Koordinasi Temporal Metabolisme Karbohidrat selama Reproduksi Nyamuk

Abstrak

Nyamuk hematofag berfungsi sebagai vektor berbagai penyakit manusia yang

menghancurkan, dan banyak fitur fisiologis unik berkontribusi pada keberhasilan evolusi
yang luar biasa dari serangga ini. Fungsi-fungsi ini menempatkan tuntutan energi tinggi pada
nyamuk betina yang sedang bereproduksi, dan metabolisme karbohidrat (CM) harus
disinkronkan dengan kebutuhan ini. Analisis fungsional profil gen metabolik menunjukkan
bahwa jalur CM utama, termasuk glikolisis, metabolisme glikogen dan gula, dan siklus sitrat,
ditekan secara dramatis pada tahap pasca eclosion = adalah Munculnya serangga dewasa dari
kantung pupa atau, yang lebih jarang, penetasan telur (PE) dalam tubuh lemak nyamuk diikuti
oleh peningkatan tajam pada pasca makan darah (PBM) tahap, yang juga diverifikasi oleh
Real-time RT-PCR. Konsisten dengan perubahan transkrip dan tingkat protein gen CM,
tingkat glikogen, glukosa dan trehalosa dan metabolit sekunder lainnya juga secara berkala
terakumulasi dan terdegradasi selama siklus reproduksi masing-masing. Tingkat
triasilgliserol (TAG), yang mewakili bentuk penyimpanan energi penting lainnya dalam
tubuh lemak nyamuk, mengikuti kecenderungan yang sama. Di sisi lain, ATP, yang
dihasilkan oleh katabolisme metabolit sekunder ini, menunjukkan tren yang berlawanan.
Selain itu, kami menggunakan studi interferensi RNA untuk hormon remaja dan reseptor
ecdysone, Met dan EcR, ditambah dengan transkriptomik dan analisis metabolomik untuk
menunjukkan bahwa reseptor hormon ini berfungsi sebagai sakelar pengatur utama yang
mengoordinasikan CM dengan kebutuhan energi yang berbeda dari nyamuk betina selama
reproduksinya. siklus. Studi kami menunjukkan bagaimana, dengan pemrograman ulang
metabolik, organisme multiseluler beradaptasi dengan perubahan fungsional yang drastis dan
cepat.

Ringkasan Penulis

Nyamuk menularkan banyak penyakit manusia yang menghancurkan karena hematophagy

wajib mereka yang diperlukan untuk reproduksi yang efisien. Metabolisme harus
disinkronkan dengan kebutuhan energi tinggi nyamuk betina untuk mencari inang, makan
darah dan perkembangan telur yang cepat. Setiap siklus reproduksi dibagi menjadi dua fase
yang secara berurutan diatur oleh hormon juvenil (JH) dan 20-hidroksiekdison. Selama fase
makan pra-darah, reseptor JH Methoprene-toleran (Met) mengontrol jalur metabolisme
karbohidrat (CM) dan pembungkaman interferensi RNA (RNAi) menyebabkan peningkatan
regulasi enzim CM pada transkrip dan tingkat protein yang mengaktifkan fluks glikolitik dan
penipisan penyimpanan dan sirkulasi gula. Selama fase kedua, setelah makan darah, CM
diatur oleh reseptor ecdysone EcR dan pembungkaman RNAi-nya memiliki efek dramatis
yang berlawanan dengan Met RNAi. Dengan demikian, kami menunjukkan bahwa Met dan
EcR berfungsi sebagai sakelar pengatur yang mengoordinasikan metabolisme karbohidrat
dengan kebutuhan energik dari siklus reproduksi nyamuk betina.

Pendahuluan

Kemampuan organisme multiseluler untuk mempertahankan homeostasis metabolik

dan menanggapi perubahan kebutuhan energi selama perkembangan, reproduksi dan stres
merupakan adaptasi penting yang penting untuk kelangsungan hidup dan keberhasilan
evolusi. Dengan demikian, penting untuk menguraikan mekanisme pengaturan yang
mengoordinasikan jalur metabolisme; memahami mekanisme ini dalam organisme yang
menghadapi tuntutan energi yang ekstrem dan berfluktuasi sangat berharga.
Nyamuk betina yang merupakan penghisap darah wajib berperan sebagai vektor
penyakit [1]. Patogen, mengambil keuntungan dari ketergantungan darah ini, menggunakan
nyamuk sebagai vektor yang menyebarkan penyakit serius pada manusia. Meskipun upaya
dan kemajuan terus-menerus dalam pengendalian serangga, nyamuk menimbulkan ancaman
besar, membunuh lebih dari satu juta orang setiap tahun. Situasi ini diperparah oleh
kurangnya vaksin yang efektif, resistensi insektisida yang tumbuh cepat, kompleksitas sosial
dan perubahan ekologi [2]. Pemahaman rinci tentang biologi reproduksi nyamuk dapat
memberikan informasi penting untuk membawa kita selangkah lebih dekat ke strategi
pengendalian vektor yang lebih efektif.
Nyamuk hematofag memiliki banyak fitur fisiologis berbeda yang memainkan peran
penting dalam adaptasi lingkungan yang menakjubkan dari serangga vektor penyakit ini. Ini
termasuk sistem reseptor bau yang kuat, perilaku mencari inang yang sangat efisien, adaptasi
untuk makan darah dan pencernaan, kemampuan untuk mengeluarkan zat terlarut dalam
jumlah besar, dan perkembangan telur yang cepat [3]. Hematofag memberikan tuntutan
energi yang sangat tinggi pada nyamuk betina pada tahap yang berbeda sepanjang siklus
reproduksinya. Oleh karena itu, jalur metabolisme harus diselaraskan dengan kebutuhan
energi nyamuk betina yang sedang bereproduksi. Namun, mekanisme pengaturan yang
mengatur koordinasi temporal metabolisme pada tingkat molekuler belum dipahami dengan
baik pada nyamuk.
Setiap siklus reproduksi nyamuk betina dibagi menjadi dua fase, yang diatur oleh titer
bergantian dari dua hormon serangga utama—hormon juvenil seskuiterpenoid (JH) dan
hormon steroid 20-hidroksiekdison (20E). JH memandu perkembangan nyamuk betina dari
eclosion dewasa dari kepompong hingga menghisap darah. Selama fase pasca eclosion (PE)
terkontrol JH ini, yang berlangsung 3-5 hari, nyamuk betina matang dan mempersiapkan diri
untuk peristiwa yang terkait dengan pemberian darah berikutnya, sambil secara aktif mencari
inang.
Menelan darah menyebabkan peristiwa dramatis pada nyamuk betina, termasuk
pencernaan makanan besar, ekskresi kuat, ekspresi gen tingkat tinggi dan pematangan telur
yang cepat. Selama fase pasca makan darah (PBM) ini, nyamuk betina menghadapi tingkat
aktivitas metabolisme yang intens. 20E adalah pengatur utama fase PBM dari siklus
reproduksi nyamuk betina, dan aksinya dimediasi oleh reseptor nuklir, Reseptor Ecdysone
(EcR) [4]. Tubuh lemak nyamuk berfungsi sebagai organ sensor nutrisi, mendeteksi nutrisi
yang berasal dari makanan darah dan nutrisi yang berasal dari darah digunakan untuk
produksi YPP dalam sel tubuh lemak [1]
Dalam penelitian ini, kami menyelidiki apakah dua regulator utama dari siklus
reproduksi nyamuk betina, JH dan 20E, terlibat dalam koordinasi temporal CM sepanjang
siklus reproduksi nyamuk betina. Hasil kami menunjukkan bahwa reseptor JH, Met, dan EcR
menyinkronkan CM dengan kebutuhan energi nyamuk betina yang bereproduksi.
Menguraikan mekanisme regulasi yang mengatur nyamuk CM telah menjelaskan adaptasi
organisme yang menghadapi stres energik yang intens.

Hasil

Dinamika ekspresi gen metabolisme karbohidrat sepanjang siklus reproduksi nyamuk betina

