REGULASI EKSPRESI GEN

Dalam cakupan arus informasi biologis kami sejauh ini, kami telah mengidentifikasi
DNA sebagai gudang utama informasi genetik, kami telah melihat bagaimana DNA direplikasi
dan diperbaiki, dan kami telah memeriksa langkah-langkah yang terlibat dalam mengekspresikan
informasi genetik DNA melalui transkripsi dan terjemahan. Dalam menyimpulkan pertimbangan
aliran informasi kami, kami sekarang akan mengeksplorasi bagaimana berbagai langkah dalam
ekspresi gen diatur sehingga setiap produk gen dibuat pada waktu yang tepat dan dalam jumlah
yang tepat untuk kebutuhan setiap sel.
Regulasi adalah aspek penting dari hampir setiap proses di alam. Ini terutama berlaku
untuk ekspresi gen. Sebagian besar gen tidak diekspresikan sepanjang waktu. Dalam beberapa
kasus, ekspresi gen selektif memungkinkan sel menjadi hemat secara metabolik, hanya
mensintesis produk-produk gen yang langsung digunakan di bawah kondisi lingkungan yang
berlaku; ini sering terjadi dengan bakteri. Dalam organisme multiseluler, ekspresi gen selektif
memungkinkan sel untuk memenuhi peran khusus. Sebagai contoh, sel-sel di kulit, kuku, dan
rambut menghasilkan sejumlah besar keratin, sedangkan sel darah merah menghasilkan jumlah
besar hemoglobin. Memahami urutan kejadian yang menyebabkan perbedaan dramatis dalam
ekspresi gen antara sel mengharuskan kita untuk memahami secara terperinci bagaimana tipe sel
yang berbeda dapat memulai atau menghentikan pengekspresian gen tertentu sebagaimana
keadaan (dan identitas) mereka yang berubah menuntut.
Seperti yang Anda duga, pengetahuan pertama kami tentang pengaturan ekspresi gen
berasal dari mempelajari bakteri. Tetapi kemajuan selanjutnya dalam teknologi DNA telah
memungkinkan kemajuan besar dengan eukariota juga. Pertama-tama kita akan melihat bakteri
dan menyoroti beberapa mekanisme kontrol gen yang ditemukan dalam organisme ini, dan
kemudian kita akan beralih ke pertimbangan eukariota.
Pengaturan Gen Bakteri
Dari beberapa ribu gen yang ada dalam sel bakteri, beberapa sangat penting sehingga
mereka selalu aktif dalam pertumbuhan sel. Contoh-contoh gen konstitutif seperti itu termasuk
gen ribosom dan gen yang mengkode enzim glikolisis. Namun, untuk sebagian besar gen
lainnya, ekspresi diatur sehingga jumlah produk gen akhir — protein atau RNA — disesuaikan
dengan kebutuhan sel untuk produk tersebut. Sejumlah gen yang diatur ini menyandikan enzim
untuk proses metabolisme yang, tidak seperti glikolisis, tidak selalu dibutuhkan. Salah satu cara
mengatur konsentrasi intraseluler dari enzim tersebut adalah dengan memulai dan menghentikan
transkripsi gen dalam menanggapi kebutuhan seluler. Karena kontrol gen pengkode enzim ini
membantu sel bakteri beradaptasi dengan lingkungannya, maka umumnya disebut sebagai
sintesis enzim adaptif.
Jalur Katabolik dan Anabolik Diatur Melalui Induksi dan Represi, Masing-masing
Bakteri menggunakan pendekatan yang agak berbeda untuk mengatur sintesis enzim,
tergantung pada apakah enzim yang diberikan terlibat dalam jalur katabolik (degradatif) atau
anabolik (sintetis). Enzim yang mengkatalisasi jalur tersebut sering diatur secara terkoordinasi;
yaitu sintesis semua enzim yang terlibat dalam jalur tertentu dihidupkan dan dimatikan bersama.
Di sini kita menjelaskan secara singkat dua jalur yang dipahami dengan baik, satu jalur katabolik
dan satu jalur anabolik
Jalur Katabolik dan Induksi Substrat.
Enzim katabolik ada untuk tujuan utama mendegradasi substrat spesifik, seringkali
sebagai cara untuk memperoleh energi. Gambar 23-1 menggambarkan langkah-langkah dalam
jalur katabolik yang mendegradasi laktosa disakarida menjadi gula sederhana yang kemudian
dapat dimetabolisme oleh glikolisis. Langkah sentral dalam jalur ini adalah hidrolisis laktosa
menjadi glukosa monosakarida dan galaktosa, suatu reaksi yang dikatalisis oleh enzim b-
galaktosidase. Namun, sebelum laktosa dapat dihidrolisis, pertama-tama harus diangkut ke dalam
sel. Sebuah protein yang disebut galactoside permease bertanggung jawab atas transportasi ini,
dan sintesisnya diatur secara terkoordinasi dengan b-galactosidase.
711

