SPEKTOFOTOMETRI

Gemala Anjani

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 SPEKTROSKOPI
merupakan produksi, penentuan, identifikasi spektrum yang diproduksi
melalui interaksi radiasi elektromagntik dengan bahan makanan yang
menghasilkan informasi struktur dan komposisi molekuler.

❑Spektrofotometri → Metode
❑Spektrofotometer → Alat

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 KONSEP DASAR
• Ketika cahaya melewati larutan, sebagian kecil diserap
• Fraksi ini dideteksi, diukur, dan digunakan untuk menghubungkan cahaya yang diserap atau
ditransmisikan dengan konsentrasi zat
• Ini memungkinkan analisis zat secara kualitatif dan kuantitatif
• Teknik spektrofotometri digunakan untuk mengukur intensitas cahaya sebagai fungsi dari panjang
gelombang. Ini dilakukan dengan:
✓ Mendifraksikan berkas cahaya menjadi spektrum panjang gelombang
✓ Arahkan ke objek
✓ Menerima cahaya yang dipantulkan atau dikembalikan dari objek
✓ Mendeteksi intensitas dengan perangkat pasangan pengisi daya
✓ Menampilkan hasil sebagai grafik pada detektor dan kemudian ditampilkan dua kali

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id
 HUKUM LAMBERT BEER
• Jumlah radiasi cahaya tampak yang diserap atau ditransmisikan oleh suatu
larutan.
• Jika seberkas sinar melewati suatu larutan, maka sebagian sinar tersebut akan
diserap oleh larutan dan sebagian akan diteruskan.

Rumus :
A = a.b.c

A = Absorbans a = Absortivitas molar zat

B = panjang lintasan c = konsentrasi

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 Spektrofotometri
Spektrofotometri dapat digunakan sebagai analisa kuantitatif (penentuan kadar
suatu zat) karena :
• Dapat digunakan secara luas :
✓Penentuan senyawa organik dan anorganik
✓Berwarna maupun tidak berwarna
• Mempunyai kepekaan yang tinggi (konsentrasi 10−7 M)
• Sangat selektif, dapat menentukan suatu komonen tanpa pemisah
• Dapat dilakukan dengan mudah dan cepat, serta tingkat ketelitian tinggi

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id
 TIPE SPEKTROSKOPI
• Radiasi
● Ultraviolet (UV) → untuk molekul konjugasi, gugus karbonil, gugus

nitro
● Sinar tampak (Vis),

● Infrared (IR) → untuk gugus fungsional dan struktur ikatan

● Gelombang radio (nuclear magnetic resonance,NMR) → untuk

bilangan, tipe, dan posisi relative dari proton

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 Spektroskopi UV-VIS
● Merupakan spektroskopi dengan gelombang
ultraviolet–visible (UV–Vis) dengan panjang 200 -
700 nm.
● Salah satunya adalah spektroskopi absorpsi
quantitative
● Untuk menentukan konsentrasi suatu zat di dalam
larutan
● Berdasar jumlah cahaya yang diserap oleh sample
saat sinar melewatinya

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 Wavelength(nm) Color Complementary-
Huea
<380 Ultraviolet
380–420 Violet Yellow-green
Rona komplementer 420–440 Violet-blue Yellow
mengacu pada warna 440–470 Blue Orange
yang diamati untuk 470–500 Blue-green Red
solusi 500–520 Green Purple
520–550 Yellow-green Violet
550–580 Yellow Violet-blue
580–620 Orange Blue
620–680 Red Blue-green
680–780 Purple Green

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 Larutan
● Larutan Sample
● Blanko
✓ Sama dengan larutan sample,
tetapi tanpa sample
✓ Menghilangkan efek refleksi

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 Kalibrasi
● Kurva kalibrasi untuk mengetahui
hubungan konsentrasi zat dengan serapan
● Dilakukan dengan analisis serapan
standard dengan berbagai konsentrasi
● Menggunakan reagen dan metode yang
sama dengan sample
● Konsentrasinya harus mencakup
konsentrasi sample

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 Nuclear magnetic resonance (NMR)
● Mengukur energi yang diserap dan dikeluarkan
oleh inti atom
● Inti atom memiliki angular momentum yang
memiliki spin quantum number (I),
● mempengaruhi dalam analisa energi
menggunakan NMR
● Inti atom yang paling sering analisis adalah
proton (H) dan isotop 13C, 19F dan 31P, yang
memiliki spin I = 1/2

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 Komposisi NMR :
• Superconducting cryomagnet
(NMR magnet),
• Konsol elekrtonik
• Pusat pengendali dan data

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 • Saat inti atom terkena medan magnet kuat, orientasi inti atom akan mengikuti arah
medan magnetnya.
• Karena sifat mekanikal kuantum (spin inti (I) memiliki kemungkinan orientasi 2I + 1 di
medan magnet)
• Pada spin 1/2, inti dapat memiliki posisi
✓Searah dengan medan magnet (parallel atau spin +1/2) atau
✓Berlawanan arah medan magnet (anti-parallel atau spin −1/2).