Kami mengkarakterisasi transkrip kelimpahan gen yang mengkode enzim CM dalam

tubuh lemak nyamuk Aedes aegypti betina sepanjang siklus reproduksi pertama. Untuk
analisis ini, kami menggunakan transkriptom microarray tubuh lemak kursus dua kali yang
mencakup seluruh siklus gonadotrofik pertama; satu yang mencakup delapan titik waktu dari
6 jam hingga 72 jam PE, dan yang kedua mencakup sembilan titik waktu dari 3 jam hingga
72 jam PBM (Tabel S1 dan S2). Kedua transkriptom diperoleh dari chip microarray Agilent
custom-made yang berisi set probe yang sesuai dengan 15.321 gen dalam genom A. aegypti
[5]. Set DEG selama PBM dihitung dengan membandingkan transkrip dari masing-masing
dari sembilan titik waktu dengan yang pada 72 jam PE menggunakan kriteria penyaringan
yang sama dengan gen PE [5]. Transkrip gen CM berlimpah selama PE 24 jam pertama,
sementara kemudian, pada PE 72 jam, ada penurunan yang cukup besar dalam levelnya
(Gambar 1 dan Gambar S1A). Setelah makan darah, sebagian besar gen CM menunjukkan
peningkatan regulasi yang signifikan yang mencapai ekspresi maksimalnya pada 36 jam
PBM, turun kembali ke level PE awal pada 72 jam PBM (Gambar 1 dan S1A Gambar).
Secara keseluruhan, gelombang kedua aktivitas gen CM selama fase PBM jauh lebih tinggi
daripada yang pertama selama fase PE. Gen yang mengkode metabolisme glikogen/gula (10
dari 17 gen pengkode enzim) dan glikolisis (13 dari 28 gen pengkode enzim) menunjukkan
fluktuasi yang sangat menonjol dalam tingkat ekspresinya (Gambar 1 dan S1B dan S1C
Gambar). Gen yang mengkode siklus sitrat menunjukkan tren yang sama, tetapi pada tingkat
yang lebih rendah (Gambar 1).
Untuk mengotentikasi hasil analisis microarray kami, tingkat transkrip gen yang
mengkode enzim kunci jalur CM dalam sampel tubuh lemak ditentukan menggunakan PCR
(qPCR) real-time (Gambar 2A dan S2 Gambar). Sesuai dengan data microarray, transkrip gen
glikogen fosforilase (GLY) yang mengkode enzim pendegradasi glikogen utama tinggi pada
awal fase PE, tetapi ekspresinya pada 72 jam PE berkurang secara dramatis (Gambar 2A).
Hal ini berlawanan dengan penurunan kecil pada level mRNA dari gen yang mengkode
enzim yang terlibat dalam biosintesis glikogen—glikogen sintase (GYS) (S2 Gambar).
Dinamika gen ini menunjukkan dominasi akumulasi glikogen selama fase PE. Selama fase
PBM, transkrip GLY sangat meningkat pada 36 jam PBM (Gambar 2A), sedangkan transkrip
gen GYS hanya menunjukkan peningkatan sedang, menunjukkan tren yang berlawanan
dengan PE dalam pemanfaatan cadangan gula selama tahap PBM (S2 Gambar ). Transkrip
gen yang mengkode enzim untuk metabolisme trehalosa, trehalosa-6-fosfat (TPS) dan
trehalosa-6-fosfatase (TPP) dan trehalase (TREA) (Gambar 2A dan S2 Gambar), enzim yang
bertanggung jawab untuk mengubah glukosa menjadi trehalosa, menurun selama fase PE.
Selama PBM, masing-masing dari ketiga gen ini memiliki puncak ekspresi yang dramatis
pada 36 jam PBM (Gambar 2A dan S2 Gambar). Tingkat transkrip dari sembilan gen
glikolitik, ditentukan menggunakan qPCR, sesuai dengan data microarray yang menunjukkan
ekspresi PE dan PBM diferensial dari gen-gen ini (Gambar 2A dan S2 Gambar). Analisis
kami mencakup tiga gen yang mengkode enzim pembatas laju glikolisis—heksokinase
(HEX), fosfofruktokinase (PFK), piruvat kinase (PYK) (Gambar 2A dan S2 Gambar).
Meskipun mereka mengikuti tren ekspresi yang sama selama siklus reproduksi nyamuk,
tingkat ekspresi relatif mereka berbeda secara signifikan (Gambar 1). PYK mengkatalisis
langkah ireversibel glikolitik akhir menghasilkan piruvat dan ATP [6]. Menariknya, PYK.

Gambar 1. Peta panas mewakili pola ekspresi gen CM berbasis microarray. Kandidat dengan
perubahan lipatan lebih besar dari 1,75 (0,8 dalam skala log2) dan tingkat penemuan palsu
(nilai p) kurang dari 0,01 disertakan. Titik waktu ekspresi gen dalam fase PE dan PBM
dinormalisasi masing-masing menjadi 6 jam PE dan 72 jam PE. Empat corak warna di
sebelah kiri mewakili jalur CM yang berbeda: merah, metabolisme glikogen/gula; hijau,
glikolisis; ungu, siklus sitrat; dan biru, jalur pentosa fosfat. Dendogram masing-masing yang
dihasilkan oleh pengelompokan hierarki gen dari setiap jalur juga disediakan.
ekspresi gen sangat meningkat selama siklus gonadotrofik nyamuk, terutama selama tahap
PBM ketika transkripnya meningkat lebih dari 200 kali lipat, sementara transkrip PFK
meningkat lebih dari 125 kali lipat (Gambar 2A). Ini menunjukkan percepatan dramatis fluks
glikolitik setelah pemberian darah. Laktat dehidrogenase (LDH) adalah enzim yang
mengkatalisis konversi piruvat menjadi laktat, dan reaksi ini memasok NAD+ [7].
Khususnya, ada peningkatan 12 kali lipat pada tingkat transkrip gen LDH oleh PBM 6 jam,
menunjukkan peningkatan drastis dalam pembentukan laktat segera setelah makan darah
(Gambar 2A).

Gambar 2. Dinamika ekspresi gen CM pada tubuh gemuk nyamuk betina dewasa. (A) analisis
qPCR dari gen CM terpilih selama PE dan PBM. Kelimpahan relatif titik waktu PE dan PBM
dinormalisasi ke PE 0-6 jam dan PE 72 jam, masing-masing. Dalam grafik, kelimpahan dua
titik waktu ini direpresentasikan sebagai 1,0, dengan penyesuaian yang sesuai untuk titik
waktu lainnya. Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga, dengan hasil yang serupa.
Bilah kesalahan mewakili ± SD. * p < 0,05;** p < 0,01. Gen CM tambahan ditunjukkan pada
S2 Gambar (B) Western blot yang menunjukkan tingkat protein tubuh lemak dari enzim CM
kunci selama PE dan PBM. Ekstrak protein total dibuat dari delapan tubuh lemak wanita
dewasa untuk setiap titik waktu yang ditunjukkan. Aktin digunakan sebagai kontrol untuk
memuat dan mentransfer

Perubahan kadar protein enzim CM selama siklus reproduksi nyamuk

Menggunakan antibodi yang mengenali masing-masing enzim Aedes CM pada

tingkat protein (Tabel S3), kami melakukan analisis western blot sampel dari 6 jam, 24 jam,
72 jam PE dan 6 jam, 36 jam, 72 jam titik waktu pengembangan PBM. Tingkat protein untuk
enzim yang menggunakan glikogen utama, GLY, dan dua enzim glikolitik utama, PGM dan
PYK, tinggi hingga 24 jam PE, setelah itu terjadi penurunan, pada 72 jam PE. Selama periode
PBM, ketiga protein berlimpah pada 36 jam (Gambar 2B). HEX, enzim yang mengkatalisis
langkah pertama dalam glikolisis, mengubah glukosa menjadi glukosa-1-P, menunjukkan
akumulasi yang lemah pada 72 jam PE dalam tubuh lemak nyamuk betina. Namun, protein
HEX ini dapat dideteksi pada tingkat yang jauh lebih tinggi pada 36 jam PBM. Tingkat
protein dari keempat enzim yang diuji menurun selama fase PBM akhir (72 jam PBM)
(Gambar 2B). Secara keseluruhan, western blot kami menunjukkan bahwa kadar protein
glikolisis dan enzim metabolisme glikogen / gula menunjukkan perubahan berkala sepanjang
siklus reproduksi nyamuk yang berkorelasi dengan kelimpahan transkrip gen masing-masing.

Tingkat penyimpanan dan sirkulasi gula dan triasilgliserol (TAG) selama siklus gonadotrofik
nyamuk betina

Untuk mengetahui apakah cadangan gula berkorelasi dengan tingkat fluktuasi enzim
CM pada tingkat gen dan protein dalam tubuh lemak nyamuk betina, kami melakukan
pengukuran kuantitatif menyeluruh dari penyimpanan dan gula yang beredar selama siklus
reproduksi nyamuk betina.
Pada nyamuk betina yang baru menutup diri, tingkat glikogen relatif rendah tetapi
meningkat secara signifikan pada PE 24 jam (sekitar 150% dari PE 6 jam) dan dipertahankan
pada tingkat yang sama selama fase perkembangan PE lainnya (Gambar 3A). Makan darah,
bagaimanapun, memicu penipisan glikogen dan pada 24 jam PBM levelnya turun menjadi
sekitar setengah dari nyamuk fase PE akhir. Tingkat glikogen meningkat 72 jam PBM, tetapi
masih lebih rendah dari nyamuk PE 72 jam (Gambar 3A). Untuk memvisualisasikan
kandungan glikogen in situ, kami menggunakan pewarnaan Periodic acid/Schiff (PAS) dari
tubuh lemak nyamuk dewasa betina tetap. Kandungan glikogen berada pada tingkat yang
dapat dideteksi pada PE 6 jam. Konsisten dengan pengukuran kolorimetri glikogen kami, ada
peningkatan signifikan dalam sinyal positif PAS dalam tubuh lemak PE 24 jam. Namun,
menggunakan metode pewarnaan ini, tingkat glikogen tertinggi diamati pada 72 jam PE
(Gambar 3A). Berkorelasi baik dengan pengukuran kadar glikogen, pewarnaan PAS
menunjukkan bahwa kandungan glikogen lebih sedikit pada PBM 6 jam daripada pada PE 72
jam. Pewarnaan juga mengungkapkan bahwa kadar glikogen meningkat secara moderat dari 6
jam menjadi 72 jam PBM dalam tubuh lemak (Gambar 3A).
Kami kemudian mengukur kadar gula yang bersirkulasi menggunakan kromatografi
gas—spektrometri massa (GC-MS). Tingkat trehalosa meningkat selama fase PE, mencapai
maksimum pada 72-78 jam PE (sekitar 3 kali lipat peningkatan dibandingkan dengan 0-6 jam
PE) (Gbr 3B). Makan darah memicu penipisan trehalosa dan pada 24 jam PBM
konsentrasinya turun menjadi sekitar setengah dari nyamuk PE tahap akhir. Selama PBM
akhir, tingkat trehalosa meningkat dan kembali ke tingkat semula pada 72 jam PBM (Gbr
3B). Meskipun trehalosa adalah bentuk utama dari gula yang bersirkulasi pada serangga,
glukosa dan fruktosa berfungsi sebagai gula sirkulasi tambahan yang ditemukan di
hemolimfa [7,8]. Selama fase akhir PE, ada sekitar 10 dan 20 kali lipat peningkatan kadar
glukosa dan fruktosa, masing-masing (Gambar 3B). Pemberian darah menghasilkan
penurunan kadar kedua gula ini sampai 36 jam PBM, setelah itu dikembalikan kembali ke
tingkat PE sebesar 72 jam PBM (Gambar 3B).
Triasilgliserol (TAG) merupakan bentuk penyimpanan energi penting lainnya dalam
tubuh lemak nyamuk. Selama fase PE, perubahan tingkat TAG tertunda dibandingkan dengan
glikogen. Tingkat TAG relatif rendah dari 6 hingga 24 jam PE, tetapi meningkat 72 jam PE
(Gbr 3C).

