Machine Translated by Google

Pengeditan Gen dan Genom 3–4 (2022) 100020

Daftar isi tersedia di ScienceDirect

Pengeditan Gen dan Genom

beranda jurnal: www.elsevier.com/loc/ggedit

Pengeditan genom pada tumbuhan

Naoki Wadaa, Keishi Osakabe a, Yuriko Osakabe b,ÿ

Sekolah Pascasarjana Teknologi, Ilmu Industri dan Sosial, Universitas Tokushima, Tokushima,
Jepang b Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati, Institut Teknologi Tokyo, Kanagawa, Jepang

info artikel abstrak

Kata kunci: Teknologi pengeditan genom telah membawa perubahan dramatis di banyak bidang penelitian, termasuk ilmu tanaman.
Tanaman
Nuklease jari seng, nuklease efektor seperti aktivator transkripsi (TALEN) dan berkerumun secara teratur diselingi
Pengeditan genom pengulangan palindromik (CRISPR) -protein terkait CRISPR 9 (Cas9) adalah pemain kunci dalam pengeditan genom dan memiliki
CRISPR-Cas9
telah dikembangkan untuk mutagenesis yang ditargetkan. Untuk menerapkan pengeditan genom pada tanaman, optimasi dan pengembangan
TALEN
ZFN
beberapa teknologi untuk mengatasi rintangan spesifik tanaman telah diperlukan. Dalam ulasan ini, kami menyoroti yang terbaru
topik di bidang penyuntingan genom tanaman di Jepang, mulai dari pengembangan alat penyuntingan genom baru
Jepang
untuk aplikasi komersial tanaman yang diedit genom. Prestasi tersebut berkontribusi besar terhadap pembangunan
penelitian genom tanaman dan penerapannya pada pemuliaan tanaman.

Perkenalan Optimalisasi CRISPR-Cas9 untuk mengedit genom tanaman

Manipulasi gen yang ditargetkan merupakan teknologi penting dalam analisis fungsi
gen tanaman dan pemuliaan tanaman. Secara tradisional di tumbuhan
penelitian, mutasi acak yang dihasilkan oleh tagagen fisik dan kimia atau penyisipan T-DNA
telah diselidiki [1]. Meskipun rekayasa urutan tanaman secara tepat melalui penargetan gen
menggunakan perbaikan terarah homologi (HDR) dapat dilakukan, efisiensinya hingga saat
ini sangat rendah.
rendah pada tanaman. Knockdown gen target menggunakan RNA kecil yang mengganggu
(siRNA) telah dilaporkan, namun efeknya bervariasi dan lengkap [1].
Teknologi pengeditan genom yang mengeksploitasi nuklease spesifik lokasi, seng
finger nuclease (ZFN), nuclease efektor seperti aktivator transkripsi
(TALEN) dan pengulangan palindromik pendek yang diselingi secara teratur
(CRISPR)-protein terkait 9 (CRISPR-Cas9) telah dikembangkan
dengan kecepatan yang mencengangkan dalam beberapa tahun terakhir [1–3]. Pada awal genom
era penyuntingan, grup Jepang mencapai generasi tanaman knockout
[4] dan tikus [5] menggunakan ZFN. Kemunculan CRISPR-Cas9 pada tahun 2012
[6–8] sangatlah penting karena memulai revolusi di banyak negara
bidang termasuk penelitian tanaman. Namun, penerapan genom
teknologi pengeditan pada tanaman memerlukan perhatian khusus [2]. Itu
alur umum pengeditan genom tanaman dan faktor-faktor yang memerlukan pertimbangan
khusus diilustrasikan pada Gambar 1. Semua poin ini perlu diatasi
jika kita ingin mencapai pengeditan genom yang efisien pada tanaman.
Penelitian terbaru telah membawa kemajuan luar biasa dalam mengatasinya
kesulitan-kesulitan ini. Di sini, kami meninjau kemajuan terkini dalam penelitian pengeditan
genom tanaman, dengan fokus khusus pada penelitian di Jepang.
Hingga saat ini, CRISPR-Cas9 telah berhasil diterapkan di banyak pabrik
spesies, termasuk Arabidopsis [9–14], beras [9,15–24], tomat [25–
28], gandum [29–31], kedelai [32], anggur [33,34], apel [34,35], beri biru [36], Morning Glory
Jepang [37–39], krisan [40], dan
pohon cedar Jepang [41]. Studi terbaru di Jepang dirangkum dalam Tabel 1.
Beras telah dipelajari secara intensif di Jepang karena merupakan salah satu
tanaman terpenting di seluruh dunia dan makanan pokok di Jepang. kentang
dan tomat juga merupakan tanaman penting untuk studi pengeditan genom di Jepang,
seperti yang dijelaskan nanti. Pohon cedar Jepang tidak hanya akrab bagi orang Jepang
untuk menyediakan bahan kayu tetapi juga untuk perannya sebagai antigen di lingkungan.
Penyebaran serbuk sari cedar Jepang menyebabkan demam pada banyak orang
orang Jepang setiap tahunnya.
Sistem ekspresi CRISPR-Cas9 telah dioptimalkan untuk pabrik
pengeditan genom. Beberapa kelompok telah mengindikasikan bahwa pilihan promotor
memiliki dampak besar pada efisiensi pengeditan genom (Gambar 2A). Motor pro untuk
ekspresi Cas9 dan ekspresi gRNA telah dioptimalkan
untuk setiap spesies tanaman [12,19,20,28,41]. Misalnya saja yang bersifat konstitutif
Promotor virus mosaik kembang kol (CaMV) 35S atau promotor ubiquitin tanaman telah
digunakan untuk mutagenesis pada spesies tanaman di mana DNA eksogen dimasukkan
ke dalam eksplan jaringan, menghasilkan efisiensi mutage nes yang tinggi pada jaringan
somatik [28,25] . Kami telah memproduksi SlIAA9
(gen kunci dalam parthenocarpy) melumpuhkan tanaman tomat menggunakan gen cas9
yang digerakkan oleh promotor konstitutif [28,25]. Peningkat translasi
dMac3—sebagian dari wilayah OsMac3 mRNA 5ÿ yang belum diterjemahkan—memiliki
peningkatan ekspresi Cas9, menghasilkan peningkatan mutage yang nyata

ÿ Penulis koresponden.
Alamat email: osakabe.y.ab@m.titech.ac.jp (Y.Osakabe).

https://doi.org/10.1016/j.ggedit.2022.100020
Diterima 3 Oktober 2022; Diterima dalam bentuk revisi 16 November 2022; Diterima 16 November 2022
2666-3880/© 2022 Penulis. Diterbitkan oleh Elsevier Ltd. Ini adalah artikel akses terbuka di bawah lisensi CC BY-NC-ND
(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)
Machine Translated by Google

N. Wada, K. Osakabe dan Y. Osakabe Pengeditan Gen dan Genom 3–4 (2022) 100020

Gambar 1. Alur umum penyuntingan genom tanaman. Poin-poin yang perlu dipertimbangkan dalam penerapan teknologi penyuntingan genom tanaman disajikan dalam kotak.

Gambar 2. Contoh topik yang dibahas dalam ulasan ini. (A) Seleksi promotor yang optimal untuk pengeditan genom pada tanaman. Pengeditan genom panel atas menggunakan promotor konstitutif, menghasilkan
efisiensi mutasi yang tinggi pada sel somatik. Panel bawah Penggunaan promotor aktif dalam sel germinal efektif dalam Arabidopsis; kuncup bunga terinfeksi Agrobacterium. (B) Strategi penyuntingan genom tanpa
kultur jaringan, misalnya melalui pengiriman langsung DNA/RNP ke meristem apikal pucuk atau zigot padi.
(C) Pengembangan teknologi pengeditan genom baru TiD. TiD membentuk kompleks multi-efektor dan menginduksi indel pendek atau penghapusan panjang dua arah di lokasi target.
(D) Penerapan TALEN pada pengeditan genom organel (plastida dan mitokondria), memungkinkan pengeditan basa urutan DNA pada genom plastida atau mitokondria.

2
Machine Translated by Google

N. Wada, K. Osakabe dan Y. Osakabe Pengeditan Gen dan Genom 3–4 (2022) 100020

Tabel 1
Studi pengeditan genom terbaru di Jepang.

