FISIKO KIMIA

SPEKTROFOTOMETRI UV- VIS

OLEH :
DONA ARISKA 16160022
MELANI ERISON 16160030
PUPUT SHAPUTRA 16160036
DOSEN :
Lusia Eka Putri, M.Si

UNIVERSITAS DHARMA ANDALAS

 Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri UV/Vis adalah teknik

analisis spektroskopi yang memakai
sumber radiasi elektromagnetik ultra
violet dekat (190 nm – 380 nm) dan sinar
tampak (380 nm – 780 nm) dengan
menggunakan instrumen spetrofotometer.
 Spektrofotometri
UV-Vis
• Merupakan alat dengan teknik spektrofotometer pada daerah

ultra-violet dansinar tampak.

• Alat ini digunakan mengukur serapan sinar ultra violet
atau sinar tampak oleh suatu materi dalam bentuk larutan.
• Konsentrasi larutan yang dianalisis sebanding dengan
jumlah sinar yang diserap oleh zat yang terdapat
dalam larutan tersebut.
• Dalam hal ini, hukum Lamber beer dapat menyatakan
hubungan antara serapan cahaya dengan konsentrasi
zat dalam larutan.
Prinsip dasar spektrometri UV/Vis
Prinsip kerja spektrofotometri UV-Vis adalah
interaksi yang terjadi antara energy yang
berupa sinar monokromatis dari sumber sinar
dengan materi yang berupa molekul
Spektrofotometri UV-Vis merupakan
penyerapan sinar tampak atau UV oleh suatu
molekul yang dapat menyebabkan terjadinya
eksitasi elektron (transisi elektronik) dari
keadaan dasar (ground state) menuju energi
yang lebih tinggi (excited state).
Prinsip dasar dalam spektrofotometer UV-Vis adalah ketika suatu cahaya atau energy
mengenai larutan , maka energi tersebut akan ditansmisikan atau diabsorbsi. Besarnya nilai
transmitansi berbanding terbalik dengan absorbansi.
Spektrum UV-Vis sangat berguna untuk pengukuran secara
kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan
dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu
dengan menggunakan hukum Lambert-Beer
HUKUM YANG MENDASARI PRINSIP
KERJA SPEKTROFOTOMETER UV-VIS
Huku Lamb -
m ert Beer
Hukum Beer : Absorbans, log (Po/P), radiasi monokromatik berbanding lurus
dengan konsentrasi sutu spesies penyerap dalam larutan.
Hukum Bouguer (Lambert) : Bayangkan suatu medium penyerap yang
homogen dalam lapisan-
lapisan yang sama tebal. Tiap lapisan menyerap radiasi monokromatik yang
memasuki lapisan itu dalam
fraksi yang sama seperti lapisan-lapisan lain. Dengan semuanya yang lain
sama, maka absorbans itu
berbanding Gabungan
lurus denganHukum
panjangLambert-Beer,
jalan yang melewati medium.
sering di tuliskan

sebagai

HUKUM LAMBERT-BEER
A = abc atau A
= εbc antara absorban dengan konsentrasi larutan sampel.
Hukum Lambert-Beer (Beer`s law) adalah hubungan linearitas
Konsentrasi dari sampel di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu
dengan menggunakan hukum Lambert-Beer.
Spektrofotometer UV-VIS dapat digunakan untuk
a. Analisis Kualitatif
Penggunaan alat ini dalam analisis kuantitatif sedikit terbatas sebab spektrum sinar tampak atau sinar
UV menghasilkan puncak-puncak serapan yang lebar sehingga dapat disimpulkan bahwa spektrum
yang dihasilkan kurang menunjukan puncak-punca serapan. Namun, walaupun puncak yang dihasilkan
bebentuk lebar, puncak tersebut masih dapat digunakan untuk memperoleh keterangan ada atau
tidaknya gugus fungsional tertentu dalam suatu molekul organic.

b. Analisis Kuantitatif
Penggunaan sinar UV dalam analisis kuantitatif memberikan beberapa
keuntungan, diantaranya ;
Dapat digunakan secara luas, Memiliki kepekaan tinggi, Keselektifannya cukup baik dan terkadang tinggi, Ketelitian
tinggi,Tidak rumit dan cepat

Adapun langkah-langkah utama dalam analisis kuantitatif adalah ;