Gambar 3. Tingkat penyimpanan dan sirkulasi gula, TAG dan ATP selama fase PE dan PBM.
(A) Tingkat glikogen endogen selama fase PE (panel atas) dan PBM (panel bawah).
Kandungan glikogen total nyamuk betina dewasa diukur secara kolorimetri (kiri; n = 6
sampel yang dikumpulkan secara independen per titik waktu, dengan enam nyamuk per
sampel). Kandungan glikogen tubuh lemak nyamuk betina juga divisualisasikan dengan
pewarnaan PAS (kanan). Hasil serupa diamati dalam dua percobaan independen tambahan.
(B) Kadar gula trehalosa (atas), glukosa (tengah) dan fruktosa (bawah) yang bersirkulasi
untuk PE dan PBM sebagaimana ditentukan melalui kromatografi gas—spektrometri massa
(GC-MS; n = 12 sampel yang dikumpulkan secara independen per titik waktu, dengan enam
nyamuk per sampel). (C) Tingkat TAG diukur selama fase PE (panel atas) dan PBM (panel
bawah) (n = 6 sampel yang dikumpulkan secara independen per titik waktu, dengan enam
nyamuk per sampel). (D) Konsentrasi ATP pada nyamuk betina selama fase PE (atas) dan
PBM (bawah) diukur menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC; n = 6 sampel
yang dikumpulkan secara independen per titik waktu, dengan enam nyamuk per sampel).
Jumlah glikogen (A, kiri), trehalosa, glukosa dan fruktosa (B), TAG (C), dan ATP (D)
dinormalisasi ke tingkat protein total. Tingkat metabolit pada PE 0-6 jam dan PE 72 jam
direpresentasikan sebagai 100, dengan penyesuaian relatif pada kadar gula dan ATP pada
titik waktu lain. Bilah kesalahan mewakili ± SD. * p < 0,05;** p < 0,01.

Selama fase PBM, tingkat TAG dalam tubuh lemak turun secara signifikan pada 6
jam PBM mencapai tingkat terendah dengan 72 jam PBM (Gbr 2C).
Adenosin trifosfat (ATP) berfungsi sebagai indikator utama konsumsi energi oleh
suatu organisme [7]. Untuk mengevaluasi pemanfaatan energi pada nyamuk betina sepanjang
siklus reproduksi, kami mengukur tingkat ATP menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi
(HPLC). Tingkat ATP tinggi pada nyamuk betina yang baru dikurung pada 6 jam PE,
menurun setelahnya, dan pada 72-78 jam PE tingkatnya hanya 50% dari nyamuk berumur 6
jam (Gambar 3D). Namun, tingkat ATP meningkat selama fase PBM, mencapai puncaknya
pada 48 jam PBM, yang lebih tinggi dari pada 72 jam PE (Gambar 3D).

Perubahan metabolit perantara selama siklus gonadotrofik nyamuk betina

Untuk memberikan wawasan lebih lanjut tentang dinamika CM dalam mereproduksi

nyamuk betina, kami menggunakan GC-MS untuk mengukur beberapa metabolit perantara
(IM) dari glikolisis dan siklus sitrat. Secara keseluruhan, analisis ini mengungkapkan bahwa
profil IM berkorelasi dengan enzim CM, masing-masing menunjukkan dua gelombang nyata
pada fase PE dan PBM (Gambar 4). Glukosa-6-fosfat mewakili IM kunci pertama dari jalur
glikolitik yang juga berfungsi sebagai prekursor untuk metabolisme glikogen/gula dan jalur
pentosa-fosfat. Selama fase PE, tingkat glukosa-6-fosfat berkurang 2 kali lipat dengan 72-78
jam (Gambar 4A). Metabolit ini juga menunjukkan penurunan yang signifikan pada levelnya
segera setelah makan darah, pada 6 jam PBM, dan levelnya tetap rendah selama fase PBM,
hanya meningkat pada 72 jam PBM (Gambar 4A). Tingkat IM glikolitik berikutnya, fruktosa-
6-fosfat, menunjukkan penurunan 2 kali lipat pada 72-78 jam PE, tetapi meningkat pada 6
jam PBM, mempertahankan tingkat tinggi selama sisa fase PBM (Gambar 4A) . Ada
penurunan dramatis dalam tingkat piruvat, produk terminal glikolisis selama fase PE. Namun,
lebih dari 100% peningkatan tingkat piruvat diamati pada 6 jam PBM, yang mencerminkan
peningkatan fluks glikolitik setelah asupan darah. Tingkat piruvat tetap tinggi sampai 36 jam
PBM, menurun setelahnya (Gambar 4A). Analisis data transkrip kami menunjukkan
penurunan tingkat mRNA dari gen yang mengkode LDH, enzim yang mengkatalisis
transformasi piruvat menjadi laktat, pada akhir periode PE (Gambar 1). Oleh karena itu,
pengukuran laktat GC-MS menunjukkan penurunan yang nyata pada tingkat PE akhir. Selain
itu, ada peningkatan tingkat laktat selama fase PBM sesuai dengan peningkatan ekspresi gen
ini (Gambar 4A).
Siklus sitrat adalah jalur kunci yang digunakan untuk produksi energi di semua
organisme aerobik. Piruvat berfungsi sebagai prekursor penting untuk siklus sitrat, dan
ketersediaannya bersama dengan tingkat aktivitas enzim siklus sitrat menentukan hasil akhir.
Yang terakhir dapat ditentukan dengan mengukur konsentrasi IM siklus sitrat. Analisis GC-
MS mengungkapkan perbedaan yang cukup besar dalam profil PE dan PBM dari siklus sitrat
IM, yang mencerminkan kebutuhan energi yang kontras dari nyamuk betina selama dua fase
siklus reproduksi ini (Gambar 4B). Tingkat sitrat, IM pertama dari siklus sitrat, menunjukkan
penurunan yang signifikan selama fase PE, sementara itu sangat meningkat pada 6 jam PBM.
Suksinat dan fumarat menunjukkan fluktuasi yang lebih moderat. Malat, bagaimanapun,
memiliki profil PE dan PBM yang mirip dengan sitrat (Gambar 4B).

