PROSEDUR PENGUJIAN ANTIOKSIDAN

Pembuatan Larutan
Seluruh proses yang digunakan dalam prosedur ini, jika yang dipindahkan adalah larutan
dengan ukuran kecil, harap gunakan mikropipet (pakai blue tip)
1. Pembuatan Blanko
Sampel 1 ml + etanol 1 ml (masukkan campuran ini ke kuvet)
2. Pembuatan stok dpph : (usahakan proses ini dilakukan di tempat minim cahaya
matahari untuk menghindari kerusakan dpph)
a. Timbang 0,01 gram (saat menimbang harap dialasi aluminium foil dan aluminium
foil harap segera ditutup / lipat setelah proses penimbangan selesai)
b. Masukkan powder dpph ke dalam botol gelap (atau pakai beaker glass kemudian
seluruh bagiannya dilapisi aluminium foil)
c. Tambahkan 250 ml etanol ke botol yang telah ada powder dpphnya, jika ada dpph
yang tertinggal dalam aluminium foil, harap disiram dengan etanol hingga warna
ungu hilang
d. Segera tutup beaker glass dengan aluminium foil
Sambil proses ini berjalan, harap spektrofotometer dihidupkan dahulu, siapkan
settingannya. Kemudian secara bertahap jika settingan sudah siap, segera lakukan analisa
untuk sampel blanko, diikuti larutan standar dan sampel.
3. Pembuatan kontrol (larutan standar)
a. Larutkan vitamin C (ascorbic acid) 0,010 gram dalam 100 ml air (aquades)
→sebagai larutan stok
b. Buat standar konsentrasi vitamin C dengan 5 standar :
1) Ambil 0,5 ml vitamin C kemudian tambahkan 19,5 ml dpph
1) Ambil 1 ml vitamin C kemudian tambahkan 19 ml dpph
2) Ambil 5 ml vitamin C kemudian tambahkan 15 ml dpph
3) Ambil 10 ml vitamin C tambahkan 10 ml dpph
4) Ambil 15 ml vitamin C tambahkan 5 ml dpph
5) Inkubasi ketiga standart tersebut selama 5 menit
c. Aquades 1 ml + ambil vitamin C hasil inkubasi dengan dpph sebanyak 1 ml
(masukkan campuran ini ke kuvet), setelah berpindah ke kuvet, harap langsung
diuji dengan spketrofotometer
4. Pengujian sampel dengan dpph (untuk semua sampel yang kan diuji, harap disiapkan
dahulu), prosedur ini berlaku untuk setiap sampel yang akan diuji
a. Masukkan 10 ml sampel ke botol gelap
b. Tambahkan 10 ml dpph ke dalam botol gelap
c. Inkubasi (diamkan) sampel selama 5 menit
d. Segera pindahkan larutan pada botol gelap sebanyak 2 ml ke dalam kuvet
(menggunakan mikropipet, pakai yang blue tip) kemudian running sampel ke
dalam spektrofotometer
Persiapan untuk Pengujian
1. Siapkan kontrol, blanko dan sampel yang telah dimasukkan dalam kuvet (penjelasan
ada di sub bab pembuatan larutan)
2. Khusus untuk dpph pada control dan sampel (setelah dpph / yang ada campurannya
dengan dpph berpindah ke kuvet, harap segera dianalisa dengan spektrofotometer.
Prosedur pengujian sampel dengan spektrofotometer
1. Sambungkan kabel utama spektrofotometer pada pusat listrik
2. Nyalakan tombol on
3. Masuk di menu awal
Teknik kalibrasi
4. Masukkan kuvet yang berisi larutan blanko
5. Klik tombol gambar “B” agar kuvet sejajar dengan sinar uv
6. Tutup spektrofotometer
7. Klik “measure blank”
8. Tunggu sampai selesai hingga muncul “0.000A”
9. Klik “test”
Mencari Panjang gelombang maksimal
10. Klik “scanning”
11. Klik “enter”
12. Masukkan nilai Panjang gelombangnya : 450 – 550 nm
13. “jika sudah muncul nilai Panjang gelombang 450 – 550 nm, maka bisa diklik “run test”,
tetapi jika belum, ikuti prosedur di bawah ini
14. Klik arah panah ke bawah (satu kali), masukkan nilai 450
15. Kemudian klik arah panah ke bwaha lagi (satu kali), masukkan nilaI 450
16. Klik “enter”
17. Klik “run test”
18. Tunggu hingga proses selesai
Kalibrasi dengan blanko
19. Klik “collect base line”
20. Tunggu hingga grafik muncul (biasanya akan ada sedikti bunyi pada mesin)
21. Masukkan larutan standar ke 1 (1 ml vit C + 19 ml dpph) ke kolom kuvet yang bertanda
“1”, arahkan kuvet sejajar dengan sinar UV dengan cara klik tombol “1”
22. Jika sudah sejajar, tutup mesin spektrofotometer
23. Klik “measure sample” sampai mesin sedikit berbunyi
24. Kemudian cek mana yang paling tinggi (blanko / standar 1) (tulis nilai absorbansi
blanko dan standar 1 ya) catat Panjang gelombangnya, selanjutnya dengan cara
klik “edit grab”