Spesies tumbuhan Pengeditan genom Gen sasaran Protein efektor DNA/RNA/ Diantarkan oleh Referensi
teknologi RNP

Arabidopsis ZFN DiABI4 FokI DNA Agrobakteri Osakabe dkk., (2010) [4]
CRISPR-Cas9 PadaOST2 Cas9×1 DNA Agrobakteri Osakabe dkk., (2016) [12]
CRISPR-Cas9 DiPDS3, DiAG, Cas9 DNA Agrobakteri Tsutsui dan Higashiyama (2017) [13]
PadaDUO1
CRISPR-Cas9 AtCLV3, AtAS1 4 Cas9-VQR, -EQR DNA Agrobakteri Yamamoto dkk., (2019) [14]
CRISPR-Cas9 lokus targetÿ2 Cas9-NG DNA Agrobakteri Endo dkk., (2019) [9]
CRISPR-Cas9 DiPDS Cas9 RNP CPP-PICsome Odahara dkk., (2021) [11]
TALEN (MENJADI) At16S rRNA, AtrpoC1, CD setengah UGI DNA Agrobakteri Nakazato dkk., (2021) [74]
AtpsbA
TALEN (MENJADI) Atatp1 CD setengah UGI DNA Agrobakteri Nakazato dkk., (2022) [75]
Beras CRISPR-Cas9 OsPDS Cas9 DNA Agrobakteri Mikami dkk., (2015) [19]
CRISPR-Cas9 DsMerah Cas9 DNA Agrobakteri Mikami dkk., (2015) [20]
CRISPR-Cas9 OsDL1, OsCYP72A33, SaCas9 DNA Agrobakteri Kaya dkk., (2016) [10]
OsCYP72A32, OsVIP1,
Seperti OsVIP1
CRISPR-Cas12a OsDL, OsALS, FnCas12a DNA Agrobakteri Endo dkk., (2016) [50]
OsNCED1, OsAO1
CRISPR-Cas9 OsAL Cas9 DNA Agrobakteri Endo dkk., (2016) [16]
CRISPR-Cas9 OsDMC1A, OsCDKB2 Nikel Cas9 DNA Agrobakteri Mikami dkk., (2016) [18]
CRISPR-Cas9 OsDL, OsDMC1A, Cas9 DNA Agrobakteri Mikami dkk., (2017) [17]
OsYSA, OsPDS
CRISPR-Cas9 (BE)ÿ3 DNA EGFP, OsFTIP1e, OsALS dCas9 atau nCas9-CDA1 Agrobakteri Shimatani dkk., (2017) [61]
CRISPR-Cas9 (BE) OsEPSPS, OsALS, OsDL Cas9-NGv1, DNA Agrobakteri Endo dkk., (2019) [9]
nCas9-NGv1-CDA1
CRISPR-Cas9 (BE) 4 situs targetÿ4 TadA-TadAÿ7.10- DNA Agrobakteri Negishi dkk., (2019) [64]
nCas9/nCas9-NGv1
CRISPR-Cas9 OsTos17 LTR Cas9 DNA Agrobakteri Saika dkk., (2019) [23]
CRISPR-Cas9 DsRed2, OsDL, OsGW7, Cas9 RNP PASAK Toda dkk., (2019) [24]
OsGCS1, OsPRR37
CRISPR-Cas12a OsDL, OsALS, OsLCD, FnCas12a DNA Agrobakteri Negishi dkk., (2020) [51]
OsAAO2, OsNCED1
CRISPR-Cas9 (GT)ÿ5 OsALS, OsCly1 Cas9 DNA Agrobakteri Nishizawa-Yokoi dkk., (2020) [21]
CRISPR-Cas9 (GT) OsLig1 Cas9 DNA Agrobakteri Nishizawa-Yokoi dkk., (2021) [22]
CRISPR-Cas9 (GT) OsPDS Cas9 DNA Agrobakteri Endo dkk., (2021) [15]
Tomat CRISPR-Cas9 SlGAD2, SlGAD3 Cas9 DNA Agrobakteri Nonaka dkk., (2017) [27]
CRISPR-Cas9 (BE) SlDELLA, SlETR1 dCas9 (atau DNA Agrobakteri Shimatani dkk., (2017) [61]
nCas9)-CDA1
CRISPR-Cas9 SlIAA9 Cas9 DNA Agrobakteri Ueta dkk., (2017) [28]
CRISPR-Cas9 SlNADK2A, SlIAA9 Cas9 DNA Agrobakteri Hashimoto dkk., (2018) [26]
CRISPR-Cas9 (BE) SlDDB1, SlDET1, nCas9-CDA1-UGI DNA Agrobakteri Hunziker dkk., (2020) [62]
SlCYC-B
ID tipe CRISPR-Cas SlIAA9, SlRIN Cas10d DNA Agrobakteri Osakabe dkk., (2020) [52]
CRISPR-Cas9 SlIAA9 Cas9 DNA Agrobakteri Abe-Hara dkk., (2021) [25]
CRISPR-Cas9 (BE) SlDELLA, SlETR1, nCas9 (atau DNA Agrobakteri Kashojiya dkk., (2022) [63]
SlETR2, SlHWS dCas9)-CDA1-UGI
CRISPR-Cas9 (BE) SlHWS nCas9-CDA DNA Agrobacterium Yuan dkk., (2021) [76]
kentang TALEN StGBSS FokI DNA Agrobacterium Kusano dkk., (2016) [70]
CRISPR-Cas9 StGBSSI Cas9 DNA Agrobacterium Kusano dkk., (2018) [42]
TALEN StSSR2 FokI DNA Agrobakterium Yasumoto dkk., (2019) [71]
TALEN StSSR2 FokI DNA Agrobakterium Yasumoto dkk., (2020) [77]
Gandum CRISPR-Cas9 TaGASR7 Cas9 DNA Penyampaian biolistik Hamada dkk., (2018) [30]
CRISPR-Cas9 TaQsd1 Cas9 DNA Agrobacterium Abe dkk., (2019) [29]
CRISPR-Cas9 TaQsd1 Cas9 DNA Pengiriman biolistik Liu dkk., (2021) [31]
Nikotiana CRISPR-Cas9 NbPDS SaCas9 DNA Agrobacterium Kaya dkk., (2017) [47]
benthamiana CRISPR-Cas9 NbPDS, NbTOM1 Cas9 DNA/RNA Agrobacterium/ PVX Ariga dkk., (2020) [78]
CRISPR-Cas9 NbPDS3 Cas9 DNA Pengiriman biolistik Nagahara dkk., (2021) [68]
Kedelai CRISPR-Cas9 Gly-m Bd 28 K, Gly-m Cas9 DNA Agrobacterium Sugano dkk., (2020) [32]
Lokus Bd 30 K
Nicotiana tabacum CRISPR-Cas12a NtPDS, NtSTF1 FnCas12a DNA Agrobacterium Endo dkk., (2016) [50]
L. CRISPR-Cas9 NtPDS, NtFT4 SaCas9 DNA Agrobacterium Kaya dkk., (2016) [10]
CRISPR-Cas9 NtPDS SaCas9 DNA Agrobacterium Kaya dkk., (2017) [47]
Anggur CRISPR-Cas9 VvPDS Cas9 DNA Agrobacterium Nakajima dkk., (2017) [33]
CRISPR-Cas9 VvPDS Cas9 DNA/RNP Agrobacterium/ PEG Osakabe dkk., (2018) [34]
apel CRSPR-Cas9 MpPDS Cas9 DNA Agrobacterium Nishitani dkk., (2016) [35]
CRISPR-Cas9 MpPDS Cas9 DNA/RNP Agrobacterium/ PEG Osakabe dkk., (2018) [34]
blueberry CRISPR-Cas9 VcCEN Cas9 DNA Agrobacterium Omori dkk., (2021) [36]
pagi Jepang CRISPR-Cas9 DalamDFR-B Cas9 DNA Agrobakterium Watanabe dkk., (2017) [39]
kejayaan CRISPR-Cas9 Di CCD Cas9 DNA Agrobakterium Watanabe dkk., (2018) [38]
CRISPR-Cas9 DiEPH1 Cas9 DNA Agrobakterium Shibuya dkk., (2018) [37]
Krisan CRISPR-Cas9 YGFP Cas9 DNA Agrobacterium Kishi-Kaboshi dkk., (2017) [40]
TALEN CmDMC1 FokI DNA Agrobacterium Shinoyama dkk., (2020) [72]
pohon cedar Jepang CRISPR-Cas9 GFP, CjChlI Cas9 DNA Agrobacterium Nanasato dkk., (2021) [41]

ÿ1: 'Cas9ÿ menunjukkan Cas9 dari Streptococcus pyogenes kecuali dinyatakan lain. ÿ2:
Empat lokus target dengan urutan 11 nt proksimal PAM yang identik dengan PAM berbeda ÿ3:
'CRISPR-Cas9 (BE)' menunjukkan pengeditan dasar.
ÿ4: Empat lokus target untuk NGG, NG PAM, masing-
masing. ÿ5: 'CRISPR-Cas9 (GT)' menunjukkan pengeditan genom untuk penargetan gen yang dimediasi HDR.