GAMBAR 23-1 Pemecahan Laktosa: Suatu Jalur Katabolik Khas. Pemecahan disakarida laktosa
melibatkan enzim (kotak ungu) yang sintesisnya diatur secara terkoordinasi. Lihat Gambar 23-3
dan 23-4 untuk pengaturan dan pengaturan gen yang mengkode enzim ini. (Enzim yang
bertanggung jawab untuk katabolisme berikutnya dari glukosa monosakarida dan galaktosa
bukan bagian dari unit pengatur yang sama.)

Karena fungsi enzim katabolik adalah untuk mendegradasi substrat tertentu, enzim tersebut
hanya diperlukan ketika sel dihadapkan oleh substrat yang relevan. Enzim b-galactosidase,
misalnya, hanya berguna ketika sel-sel memiliki akses ke laktosa; dengan tidak adanya laktosa,
enzim tersebut berlebihan. Dengan demikian, masuk akal dalam hal ekonomi seluler untuk
sintesis b-galactosidase untuk dihidupkan, atau diinduksi, di hadapan laktosa tetapi harus
dimatikan jika tidak ada. Pengaktifan sintesis enzim ini disebut induksi substrat, dan enzim yang
sintesisnya diatur dengan cara ini disebut sebagai enzim yang diinduksi. Sebagian besar jalur
katabolik dalam sel bakteri tunduk pada induksi substrat enzim mereka.
Jalur Anabolik dan Represi Produk Akhir. Regulasi jalur anabolik dalam arti hanya kebalikan
dari itu untuk jalur katabolik. Untuk jalur anabolik, jumlah enzim yang diproduksi oleh sel
biasanya berkorelasi terbalik dengan konsentrasi intraseluler dari produk akhir jalur. Hubungan
seperti itu masuk akal. Misalnya, ketika konsentrasi triptofan naik, menguntungkan bagi sel
untuk menghemat sumber daya metaboliknya dengan mengurangi produksi enzim yang terlibat
dalam mensintesis triptofan. Tetapi sama pentingnya bahwa sel dapat mengubah produksi enzim-
enzim ini kembali ketika tingkat triptofan menurun lagi. Jenis kontrol ini dimungkinkan oleh
kemampuan produk akhir dari jalur anabolik — dalam contoh kita, triptofan — untuk menekan
atau mengurangi produksi enzim lebih lanjut yang terlibat dalam pembentukannya. Pengurangan
dalam ekspresi gen pengkode enzim ini disebut represi produk akhir. Sebagian besar jalur
biosintetik dalam sel bakteri diatur dengan cara ini

Represi adalah istilah umum dalam genetika molekuler, mengacu pada pengurangan ekspresi gen
yang diatur. Represi genetik sejati selalu berdampak pada sintesis protein, tidak hanya pada
aktivitas protein. Ingat dari Bab 6 bahwa produk akhir dari jalur biosintetik sering memiliki efek
penghambatan pada aktivitas enzim juga. Penghambatan umpan balik ini berbeda dari represi
baik dalam mekanisme maupun hasil. Dalam penghambatan umpan balik, molekul enzim masih
ada, tetapi aktivitas katalitiknya terhambat. Dalam represi produk akhir, molekul enzim bahkan
tidak dibuat