25. Klik “met” pilih “peak and value” (menu panah pada ujung kanan)
26. Klik “enter” kemudian klik “esc”
27. Akan muncul Panjang gelombang maksimum di ….. ppm dengan nilai absorbansi “…….”
28. Kemudian keluar, klik “esc” dan ulangi lagi klik “esc” sampai di layar muncul bacaan
“measure sample” (menu sebelah kanan)
29. Jika sudah muncul, buka tempat kuvet, ganti kuvet yang ada di kolom 1 dengan larutan
standar 2 (5 ml vit.c + 15 ml dpph), sejajarkan dengan lampu sinar uv (sebelah kiri),
namun jika sudah sejajar tidak perlu klik tombol “1”
30. Kemudian tutup penutup kuvet (mesin spektrofotometer)
31. Klik “measure sample” tunggu hingga running selesai ditandai denga nada sedikit
bunyi pada instrument
32. Jika sudah selesai, klik “edit grab” kemudian klik “met”
33. Klik “peak and value” kemudian “enter” , selanjutnya klik “esc” tunggu hingga proses
di layar selesai
34. Kemudian akan muncul nilai absorbansi larutan standar 2, harap dicatat nilai dan
Panjang gelombangnya
35. Kemudian keluar, klik “esc” dan ulangi lagi klik “esc” sampai di layar muncul bacaan
“measure sample” (menu sebelah kanan)
36. Jika sudah muncul, buka tempat kuvet, ganti kuvet yang ada di kolom 1 dengan larutan
standar 3 (10 ml vit.c + 10 ml dpph), sejajarkan dengan lampu sinar uv (sebelah kiri),
namun jika sudah sejajar tidak perlu klik tombol “1”
37. Kemudian tutup penutup kuvet (mesin spektrofotometer)
38. Klik “measure sample” tunggu hingga running selesai ditandai denga nada sedikit
bunyi pada instrument
39. Jika sudah selesai, klik “edit grab” kemudian klik “met”
40. Klik “peak and value” kemudian “enter” , selanjutnya klik “esc” tunggu hingga proses
di layar selesai
41. Kemudian akan muncul nilai absorbansi larutan standar 3, harap dicatat nilai dan
Panjang gelombangnya
42. Kemudian klik “esc”
43. Ulangi prosesnya hingga larutan standart 5 (pada tulisan berwarna biru)
44. Dari data yang telah dicatat, cari Panjang gelombang yang sering muncul
45. Yang sering muncul adalah Panjang gelombang maksimal yang akan digunakan untuk
analisa sampel
46. Jika sudah ketemu Panjang gelombang maksimal dari sampel maka klik “esc”
kemudian klik “esc” klik lagi “esc” klik lagi “esc” sampai muncul menu “don’t save”
kemudian klik (dengan bantuan menu panah nomor 2 dari kiri) pada deretan paling
atas kemudian buat standart kurva dari larutan standart yang ada
47. Kemudian akan muncul pada layar (ada menu standart curv. Pada deretan keterangan
pada layar)
48. Kemudian klik “standart curv” dengan bantuan menu panah atas bawah (sebelah
bawah) kemudian klik “enter”
49. Pada menu baris ke 3, akan diminta mengisikan Panjang gelombang maksimal. Silakan
diisi sesuai data yang sebelumnya (data absorbansi standar) kemudian klik “enter”
50. Selanjutnya pada menu baris ke 4, cek dalam kondisi “off”
51. Cek jumlah standartnya berapa dan sampelnya ada berapa, kemudian isikan yang
sesuai (jumlah standartnya 5 dan jumlah sampelnya 10), harap diisikan pada menu
52. Jika ada 5 sampel, masukkan di kolom kuvet nomor 1 – 5 (harus diingat labelnya ya)
53. Kemudian klik “run standart”
54. Proses running berlangsung, tunggu sampai selesai
55. Akan muncul hasil absorbansi
56. Tulis label masing – masing sampel pada spektrofotometer
57. Klik “measure standart” kemudian klik “enter”
58. Jika sudah muncul angkanya, klik “view graph” untuk melihat grafiknya
59. Foto grafiknya.