3
Machine Translated by Google
N. Wada, K. Osakabe dan Y. Osakabe
efisiensi nes pada kentang [42]. Penggunaan promotor spesifik jaringan tersebut
sebagai promotor SlEF1 yang memiliki aktivitas promotor secara meristematik
sel, telah mempengaruhi pola mutasi yang diinduksi pada tomat [26]. Di dalam
kasus Arabidopsis, di mana kuncup bunga umumnya dipilih sebagai
bahan pengenalan DNA, promotor dengan aktivitas tinggi pada kuman
sel atau sel meristem telah dilaporkan efektif. Misalnya, vektor pKAMA-ITACHI yang
menampung PROTEIN Ribosomal S5A
(RPS5A) promotor dengan tingkat ekspresi konstitutif yang tinggi di semua tahap
perkembangan, termasuk sel telur dan sel meristematik, menginduksi
fenotip nol yang diwariskan bahkan pada generasi T1 di Arabidopsis [13].
CRISPR-Cas9 menargetkan beberapa situs secara bersamaan dengan mengekspresikan
beberapa gRNA dalam satu sel. Beberapa pendekatan telah dikembangkan untuk
ekspresi gen cas9 dan beberapa gRNA [43]. Mikami dkk.
[17] mengembangkan sistem ekspresi yang menarik dan sederhana
beberapa gRNA. Mereka menemukan bahwa gen cas9 dan gRNA dapat diekspresikan dari
satu promotor Pol II, sehingga menghindari penggunaan promotor Pol III, yang masih kurang
dipahami mengenai ekspresi gRNA dalam beras.
Penggabungan kedua gen dapat diekspresikan tanpa tambahan apa pun
urutan antara keduanya dan berfungsi untuk mutagenesis, menunjukkan bahwa sistem
pemrosesan RNA tanaman dapat memproses Cas9-gRNA dalam beras.
Penambahan gRNA lebih lanjut ke ujung 3ÿ gRNA pertama menggunakan penghubung
urutan telah mengaktifkan pengeditan genom multipleks menggunakan vektor ini dengan
konfigurasi sederhana. Hashimoto dkk. [26] menunjukkan multipleks itu
pengeditan genom dapat diterapkan untuk induksi penghapusan di antaranya
situs target dalam tomat. Menggunakan pendekatan penghapusan yang ditargetkan, Saika dkk.
[23] berhasil dalam penghapusan retrotransposon yang ditargetkan pada beras,
membuka jalan bagi pendekatan pemuliaan baru pada tanaman dengan tingkat erozigositas
tinggi melalui reaktivasi gen yang tidak aktif melalui penyisipan TE.
Pengeditan genom multipleks juga berguna untuk melumpuhkan gen target
pada tanaman poliploid. Misalnya, Abe dkk. [29] menginduksi mutasi ke
Gen TaQsd1 pada subgenom A, B, D dalam gandum dan menghasilkan mutan knockout
rangkap tiga dari gen TaQsd1 dengan kombinasi pengeditan genom
oleh CRISPR-Cas9 diikuti dengan penyeberangan. Salah satu aplikasi menarik dari pengeditan
genom multipleks adalah domestikasi de novo
tumbuhan liar, yang mengandung gen kunci untuk domestikasi spesies liar
telah ditargetkan [44]. Pengeditan genom akan memfasilitasi program pemuliaan dengan
memberikan peluang yang sangat berharga untuk mengeksploitasi aspek agronomi
keuntungan dari spesies liar.
Penargetan gen yang dimediasi HDR adalah penerapan penting lainnya
teknologi pengeditan genom. Pada sel eukariotik, untai ganda
kerusakan (DSB) telah diperbaiki terutama melalui jalur non homologous end join (NHEJ) yang
rawan kesalahan. Perbaikan DNA oleh NHEJ sering terjadi
menghasilkan induksi mutasi pada lokasi target. Di samping itu,
Perbaikan DNA dengan HDR telah diketahui menghasilkan perbaikan DSB yang tepat.
Oleh karena itu, pendekatan ini dapat digunakan untuk mencapai modifikasi yang tepat
Urutan DNA. Namun, efisiensi rekombinasi homolog
umumnya sangat rendah pada tanaman. Beberapa pendekatan telah dicoba untuk
meningkatkan efisiensi HDR di pabrik. Endo dkk. [16] melaporkan mutasi itu
gen DNA ligase 4 secara dramatis meningkatkan efisiensi presisi
penargetan gen, mungkin karena penekanan jalur NHEJ dan
integrasi DNA donor. Nishizawa-Yokoi dkk. [21] mengembangkan yang sederhana
dan sistem vektor universal all-in-one pada beras dan tembakau, yang mencakup kaset
ekspresi CRISPR-Cas9, penanda yang dapat dipilih, dan donor
templat untuk HDR. Penggunaan sistem ini memungkinkan penargetan gen pada gen endogen.
Selain itu, vektor lengkap ini memungkinkan evaluasi efisiensi penargetan gen secara tepat
karena semua komponen, termasuk
templat donor, dapat diperkenalkan pada satu vektor. Untuk mengatasi rendahnya
efisiensi HDR pada tanaman, sistem seleksi positif-negatif yang efisien dikombinasikan dengan
sistem eliminasi gen penanda tanpa bekas luka yang baru
telah dikembangkan [15]. Nishizawa-Yokoi dan rekannya mengembangkan a
sistem yang menggunakan pembelahan I-SceI dan perbaikan DNA yang dimediasi oleh single-
strand annealing (SSA) berikutnya untuk menghilangkan gen penanda. Di dalam
Arabidopsis, efisiensi penargetan gen yang dimediasi HDR telah ditingkatkan dengan
pendekatan transformasi sekuensial dengan garis orangtua
mengekspresikan Cas9 di bawah sel telur dan promotor gen DD45 spesifik embrio pertama
kali dibentuk, diikuti dengan transformasi berturut-turut
4
Pengeditan Gen dan Genom 3–4 (2022) 100020
gRNA dan urutan donor dengan metode yang dimediasi Agrobacterium [45].
Meskipun mereka tidak bisa mendapatkan garis penargetan gen yang diwariskan dengan menggunakan a
metode umum, strategi transformasi sekuensial ini telah ditingkatkan
efisiensi HDR di Arabidopsis menjadi 9,3%.
Pengembangan sistem pengiriman DNA/RNP yang efisien pada tanaman
Kebutuhan akan proses regenerasi setelah pengiriman gen ke dalam eksplan atau
protoplas jaringan merupakan salah satu hambatan yang membatasi potensi penyuntingan
genom tanaman. Proses regenerasi belum terjadi
terbentuk di sebagian besar spesies tanaman, dan bahkan di tempat proses seperti itu terjadi
Memang ada, meregenerasi tanaman dari eksplan protoplas atau jaringan membutuhkan
waktu dan tenaga yang banyak. Baru-baru ini, beberapa pendekatan telah dilaporkan
untuk menghindari keterbatasan proses regenerasi (Gbr. 2B)
[24,30,67,68]. Hamada dkk. [30] dikembangkan dalam pengeditan genom planta
teknologi di mana partikel emas yang dilapisi dengan DNA pengkodean CRISPR Cas9
dibombardir ke dalam meristem apikal pucuk (SAM) yang diserap
biji. Teknologi ini tidak memerlukan proses kultur jaringan
menghasilkan tanaman yang genomnya diedit karena sel germinal kemudian berkembang
membombardir SAM selama organogenesis bunga. Liu dkk. [31] berhasil
mencapai pengeditan genom pada gandum elit Jepang yang relevan secara komersial
varietas menggunakan ini dalam teknologi planta [31]. Toda dkk. [24] memilih
zigot padi dihasilkan melalui fertilisasi in vitro gamet terisolasi sebagai a
bahan untuk memperkenalkan reagen pengeditan genom. Pengiriman RNP yang dimediasi
PEG langsung ke zigot padi telah memungkinkan pengeditan genom bebas penanda yang
dapat dipilih, menghindari kultur protoplas dan kalus.
Nagahara dkk. [68] memilih serbuk sari sebagai jaringan target dan menetapkan a
metode untuk memasukkan DNA plasmid yang mengkode Cas9 dan gRNA ke dalam serbuk sari
melalui pengiriman biolistik pada tembakau. Dalam sistem mereka, tabung serbuk sari memanjang
dari serbuk sari yang dibombardir, mereka mengirimkan DNA mereka, yang mengandung
mutasi yang ditargetkan, ke dalam bakal biji, dan tanaman yang diedit genomnya dihasilkan tanpa
perlunya proses kultur jaringan. Reagen pengiriman sendiri punya
juga telah dieksplorasi oleh Odahara dkk. [11], yang mengembangkan sistem pengiriman
protein langsung menggunakan poliion yang ditampilkan peptida penembus sel
vesikel kompleks—beberapa CPP-PIC—tanpa mencerna dinding sel. Pengiriman RNP secara
langsung ke kalus Arabidopsis telah dicapai dengan menggunakan
CPP-PICsome. Teknologi ini dan teknologi lainnya terbukti bermanfaat
mengatasi kesulitan spesifik yang dihadapi oleh rekayasa genetika tanaman.
Penerapan varian Cas9 dan sistem CRISPR-Cas lainnya untuk
pengeditan genom tanaman
Ortolog Cas9 dan protein Cas9 rekayasa yang memiliki spesifisitas tinggi atau urutan
pengenalan PAM berbeda telah diidentifikasi dan
diterapkan pada pengeditan genom [46]. Penerapan protein Cas9 baru ini
juga telah dipelajari di Jepang. Misalnya Staphylococcus aureus Cas9
(SaCas9), yang lebih kecil dari SpCas9, telah diterapkan untuk genom
pengeditan pada tembakau dan beras (SaCas9: 1053 aa, SpCas9: 1368 aa) [10].
Kaya dkk. [47] selanjutnya membagi SaCas9 menjadi dua bagian, dan mendemonstrasikannya
ekspresi setiap bagian SaCas9 dari vektor yang berbeda, satu dari
Virus mosaik tomat dan yang lainnya dari Agrobacterium, dapat dibentuk kembali
SaCas9 fungsional di N. benthamiana. Varian Cas9 yang direkayasa dengan preferensi PAM
yang berbeda juga telah diterapkan pada pengeditan genom
tanaman. SpCas9-VQR (PAM: NGAN atau NGNG) dan SpCas9-EQR (PAM:
NGAG) berfungsi di Arabidopsis [14]. Cas9-NG [48], yang bisa
mengenali PAM (NG) yang santai, telah berhasil diterapkan pada genom
pengeditan nasi dan Arabidopsis [9].
Sistem selain CRISPR-Cas9 juga telah diterapkan pada genom
pengeditan pada tanaman. Endonuklease Cas12a—protein efektor di
Sistem CRISPR-Cas tipe V—adalah salah satu protein Cas yang paling banyak digunakan [49].
Francisella novicida Cas12a (juga dikenal sebagai Cpf1), yang dapat mengenali
TTTN PAM dan menghasilkan overhang 5ÿ di ujung DNA, diinduksi ditargetkan
mutagenesis pada tembakau dan beras [50]. Negishi dkk. [51] menunjukkan hal itu
perubahan panjang panduan crRNA mempengaruhi efisiensi mutasi dan
ukuran penghapusan yang diinduksi, tetapi tingkat mutasi yang tidak sesuai target pada pengeditan
genom yang dimediasi FnCas12a pada beras.
Machine Translated by Google