Pembentukan warna ( untuk zat yang yang tak berwarna atau warnanya kurang kuat ), Penentuan panjang gelombang
maksimum, Pembuatan kurva kalibrasi, Pengukuran konsentrasi sampel.
 Instrumen UV-VIS

Spektrofotometer terdiri dari :

· Sumber cahaya.
· Monokromator.
· Kompartemen sampel.
· Detektor dan pengukur intensitas
cahaya. sumber cahaya – monokromator – sel sampel – etector – read out (pembaca).
· Skema konstruksi spektrofotometer
Secara sederhana Instrumen spektrofotometri
yang disebut spektrofotometer terdiri dari:
1. Sumber Cahaya
Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah
memiliki pancaran radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi.
Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah tampak,
ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu
pijar dengan kawat rambut terbuat dari wolfram (tungsten).
Lampu ini mirip dengan bola lampu pijar biasa, daerah
panjang gelombang (l ) adalah 350 – 2200 nanometer (nm).
Di bawah kira-kira 350 nm, keluaran lampu wolfram itu tidak
memadai untuk spektrofotometer dan harus digunakan
sumber yang berbeda. Paling lazim adalah lampu tabung tidak
bermuatan (discas) hidrogen (atau deuterium) 175 ke 375
atau 400 nm. Lampu hidrogen atau lampu deuterium
digunakan untuk sumber pada daerah ultraviolet (UV).
2. Monokromator
Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan
cahaya polikromatis menjadi beberapa komponen panjang
gelombang tertentu (monokromatis) yang bebeda
(terdispersi).
Ada 2 macam monokromator yaitu :
 PRISMA

. Grating
(kisi difraksi)

Keuntungan menggunakan kisi difraksi :

· Dispersi sinar merata
· Dispersi lebih baik dengan ukuran pendispersi yang sama
· Dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spectrum
 Sel sampel
Berfungsi sebagai tempat meletakan sampel, UV-VIS menggunakan kuvet sebagai tempat
sampel. Kuvet biasanya terbuat dari kuarsa atau gelas, namun kuvet dari kuarsa yang
terbuat dari silika memiliki kualitas yang lebih baik. Hal ini disebabkan yang terbuat dari
kaca dan plastik dapat menyerap UV sehingga penggunaannya hanya pada
spektrofotometer sinar tampak (VIS). Kuvet biasanya berbentuk persegi panjang dengan
lebar 1 cm.

Cuvet harus memenuhi syarat- syarat sebagai berikut :

· Tidak berwarna sehingga dapat mentransmisikan semua
cahaya.
· Permukaannya secara optis harus benar- benar sejajar.
· Harus tahan (tidak bereaksi) terhadap bahan- bahan
kimia.
· Tidak boleh rapuh.
· Mempunyai bentuk (design) yang sederhana.
4. Detektor
Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari
sampel dan mengubahnya menjadi arus listrik. Syarat-syarat
sebuah detektor :
· Kepekaan yang tinggi
· Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi
· Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.
· Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.
· Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan
tenaga radiasi.
Macam-macam detektor :
· Detektor foto (Photo detector)
· Photocell, misalnya CdS.
· Phototube
· Hantaran foto
· Dioda foto
· Detektor panas