Reseptor JH, Met, berfungsi sebagai sakelar pengatur CM selama fase PE

Untuk menyelidiki peran JH dalam regulasi CM selama fase PE, kami menerapkan JH
III secara topikal ke nyamuk betina yang baru dikurung dan menyelidiki efek dari perawatan
ini 20 jam kemudian . Penerapan JHIII menyebabkan penurunan prematur dalam kelimpahan
transkrip gen CM (S3AGambar). Pada saat yang sama, ada peningkatan yang signifikan
dalam kadar glikogen dan glukosa dibandingkan dengan nyamuk kontrol yang tidak diberi
perlakuan (Gambar S3B).
Data kami sebelumnya menunjukkan bahwa reseptor JH Met memainkan peran
sentral dalam mengatur ekspresi gen yang dimediasi JH dalam tubuh lemak nyamuk betina
PE [5]. Met silencing telah terbukti menghambat pertumbuhan folikel ovarium serta
mengakibatkan pengurangan jumlah telur [5,9]. Kami memeriksa transkriptom yang
diperoleh dari tubuh lemak betina yang kekurangan RNAi Met dan menganalisis respons gen
CM. Transkrip gen CM diperkaya di antara kohort gen yang diregulasi dari transkriptom iMet
(S4A Gambar). Transkrip gen yang termasuk dalam metabolisme glikogen/gula dan glikolisis
secara khusus diregulasi, sedangkan transkrip dari siklus sitrat meningkat secara signifikan ke
tingkat yang lebih rendah (Gambar 5A dan Tabel S4). Selanjutnya, kami membungkam
interferensi Met oleh RNA (RNAi) pada nyamuk betina (iMet) pada PE 24 jam dan
menganalisis level transkrip gen CM 4 hari kemudian menggunakan qPCR. Kami mengukur
kadar mRNA dari empat gen metabolisme glikogen / gula — GLY, TPS, TPP, dan TREA —
di latar belakang Met-depleted dan menemukan gen ini diinduksi secara signifikan (Gambar
5B dan S4C Gambar). Enam gen pengkode enzim glikolitik, termasuk PYK dan HEX yang
membatasi laju, diregulasi secara signifikan dalam tubuh lemak nyamuk iMet (Gambar 5B
dan S4C Gambar). Kami juga menguji enzim pembatas kecepatan utama PFK tetapi tidak
menemukan efek Met, konsisten dengan hasil microarray (Gambar S4C). Analisis Western
blot menunjukkan akumulasi substansial enzim untuk metabolisme glikogen/gula dan
glikolisis pada tingkat protein dalam tubuh lemak nyamuk betina yang dibungkam Met
(Gambar 5C). Hasil ini menunjukkan efek dramatis dari knockdown Met RNAi pada gen CM
dan tingkat protein, menunjukkan bahwa reseptor JH memainkan peran penting dalam
regulasi CM.
Tingkat glikogen berkurang secara signifikan pada nyamuk betina yang dibungkam
Met (Gambar 6A dan 6B). Penipisan cadangan glikogen yang dramatis dalam tubuh lemak
nyamuk betina yang dibungkam Met dikonfirmasi dengan pewarnaan PAS (Gambar 6A).
Gula hemolimfa yang bersirkulasi—trehalosa, fruktosa, dan glukosa—secara signifikan
menurun jumlahnya pada nyamuk betina yang kekurangan Met (Gambar 6B). Seperti
cadangan gula, kadar TAG juga menurun setelah penurunan Met (Gambar 6C). Memenuhi
penipisan RNAi menghasilkan peningkatan kadar ATP, menunjukkan peningkatan konsumsi
energi pada nyamuk ini (Gambar 6D). Kami kemudian mengukur kadar piruvat dan laktat,
produk akhir metabolisme glikolisis, yang keduanya meningkat secara signifikan dengan
penipisan Met, menunjukkan bahwa Met mempengaruhi fluks glikolitik. Namun, sitrat,
suksinat dan malat, IM dari siklus sitrat, tidak menunjukkan fluktuasi yang nyata dalam
menanggapi penipisan Met (Gambar 6E). Data kami menunjukkan bahwa CM sangat
terganggu pada nyamuk betina yang dibungkam Met. Efek pembungkaman Met RNAi ini
dengan jelas menunjukkan bahwa Met berfungsi sebagai sakelar pengatur utama CM selama
fase PE dari siklus gonadotrofik.

20E dan asam amino penting untuk regulasi CM selama fase PBM

20E dan Asam Amino (AA)/Target jalur Rapamycin telah terlibat dalam mengatur
peristiwa vitellogenik pada nyamuk betina [10,11,12]. Untuk menguji apakah AA dan 20E
mempengaruhi ekspresi gen CM pada tubuh gemuk wanita, kami menggunakan uji kultur
jaringan in vitro di mana jaringan tubuh lemak yang diisolasi dari nyamuk pada 72 jam PE
diinkubasi dengan adanya AA dan/atau 20E [11,13 ]. Inkubasi tubuh lemak dalam media
yang mengandung AA meningkatkan kelimpahan transkrip PYK dan GLY, sementara
penambahan 20E ke media ini menghasilkan peningkatan level lebih lanjut (S5A Gambar).
Untuk menyelidiki apakah faktor pengatur ini juga terlibat dalam mengendalikan
metabolisme CM selama fase PBM, nyamuk betina 72PE disuntik dengan 20E dan AA.
Ekspresi GLY dan PYK diregulasi sebagai hasil dari aplikasi AA dan 20E secara simultan;
LDH responsif terhadap AA tetapi tidak pada 20E, sementara GYS terhadap kedua regulator
ini (Gambar S5B). Sesuai dengan percobaan in vitro, AA meningkatkan kelimpahan transkrip
LDH, tetapi 20E memiliki sedikit efek. Dengan demikian, 20E dan AA memainkan peran
berbeda dalam regulasi gen CM. Eksperimen in vivo menggunakan aplikasi 20E dan AA,
kadar glikogen dan glukosa menurun ketika AA dan 20E diberikan, meniru status gula ini
pada nyamuk PBM (Gbr S5C).

EcR adalah pengatur penting CM selama fase reproduksi PBM

20E adalah hormon utama yang mengatur peristiwa reproduksi PBM pada nyamuk
betina. Pembungkaman EcR telah dilaporkan pada nyamuk dengan EcR knockdown yang
mengakibatkan berkurangnya panjang folikel ovarium [14], dan jumlah telur dibandingkan
dengan kontrol (Gbr S6A). Oleh karena itu, kami menyelidiki apakah EcR berperan dalam
mengendalikan CM. Kami membungkam EcR menggunakan dsRNA ke wilayah EcR umum
(iEcR) pada nyamuk betina pada 24 jam PE, darah memberi mereka makan 4 hari kemudian,
dan menganalisis tingkat transkrip gen CM pada 36 jam PBM menggunakan qPCR (Gambar
S6B). Ekspresi gen TREA dan TPP yang mengkode enzim metabolisme glikogen/gula
ditekan secara transkripsi pada 36 jam PBM sebagai akibat dari pembungkaman EcR (S6C
Gambar). Gen glikolitik representatif— HEX, PFK dan PYK—dikendalikan oleh EcR
dengan cara yang sama (Gambar 7A dan S6C Gambar). GLY, PGM dan GPI mengikuti tren
yang sama. Sebaliknya, GYS dan LDH tidak terpengaruh oleh pembungkaman EcR RNAi.
Ini sesuai dengan kurangnya efek 20E pada ekspresi gen-gen ini yang dijelaskan di atas.
Perubahan transkripsi ini juga tercermin dalam tingkat protein enzim, meskipun efeknya lebih
ringan dalam kasus protein (Gambar 7B).
Pengobatan EcR dsRNA menghasilkan peningkatan glikogen tubuh lemak 36h PBM
seperti yang diungkapkan melalui pewarnaan PAS (Gambar 7C). Peningkatan gula yang
beredar diamati pada nyamuk betina EcRdepleted; khususnya, kadar glukosa dan fruktosa
sangat tinggi, mencerminkan ketidakmampuan nyamuk ini untuk memanfaatkan gula
(Gambar 7D). Kadar glukosa dan fruktosa meningkat lebih dari 3 kali lipat pada PBM 36 jam
sebagai akibat dari knockdown EcR. Pengobatan EcR dsRNA menghasilkan peningkatan
kadar TAG dan penurunan kadar ATP 36 jam PBM (Gambar 7E dan 7F). Untuk memeriksa
apakah EcR mempromosikan CM, PBM, melalui perubahan fluks glikolitik, kami mengukur
level IM di hilir glikolisis. Konsisten dengan ketidakmampuan mereka untuk
mengkatabolisme cadangan gula, nyamuk yang dibungkam EcR menunjukkan akumulasi zat
antara awal dari jalur glikolitik—glukosa-6-fosfat dan fruktosa-6-fosfat (Gambar 7G). Ada
juga penumpukan laktat yang cukup besar (Gambar 7G). Tingkat piruvat sedikit menurun,
sedangkan sitrat menurun jauh pada nyamuk ini. Hasil ini dengan jelas menunjukkan fakta
bahwa EcR adalah pengatur penting CM selama fase PBM dari siklus gonadotrofik pada
nyamuk betina.

Koordinasi temporal dari phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK)

PEPCK adalah enzim penting dalam mempertahankan homeostasis glukosa dan

dengan demikian memberikan peran penting dalam menanggapi stres dan kelaparan
[15,16,17]. Analisis microarray dan qPCR telah mengungkapkan bahwa tingkat transkrip gen
PEPCK tinggi pada awal fase PE, tetapi secara dramatis dikurangi oleh PE 72 jam (Gambar 1
dan Gambar S7A). Sesuai dengan data ini, ekspresi gen PEPCK dihambat oleh penerapan JH
in vivo dan diaktifkan oleh pembungkaman Met RNAi, menunjukkan regulasi negatif gen ini
oleh JH/Met dalam fase PE (S7B dan S7C Gambar). Berbeda dengan sebagian besar gen CM,
aktivasi yang mencapai maksimum pada 36 jam PBM, gen PEPCK diregulasi secara tinggi
segera setelah makan darah pada betina Aedes (Gambar 1 dan Gambar S7D). Secara
signifikan, baik percobaan kultur jaringan in vivo dan in vitro telah menunjukkan bahwa AA
memainkan peran kunci dalam mengaktifkan ekspresi gen ini (Gambar S7E dan S7F).
Namun, percobaan ini telah menunjukkan bahwa 20E tidak terlibat dalam regulasi ekspresi
gen ini (Gambar S7E dan S7F). Lebih lanjut, pembungkaman EcR RNAi tidak memengaruhi
level transkripnya (Gambar S7G).