N. Wada, K. Osakabe dan Y. Osakabe Pengeditan Gen dan Genom 3–4 (2022) 100020

Meja 2
Alat CRISPR-Cas dijelaskan dalam ulasan ini.

Tipe Kelas Protein efektor Sasaran PAM Urutan taget (nt) Keluaran

CRISPR-Cas9 ÿ 2 jenis Cas9 DNA 5ÿ-NGG-3ÿ 18–24 Indel pendek

-Cas9-VQR II Cas9-VQR DNA 5ÿ-NGA-3ÿ 18–24 Indel pendek

-Cas9-EQR Cas9-EQR DNA 5ÿ-NGAG-3ÿ 18–24 Indel pendek

-Cas9-NG Cas9-NG DNA 5ÿ-NG-3ÿ 18–24 Indel pendek

-SpG SpG (Cas9) DNA 5ÿ-NGN-3ÿ 18–24 Indel pendek

-Sigap SpRY (Cas9) DNA 5ÿ-NRN-3ÿ > 5ÿ-NYN-3ÿ 18–24 Indel pendek
-SaCas9ÿÿ SaCas9 DNA 5ÿ-NNGRR(T)ÿ3ÿ 20–22 Indel pendek

CRISPR-Cas12a (Cpf1) 2 tipe V FnCas12a DNA 5ÿ-TTTN-3ÿ 18–25 Indel pendek

CRISPR-Cas3 ÿÿÿ 1 tipe IE Cas3 DNA 5ÿ-ARG-3ÿ 32 Penghapusan panjang satu arah
ID tipe CRISPR-Cas (TiD) 1 tipe ID Cas10d DNA 5ÿ-GTH-3ÿ 35–36 Indel pendek dan deletin panjang dua arah
CRISPR-Cas7–11ÿÿÿ 1 RNA – 22–25 pengetatan RNA
tipe III-E Cas7–11
CRISPR-Cas13 2 Cas13 RNA – 22–30 pengetatan RNA
tipe VI

ÿ Cas9 dari Streptococcus pyogenes. ÿÿ

Cas9 dari Staphylococcus aureus. ÿÿÿ Alat-
alat ini belum diuji di pabrik.

Ada laporan terbaru tentang penerapan sistem CRISPR-Cas tipe I pada tanaman [52].
Kelas I CRISPR-Cas tipe I mempunyai ciri-ciri yang
berbeda dari CRISPR-Cas9 atau Cas12a Kelas 2 yang telah dipelajari dengan baik, seperti
pembentukan kompleks multi-efektor dan pengenalan urutan get tar yang lebih panjang. Kami
telah mengidentifikasi dan mengembangkan Microcystis aeruginosa
Sistem ID tipe CRISPR-Cas (TiD) sebagai alat pengeditan genom dalam sel eukariotik (Gbr.
2C) [52,53]. TiD terdiri dari lima jenis protein Cas
dan crRNA yang mengenali urutan target 35–36 nt. Cas10d pro tein—protein Cas unik dalam
tipe ID—diidentifikasi sebagai nuklease
TiD. Introduksi komponen TiD ke dalam eksplan daun tomat diinduksi
penghapusan jarak jauh dua arah serta indel kecil pada tomat.
Pola mutasi bimodal ini merupakan ciri unik yang membedakannya
dari alat CRISPR-Cas lainnya seperti Cas9, Cas12a atau CRISPR-Cas
tipe IE yang telah dilaporkan pada sel mamalia [54-57]. TiD juga
menghasilkan mutan bi-alelik pada generasi pertama, menunjukkan bahwa TiD
adalah alat pengeditan genom yang efisien pada tanaman. Pengakuan yang lebih lama
Urutan target menunjukkan bahwa spesifisitasnya lebih tinggi daripada yang lain
Alat CRISPR-Cas. Konsisten dengan hipotesis ini, tidak ada mutasi di luar target yang
terdeteksi. Hasil ini menunjukkan bahwa TiD adalah alat pengeditan genom yang unik dan
efisien dengan spesifisitas tinggi pada tanaman. Ringkasan singkat alat CRISPR-Cas telah
dijelaskan pada Tabel 2.
Pengeditan genom tanpa menginduksi pemutusan DNA untai ganda adalah a
strategi yang menjanjikan untuk membatasi induksi indel yang tidak perlu pada target
dan situs di luar target. Pengeditan dasar, yang menggunakan Cas9 yang dinonaktifkan (dCas9)
atau Cas9 nickase (nCas9) yang menyatu dengan cytidine deaminase atau adenine deam
inase, telah dikembangkan [58-60] dan diterapkan pada pengeditan genom di
tanaman. Shimatani dkk. [61] berhasil menerapkan teknologi Target-AID,
yang memanfaatkan ortolog cytidine deaminase (AID) yang diinduksi aktivasi
PmCDA1 untuk pengeditan dasar, untuk pengeditan dasar pada nasi dan tomat. Lebih jauh
lagi, teknologi Target-AID telah diterapkan pada basis simultan
pengeditan beberapa gen dan modifikasi sifat-sifat penting secara pertanian dalam model
tomat 'Micro-Tom' serta dalam tomat komersial.
kultivar [62,63]. Baru-baru ini telah ditunjukkan bahwa Cas9 yang direkayasa
varian, Cas9-NG, juga dapat digunakan untuk pengeditan dasar pada nasi [64]. Yang baru
teknologi, pengeditan utama, juga telah dikembangkan untuk genom yang tepat
rekayasa tanpa menginduksi kerusakan DNA untai ganda [65] dan telah
mulai digunakan dalam pengeditan genom tanaman [66]. Teknologi baru ini
telah memperluas kotak peralatan pengeditan genom tanaman untuk membantu para peneliti
pencarian mereka untuk pengeditan genom yang tepat.
Pengeditan genom organel dengan TALEN—aplikasi baru dari
teknologi yang ada
Meskipun CRISPR-Cas9 lebih dikenal luas, TALEN adalah alat asli untuk pengeditan
genom pada tanaman. Platinum TALEN dikembangkan
oleh Sakuma dkk. [69] telah diterapkan pada pengeditan genom pada tanaman.
Kusano dkk. [70] menetapkan sistem konstruksi vektor sederhana sebagai
didukung oleh sistem “Gateway”, dan menamakannya Emerald-Gateway
sistem TALEN. Menggunakan vektor yang dibangun menggunakan sistem ini, mutasi
dimasukkan ke dalam kalus kentang. Yasumoto dkk. [71] mengembangkan a
Sistem konstruksi vektor ekspresi Platinum TALEN dibantu oleh
Sistem Golden Gate dan MultiSite Gateway. Dengan menggunakan sistem ini, mereka
berhasil menghasilkan SSR2 (enzim kunci dalam jalur biosintesis kaloid glikoal steroid)
tanaman kentang tetraploid KO menggunakan
Transformasi stabil yang dimediasi Agrobacterium . Selain itu, mereka mendirikan tanaman
kentang yang diedit genomnya tanpa transgen menggunakan transien
sistem ekspresi yang tidak memerlukan pemilihan antibiotik [77]. Shi noyama dkk. [72]
menargetkan enam lokus gen DMC1 pada heksaploidi chrysan themum dan berhasil
menginduksi mutasi pada keenam lokus menggunakan
TALEN yang dirancang dengan baik. Hasil ini menunjukkan bahwa TALEN masih merupakan sebuah
alat yang menarik untuk mengedit genom pada tanaman.
Baru-baru ini, TALEN mengaktifkan pengeditan dasar plastid yang ditargetkan
[73,74] dan genom mitokondria [73,75] (Gbr. 2D). Tidak seperti CRISPR Cas9, TALEN dapat
direkrut ke setiap organel dengan menghubungkan ke urutan peptida target plastid atau sinyal
penargetan mitokondria.
Menginduksi pemutusan untai ganda ke dalam genom mitokondria yang disebabkan
penghapusan besar-besaran dan perubahan struktur genom, tetapi teknologi pengeditan
dasar memungkinkan pengeditan yang tepat tanpa menimbulkan efek buruk. Ini
teknologi membuka bidang baru analisis fungsional dan manipulasi genom organel.
Penerapan pengeditan genom tanaman untuk menghasilkan varietas baru
Penerapan teknologi penyuntingan genom tanaman berpotensi memberikan dampak
yang besar tidak hanya pada ilmu-ilmu dasar tetapi juga pada tanaman.
pemuliaan untuk menghasilkan varietas baru, yang dapat menjadi makanan bagi manusia atau
konsumsi hewan atau aplikasi praktis lainnya. Di beberapa negara,
termasuk Jepang, isolasi tanaman bebas transgen (null segregant)
diperlukan untuk komersialisasi tanaman yang diedit genomnya. Pemindahan
transgen juga penting untuk mengurangi risiko tidak tepat sasaran
mutasi. Beberapa pendekatan selain segregasi Mendel adalah dengan
penyeberangan telah dikembangkan untuk mencapai hal ini [2]. Salah satu strategi tersebut adalah
untuk menghilangkan transgen setelah transformasi stabil. Nishikawa-Yokoi
dkk. [22] mengembangkan sistem seleksi positif-negatif yang diikuti oleh
transposisi piggyBac -eksisi gen penanda yang dapat dipilih. Untuk mengatasi keterbatasan
sistem piggyBAC , yang memerlukan elemen TTAA di lokasi target, Endo dkk. [15]
mengembangkan lebih lanjut transgen
sistem eliminasi yang menggunakan pencernaan I-Sce I yang diikuti dengan perbaikan DNA
oleh SSA seperti disebutkan di atas. Pendekatan lain adalah ekspresi sementara CRISPR-
Cas9 tanpa integrasi transgen yang stabil. Yuan dkk.
[76] mengadopsi sistem ekspresi sementara yang efisien yang menggunakan replikasi
permata iniviral dan terminator ganda. Ekspresi sementara dari
TALEN juga telah dilakukan (Yasumoto dkk. [77]). Selain itu, pendekatan yang memperkenalkan
reagen CRISPR-Cas tanpa menggunakan eksogen