5. Read out
merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya
isyarat listrik yang berasal dari detektor.
SPEKTROFOTOMETER
KELEBIHAN DAN KEKURANGAN SPEKTROFOTOMETER
UV/VIS
· Kelebihan Spektrofotometer
UV/VIS
Panjang gelombang dari sinar
putih dapat lebih terseleksi
Caranya sederhana
Dapat menganalisa larutan dengan
konsentrasi yang sangat kecil
· Kekurangan Spektrofotometer
UV/VIS
Absorbsi dipengaruhi oleh pH
larutan, suhu dan adanya zat
pengganggu dan kebersihan dari
kuvet
Hanya dapat dipakai pada daerah
ultra violet yang panjang
gelombang >185 nm
Pemakaian hanya pada gugus
fungsional yang mengandung
elektron valensi dengan energy
eksitasi rendah
Sinar yang dipakai harus
monokromatis
Contoh Sampel
Spektrofotometer
Contoh
Kuvet
 UV-Visible Spectrophotometric Method
Development and Quantification of Ciprofloxaciline
in Tablets Dosage Form
• 1. Introduction
• Spectrophotometeric analysis continues to be one ofthe most
widely used analytical techniques available. The greatest use of UV-
Vis absorption spectroscopy lies in its application to quantitative
measurements. The reasons for this stem from the ease with which
most spectrophotometeric measurements can be made, their
sensitivity and precision, and the relatively low cost of instrument
purchase and operation
• Direct spectrophotometric determinations are made when the
analyte molecule contains a chromophore, thus allowing the direct
measurement of its absorbance. Indirect determinations are
usedcommonly when the analyte molecule does not contain a
suitable chromophore.
• Ciprofloxacin, 1-Cyclopropyl-6-fluoro-4-oxo-7-(piperazin-1-
yl)-1, 4-dihydroquinoline-3-carboxylic acid, is asynthetic
broad antibacterial compound belonging to the groupof
fluoroquinolones.
• It contains chromophore in its structure and hence direct
measurement of its UV-Vis absorbance can be made
without any modification. Literature revealed that HPLC
methods have been reported for the quantification of
Ciprofloxacin in pharmaceutical preparations, but no
analytical method using UV spectrophotometer for its
quantification is reported yet.
Accordingly, the following performance
characteristics are recommended for assay
method validation: specificity, linearity, precision
(repeatability, intermediate precision, and
reproducibility), accuracy, range and
robustness.Limit of detection (LOD) and limit of
quantification (LOQ) may also be done for
quantitative tests like testing for impurities
General Objective
The study mainly aims to develop and validate spectrophotometeric assay method
for Ciprofloxacin tablet.
pecific Objectives
To identify maximum wave length and quantify Ciprofloxacin in 500 mg
Ciprofloxacin tablet. To studies the effect of excipients on assay determination of
Ciprofloxacin tablet, To evaluate the linearity, accuracy, precision of the method
developed, and to determine the range of theCiprofloxacin concentration in which
the method is reliable
Experimental
Instruments
Precision balance (Mettler Toledo, AL204-IC, and Switzerland), UV-Vis
spectrophotometer (Shimadzu Corporation, UV-2401PC, China), sonicator, mortar
and pestle, different glass wares were used throughout the experimental work.
5. Repeatability. the absorbance of the solution was takenat each time. Finally, six assay results (n = 6),
indicating the amount of Ciprofloxacin in Ciprofloxacin tablet, were obtained and the standard deviation (SD)
was calculated using Microsoft Excel 2003 and the corresponding relative standard deviation (RSD) was
calculated by the following formula:
RSD = SD/X x100,
Where X is the mean of the six assay results. It should not exceed 2 %.

6. Intermediate Precision. same procedure was followed that three assay results were obtained on one day by
one analyst. And the other three assay results wereobtained on the second day (after 24 hrs of the fist test) by
another analyst from newly prepared5 µg/ml sample solution.

7. Accuracy. A sample was prepared by blending the active pharmaceutical ingredient (Ciprofloxacin HCl) and
the excipients and the coating material in the same amount and the same type as present in the formulation
(Ciprofloxacin 500 mg film coated tablet). Finally, nine test results were obtained and the percent recovery was
determined. It should be between 98 to102%.
8. Robustness. (i) Solution Stability. The test result should be between 98.0 and 102.0% of the initial value.
(ii) Wavelength Change . The effect of a small change in wavelength (λmax ±1nm) on the test result was
studied. The assay results obtained at λmax - 1nm and at λmax + 1nm were compared with that obtained at
λmax.

9. Limit of Detection and Limit of Quantification . The limit of detection and limit of quantification were
determined from the calibration curve data obtainedby (Instant +) version 3.33 programs using the following
formulae:
LOD = 3.3 σ/S
LOQ = 10 σ/S
• Conclusion
• In this study, a simple UV-Vis spectrophotometeric assay method for Ciprofloxacin film
coated tablet was developed and validated. Distilled water, which is easily available
and cheaper than other solvents, was selected as a solvent since Ciprofloxacin HCl is
soluble in it. The maximum wavelength (λ max) for Ciprofloxacin HCl was found to be
275 nm. The method was then validated for specificity, linearity, accuracy,
repeatability, intermediate precision and robustness in accordance with ICH guidelines.