• Orientasi pararel ini memiliki energi yang lebih rendah dan memiliki populasi yang lebih
tinggi.
• Kelebihan ini pada kondisi spin +1/2 yang menghasilkan net magnetization yang
menjadi inti dalam analisa NMR.

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id
 Spektrokospi Infra merah
Merupakan suatu metode yang mengamati interaksi molekul dengan
radiasi elektromagnetik yang berada pada 0,75-1,000 μm.

Spektrofotometer infra merah digunakan untuk mengidentifikasi

senyawa-senyawa organik murni maupun senyawa anorganik

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id
 Atomic Absorption Spectroscopy (AAS)
● Berdasarkan penyerapan radiasi uv-vis oleh atom bebas
dalam fase gas.
● Setiap elemen memiliki spektrum unik

● Dalam bahan pangan, semua elemen berbentuk campuran

dan komplek, sehingga harus dikonversi kedalam atom

netral (diatomkan) sebelum pengukuran dengan AAS

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 Skema AAS

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 Mass spectrometry
● MS bekerja dengan memberikan muatan pada molekul dan
mengubahnya menjadi ion dalam proses yang disebut ionisasi.
● Ion yang dihasilkan lalu dikelompokkan berdasarkan rasio massa –
muatan (m/z) dengan cara dimasukkan ke dalam medan elektrostatis
(mass analyzer) dan dapat dideteksi
● Tahap tambahan sebagai fragmentasi ion dapat dilakukan sebelum
deteksi untuk mengetahui struktur molekul menggunakan tehnik
yang disebut tandem MS.

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 ● Hasil produksi ion, pemisahan, fragmentasi dan deteksi tertuang pada
spektrum masa yang dapat diterjemahkan sebagai berat molekul atau
informasi struktur.
● Proses ini dapat digunakan untuk deteksi dan identifikasi bahan yang
tidak diketahui

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 • Molekul murni dalam bentuk gas atau cair mudah menguap dapat disuntikkan
secara langsung dengan metode statik atau disebut penyuntikan langsung.
• Untuk padatan yang dapat menguap dapat dilakukan dengan metode direct
insertion probe
• Sample diletakkan di wadah kecil pada awal probe, kemudian diuapkan dengan
panas

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 • Metode statik bekerja dengan baik pada sample murni, dan kurang
baik pada Kurang sample komplek,
• Sample komplek memerulukan pemisahan menjadi komponen
component menggunakan GC atau LC yang terhubung menggunakan
sebuah antarmuka.
• Antarmuka digunakan untuk menghilangkan pelarut yang berlebih

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 SPESIFIKASI SPEKTROFOTOMETER
1) Single Beam Spectrophotometer
• Hanya terdapat satu berkas sinar yang dilewatkan melalui cuvet
• Blanko, larutan standard, dan sampel diperiksa bergantian
• Panjang gelombang : 190-1000 nm

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 SPESIFIKASI SPEKTROFOTOMETER
2) Double Beam Spectrophotometer
• Sinar dari sumber cahaya dibagi menjadi 2 berkas oleh cermin yang
berptar
✓ Berkas pertama : melalui cuvet berisi blanko
✓ Berkasi kedua : melalui cuvet berisi standar atau sampel

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 SPESIFIKASI SPEKTROFOTOMETER
3) Double Beam – In Tme Spectrophotometer

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 CARA KERJA SPEKTROFOTOMETER
• PRINSIP KERJA :
Bila cahaya (monokrommatik maupun campuran) jatuh pada
suatu medium homogen, sebagian dari sinar masuk akan
dipantulkan sebagian diserap dalam medium itu dan sisanya
diteruskan. Nilai yang keluar dari cahaya yang diteruskan dinyatakan
dalam nilai absorbansi karena memiliki hubungan dengan
konsentrasi sampel.

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id
 TERIMA KASIH

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 Analisis Antioksidan
Gemala Anjani

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 ANTIOXIDANT

Free radicals are molecules or atoms that have at least one unpaired electron
which usually increases the chemical reactivity of the molecule.
Free radicals can react with other molecules to cause cell damage or DNA
mutation.
Molecules called antioxidants protect against free radical damage
http://sciencedoing.blogspot.jp/2012/09/free-radicals-cause-and-concern.html

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 Antioksidan
Antioksidan : zat yang dapat menghambat proses oksidasi sehingga dapat
melindungi sel dari bahaya radikal bebas.