5
Machine Translated by Google
N. Wada, K. Osakabe dan Y. Osakabe
DNA telah dikembangkan. Penerapan vektor virus bebas DNA seperti vektor virus
kentang X (PVX) [78] dan vektor virus mosaik tomat (ToMV) [79] yang mengekspresikan
protein Cas dan gRNA digunakan untuk tujuan ini.
Selain itu, pengiriman langsung RNP Cas9-crRNA adalah pendekatan yang paling
menjanjikan untuk pengeditan genom tanpa integrasi DNA eksogen [11,24,34].
Pendekatan-pendekatan ini memberikan strategi yang sangat menjanjikan untuk
menciptakan tanaman yang disunting genom bebas transgen.
Baru-baru ini, tanaman yang dimodifikasi genomnya juga menarik bagi konsumen
umum telah dilaporkan di Jepang. Salah satunya adalah kentang glikoalkaloid steroid
rendah yang diproduksi melalui pengeditan genom gen SSR2 [ 71,77]. Glikoalkaloid
seperti -solanin dan -chaconine bersifat racun bagi manusia, oleh karena itu
pengurangannya akan bermanfaat bagi konsumen umum. Selain itu, salah satu
kemajuan paling luar biasa dalam aplikasi komersial teknologi pengeditan genom di
Jepang adalah tomat yang diedit genom dengan peningkatan kandungan asam
-aminobutyric (GABA) [27]. GABA dilaporkan efektif dalam mengurangi tekanan darah,
menginduksi relaksasi dan meningkatkan kekebalan [80-82]. Pada tahun 2021, tomat
kaya GABA menjadi makanan hasil edit genom pertama yang dijual di pasar [83], dan
dengan demikian mewakili tonggak sejarah yang sangat penting menuju penerimaan
sosial terhadap teknologi penyuntingan genom.
Kesimpulan
Pengeditan genom terdiri dari serangkaian teknologi revolusioner yang memiliki
dampak signifikan pada penelitian tanaman. Studi penyuntingan genom tanaman di
Jepang telah berkontribusi pada pengembangan dan penerapan teknologi penyuntingan
genom pada ilmu tanaman dan pemuliaan tanaman. Perkembangan teknologi
penyuntingan genom tanaman yang efisien telah memungkinkan analisis fungsional
gen inti melalui mutagenesis yang ditargetkan, penargetan gen yang tepat, dan induksi
penghapusan yang lama. Pengeditan genom tanaman semakin dipercepat dengan
pengembangan teknologi baru yang memotong proses kultur jaringan yang memakan
banyak waktu dan tenaga. Pengeditan genom organel tidak diragukan lagi akan
membuka pintu baru dalam analisis fungsional organel. Teknologi pengeditan genom
baru seperti varian Cas9 yang direkayasa hampir tanpa PAM, SpG dan SpRY [84],
RNA yang menargetkan sistem CRISPR tipe VI CRISPR-Cas13 [85,86], tipe III-E
CRISPR-Cas7– 11 [87,88] dll. (Tabel 2), terus bermunculan, terus memperluas
kemungkinan penyuntingan genom tanaman dan meningkatkan apa yang dapat kita
lakukan dalam penelitian tanaman. Kontribusi dari upaya penelitian yang luas ini,
termasuk dari Jepang, membuka jalan baru untuk mempercepat penelitian dasar
tanaman dan pemuliaan tanaman.
Deklarasi Kepentingan Bersaing
Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak mempunyai kepentingan finansial
atau hubungan pribadi yang saling bersaing yang dapat mempengaruhi pekerjaan yang
dilaporkan dalam makalah ini.
Para penulis menyatakan kepentingan finansial/hubungan pribadi berikut ini
hubungan yang dapat dianggap sebagai potensi persaingan kepentingan:
Ketersediaan Data
Tidak ada data yang digunakan untuk penelitian yang dijelaskan dalam artikel.
Ucapan Terima Kasih
Kami mohon maaf kepada peneliti yang karyanya tidak dikutip karena keterbatasan
ruang. Penulis didukung oleh JSPS KAKENHI Hibah Nomor JPJP22K06192 kepada
NW, Badan Sains dan Teknologi Jepang (JST) Program Transfer Teknologi yang
Mudah Beradaptasi dan Tanpa Batas melalui Penelitian dan Pengembangan Berbasis
Target (A-STEP) ke KO, JST Penelitian Inti untuk Sains dan Teknologi Evolusional
(CREST) kepada KO, dan JST Center of Innovation NEXT (COI-NEXT, Nomor Hibah
JPMJPF2010) kepada YO
Referensi
[1] Osakabe Y, Osakabe K. Pengeditan genom dengan rekayasa nukleasi pada tumbuhan. Fisiol
Tumbuhan dan Sel 2015;56:389–400. doi:10.1093/pcp/pcu170.
6
Pengeditan Gen dan Genom 3–4 (2022) 100020
[2] Wada N, Ueta R, Osakabe Y, Osakabe K. Pengeditan genom presisi pada tanaman: tercanggih
dalam rekayasa genom berbasis CRISPR/Cas9. Biol Pabrik BMC 2020;20:234. doi:10.1186/
s12870-020-02385-5.
[3] Wang H, Russa MLa, Qi LS. CRISPR/Cas9 dalam pengeditan genom dan seterusnya. Annu Rev
Biokimia 2016;85:227–64. doi:10.1146/annurev-biochem-060815-014607.
[4] Osakabe K, Osakabe Y, Toki S. Mutagenesis terarah situs di Arabidopsis menggunakan nukleasi
jari seng yang dirancang khusus. Proc Natl Acad Sci USA 2010;107:12034– 9. doi:10.1073/
pnas.1000234107.
[5] Mashimo T, Takizawa A, Voigt B, Yoshimi K, Hiai H, Kuramoto T, Serikawa T.
Generasi Tikus Knockout dengan X-Linked Severe Combined Immunodeficiency (X-SCID)
Menggunakan Zinc-Finger Nucleases. PLoS SATU 2010;5:e8870. doi:10.1371/jour
nal.pone.0008870.
[6] Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraf fini LA, Zhang
F. Rekayasa genom multipleks menggunakan sistem CRISPR/Cas. Sains 2013;339:819–23.
doi:10.1126/sains.1231143.
[7] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. Endonuklease DNA berpandu
dual-RNA yang dapat diprogram dalam imunitas bakteri adaptif.
Sains 2012;337:816–21. doi:10.1126/sains.1225829.
[8] Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, GM Gereja.
Rekayasa genom manusia yang dipandu RNA melalui Cas9. Sains 2013;339:823–6. doi:10.1126/
sains.1232033.
[9] Endo M, Mikami M, Endo A, Kaya H, Itoh T, Nishimasu H, Nureki O, Toki S.
Pengeditan genom pada tanaman dengan rekayasa CRISPR–Cas9 yang mengenali NG PAM.
Tanaman Nat 2019;5:14–17. doi:10.1038/s41477-018-0321-8.
[10] Kaya H, Mikami M, Endo A, Endo M, Toki S. Mu tagenesis bertarget yang sangat spesifik pada
tanaman menggunakan Staphylococcus aureus Cas9. Perwakilan Sains 2016;6:26871.
doi:10.1038/srep26871.
[11] Odahara M, Watanabe K, Kawasaki R, Tsuchiya K, Tateishi A, Motoda Y, Kigawa T, Kodama Y,
Numata K. Vesikel kompleks poliion skala nano untuk pengiriman protein muatan dan kompleks
ribonukleoprotein Cas9 ke sel tanaman. Aplikasi ACS Nano Mater 2021;4:5630–5. doi:10.1021/
acsanm.1c00695.
[12] Osakabe Y, Watanabe T, Sugano SS, Ueta R, Ishihara R, Shinozaki K, Osakabe K.