Koordinasi temporal gen jalur pentosa fosfat (PPP) selama siklus gonadotrofik

PPP terdiri dari cabang oksidatif dan non-oksidatif [18]. Berbeda dengan jalur CM
lainnya, gen yang mengkode enzim PPP dari kedua cabang aktif secara transkripsi sepanjang
fase PE dan diturunkan regulasi selama fase PBM (Gambar 1). Dalam cabang oksidatif PPP,
glukosa-6-fosfat digunakan untuk sintesis ribosa-5-fosfat, dengan glukosa6-fosfat
dehidrogenase menjadi enzim pembatas laju [18]. Dalam hal ini, sangat menarik bahwa gen
yang mengkode glukosa-6-fosfat dehidrogenase (G6PD) dan ribose5-fosfat isomerase A
(RPIA) diaktifkan secara berurutan selama fase PE (Gambar 1). G6PD juga mereduksi
NADP+ menjadi NADPH yang digunakan dalam biosintesis lipid [18]. Pada nyamuk Aedes
betina, ekspresi gen yang mengkode G6PD diatur oleh Met (Gambar 5A). Penipisan G6PD
RNAi mengakibatkan penurunan kadar TAG, menunjukkan bahwa kontrol yang bergantung
pada Met dari enzim ini berkontribusi pada metabolisme lemak dalam tubuh lemak nyamuk
(Gambar 8A).
Transketolase (TAL), yang merupakan enzim pembatas laju dari cabang PPP non-
oksidatif [18], menunjukkan tingkat ekspresi yang lebih tinggi selama 24 jam PE pertama,
sementara ekspresinya diturunkan regulasinya selama fase PBM (Gambar 1). Kami
menggunakan qPCR untuk memeriksa kelimpahan transkrip gen yang mengkode RPIA dan
TAL, masing-masing perwakilan dari cabang PPP oksidatif dan non-oksidatif. Analisis ini
mengkonfirmasi data transkriptom yang menunjukkan peningkatan kelimpahan transkrip dari
dua gen PPP ini pada fase PE akhir dan penurunan pada 36 jam PBM (Gambar 8B).
Penipisan RNAi menunjukkan bahwa Met adalah penggerak ekspresi gen-gen ini, sementara
EcR tidak berpengaruh (Gambar 8C). Selain itu, percobaan uji tubuh lemak in vitro
mengkonfirmasi kurangnya efek 20E pada ekspresi TAL dan RPIA (Gambar 8D).

Gambar 4. Perubahan kadar metabolit perantara sepanjang siklus reproduksi nyamuk betina
dewasa. (A dan B) Tingkat relatif untuk metabolit perantara glikolisis (A) dan siklus sitrat
(B) selama pengembangan PE dan PBM. Glukosa-6-fosfat, fruktosa-6-fosfat, piruvat dan
laktat dari jalur glikolitik, dan sitrat, suksinat fumarat dan malat dari siklus sitrat diukur
menggunakan kromatografi gas—spektrometri massa (GC/MS). Titik waktu 0-6h PE dan 72h
PE digunakan sebagai kontrol untuk periode PE dan PBM, masing-masing. Kontrol
direpresentasikan sebagai kelimpahan relatif 100, dan level pada titik waktu lain disesuaikan.
Dalam plot kotak, kotak mewakili kuartil bawah dan atas, garis horizontal mewakili median
dan batang mewakili titik data minimum dan maksimum (n = 12 sampel yang dikumpulkan
dari populasi independen, dengan enam nyamuk betina dewasa per sampel). Tiga set
pengukuran metabolit independen dilakukan dengan hasil yang serupa

Gambar 5. Gen CM diregulasi di Met -depleted nyamuk (A) Heatmap menunjukkan

perubahan ekspresi gen CM pada nyamuk Met-depleted (iMet) dibandingkan dengan sampel
kontrol iLuc dan 72h PE, yang ditandai dengan analisis microarray Nilai intensitas mentah
untuk ekspresi CM gen dalam sampel iMet dan iLuc dinormalisasi menjadi PE 72 jam,
sedangkan nilai PE 72 jam dinormalisasi menjadi sampel PE 6 jam. Hanya gen yang
menunjukkan perubahan lipatan > 1,75 (0,8 dalam skala log2) dengan tingkat penemuan
palsu (nilai p) kurang dari 0,01 dimasukkan. Dendogram pengelompokan hierarkis untuk
empat jalur CM yang berbeda disediakan. Dendogram diberi kode warna untuk metabolisme
glikogen / gula (merah), glikolisis (hijau), siklus sitrat (ungu) dan jalur pentosa fosfat (biru).
(B) validasi qPCR untuk satu set gen yang dipilih dari metabolisme glikogen/gula dan
glikolisis, menunjukkan efek penipisan Met pada gen-gen ini pada tingkat transkrip.
Kelimpahan relatif kontrol iLuc direpresentasikan sebagai 1, dengan penyesuaian yang sesuai
dalam nilai iMet. Bilah kesalahan mewakili ± SD. * p < 0,05;** p < 0,01. (C) Western blot
menunjukkan perubahan dramatis pada enzim CM pada tingkat protein dalam tubuh lemak
nyamuk Metdepleted selama pengembangan PE. Aktin digunakan sebagai kontrol pemuatan.

Gambar 6. Nyamuk met-depleted menunjukkan cacat metabolisme. (A) Penurunan kadar

glikogen diamati pada nyamuk betina dewasa yang kekurangan Met, yang diukur dengan
kolorimetri (kiri) dan pewarnaan PAS (kanan). Nyamuk yang disuntik dengan iLuc
digunakan sebagai kontrol. (B) Perubahan kadar gula yang bersirkulasi sebagai akibat dari
penipisan Met. Penurunan konsentrasi trehalosa, glukosa dan fruktosa diamati pada nyamuk
iMet dibandingkan dengan kontrol iLuc. (C) Penurunan tingkat TAG diamati pada nyamuk
betina dewasa yang kekurangan Met, yang diukur dengan kolorimetri. (D) Tingkat ATP pada
nyamuk iMet seperti yang ditentukan oleh HPLC. Peningkatan yang signifikan dalam tingkat
ATP diamati pada nyamuk iMet bila dibandingkan dengan kontrol. Prosedur eksperimental,
normalisasi dan analisis statistik serupa dengan yang di Gambar 2, bagian AC, masing-
masing. (E) Plot kotak yang menunjukkan tingkat relatif metabolit perantara CM pada
nyamuk iMet. Sementara laktat dan piruvat produk akhir glikolitik diinduksi secara
signifikan, penurunan kadar glukosa-6-fosfat dan fruktosa-6-fosfat diamati. Intermediet dari
siklus sitrat, sitrat, suksinat dan malat menunjukkan sedikit peningkatan konsentrasi. Tiga
kelompok percobaan independen dilakukan, masing-masing menunjukkan hasil yang serupa.
Pengambilan dan pengambilan sampel jaringan dilakukan 4 hari setelah injeksi. Semua
tingkat metabolit dinormalisasi dengan jumlah protein endogen total. Kontrol iLuc
direpresentasikan sebagai kelimpahan relatif 100, dengan penyesuaian yang sesuai pada level
iMet. Bilah kesalahan mewakili ± SD. * p < 0,05; ** p < 0,01.

Gambar 7. Deplesi EcR mempengaruhi CM selama pengembangan PBM. (A) tingkat

transkrip enzim CM berbasis qPCR pada nyamuk betina dewasa iEcR. Transkrip HEX, GLY,
PGM dan PYK ditekan secara signifikan sebagai akibat dari knockdown EcR. (B) Western
blot menunjukkan tingkat protein enzim GLY, HEX, PGM dan PYK pada nyamuk yang
kehabisan EcR. Aktin digunakan sebagai kontrol pemuatan. (C) Peningkatan moderat tingkat
glikogen diamati sebagai akibat dari penipisan RNAi dari EcR. Kadar glikogen diukur
dengan kolorimetri (kiri) dan pewarnaan PAS (kanan). (D) Pengaruh knockdown EcR pada
konsentrasi gula yang bersirkulasi. Sementara peningkatan dramatis dalam kadar glukosa dan
fruktosa dicatat sebagai akibat dari penipisan EcR, trehalosa hanya sedikit diubah.
Kromatografi gas—spektrometri massa (GC-MS) digunakan untuk kuantifikasi gula yang
bersirkulasi. (E) Peningkatan kadar TAG diamati pada nyamuk betina yang kekurangan Met,
yang diukur dengan kolorimetri (F) Pengukuran ATP berbasis kromatografi cair kinerja
tinggi (HPLC) pada nyamuk iEcR. Penurunan moderat tingkat ATP diamati pada nyamuk
yang diobati. (G) Plot kotak yang menunjukkan variasi tingkat relatif untuk metabolit kecil
dari jalur CM pada nyamuk yang kehabisan EcR. Metabolit kecil dinormalisasi ke tingkat
protein total organisme. Pengukuran dari tiga eksperimen biologis independen dilakukan,
dengan hasil yang serupa. Percobaan dilakukan dalam rangkap tiga menggunakan kohort
nyamuk yang terpisah. Untuk semua percobaan, nyamuk iLuc digunakan sebagai kontrol.
Nyamuk iEcR dan iLuc diberi makan darah 4 hari setelah injeksi, diikuti dengan
pengumpulan sampel pada 36 jam PBM. Kontrol iLuc direpresentasikan sebagai kelimpahan
relatif 100, dengan penyesuaian yang sesuai pada level iEcR. Bilah kesalahan mewakili ± SD.
*p < 0,05; **p < 0,01
Diskusi