.Molekul Effector. Salah satu fitur yang umum untuk induksi dan represi sintesis enzim adalah
kontrol dipicu oleh molekul organik kecil yang ada di dalam sel atau di sekitar sel. Para ahli
genetika menyebut molekul organik kecil yang berfungsi dengan cara ini sebagai efektor. Untuk
jalur katabolik, efektor hampir selalu merupakan substrat (laktosa dalam contoh kita), dan
mereka berfungsi sebagai penginduksi ekspresi gen dan, dengan demikian, sintesis enzim. Untuk
jalur anabolik, efektor biasanya merupakan produk akhir (tryptophan dalam contoh kami), dan
biasanya mengarah pada represi ekspresi gen dan dengan demikian represi sintesis enzim.

Gen-gen yang Terlibat dalam Katabolisme Laktosa Diatur menjadi Operon yang Diinduksi

Contoh klasik dari sistem enzim yang dapat diinduksi terjadi dalam bakteri Escherichia coli dan
melibatkan sekelompok enzim yang terlibat dalam katabolisme laktosa — enzim yang
mengkatalisasi langkah-langkah yang ditunjukkan pada Gambar 23-1. Banyak dari apa yang kita
ketahui tentang kontrol ekspresi gen pada bakteri, termasuk kosakata yang digunakan untuk
menyatakan pengetahuan itu, didasarkan pada studi perintis sistem ini yang dilakukan oleh ahli
genetika molekuler Prancis, François Jacob dan Jacques Monod, yang menerima Hadiah Nobel
dalam Fisiologi atau Kedokteran pada tahun 1965 untuk pekerjaan mereka. Pada tahun 1961,
Jacob dan Monod menerbitkan sebuah makalah klasik yang mungkin lebih memengaruhi
pemahaman kita tentang pengaturan gen daripada karya lain.

Dalam makalah mereka, Jacob dan Monod mengusulkan model umum regulasi gen dengan
implikasi yang luas. Landasan dari model ini bertumpu pada penemuan mereka bahwa kontrol
katabolisme laktosa melibatkan dua jenis gen: yang pertama adalah gen yang mengkode enzim
yang terlibat dalam penyerapan dan metabolisme laktosa, dan yang kedua adalah gen pengatur
yang produknya mengontrol aktivitas yang pertama. set gen. Gen yang terlibat dalam
metabolisme laktosa adalah (1) gen lacZ, yang mengkode b-galactosidase, enzim yang
menghidrolisis laktosa dan b-galaktosida lainnya; (2) gen lacY, yang mengkode galaktosid,
protein membran plasma yang mengangkut laktosa ke dalam sel; dan (3) lacAgene, yang
mengkode transasetlaslas yang menambahkan gugus asetil ke laktosa saat diambil oleh sel. Gen
lacZ, lacY, dan lacA terletak berdampingan dalam kromosom bakteri dan diekspresikan hanya
ketika induser seperti laktosa hadir. Secara keseluruhan, pengamatan ini mengarahkan Jacob dan
Monod untuk menyarankan bahwa ketiga gen itu milik satu unit pengatur tunggal, atau,
sebagaimana mereka menyebutnya, sebuah operon — sekelompok gen dengan fungsi terkait
yang dikelompokkan bersama dengan sekuens DNA yang memungkinkan gen tersebut untuk
dihidupkan dan dimatikan secara bersamaan.

Organisasi gen terkait fungsi menjadi operon biasanya diamati pada prokariota tetapi kurang
umum pada eukariota. Dalam nematoda Caenorhabditis elegans, misalnya, sekitar 15% gen
ditemukan di operon; Namun, tidak seperti pada bakteri, gen dalam operon dalam C. elegans
tidak selalu terkait secara fungsional. Meskipun demikian, model operon menetapkan beberapa
prinsip dasar yang telah membentuk pemahaman kita tentang regulasi transkripsional dalam
sistem prokariotik dan eukariotik.