Optimalisasi pengeditan genom CRISPR/Cas9 untuk memodifikasi respons stres abiotik pada
tanaman. Perwakilan Sains 2016;6:26685. doi:10.1038/srep26685.
[13] Tsutsui H, vektor Higashiyama T. pKAMA-ITACHI untuk KO gen yang dimediasi CRISPR/Cas9
yang sangat efisien di Arabidopsis thaliana. Fisiol Sel Tumbuhan 2017;58:46–56. doi:10.1093/pcp/
pcw191.
[14] Yamamoto A, Ishida T, Yoshimura M, Kimura Y, Sawa S. Mengembangkan mutasi yang diwariskan
di arabidopsis thaliana menggunakan toolkit CRISPR/Cas9 yang dimodifikasi yang terdiri dari
varian Cas9 yang Diubah PAM dan gRNA. Fisiol Tumbuhan dan Sel 2019;60:2255–62. doi:10.1093/
pcp/pcz118.
[15] Endo M, Iwakami S, Toki S. Pengeditan genom presisi pada tanaman melalui penargetan gen dan
anil untai tunggal yang diinduksi oleh kerusakan berikutnya. Bioteknologi Tanaman J 2021;19:563–
74. doi:10.1111/pbi.13485.
[16] Penargetan gen Endo M, Mikami M, Toki S. Biallelic pada padi. Fisiol Tumbuhan
2016;170:667–77. doi:10.1104/hlm.15.01663.
[17] Mikami M, Toki S, Endo M. Planta memproses kompleks SpCas9 – gRNA. Fisiol Tumbuhan dan Sel
2017;58:1857–67. doi:10.1093/pcp/pcx154.
[18] Mikami M, Toki S, Endo M. Mutagenesis yang ditargetkan secara presisi melalui nikas berpasangan
Cas9 dalam nasi. Fisiol Sel Tumbuhan 2016;57:1058–68. doi:10.1093/pcp/pcw049.
[19] Mikami M, Toki S, Endo M. Perbandingan konstruksi ekspresi CRISPR/Cas9 untuk mutagenesis
bertarget yang efisien pada beras. Tanaman Mol Biol 2015;88:561–72. doi:10.1007/
s11103-015-0342-x.
[20] Mikami M, Toki S, Endo M. Parameter yang mempengaruhi frekuensi mutagenesis target yang
dimediasi CRISPR/Cas9 pada padi. Perwakilan Sel Tumbuhan 2015;34:1807–15. doi:10.1007/
s00299-015-1826-5.
[21] Nishizawa-Yokoi A, Mikami M, Toki S. Sistem universal penargetan gen yang dimediasi CRISPR/
Cas9 menggunakan vektor all-in-one pada tanaman. Editor Genom Depan 2020;2:604289.
doi:10.3389/fgeed.2020.604289.
[22] Nishizawa-Yokoi A, Toki S. Sistem transgenesis yang dimediasi piggyBac untuk ekspresi sementara
CRISPR/Cas9 pada beras. Bioteknologi Tanaman J 2021;19:1386–95. doi:10.1111/pbi.13559.
[23] Saika H, Mori A, Endo M, Toki S. Target penghapusan retrotransposon beras Tos17 melalui
CRISPR/Cas9. Perwakilan Sel Tumbuhan 2019;38:455–8. doi:10.1007/s00299-018-2357-7.
[24] Toda E, Koiso N, Takebayashi A, Ichikawa M, Kiba T, Osakabe K, Osak abe Y, Sakakibara H, Kato
N, Okamoto T. Sistem pengeditan genom bebas DNA dan penanda yang dapat dipilih dan efisien
menggunakan zigot di beras. Pabrik Nat 2019;5:363–8. doi:10.1038/s41477-019-0386-z.
[25] Abe-Hara C, Yamada K, Wada N, Ueta R, Hashimoto R, Osakabe K, Osakabe Y. Pengaruh mutasi
sliaa9 terhadap pertumbuhan pemanjangan tunas kultivar tomat. Ilmu Pengetahuan Tanaman
Depan 2021;12:627832. doi:10.3389/fpls.2021.627832.
[26] Hashimoto R, Ueta R, Abe C, Osakabe Y, Osakabe K. Pengeditan genom multipleks yang efisien
menginduksi mutasi tipe self-ligated yang tepat pada tanaman tomat. Ilmu Pengetahuan Tanaman
Depan 2018;9:916. doi:10.3389/fpls.2018.00916.
[27] Nonaka S, Arai C, Takayama M, Matsukura C, Ezura H. Peningkatan kandungan asam ÿ
aminobutyric (GABA) yang efisien dalam buah tomat dengan mutagenesis yang ditargetkan.
Perwakilan Sains 2017;7:7057. doi:10.1038/s41598-017-06400-y.
[28] Ueta R, Abe C, Watanabe T, Sugano SS, Ishihara R, Ezura H, Osakabe Y, Osak abe K. Pemuliaan
cepat tanaman tomat parthenocarpic menggunakan CRISPR/Cas9. Perwakilan Sains 2017;7:507.
doi:10.1038/s41598-017-00501-4.
[29] Abe F, Haque E, Hisano H, Tanaka T, Kamiya Y, Mikami M, Kawaura K, Endo M, Onishi K, Hayashi
T, Sato K. Mutasi triple-resesif yang diedit oleh genom mengubah dormansi benih dalam gandum.
Perwakilan Sel 2019;28 1362-1369.e4. doi:10.1016/j.celrep.2019.06.090.
[30] Hamada H, Liu Y, Nagira Y, Miki R, Taoka N, Imai R. Ekspresi CRISPR/Cas9 trans sien berbasis
pengiriman biolistik memungkinkan pengeditan genom tanaman dalam gandum. Perwakilan Sains
2018;8:14422. doi:10.1038/s41598-018-32714-6.
Machine Translated by Google
N. Wada, K. Osakabe dan Y. Osakabe
[31] Liu Y, Luo W, Linghu Q, Abe F, Hisano H, Sato K, Kamiya Y, Kawaura K, Onishi K, Endo M, Toki
S, Hamada H, Nagira Y, Taoka N, Imai R. Di planta pengeditan genom pada varietas gandum
komersial. Ilmu Pengetahuan Tanaman Depan 2021;12:648841. doi:10.3389/fpls.2021.648841.
[32] Sugano S, Hirose A, Kanazashi Y, Adachi K, Hibara M, Itoh T, Mikami M, Endo M, Hirose S,
Maruyama N, Abe J, Yamada T. Induksi simultan alel mutan dari dua gen alergen pada kedelai
dengan menggunakan mutagenesis terarah situs. Biol Pabrik BMC 2020;20:513. doi:10.1186/
s12870-020-02708-6.
[33] Nakajima I, Ban Y, Azuma A, Onoue N, Moriguchi T, Yamamoto T, Toki S, Endo M. CRISPR/Cas9-
mediated mutagenesis bertarget dalam anggur. PLoS SATU 2017;12:e0177966. doi:10.1371/
journal.pone.0177966.
[34] Osakabe Y, Liang Z, Ren C, Nishitani C, Osakabe K, Wada M, Komori S, Malnoy M, Velasco R,
Poli M, Jung MH, Koo OJ, Viola R, Kanchiswamy CN. CRISPR – Cas9- pengeditan genom yang
dimediasi pada apel dan selentingan. Protokol Nat 2018;13:2844–63. doi:10.1038/
s41596-018-0067-9.
[35] Nishitani C, Hirai N, Komori S, Wada M, Okada K, Osakabe K, Yamamoto T, Os akabe Y.
Pengeditan genom yang efisien di apel menggunakan sistem CRISPR/Cas9. Perwakilan Sains
2016;6:31481. doi:10.1038/srep31481.
[36] Omori M, Yamane H, Osakabe K, Osakabe Y, Tao R. Mutagenesis CENTRORADIALIS yang
ditargetkan menggunakan sistem CRISPR/Cas9 melalui peningkatan efisiensi transformasi
genetik blueberry highbush tetraploid. J Hortic Sci Bioteknologi 2021;96:153–61.
doi:10.1080/14620316.2020.1822760.
[37] Mutagenesis yang dimediasi Shibuya K, Watanabe K, Ono M. CRISPR/Cas9 dari lokus
EPHEMERAL1 yang mengatur penuaan kelopak bunga di pagi hari Jepang.
Biokimia Fisiol Tumbuhan 2018;131:53–7. doi:10.1016/j.plaphy.2018.04.036.
[38] Watanabe K, Oda-Yamamizo C, Sage-Ono K, Ohmiya A, Ono M. Perubahan warna bunga di
Ipomoea nil melalui mutagen esis pembelahan karotenoid dioksigenase yang dimediasi CRISPR/
Cas9 4. Transgenic Res 2018;27:25 –38. doi:10.1007/s11248-017-0051-0.
[39] Watanabe K, Kobayashi A, Endo M, Sage-Ono K, Toki S, Ono M. CRISPR/Cas9- mutagenesis
yang dimediasi dari lokus dihydroflavonol-4-reductase-B (DFR-B) di Morning Glory Jepang
