
Laboratorium Biokimia dan Laboratorium
Fisiologi Hewan Fakultas MIPA,
Universitas Brawijaya atas dukungan,
bantuan, dan kerjasama yang luar biasa
untuk penyelesaian penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Barnes, P.J., K.F. Chung, & C.P. Page.
1998. Inflammatory Mediators of
Asthma: An Update.
Pharmacological Reviews 50(4) :
515 – 596.
Busse, W.W., & R.F. Lemanske, Jr. 2001.
Asthma. The New England
Journal of Medicine 344(5) : 350-
362.
Bowler, R.P., & J.D. Crapo. 2002.
Oxidative Stress in Airways. Am.
6
J. Respir. Crit. Care Med. 166:
S38-S43.
Caramori, G., & A. Papi. 2004. Oxidants
and Asthma. Thorax 59 (2): 170-
173.
Comhair, S.A. XuW, S. Ghosh, F.B.
Thunnissen, A. Almasan, W.J.
Calhoun, A.J. Janocha, L. Zheng,
S.L. Hazen, & S.C. Erzurum.
2005b. Superoxide Dismutase
Inactivation in Pathophysiology
of Asthmatic Airway Remodeling
and Reactivity. Am. J. Pathol.
166: 663–674.
Eisenbarth, S.C., D.A. Piggott, J.W.
Huleatt, I. Visintin, C.A.
Herrick, & K. Bottomly. 2002.
Lipopolysaccharide-enhanced,
Toll-like Receptor 4–dependent
T Helper Cell Type 2 Responses
to Inhaled Antigen. J. Exp. Med.
196 (12): 1645-1651.
Filipović, M. & S. Cekić. 2001. The Role
of Eosinophils in Asthma.
Medicine and Biology (8): 6-10.
Kinnula, V.L. & J.D. Crapo. 2003.
Superoxide Dismutases in the
Lung and Human Lung Diseases.
Am J Respir Crit Care Med Vol
167. pp 1600–1619
National Heart, Lung, Blood, Institute
(NHLBI). 2007. National Asthma
Education and Prevention
Program. Expert Panel Report 3:
Guidelines for The Diagnosis and
Management of Asthma. Full
Report.
Oosterhout, A.J., B.V. Esch, G. Hofman,
C.L. Hofstra, I.V. Ark, F.P.
Nijkamp, M.L. Kapsenberg,
H.F.J. Savelkoul, & F.R. Weller.
1998. Allergen Immunotherapy
Inhibits Airway Eosinophilia and
Hyperresponsiveness Associated
with Decreased IL-4 Production
by Lymphocytes in a Murine
Model of Allergic Asthma. Am. J.
Respir. Cell Mol. Biol. 19: 622–
628.
Palmans, E., N.J. Vanacker, R.A. Pauwels,
& J.C. Kips. 2002. Effect of Age
on Allergen Induced Structural
Airway Changes in Brown
Norway Rats. Am. J. Respir. Crit.
Care Med. 165: 1280–1284
Rifa’i, M. 2011. Alergi dan Hipersensitif.
Jurusan Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas
Braijaya, Malang.
Strohmeier, G.R., J.H. Walsh, E.S. Kling,
H.W. Farber, W.W. Cruikshank,
D.M. Center, M.J. Fenton. 2001.
Lipopolysaccharide Binding
Protein Potentiates Airway
Reactivity in a Murine Model of
Allergic Asthma. J. Immunol. 166
: 2063-2070
Utomo, H. 2006. Management of Oral
Focal Infection in Patients with
Asthmatic Symptoms. Dent. J.
39(3): 120–125.
Yoon, K.K., Y.O. Sun, G.J. Seong, W.P.
Heung, Y.L. Soo, Y.C. Eun, B.
Boram, S.L. Hyun, H.O. Min,
S.K. You, H.K. Jong, S.G. Yong,
H.C. Sang, U.M. Kyung, Y.K.
You, Z. Zhu. 2007. Airway
Exposure Levels of
Lipopolysaccharide Determine
Type 1 versus Type 2
Experimental Asthma. The
Journal of Immunology 178:
5375-5382.