• It is accurate as the percent mean recovery obtained (101.57%) lies within the
recommended limit (98 - 102%). The RSD of assay results (n = 6) of Ciprofloxacin
tablet, determined at 100% test concentration was less than2.0%. In addition, the
changes in analyst and day (24 hrs) did not affect the consistency of assay results as
the RSD of assay results (n=6) was less than 2.0%.
• These assured that the proposed method is precise. However, the investigated sample
solution was found to be instable after 24 hrs. Unlike solution stability, a small change
in wave length (λ max ±1 nm) did not affect the robustness of the method. In general,
the proposed method is simple, precise, accurate and specific over the concentration
range 3 µg/ml (60%) to 7 µg/ml (140%) of Ciprofloxacin where the target
concentration is 5 µg/ml. It is also inexpensive since only water is used as solvent.
•
 Pengembangan Metode Spektrofotometri UV-
Terlihat dan Kuantifikasi Ciprofloxacilline
dalam Bentuk Dosis Tablet
1. Perknalan
• Analisis spektrofotometer terus menjadi salah satu teknik analisis yang
paling banyak digunakan. Penggunaan terbesar spektroskopi serapan
sinar UV-Vis terletak pada penerapannya pada pengukuran kuantitatif.
Alasan berasal dari kemudahan pengukuran radiometrik yang paling
banyak, kepekaan dan ketepatannya, dan biaya pembelian instrumen dan
operasi yang relatif rendah.
• Penentuan spektrofotometri langsung dilakukan saat molekul analit
mengandung kromofor, sehingga memungkinkan pengukuran langsung
absorbansinya. Penentuan tidak langsung digunakan secara umum ketika
molekul analit tidak mengandung kromofor yang sesuai.
• Asam Ciprofloxacin, 1-Cyclopropyl-6-fluoro-4-oxo-7-
(piperazin-1-yl) -1, 4-dihydroquinoline-3-carboxylic,
adalah senyawa antibakteri luas asynthetic milik kelompok
fluoroquinolones.
• Ini mengandung kromofor dalam strukturnya dan
karenanya pengukuran langsung absorbansi UV-Vis dapat
dilakukan tanpa modifikasi apapun. Literatur
mengungkapkan bahwa metode HPLC telah dilaporkan
untuk kuantifikasi Ciprofloxacin dalam sediaan farmasi,
namun tidak ada metode analisis dengan menggunakan
UV
karakteristik kinerja berikut direkomendasikan
untuk validasi metode pengujian: spesifisitas,
linieritas, presisi (pengulangan, presisi
menengah, dan reproduktifitas), akurasi,
jangkauan dan ketahanan. Batas deteksi (LOD)
dan batas kuantifikasi (LOQ) juga dapat
dilakukan untuk tes kuantitatif seperti pengujian
untuk kotoran
• Tujuan Umum Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan dan
memvalidasi metode uji spektrofotometer untuk tablet
Ciprofloxacin.
• Tujuan Khusus Untuk mengetahui panjang gelombang maksimum
dan mengkuantifikasi Ciprofloxacin dalam tablet Ciprofloxacin 500
mg. Untuk mempelajari pengaruh eksipien pada penentuan uji
tablet Ciprofloxacin, Untuk mengevaluasi linearitas, akurasi,
ketepatan metode yang dikembangkan, dan untuk menentukan
kisaran konsentrasi CIProfloxacin dimana metode ini
reliabelExperimental
• 3.1. Instrumen Keseimbangan presisi (Mettler Toledo, AL204-IC,
dan Swiss), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu Corporation, UV-
2401PC, China), sonikator, mortir dan alu, barang kaca yang
berbeda digunakan selama percobaan.
Bahan Kimia dan Reagen
Nilai farmasi (standar referensi) Bahan kimia Ciprofloxacin HCl diperoleh dari RX Africa
(Ethiopia), obat-obatan Etio-Amerika, Bishoftu, Ethiopia dan air suling digunakan
sebagai pelarut.
Metode
1. Pemilihan Panjang gelombang maksimum. Pemindaian dilakukan di atas rentang
panjang gelombang 200 - 600 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis
2. Kuantifikasi Ciprofloxacin di Indonesia
Tablet Ciprofloxacin (500 mg) Sepuluh tablet Ciprofloxacin diambil dan diberi bubuk
halus setelah masing-masing ditimbang secara terpisah
3. Kekhususan. absorbansi larutan plasebo dan larutan CRS (5μg / ml) diukur
bersamaan pada panjang gelombang maksimum yang dipilih. Dimana Wab dan W Ars
menyerap larutan plasebo dan larutan standar. Seharusnya tidak melebihi 2%.
4. Linearitas. Lima tingkat konsentrasi disiapkan dengan mengencerkan larutan
larutan 3, 4, 5, 6, dan 7 ml sampai 100 ml dengan air masing-masing 3, 4, 5, 6, dan
7μg / ml. Pembacaan absorbansi masing-masing dari lima tingkat konsentrasi diambil
pada panjang gelombang maksimum yang dipilih. Kemudian, konsentrasi versus
absorbansi diplot untuk mendapatkan kurva kalibrasi Beer-Lambert.
• 5.Repeatability. absorbansi larutan itu diambil setiap waktu. Akhirnya, enam hasil uji (n = 6),
menunjukkan jumlah Ciprofloxacin dalam tablet Ciprofloxacin, diperoleh dan standar deviasi (SD)
dihitung dengan menggunakan Microsoft Excel 2003 dan standar deviasi relatif (RSD) yang sesuai
dihitung dengan rumus berikut. :
RSD = SD / X x100,
Dimana X adalah mean dari enam hasil uji. Seharusnya tidak melebihi 2%.
6. Presisi Menengah. Prosedur yang sama bahwa tiga hasil uji diperoleh pada satu hari oleh satu
analis. Dan tiga hasil tes lainnya diperoleh pada hari kedua (setelah 24 jam uji tinju) oleh analis lain
dari solusi sampel yang baru disiapkan5 μg / ml.
• 7.Ketepatan. Sampel disiapkan dengan mencampur bahan farmasi aktif (Ciprofloxacin HCl) dan bahan
eksipien dan bahan pelapis dengan jumlah yang sama dan jenis yang sama seperti yang ada dalam
formulasi (tablet berlapis film Ciprofloxacin 500 mg). Akhirnya, sembilan hasil tes diperoleh dan
persentase pemulihan ditentukan. Seharusnya antara 98 sampai102%.
• 8. Kekokohan (i) Stabilitas Solusi Prosedur . Hasil uji harus antara 98,0 dan 102,0% dari nilai awal.
• (ii) Perubahan Panjang Gelombang Pengaruh perubahan kecil dalam panjang gelombang .Hasil uji
yang diperoleh pada λmax - 1nm dan pada λmax + 1nm dibandingkan dengan yang diperoleh pada
λmax.