Sepanjang setiap siklus gonadotrofik, nyamuk betina hematofag mengalami

perubahan fisiologis yang drastis, beralih dari mencari makan nektar dan mencari inang ke
pemanfaatan darah dan perkembangan telur yang cepat. Kami menunjukkan di sini bahwa
perubahan ini disertai dengan pemrograman ulang CM untuk mendukung persyaratan
fungsional yang sangat berbeda dari nyamuk betina yang bereproduksi. Untuk
mengakomodasi pemrograman ulang ini, tubuh gemuk nyamuk betina, yang merupakan pusat
metabolisme, mengalami transformasi yang luar biasa. Analisis transkriptom dan qPCR kami
telah menunjukkan bahwa ekspresi gen yang mengkode enzim CM dalam jaringan ini
disinkronkan dengan dua fase siklus gonadotrofik, menanggapi berbagai kebutuhan energi
dari nyamuk betina yang bereproduksi. Tingkat protein enzim yang terlibat dalam glikolisis
dan metabolisme glikogen/gula menunjukkan perubahan periodik sepanjang siklus reproduksi
nyamuk yang berkorelasi dengan kelimpahan transkrip gen masing-masing. Tingkat gula
yang disimpan dan beredar mengungkapkan akumulasi dan penipisan periodiknya sebagai
respons terhadap perubahan kebutuhan energi secara keseluruhan. Kadar gula ini bersamaan
dengan tingkat transkrip gen yang mengkode glikogen/enzim metabolisme gula. Analisis
metabolisme memberikan bukti lebih lanjut bahwa dinamika CM sepenuhnya berbeda selama
fase PE dan PBM dari siklus gonadotrofik nyamuk betina. Selain itu, data ini dikuatkan
dengan adanya hubungan antara tingkat ekspresi gen CM dan IM. Selain itu, analisis kami
telah mengungkapkan bahwa waktu dan regulasi PPP berbeda dari jalur CM lainnya,
menunjukkan peran penting dalam homeostasis metabolik nyamuk betina. Secara
keseluruhan, analisis kami menunjukkan bahwa koordinasi temporal CM pada nyamuk betina
terjadi sebagian besar pada tingkat gen.
Kami telah menunjukkan di sini bahwa Met berfungsi sebagai sakelar pengatur utama
yang mengatur pemrograman ulang metabolik selama fase PE dari siklus gonadotrofik
nyamuk betina. Data kami menunjukkan bahwa Met bertindak pada tingkat genomik,
memengaruhi ekspresi gen CM, sehingga menentukan pemrograman ulang PE CM.
Mayoritas gen yang terlibat dalam CM, termasuk glikogen/gula, glikolisis dan siklus sitrat,
sangat meningkat pada nyamuk betina yang dibungkam Met, sementara beberapa gen yang
mengkode PPP diturunkan regulasinya. Reseptor JH Met termasuk dalam famili bHLH-PAS
dari faktor transkripsi heterodimerik, protein yang merespons sinyal lingkungan atau
fisiologis dan terlibat dalam mediasi berbagai respons sel termasuk metabolisme dan kanker
[19,20]. Tindakan genomik Met telah ditetapkan [21]—Met membentuk heterodimer dengan
faktor bHLH-PAS lainnya dengan cara yang bergantung pada JH dan mengaktifkan gen
target melalui interaksi dengan motif E-box di wilayah regulasinya [22,23,24,25 ]. Namun,
Met juga terlibat dalam hierarki represi yang dimediasi JH. Sementara aktivasi gen oleh Met
tampaknya langsung, tindakan represifnya membutuhkan faktor perantara [5]. Selain efek
signifikan pada enzim CM pada tingkat transkrip, pembungkaman Met RNAi menyebabkan
peningkatan fluks glikolitik dan penipisan gula yang disimpan dan beredar.

Gambar 8. Analisis gen jalur pentosa fosfat. (A) Penurunan kadar TAG pada nyamuk betina
dewasa yang kekurangan G6PD, yang diukur dengan kolorimetri. (B) Ekspresi gen jalur
pentosa fosfat TAL (atas) dan RPIA (bawah) selama PE dan PBM. Titik sampel,
pengumpulan sampel, dan prosedur eksperimental serupa dengan Gambar 1C. (C) Pengaruh
knockdown Met dan EcR pada ekspresi TAL (atas) dan RPIA (bawah) selama PE dan PBM.
Koleksi sampel dan eksperimen serupa dengan Gambar 4B (untuk iMet) dan Gambar 6A
(untuk iEcR). (D) AA dan 20E tidak berpengaruh pada ekspresi TAL dan RPIA.
Pengambilan sampel dan eksperimen serupa dengan S5A Gambar. Kontrol direpresentasikan
sebagai kelimpahan relatif 100. Bilah kesalahan mewakili ± SD. *p < 0,05;**p < 0,01.
 Menelan darah menyebabkan peristiwa dramatis pada nyamuk betina. Analisis
transkriptomik dan metabolomik kami telah mengungkapkan bahwa ada perubahan langsung
dalam status CM setelah pemberian darah. Transkrip TREA meningkat dan penurunan
tingkat trehalosa pada 6 jam PBM menunjukkan permulaan awal pemanfaatan trehalosa
untuk glikolisis. Demikian juga, ada peningkatan dramatis dalam tingkat transkrip LDH
sedini 3 jam PBM diikuti oleh lonjakan laktat. IM siklus sitrat juga menunjukkan peningkatan
tajam awal pada 6 jam PBM. Peningkatan instan glikolisis untuk mempertahankan tingkat
intermediet glikolitik yang tinggi terjadi sebelum kenaikan titer 20E pada nyamuk betina,
yang menunjukkan bahwa hal itu diatur oleh faktor-faktor selain hormon ini. Memang, kami
menemukan bahwa respons PBM awal kemungkinan dikendalikan oleh asam amino. Dalam
uji kultur tubuh lemak in vitro, transkrip gen LDH meningkat sebagai respons terhadap asam
amino, tetapi diturunkan regulasinya oleh 20E. Peran jalur asam amino/TOR dalam kejadian
PBM vitellogenik telah ditetapkan [10]. Tubuh lemak nyamuk berfungsi sebagai organ sensor
nutrisi yang mendeteksi sinyal asam amino yang berasal dari makanan darah [1,26]. Di sini,
kami telah mengungkap peran asam amino dalam mengatur CM pada tahap awal PBM.
Aktivasi gen PEPCK oleh AA terjadi pada permulaan pemberian makan darah, saat menelan
sejumlah besar makanan dalam bentuk darah. Keadaan fisiologis ini menimbulkan kebutuhan
energi yang sangat besar pada nyamuk betina yang diperlukan untuk ekskresi cairan dalam
jumlah besar dan pencernaan makanan darah yang banyak. Tampaknya elevasi tinggi
ekspresi gen PEPCK yang berkorelasi dengan peristiwa ini sangat penting untuk
mempertahankan homeostasis gula yang bersirkulasi dan mewakili adaptasi nyamuk CM
terhadap hematofag.
Tahap PBM adalah puncak dari siklus gonadotrofik, ketika nyamuk betina
menggunakan makanan darah yang sangat banyak dan dengan cepat mengembangkan lebih
dari seratus telur hanya dalam waktu 48 jam. Kami menunjukkan di sini bahwa ada tingkat
aktivitas CM yang sangat tinggi selama pertengahan tahap PBM, khususnya glikolisis. Gen
yang mengkode glikogen pembatas laju dan enzim glikolitik, seperti GLY, PFK dan PYK,
diregulasi 40 hingga lebih dari 100 kali lipat oleh 36 jam PBM. Selain menyediakan substrat
untuk produksi energi, fungsi utama glikolisis aerobik adalah mempertahankan tingkat
intermediet glikolitik yang tinggi untuk mendukung reaksi anabolik dalam sel yang
membelah dengan cepat [6]. Analisis kami terhadap CM IM menunjukkan bahwa fluks
glikolitik sangat meningkat pada tahap PBM.
20E adalah hormon utama yang mengendalikan peristiwa tahap PBM dari siklus
reproduksi nyamuk betina, dan aksinya dimediasi oleh heterodimer EcR dan serangga RXR
homolog Ultraspiracle, keduanya merupakan anggota superfamili reseptor nuklir [4].
Reseptor nuklir adalah keluarga khusus faktor transkripsi terikat ligan atau tidak terikat yang
memainkan peran sentral dalam mengatur perkembangan, pertumbuhan dan metabolisme
[27]. Pada nyamuk betina, hierarki regulasi 20E bertanggung jawab atas ekspresi gen YPP
dalam tubuh gemuk [28,29,30]. Hasil kami lebih lanjut menunjukkan bahwa kontrol CM
terjadi terutama pada tingkat gen, dan EcR adalah pengatur penting gen-gen ini selama
peningkatan dramatis dalam CM. Dalam larva Drosophila melanogaster yang berkembang
pesat, CM dikoordinasikan secara temporal oleh reseptor terkait estrogen (ERR) [8]. Reseptor
nuklir ini mengubah ekspresi gen yang mengkode enzim jalur metabolisme, sehingga
memainkan peran sebagai saklar metabolik. Apakah ERR memainkan peran serupa pada
nyamuk betina dan cara interaksinya dengan EcR dalam menyinkronkan CM selama tahap
PBM memerlukan penelitian lebih lanjut.
Singkatnya, kami telah menyajikan analisis komprehensif dinamika CM pada nyamuk
betina selama siklus reproduksi. Kami menunjukkan bahwa metabolisme tersebut berkorelasi
erat dengan kondisi fisiologis yang berubah dengan cepat dari organisme ini. Studi
transkriptomik dan metabolomik kami telah mengungkapkan hubungan ekspresi gen yang
mengkode jalur CM dan IM. Analisis kami telah mengidentifikasi bahwa Met adalah sakelar
pengatur utama yang bertanggung jawab untuk koordinasi temporal CM selama fase PE dari
siklus gonadotrofik nyamuk betina. Kami juga menunjukkan bahwa 20E/EcR dan asam
amino memainkan peran yang berbeda dalam regulasi CM. Analisis molekuler lebih lanjut
dari jalur regulasi metabolik ini dapat mengarah pada penerapan metode berbasis
metabolisme untuk mencegah penularan penyakit yang ditularkan oleh nyamuk.