Ipomoea (Farbitis) nihil. Perwakilan Sains 2017;7:10028. doi:10.1038/s41598-017-10715-1.
[40] Kishi-Kaboshi M, Aida R, Sasaki K. Generasi Chrysanthemum mori folium yang diedit gen
menggunakan transgen multi-salinan sebagai target dan penanda. Fisiol Sel Tumbuhan
2017;58:216–26. doi:10.1093/pcp/pcw222.
[41] Nanasato Y, Mikami M, Futamura N, Endo M, Nishiguchi M, Ohmiya Y, Konagaya K, Taniguchi T.
CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis bertarget pada pohon cedar Jepang (Cryptomeria japonica
D. Don). Perwakilan Sains 2021;11:16186. doi:10.1038/s41598-021-95547-w.
[42] Kusano H, Ohnuma M, Mutsuro-Aoki H, Asahi T, Ichinosawa D, Onodera H, Asano K, Noda T,
Horie T, Fukumoto K, Kihira M, Teramura H, Yazaki K, Umemoto N, Muranaka T, Shimada H.
Pembentukan sistem CRISPR/Cas9 yang dimodifikasi dengan peningkatan frekuensi mutagenesis
menggunakan penambah translasi dMac3 dan beberapa RNA pemandu dalam kentang.
Perwakilan Sains 2018;8:13753. doi:10.1038/s41598-018-32049-2.
[43] Wada N, Miyaji T, Abe-Hara C, Osakabe K, Osakabe Y. Alat CRISPR/Cas9 untuk pengeditan
genom multiplex pada tanaman. Masuk: Zhao K, Mishra R, Joshi RK, editor. Teknologi pengeditan
genom untuk peningkatan hasil panen. Singapura: Springer Nature Singapura; 2022. hal. 95–
107. doi:10.1007/978-981-19-0600-8_4.
[44] Gasparini K, dos R Moreira J, Peres LEP, Zsögön A. Domestikasi spesies liar secara de novo untuk
menciptakan tanaman dengan peningkatan ketahanan dan nilai gizi. Biol Tanaman Opin Saat Ini
2021;60:102006. doi:10.1016/j.pbi.2021.102006.
[45] Miki D, Zhang W, Zeng W, Feng Z, Zhu JK. Pengumpulan tar gen yang dimediasi CRISPR/Cas9
di Arabidopsis menggunakan transformasi sekuensial. Nat Commun 2018;9:1967. doi:10.1038/
s41467-018-04416-0.
[46] Wada N, Osakabe K, Osakabe Y. Memperluas kotak peralatan pengeditan genom tanaman dengan
sistem CRISPR – Cas yang baru dikembangkan. Fisiol Tumbuhan 2022;188:1825–37. doi:10.1093/
plphys/kiac027.
[47] Kaya H, Ishibashi K, Toki S. Split staphylococcus aureus Cas9 sebagai alat pengeditan genom
kompak pada tanaman. Fisiol Tumbuhan dan Sel 2017;58:643–9. doi:10.1093/pcp/pcx034.
[48] Nishimasu H, Shi X, Ishiguro S, Gao L, Hirano S, Okazaki S, Noda T, Abudayyeh OO, Gootenberg
JS, Mori H, Oura S, Holmes B, Tanaka M, Seki M, Hirano H, Aburatani H , Ishitani R, Ikawa M,
Yachie N, Zhang F, Nureki O. Merekayasa senjata nuklir CRISPR-Cas9 dengan ruang penargetan
yang diperluas. Sains 2018;361:1259–62. doi:10.1126/sci ence.aas9129.
[49] Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletzbich ler P, Volz
SE, Joung J, van der Oost J, Regev A, Koonin EV, Zhang F. Cpf1 adalah endonuklease
berpemandu RNA tunggal dari sistem CRISPR-Cas kelas 2. Sel 2015;163:759–71. doi:10.1016/
j.cell.2015.09.038.
[50] Endo A, Masafumi M, Kaya H, Toki S. Mutagenesis genom padi dan tembakau yang ditargetkan
secara efisien menggunakan Cpf1 dari Francisella novicida. Perwakilan Sains 2016;6:38169.
doi:10.1038/srep38169.
[51] Negishi K, Mikami M, Toki S, Endo M. Peningkatan mu tagenesis target yang dimediasi FnCas12a
menggunakan crRNA dengan panjang target yang diubah pada beras. Editor Genom Depan
2020;2:608563. doi:10.3389/fgeed.2020.608563.
[52] Osakabe K, Wada N, Miyaji T, Murakami E, Marui K, Ueta R, Hashimoto R, Abe Hara C, Kong B,
Yano K, Osakabe Y. Pengeditan genom pada tanaman menggunakan CRISPR type ID nuclease.
Biol Komunitas 2020;3:648. doi:10.1038/s42003-020-01366-6.
[53] Osakabe K, Wada N, Murakami E, Miyashita N, Osakabe Y. Pengeditan genom dalam sel mamalia
menggunakan nuklease ID tipe CRISPR. Asam Nukleat Res 2021;49:6347– 63. doi:10.1093/nar/
gkab348.
[54] Cameron P, Coons MM, Klompe SE, Lied AM, Smith SC, Vidal B, Donohoue PD, Rotstein T, Kohrs
BW, Nyer DB, Kennedy R, Banh LM, Williams C, Toh MS, Irby MJ,
7
Pengeditan Gen dan Genom 3–4 (2022) 100020
Edwards LS, Lin CH, Owen ALG, Künne T, van der Oost J, Brouns SJJ, Slorach EM, Fuller CK,
Gradia S, Kanner SB, May AP, Sternberg SH. Memanfaatkan sistem CRISPR– Cas tipe I untuk
rekayasa genom dalam sel manusia. Nat Bioteknologi 2019;37:1471–7. doi:10.1038/
s41587-019-0310-0.
[55] Dolan AE, Hou Z, Xiao Y, Gramelspacher MJ, Heo J, Howden SE, Freddolino PL, Ke A, Zhang Y.
Memperkenalkan spektrum penghapusan genom jangka panjang pada sel induk embrio manusia
menggunakan CRISPR- tipe I Kas. Sel Mol 2019;74 936-950.e5. doi:10.1016/j.molcel.2019.03.014.
[56] Morisaka H, Yoshimi K, Okuzaki Y, Gee P, Kunihiro Y, Sonpho E, Xu H, Sasakawa N, Naito Y,
Nakada S, Yamamoto T, Sano S, Hotta A, Takeda J, Mashimo T. CRISPR Cas3 menginduksi
pengeditan genom yang luas dan searah dalam sel manusia. Nat Commun 2019;10:5302.
doi:10.1038/s41467-019-13226-x.
[57] Tan R, Krueger RK, Gramelspacher MJ, Zhou X, Xiao Y, Ke A, Hou Z, Zhang Y. Cas11
memungkinkan rekayasa genom dalam sel manusia dengan sistem CRISPR-Cas3 yang ringkas.
Sel Mol 2022;82 852-867.e5. doi:10.1016/j.molcel.2021.12.032.
[58] Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, Packer MS, Badran AH, Bryson DI, Liu DR. Pengeditan basa
A•T ke G•C yang dapat diprogram dalam DNA genom tanpa pembelahan DNA. Alam
2017;551:464–71. doi:10.1038/nature24644.
[59] Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA, Liu DR. Pengeditan basis target dalam DNA genom yang
dapat diprogram tanpa pembelahan DNA beruntai ganda. Alam 2016;533:420–4. doi:10.1038/
nature17946.
[60] Nishida K, Arazoe T, Yachie N, Banno S, Kakimoto M, Tabata M, Mochizuki M, Miyabe A, Araki M,
Hara KY, Shimatani Z, Kondo A. Pengeditan nukleotida yang ditargetkan menggunakan imun
adaptif prokariotik hibrida dan vertebrata sistem. Sains 2016;353:aaf8729. doi:10.1126/
science.aaf8729.
[61] Shimatani Z, Kashojiya S, Takayama M, Terada R, Arazoe T, Ishii H, Teramura H, Ya mamoto T,
Komatsu H, Miura K, Ezura H, Nishida K, Ariizumi T, Kondo A. Pengeditan dasar yang ditargetkan
di nasi dan tomat menggunakan fusi CRISPR-Cas9 cytidine deaminase. Nat Bioteknologi
2017;35:441–3. doi:10.1038/nbt.3833.
[62] Hunziker J, Nishida K, Kondo A, Kishimoto S, Ariizumi T, Ezura H. Substitusi multi gen dengan
teknologi pengeditan dasar Target-AID pada tomat. Perwakilan Sains 2020;10:20471. doi:10.1038/