• 9. Batas Deteksi dan Batas Kuantifikasi Batas deteksi dan batas kuantifikasi ditentukan dari data kurva
kalibrasi yang diperoleh melalui program (Instant +) versi 3.33 dengan menggunakan rumus berikut:
• LOD = 3,3 σ / S
• LOQ = 10 σ / S
• Dimana, σ adalah standar deviasi dari respon dan S adalah kemiringan kurva kalibrasi

•
metode uji spektrofotometer UV-Vis sederhana untuk tablet dilapisi film
Ciprofloxacin dikembangkan dan divalidasi. Air suling, yang mudah didapat dan
lebih murah dari pelarut lainnya, dipilih sebagai pelarut sejak Ciprofloxacin HCl
larut di dalamnya. Panjang gelombang maksimum (λ max) untuk Ciprofloxacin
HCl ditemukan 275 nm. Metode ini kemudian divalidasi untuk spesifisitas,
linieritas, akurasi, pengulangan, presisi menengah dan ketahanan sesuai
dengan pedoman ICH.
Hal ini akurat karena perolehan persen rata yang diperoleh (101,57%) berada
pada batas yang direkomendasikan (98 - 102%). Hasil pengujian RSD (n = 6)
tablet Ciprofloxacin, ditentukan pada konsentrasi uji 100% kurang dari 2,0%.
Selain itu, perubahan analis dan hari (24 jam) tidak mempengaruhi konsistensi
hasil uji karena hasil uji RSD (n = 6) kurang dari 2,0%. Ini meyakinkan bahwa
metode yang diusulkan tepat.
Namun, larutan sampel yang diteliti ternyata tidak stabil setelah 24 jam. Tidak
seperti stabilitas solusi, perubahan kecil dalam panjang gelombang (λ max ± 1
nm) tidak mempengaruhi ketangguhan metode. Secara umum, metode yang
diusulkan sederhana, tepat, akurat dan spesifik selama rentang konsentrasi 3
μg / ml (60%) sampai 7 μg / ml (140%) dari Ciprofloxacin dimana target
konsentrasi adalah 5 μg / ml. Hal ini juga murah karena hanya air yang
digunakan sebagai pelarut.