Bahan dan Metode

Hewan percobaan

Nyamuk A. aegypti strain Rockefeller dibesarkan seperti yang dijelaskan sebelumnya

[11,31]. Nyamuk dewasa diberi makan air dan larutan sukrosa 10% secara terus menerus.
Semua prosedur untuk penggunaan hewan vertebrata telah disetujui oleh Institute of Zoology
Animal Care and Use Committee.

Profil metabolik

Kumpulan sampel dari 12 populasi nyamuk independen dianalisis untuk setiap kondisi
percobaan. Enam nyamuk per titik sampel dicuci dalam buffer PBS, dibekukan dalam
nitrogen cair, ditumbuk dalam 400 l 90% MeOH yang telah didinginkan sebelumnya dan
kemudian diinkubasi selama 1 jam pada -20°C [32]. Setelah sentrifugasi dan penghilangan
puing-puing, langkah ekstraksi kedua dengan 60% MeOH dilakukan. Supernatan dikeringkan
dengan vakum selama 1 jam dan diinkubasi dengan 40 l O-metoksilamin hidroklorida (20
mg/ml jenuh dalam piridin) selama 1 jam pada 37°C. Kemudian, 50 l reagen MSTFA
ditambahkan ke sampel, yang kemudian diinkubasi selama 30 menit pada 37 ° C, dengan
pengocokan, dan akhirnya diencerkan dengan 400 l n-heksana dan dipindahkan ke botol
sampel otomatis untuk langkah berikutnya. Analisis GC-MS dilakukan mengikuti protokol
standar menggunakan Agilent 7890 GC yang digabungkan dengan detektor selektif massa
seri 5975N (MSD). Langkah-langkah suhu berikut digunakan: suhu awal 75°C selama 1
menit, kemiringan 5 °C / menit hingga 250 °C selama 5 menit, kemiringan 5 °C/menit hingga
320 °C selama 3 menit. Sampel 1-l disuntikkan dalam mode split-less pada 250 ° C dengan
aliran gas pembawa helium ditetapkan pada 1 ml / menit. Kolom HP-5MS dengan kolom
pelindung sepanjang 5 m digunakan untuk analisis. Akuisisi kromatogram, dekonvolusi
puncak, dan pencarian perpustakaan dilakukan menggunakan perangkat lunak Agilent MSD
Chemstation. Metabolit diidentifikasi menggunakan standar kimia otentik yang dianalisis
pada sistem yang sama.

Pengukuran Glikogen, TAG, dan ATP

Tes Glikogen dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [33,34]. SpectraMax Plus384
digunakan untuk deteksi. Enam sampel biologis independen, dengan enam nyamuk betina
dewasa per sampel, digunakan untuk setiap kondisi percobaan. Setelah sentrifugasi, sampel
dipindahkan ke pelat 96-sumur, diinkubasi dengan Reagen Gliserol Gratis (Sigma), dan diuji
menggunakan SpectraMax Plus384. Untuk pengukuran TAG, enam nyamuk dihomogenisasi
dalam 100 l PBST yang mengandung 0,5% Tween-20 dan diinkubasi pada suhu 70°C selama
5 menit. Kemudian, sampel diinkubasi dengan Trigliserida Reagen (Sigma) dan diuji secara
kolorimetri. Untuk pengukuran ATP, enam nyamuk dihomogenisasi dalam buffer ekstraksi (6
M guanidine-HCL, 100 mM Tris, 4 mM EDTA) dan direbus selama 5 menit. Setelah
sentrifugasi, supernatan disaring melalui membran PTFE untuk pengujian HPLC yang
dilakukan menggunakan HPLC Agilent 1100 yang digabungkan dengan detektor DVD,
mengikuti protokol yang diterbitkan [35]. Pada kromatogram, puncak ATP diidentifikasi
dengan memanfaatkan waktu retensi standar (Molecular Probe, 911734). Total glikogen,
TAG, dan konsentrasi ATP dinormalisasi ke tingkat protein endogen sampel, ditentukan
menggunakan uji Bradford (BioRad, 500-0201).

Pewarnaan glikogen
Untuk analisis histokimia kandungan glikogen tubuh lemak, pewarnaan dan visualisasi
dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [36]. Perut dipisahkan dari bagian tubuh
lainnya dan difiksasi dalam paraformaldehida 4% pada suhu 4°C semalaman. Setiap sampel
kemudian didehidrasi dengan peningkatan konsentrasi etanol, dimasukkan ke dalam parafin,
dan dipotong menjadi irisan 3 hingga 5 m. Fragmen perut diwarnai menurut metode Schiff
asam periodik (PAS) (Sigma, 395B) dan diamati di bawah mikroskop Nikon Ni-E.

Mikro-injeksi dsRNA dan aplikasi hormon

sintesis dsRNA dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [5]. Gen luciferase bakteri
digunakan untuk menghasilkan kontrol iLuc dsRNA. Injektor Nanoliter 2000 (Instrumen
Presisi Dunia) digunakan untuk memasukkan dsRNA yang sesuai ke dalam toraks nyamuk
betina 24 jam PE yang dibius dingin. Spesifisitas knockdown gen ditandai dengan penurunan
50-70% dalam kelimpahan transkrip gen target (Gambar S3B dan S4A). Semua primer yang
digunakan untuk membuat dsRNA tercantum dalam Tabel S5. Untuk menguji efek JH, 0,5 l
JH (10 g/ml JH dalam aseton sebagai pelarut) atau aseton dioleskan ke perut nyamuk betina
yang baru ditutup. Betina diperiksa 20 jam pasca perawatan seperti yang dijelaskan
sebelumnya [24]. Untuk pengukuran metabolit, sampel dikumpulkan 20 jam setelah
perawatan JH. Untuk menguji efek 20E, 0,5 l 10−6 M 20E disuntikkan bersama dengan asam
amino ke nyamuk betina PE 72 jam. Nyamuk diperiksa 20 jam pasca perawatan. Percobaan
dilakukan dalam rangkap tiga di bawah kondisi yang sama.

Persiapan RNA dan analisis qPCR

Sampel RNA total disiapkan dalam tiga kondisi berbeda, dan tubuh lemak dibedah dari perut
10-15 individu nyamuk. reaksi qPCR dilakukan pada sistem MX3000P (Stratagene, CA)
menggunakan SYBR green PCR Master Mix (Tiangen, Beijing). Kondisi siklus termal
adalah: 94°C, 5 detik; 59°C, 20 detik; dan 72°C, 20 detik. Pengukuran kuantitatif dilakukan
dalam rangkap tiga dan dinormalisasi ke mRNA protein ribosom S7 kontrol internal untuk
setiap sampel. Primer yang digunakan untuk qPCR tercantum dalam Tabel S5.

Analisis Western blot

Delapan tubuh lemak nyamuk dihomogenisasi dalam 100 l buffer pemecah dengan alu pelet,
seperti yang dijelaskan sebelumnya [37]. Aliquot dari seluruh sampel protein nyamuk
diselesaikan pada 4-15% gradien gel SDS-poliakrilamida (Bio-Rad) dan dipindahkan ke
membran PVDF (Invitrogen). Setelah pemblokiran, membran diinkubasi semalaman dengan
antibodi primer pada suhu 4°C (Tabel S3). Sebagai kontrol pemuatan, antibodi terhadap -
aktin (Sigma) digunakan.

Bioinformatika dan analisis statistik

Kumpulan data DEG dari mikroarray kursus waktu PE dan PBM digunakan untuk
merekonstruksi profil ekspresi gen yang terlibat dalam metabolisme. Pengelompokan hierarki
linkage lengkap dilakukan menggunakan fungsi hclust di R [5]. Cluster diskrit diperoleh
dengan memotong dendrogram yang dihasilkan dengan fungsi cuttree menggunakan nilai
ketinggian yang ditentukan secara visual. Kelompok ortologi dan informasi jalur, berdasarkan
Kyoto Encyclopedia of Gens and Genomes (KEGG), diunduh dari database [38] dan
digunakan dalam penelitian ini. Analisis pengayaan digunakan untuk mendeteksi signifikansi
perubahan setiap jalur metabolisme, dan nilai p dihitung berdasarkan tes hiper-geometrik,
seperti yang dijelaskan sebelumnya [39]. Dalam semua eksperimen lain, signifikansi statistik
ditentukan oleh nilai p < 0,01, sebagaimana dievaluasi menggunakan uji-t siswa berpasangan,
dua sisi (Graphpad 5.0). Perbandingan dibuat antara titik waktu/perlakuan dan kontrol dan
perbedaan yang signifikan ditunjukkan dalam grafik. Semua data kuantitatif dilaporkan
sebagai mean ± SD.

Kultur tubuh lemak in-vitro

Eksperimen kultur tubuh lemak in vitro dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya
[11,26]. Dinding perut nyamuk betina dengan jaringan tubuh lemak yang melekat diinkubasi
dalam media kultur dalam berbagai kondisi. Dalam media kultur yang kekurangan asam
amino, jumlah molar yang sama manitol ditambahkan untuk mengkompensasi perubahan
tekanan osmotik [26]. 20E ditambahkan ke media kultur dilengkapi dengan satu set lengkap
asam amino [26]. Untuk meniru kenaikan alami pada titer 20E, jaringan pertama kali
diinkubasi dengan 5 x 10−8 M hormon ini selama 4 jam dan kemudian dengan adanya 10−6
M selama 4 jam. Total RNA kemudian diisolasi dan kelimpahan transkrip dianalisis
menggunakan qPCR. Percobaan diulang tiga kali dalam kondisi yang sama.