s41598-020-77379-2.
[63] Kashojiya S, Lu Y, Takayama M, Komatsu H, Minh LHT, Nishida K, Shirasawa K, Miura K, Nonaka
S, Masuda J, Kondo A, Ezura H, Ariizumi T. Modifikasi sifat pemuliaan tomat dan hormon tanaman
sinyal oleh Target-AID, sistem pengeditan genom yang menginduksi substitusi nukleotida yang
efisien. Hort Res 2022;9:uhab004. doi:10.1093/jam/uhab004.
[64] Negishi K, Kaya H, Abe K, Hara N, Saika H, Toki S. Editor basis adenin dengan cakupan penargetan
yang diperluas menggunakan SpCas9-NG v1 pada beras. Bioteknologi Tanaman J 2019;17:1476–
8. doi:10.1111/pbi.13120.
[65] Anzalone AV, Randolph PB, Davis JR, Sousa AA, Koblan LW, Levy JM, Chen PJ, Wilson C, Newby
GA, Raguram A, Liu DR. Pengeditan genom pencarian dan penggantian tanpa pemutusan untai
ganda atau DNA donor. Alam 2019;576:149–57. doi:10.1038/s41586-019-1711-4.
[66] Li Y, Li W, Li J. Revolusi CRISPR/Cas9 berlanjut: dari penyuntingan dasar hingga penyuntingan
utama dalam ilmu tanaman. J Genet Genom 2021;48:661–70. doi:10.1016/j.jgg.2021.05.001.
[67] Maher MF, Nasti RA, Vollbrecht M, Starker CG, Clark MD, Voytas DF. Pengeditan gen tanaman
melalui induksi meristem de novo. Nat Bioteknologi 2020;38:84–9. doi:10.1038/s41587-019-0337-2.
[68] Nagahara S, Higashiyama T, Mizuta Y. Deteksi pengiriman biolistik penanda fluoresen dan
CRISPR/Cas9 ke tabung serbuk sari. Reproduksi Tanaman 2021;34:191–205. doi:10.1007/
s00497-021-00418-z.
[69] Sakuma T, Ochiai H, Kaneko T, Mashimo T, Tokumasu D, Sakane Y, Suzuki K, Miyamoto T,
Sakamoto N, Matsuura S, Yamamoto T. Pola berulang variasi non-RVD dalam modul pengikatan
DNA meningkatkan TALEN aktivitas. Perwakilan Sains 2013;3:3379. doi:10.1038/srep03379.
[70] Kusano H, Onodera H, Kihira M, Aoki H, Matsuzaki H, Shimada H. Sistem konstruksi gen TALEN
berbantuan gerbang sederhana untuk pengeditan genom tanaman. Perwakilan Sains
2016;6:30234. doi:10.1038/srep30234.
[71] Yasumoto S, Umemoto N, Lee HJ, Nakayasu M, Sawai S, Sakuma T, Yamamoto T, Mizutani M,
Saito K, Muranaka T. Rekayasa genom yang efisien menggunakan platinum TALEN dalam
kentang. Bioteknologi Tanaman 2019;36:167–73. doi:10.5511/plantbiotechnol ogy.19.0805a.
[72] Shinoyama H, Ichikawa H, Nishizawa-Yokoi A, Skaptsov M, Toki S. KO gen DMC1 krisan yang
dimediasi TALEN secara simultan memberikan kemandulan pria dan wanita. Perwakilan Sains
2020;10:16165. doi:10.1038/s41598-020-72356-1.
[73] Kang BC, Bae SJ, Lee S, Lee JS, Kim A, Lee H, Baek G, Seo H, Kim J, Kim JS.
Pengeditan DNA kloroplas dan mitokondria pada tumbuhan. Tanaman Nat 2021;7:899–905.
doi:10.1038/s41477-021-00943-9.
[74] Nakazato I, Okuno M, Yamamoto H, Tamura Y, Itoh T, Shikanai T, Takanashi H, Tsutsumi N,
Arimura S. Pengeditan basis yang ditargetkan dalam genom plastid Arabidopsis thaliana.
Tanaman Nat 2021;7:906–13. doi:10.1038/s41477-021-00954-6.
[75] Nakazato I, Okuno M, Zhou C, Itoh T, Tsutsumi N, Takenaka M, Arimura S. Pengeditan basis yang
ditargetkan dalam genom mitokondria Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci AS
2022;119:e2121177119. doi:10.1073/pnas.2121177119.
[76] Yuan S, Kawasaki S, Abdellatif IMY, Nishida K, Kondo A, Ariizumi T, Ezura H, Miura K. Pengeditan
basa yang efisien dalam tomat menggunakan sistem transien yang sangat nyata.
Perwakilan Sel Tumbuhan 2021;40:667–76. doi:10.1007/s00299-021-02662-z.
[77] Yasumoto S, Sawai S, Lee HJ, Mizutani M, Saito K, Umemoto N, Muranaka T.
Pengeditan genom yang ditargetkan pada kentang tetraploid melalui ekspresi TALEN sementara
oleh infeksi Agrobacterium . Bioteknologi Tanaman 2020;37:205–11. doi:10.5511/bioteknologi
tanaman.20.0525a.
[78] Ariga H, Toki S, Ishibashi K. Pengeditan genom bebas DNA yang dimediasi vektor virus kentang
X pada tanaman. Fisiol Sel Tumbuhan 2020;61:1946–53. doi:10.1093/pcp/pcaa123.
Machine Translated by Google
N. Wada, K. Osakabe dan Y. Osakabe
[79] Chujo T, Yoshikawa M, Ariga H, Endo M, Toki S, Ishibashi K. Vektor virus yang dapat
dihilangkan yang cocok untuk pengeditan genom tanaman. Pabrik J 2017;91:558–61.
doi:10.1111/tpj.13581.
[80] Abdou AM, Higashiguchi S, Horie K, Kim M, Hatta H, Yokogoshi H. Relaksasi dan
efek peningkatan kekebalan dari pemberian asam -Aminobutyric (GABA) di
manusia. BioFactors 2006;26:201–8. doi:10.1002/biof.5520260305.
[81] Inoue K, Shirai T, Ochiai H, Kasao M, Hayakawa K, Kimura M, San sawa H. Efek penurun
tekanan darah dari susu fermentasi baru yang mengandung -
asam aminobutyric (GABA) pada hipertensi ringan. Eur J Clin Nutr 2003;57:490–5.
doi:10.1038/sj.ejcn.1601555.
[82] Takayama M, Ezura H. Bagaimana dan mengapa tomat menumpuk dalam jumlah besar
GABA dalam buah? Ilmu Tanaman Depan 2015;6. doi:10.3389/fpls.2015.00612.
[83] Tomat yang diperkaya Waltz E. GABA adalah makanan hasil editan CRISPR pertama yang memasuki pasar. Nat
Bioteknologi 2022;40:9–11. doi:10.1038/d41587-021-00026-2.
[84] Walton RT, Christie KA, Whittaker MN, Kleinstiver BP. Tar genom yang tidak dibatasi
diperoleh dengan varian CRISPR-Cas9 yang direkayasa hampir tanpa PAM. Sains 2020;368:290–
6. doi:10.1126/science.aba8853.
Pengeditan Gen dan Genom 3–4 (2022) 100020
[85] Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S, Joung J, Slaymaker IM, Cox DBT,
Shmakov S, Makarova KS, Semenova E, Minakhin L, Severinov K, Regev A, Lan der ES,
Koonin EV, Zhang F. C2c2 adalah efektor CRISPR penargetan RNA yang dipandu RNA
satu komponen yang dapat diprogram. Sains 2016;353:aaf5573. doi:10.1126/sci
ence.aaf5573.
[86] Cox DBT, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Franklin B, Kellner MJ, Joung J, Zhang F.
Pengeditan RNA dengan CRISPR-Cas13. Sains 2017;358:1019–27. doi:10.1126/sci
ence.aaq0180.
[87] Özcan A, Krajeski R, Ioannidi E, Lee B, Gardner A, Makarova KS,
Koonin EV, Abudayyeh OO, Gootenberg JS. Penargetan RNA yang dapat diprogram
dengan efektor CRISPR protein tunggal Cas7-11. Alam 2021;597:720–5.
doi:10.1038/s41586-021-03886-5.
[88] van Beljouw SPB, Haagsma AC, Rodríguez-Molina A, van den Berg DF, Vink JNA,
Brouns SJJ. Efektor gRAMP CRISPR-Cas adalah endonuklease RNA yang dikomplekskan
dengan peptidase mirip caspase. Sains 2021;373:1349–53. doi:10.1126/sci ence.abk2718.