Radikal Bebas :
Atom atau molekul yang tidak berpasangan, bersifat sangat tidak stabil.
Dapat bereaksi dengan protein, lipid, KH, DNA dll.
Menyebabkan terjadinya reaksi berantai menghasilkan radikal bebas yang baru

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 Penggolongan antioksidan
(berdasarkan fungsi)

PRIMER SEKUNDER

Merupakan antioksidan pemutus rantai yang
bereaksi dengan radikal lipid dan membentuk
senyawa yang lebih stabil atau senyawa non-
radikal (donor hidrogen)
Contoh: enzim superoksida dismutase (SOD)
menghambat oksidasi lipid (mencegah kerja
pro-oksidan) melalui berbagai mekanisme:
• pengkhelat ion logam transisi,
• Pengurangan oksigen,
• Transfer hidrogen ke antioksidan primer,
• menyerap radiasi UV,
• deaktivasi spesies reaktif.

Contoh: senyawa fenolik

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 Penggolongan antioksidan
(berdasarkan asal senyawa)

ALAMI SINTETIK

Merupakan antioksidan yang diperoleh dari hasil Merupakan antioksidan yang diperoleh dari hasil
ekstraksi bahan alam sintesi reaksi kimia

Contoh: antioksidan mineral, antioksidan vitamin

and beberapa senyawa fitokimia, seperti: Contoh: Butilhidroksianisol (BHA),
senyawa fenolik, flavonoid, katekin, karotenoid, butilhidroksitoluena (BHT), propil gallate (PG),
β-carotene, lycopene, diterpene, black pepper, butilhidrokuinon tersier (TBHQ),
thimi, garlic, curcumin dan turunannya.

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 Penggolongan antioksidan

Antioksidan Enzymatic Antioksidan

(endogenous) Non-enzymatic
• Banyak terdapat dalam berbagai sayuran dan
• Diproduksi secara alami di dalam tubuh. buah
• Mencegah pembentukan radikal bebas yang
baru • Contoh: senyawa polifenol (asam fenolat dan
• Menonaktifkan radikal bebas yang sudah ada, flavonoid), vitamins, carotenoids, organosulfural
• Contoh: and minerals
 enzim superoksida dismutase (SOD), katalase,
glutation reductase
 Kofaktor enzim

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 Muharram and Youssef, 2014)
GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id
 Metode Uji Aktivitas Antioksidan

In Vitro In Vivo

METODE TRANSFER Ferric reducing ability of plasma (FRAP)

METODE TRANSFER ATOM HIDROGEN
ELEKTRON
ROO• + AH/ArOH  ROOH +A•/ArO• Reduced glutathione (GSH) estimation
Glutathione peroxidase (GSHPx) estimation
Lipid peroxidation (LPO) assay
• Oxygen radical absorbance • Trolox equivalent Catalase (CAT)
capacity (ORAC) antioxidant capacity Superoxide dismutase (SOD) method
• Lipid peroxidation (TEAC) decolourization Glutathione reductase (GR) assay
inhibition capacity (LPIC) • Ferric reducing
• Total radical trapping antioxidant power (FRAP)
• DPPH free radical
antioxidant parameter scavenging
(TRAP) • N,N-dimethyl-p-
• Scavenging of H2O2, phenylenediamine
radicals (DMPD)
• ABTS radical scavenging • Copper (II) reduction
• Β-carotene bleaching assay capacity

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 1. METODE DPPH
DPPH* (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl): suatu radikal bebas, memiliki atom Nitrogen dengan elektron tidak
berpasangan, memiliki absorbansi kuat sekitar pada 520 nm.

Prinsip uji: dengan adanya senyawa antioksidan (mendonorkan H), DPPH tereduksi, warna berubah dari ungu
menjadi kuning. Serapan diukur pada 515-528 nm menggunakan spektrofotometer.