Informasi Pendukung
S1 Gambar. Dinamika ekspresi gen CM dalam tubuh gemuk nyamuk betina dewasa. (A)
Diagram skematik yang menunjukkan gen yang mengkode enzim jalur untuk metabolisme
glikogen/gula dan glikolisis. Gen yang berdasarkan data microarray menunjukkan regulasi
turun lebih dari empat kali lipat pada 72 jam PE dan regulasi naik pada 36 jam PBM ditandai
dengan warna merah muda. (B dan C) Analisis berbasis KEGG dari kohort gen jalur CM di
PE dan PBM. Setiap batang mewakili jumlah total gen dari jalur CM tertentu di Ae. aegypti,
sedangkan jumlah gen yang diperkaya secara signifikan dalam waktu tertentu ditandai
dengan nada yang lebih gelap. (B) Kategori gen diperkaya pada PE 6 jam (merah) dan PE 24
jam (biru). (C) Kategori gen diperkaya pada PBM 12 jam (merah), PBM 24 jam (biru) dan
PBM 36 jam (hijau). Nilai gen P menunjukkan pengayaan gen di masing-masing jalur. (TIF)

S2 Gambar. qPCR berdasarkan tingkat transkrip gen tambahan yang mengkode enzim jalur
CM selama perkembangan reproduksi pada nyamuk betina dewasa Ae. aegypti. Transkrip
titik waktu PE dinormalisasi ke level PE 0-6 jam, sedangkan transkrip PBM dinormalisasi ke
level PE 72 jam. Bilah kesalahan mewakili ± SD. p < 0,05; p < 0,01.
(TIF)

S3 Gambar. Efek JH pada gen CM dan metabolit. (A) analisis qPCR dari gen CM terpilih
pada nyamuk betina setelah aplikasi topikal JH III. Jaringan diisolasi 20 jam pasca perawatan
dan dilakukan analisis qPCR. (B) Kadar glikogen, glukosa dan TAG pada nyamuk betina
setelah perlakuan yang sama. Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga, dengan hasil
yang serupa. Bilah kesalahan mewakili ± SD. p < 0,05; p < 0,01. (TIF)

S4 Gambar. Pengaruh reseptor JH Met pada CM selama analisis pengayaan berbasis PE (A)
KEGG untuk gen jalur CM dalam transkriptom nyamuk yang habis Met. Transkriptom yang
diregulasi iMet secara signifikan diperkaya dalam gen metabolisme glikolisis dan
glikogen/gula. Jumlah transkrip yang diregulasi iMet milik jalur tertentu ditandai dengan
nada yang lebih gelap. Batang mewakili jumlah total gen nyamuk di setiap jalur CM yang
dianalisis. (B) Tingkat knockdown transkrip Met pada nyamuk betina dewasa yang
disuntikkan dsMet. ( C ) Ekspresi gen CM pada nyamuk yang kekurangan Met dibandingkan
dengan kontrol iLuc. RNA tubuh lemak dikumpulkan 5 hari pasca injeksi dan dianalisis
dengan qPCR. Bilah kesalahan mewakili ± SD. p < 0,05; p < 0,01. (TIF)

S5 Gambar. Efek diferensial AA dan 20E pada ekspresi gen CM yang dipilih. (A). Pengaruh
AA dan 20E pada ekspresi gen CM dalam kultur tubuh lemak in vitro. NT, media kultur
tanpa AA dan 20E; AA—media kultur yang dilengkapi dengan AA; AA+20E, media kultur
yang dilengkapi dengan AA dan 20E. Tubuh gemuk yang dibedah dari nyamuk betina
dewasa PE 72 jam diinkubasi dalam media kultur dengan AA atau AA+20E selama 8 jam.
Tubuh lemak yang dikultur pada media minimal digunakan sebagai kontrol (NT). Jaringan
dipanen untuk isolasi RNA dan analisis qPCR. (B) Pengaruh AA dan 20E in vivo. Nyamuk
betina 72h PE disuntik dengan 20E, AA atau kombinasi 20E dan AA. Injeksi dengan etanol
(pelarut) berfungsi sebagai kontrol. Jaringan diisolasi 20 jam pasca injeksi dan dilakukan
analisis qPCR. (C) Penurunan kadar glikogen dan glukosa diamati pada nyamuk betina yang
diobati dengan 20E dan AA. Bilah kesalahan mewakili ± SD. p < 0,05, p < 0,01. (TIF)

S6 Gambar. Efek pembungkaman EcR RNAi. (A) Penurunan jumlah telur yang diletakkan
diamati pada nyamuk betina dewasa yang kekurangan EcR. (B) Penghancuran transkrip EcR
yang efektif pada nyamuk betina dewasa yang disuntikkan dsEcR. ( C ) Ekspresi gen CM
tambahan pada nyamuk yang kehabisan EcR dibandingkan dengan kontrol iLuc. Nyamuk
diberi makan darah lima hari setelah injeksi dengan dsEcR, RNA tubuh lemak dikumpulkan
36 jam PBM dan menjadi sasaran analisis qPCR. Bilah kesalahan mewakili ± SD. p < 0,05; p
< 0,01. (TIF)

S7 Gambar. Koordinasi temporal fosfoenolpiruvat karboksikinase (PEPCK). (A) analisis

qPCR dari kelimpahan transkrip gen PEPCK selama PE. Kelimpahan relatif titik waktu PE
dinormalisasi ke PE 0-6 jam. Dalam grafik, kelimpahan dua titik waktu ini direpresentasikan
sebagai 1,0, dengan penyesuaian yang sesuai untuk titik waktu lainnya. (B) Pengaruh
knockdown Met dan EcR pada ekspresi PEPCK selama PE dan PBM. Koleksi sampel dan
eksperimen serupa dengan Gambar 4B (untuk iMet) dan Gambar 6A (untuk iEcR). (C)
Ekspresi gen PEPCK pada nyamuk yang kekurangan Met dibandingkan dengan yang di
kontrol iLuc. (D) analisis qPCR dari kelimpahan transkrip gen PEPCK selama PBM.
Kelimpahan relatif titik waktu PBM dinormalisasi ke PE 72 jam. Dalam grafik, kelimpahan
dua titik waktu ini direpresentasikan sebagai 1,0, dengan penyesuaian yang sesuai untuk titik
waktu lainnya. (E) Pengaruh AA dan 20E pada ekspresi gen CM. Induksi gen PEPCK yang
jelas oleh AA diamati dalam eksperimen kultur tubuh lemak in-vitro. Penambahan 20E (AA
+20E) tidak menghasilkan induksi lebih lanjut dari gen ini. Eksperimen dilakukan seperti
pada Gambar S4. Tubuh lemak yang dibedah dari nyamuk betina dewasa PE 72 jam
diinkubasi dalam media kultur dengan AA atau AA +20E selama 8 jam. Tubuh lemak yang
dikultur pada media minimal digunakan sebagai kontrol (NT). Jaringan dipanen untuk isolasi
RNA dan analisis qPCR. (F) Pengaruh AA dan 20E in vivo. Nyamuk betina 72h PE disuntik
dengan 20E, AA atau kombinasi 20E dan AA. Injeksi dengan etanol (pelarut) berfungsi
sebagai kontrol. Jaringan diisolasi 20 jam pasca injeksi dan dilakukan analisis qPCR. (G)
Ekspresi gen PEPCK pada nyamuk yang kehabisan EcR dibandingkan dengan kontrol iLuc.
Nyamuk diberi makan darah lima hari setelah injeksi dengan dsEcR, RNA tubuh lemak
dikumpulkan 36 jam PBM dan menjadi sasaran analisis qPCR. Semua percobaan dilakukan
dalam rangkap tiga, dengan hasil yang serupa. Bilah kesalahan mewakili ± SD. p < 0,01.
(TIF)
Tabel S1. Ekspresi temporal gen CM selama pengembangan PE. Gen yang mengkode enzim
jalur metabolisme glikogen/gula, glikolisis, siklus sitrat dan jalur pentosa fosfat disediakan.
Ekspresi diferensial dihitung menggunakan perubahan lipatan minimum 1,75 (0,8 dalam
skala log2) sebagai ambang kepercayaan dan tingkat penemuan palsu (nilai P) 0,01 (Zou et
al., 2013). (XLSX)

Tabel S2. Ekspresi temporal gen CM selama pengembangan PBM. Gen yang mengkode
enzim jalur metabolisme glikogen/gula, glikolisis, siklus sitrat dan jalur pentosa fosfat
disediakan. Ekspresi diferensial selama PBM dihitung dengan membandingkan transkrip dari
masing-masing titik sembilan kali dengan PE 72 jam menggunakan kriteria penyaringan yang
sama seperti untuk gen PE. (XLSX)

Tabel S3. Daftar antibodi yang digunakan untuk analisis western blot. Karena konservasi
jalur CM dan enzim jalur, antibodi komersial terhadap enzim CM dari spesies lain dapat
digunakan untuk mendeteksi protein Aedes. (XLSX)

Tabel S4. Ekspresi gen CM pada nyamuk Met depleted. Ekspresi gen diferensial di iLuc dan
iMet dihitung dengan perbandingan dengan nyamuk PE 72 jam dengan tingkat penemuan
palsu (nilai P) 0,01 (Zou et al., 2013). Kontrol 72 jam PE dibandingkan dengan 6 jam PE.
(XLSX)

S5 Tabel. Primer yang digunakan untuk qPCR dan RNAi. (XLSX)