Aktivitas antiradical digambarkan dengan nilai IC50 (konsentrasi seyawa yang mampu menurunkan absorbansi
DPPH sebesar 50%)

Keunggulan: Keterbatasan:
-mudah, - DPPH* berinteraksi
-akurat, dgn radikal lain,
- sensitive, - sensitif terhadap basa Lewis
- relative murah dan pelarut,
- reproduksibiltasnya tinggi - Menggunakan pelarut organik

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id
 ＤＰＰＨ
N
HO O
-e-/-H+ N
H O O

N* NH
NO2 NO2 NO2 NO2

O H O
OH O
O *
OH

NO2 NO2

DPPH* Genistein DPPH Genistein*

Method Sample
Brand-Williams et al (1995) Preparation

1. Reaction Time , the reaction determines a decrease

in Spectrometer absorbance 515 nm at regular time 62.5 µM DPPH Various
until a steady value that represent the final reaction in methanol genistein in
methanol
2. Calibration Curve, to measure the exact value of
Initial DPPH concentration
3. EC50 (Efficient concentration substrate to reduce 50%
DPPH) and ARP (Antiradical Power)

Spectrometer at 515 nm at
regular time : 0, 15 min, 30
min….120 min….
GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id
 Result
1
DPPH 0 min
DPPH + Genistein 5 µM
0.9 1
15 min 0.9
0.8
30 min 0.8
0.7 0 min
60 min 0.7
0.6 15 min
90 min 0.6
30 min
Abs

Abs
0.5 0.5
120 min 60 min
0.4 0.4
90 min
0.3 0.3
120 min
0.2 0.2
0.1
0.1
0
0

437.8
400

463

526

589
412.6
425.2

450.4

475.6
488.2
500.8
513.4

538.6
551.2
563.8
576.4
400

448

496

544

592
409.6
419.2
428.8
438.4

457.6
467.2
476.8
486.4

505.6
515.2
524.8
534.4

553.6
563.2
572.8
582.4
Wavelenght (nm)
Wavelength (nm)

1
0.9
0.8
0.7
0.6
Abs

0.5 DPPH
0.4
0.3 DPPH+Gen
0.2
0.1
0
400
412.6
425.2
437.8
450.4
463
475.6
488.2
500.8
513.4
526
538.6
551.2
563.8
576.4
589
wavelenght (nm)

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 2. METODE ABTS/TEAC
ABTS•+ adalah suatu kation radikal yg tidak ditemukan dalam tubuh manusia dan memiliki absorbansi pada 743 nm
(warna hijau biru).

Prinsip Uji: antioksidan mereduksi ABTS•+ → ABTS (2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid), warna

berubah dari hijau-biru menjadi tidak berwarna. Serapan utama pada 415 nm dan serapan kedua max pada 660, 734,
and 820 nm yg diukur dgn diode-array spectrophotometer

Pembanding/standar: Trolox (suatu antioksidan analog vitamin E yang larut dalam air → yang memberikan Hidrogen)
sehingga dikenal jg dengan metode Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC).

ABTS dioksidasi oleh peroksida dan H2O2 atau Kalium persulfat atau Mangan dioksida (MnO2), menghasilkan ABTS•+
dengan absorbansi pada 743 nm.

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 Keunggulan: mudah, cepat, dapat dialkukan pada rentang pH yang luas,
dpt digunakan utk pengujian antioksidan bersifat hidrofilik dan lipofilik
Keterbatasan:interval waktu pengujian harus dimonitor ketat

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 ABTS
1.6
ABTS*
1.4 Genistein 1 M
Caseinate 0.5 M
Cas + Gen
1.2

Abs / Au
0.8

0.6

0.4

0.2

0
300 400 500 600 700 800 900

A+ A+ A+ Wavelenght / nm
ABTS
Cas-G Cas Gen

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 3. METODE ORAC
(oxygen radical absorption capacity)
Pereaksi:

2,2’-azobis-(2-amidino-propane) dihydrochloride (AAPH) sebagai generator radikal peroksi, pada suhu 37

C

Prinsip Uji: antioksidan menghambat proses oksidasi β-phycoerythrin/fluorescein oleh ROS → penurunan
fluoresensi yang diukur pada panjang gelombang eksitasi 485 nm dan panjang gelombang emisi 520 nm

Standar/pembanding: Trolox
Banyak digunakan untuk sayuran dan buah, antioksidan yg bersifat hidrofilik

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id
 4. METODE FRAP
(ferric reducing antioxidant power)

Pereaksi:
Komplek ferric iron-TPTZ (2,3,5-triphenyl-1,3,4-triaza-
2-azoniacyclopenta-1,4-diene chloride).

Prinsip Uji: antioksidan mereduksi kompleks ferric

tripyridyltriazine (Fe+3-TPTZ) menjadi kompleks
ferrous (Fe+2-TPTZ) berwarna biru pada pH rendah,
setelah 30 menit suhu 37 C serapan diukur pada 593
nm menggunakan diode-array spectrophotometer

Pembanding: Trolox (TEAC) atau asam askorbat

(AEAC)

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id

 TERIMA KASIH

GLOBALISASI, KOLABORASI, AKSELERASI www.undip.ac.id