712
Organisasi gen terkait fungsi menjadi operon biasanya diamati pada prokariota tetapi kurang
umum pada eukariota. Dalam nematoda Caenorhabditis elegans, misalnya, sekitar 15% gen
ditemukan di operon; Namun, tidak seperti pada bakteri, gen dalam operon dalam C. elegans
tidak selalu terkait secara fungsional. Meskipun demikian, model operon menetapkan beberapa
prinsip dasar yang telah membentuk pemahaman kita tentang regulasi transkripsional dalam
sistem prokariotik dan eukariotik.

Lac operon diatur secara negatif oleh lac Repressor

Fitur utama dari model operon adalah sebuah gagasan bahwa gen dengan fungsi terkait
metabolisme dikelompokkan bersama sehingga transkripsi dapat diatur sebagai satu kesatuan.
Tetapi bagaimana pengaturan ini dicapai? Jacob dan Monod menjawab pertanyaan ini dengan
mempelajari kemampuan penginduksi seperti laktosa untuk mengaktifkan produksi enzim yang
terlibat dalam metabolisme laktosa. Mereka menemukan bahwa agar terjadi induksi, gen
tambahan harus ada — gen pengatur yang mereka namai lacI (untuk inducibilitas). Sedangkan
bakteri normal akan menghasilkan b-galaktosidase, galaktosid permease, dan transasetilase
hanya ketika induser hadir, penghapusan gen lacI menghasilkan sel yang selalu menghasilkan
protein ini, bahkan ketika induser tidak ada. Oleh karena itu Jacob dan Monod menyimpulkan
bahwa gen lacI mengkode produk yang biasanya menghambat, dan dengan demikian mengatur,
ekspresi gen lacZ, lacY, dan lacA. Produk gen pengatur yang menghambat ekspresi gen lain
disebut protein penekan.
Untuk memahami bagaimana represor dapat mengatur ekspresi gen, kita perlu melihat lebih
dekat pada organisasi gen yang terlibat dalam metabolisme laktosa. Seperti yang ditunjukkan
Gambar 23-2, lac operon terdiri dari gen lacZ, lacY, dan lacA yang didahului oleh promoter
(Plac) dan urutan nukleotida khusus yang disebut operator (O), yang sebenarnya tumpang tindih
dengan promotor. Transkripsi lac operon dimulai pada promotor, yang merupakan tempat
perlekatan RNA polimerase, dan kemudian dilanjutkan melalui operator dan gen lacZ, lacY, dan
lacA hingga akhirnya berakhir pada urutan terminator. Hasil bersihnya adalah molekul tunggal
pengkodean mRNA untuk produk polipeptida dari ketiga gen. Molekul mRNA tersebut, yang
mengkode lebih dari satu polipeptida, disebut mRNAs polikistronik.
Keuntungan dari pengelompokan gen terkait ke dalam operon untuk transkripsi menjadi mRNA
polikistronik tunggal adalah bahwa hal itu memungkinkan sintesis beberapa polipeptida untuk
dikendalikan dalam satu langkah tunggal. Langkah penting dalam kontrol ini adalah interaksi
antara lokasi operator dalam DNA dan protein penekan. Interaksi antara elemen-elemen operasi
lac ini digambarkan pada Gambar 23-3. Protein penekan, yang disebut penekan lac, dikodekan
oleh gen pengatur lacI, yang terletak di luar operon (meskipun kebetulan terletak berdekatan
dengan operon lac yang diaturnya). Penekan lac adalah protein pengikat DNA yang secara
khusus mengenali dan mengikat ke lokasi operator operon lac. Ketika represor terikat ke operator
(Gambar 23-3a), RNA polimerase diblokir dari bergerak ke bawah lac operon dan menyalin gen
lacZ, lacY, dan lacA. Dengan kata lain, untuk menggunakan singkatan biologi molekuler umum,
pengikatan represor ke operator membuat gen operon "dimatikan."

Gambar 23-2

Gambar 23-2 Laktosa (lac) operon dari E. coli. Lac operon terdiri dari segmen DNA yang
mencakup tiga gen yang berdekatan (lacZ, lacY, dan lacA), yang ditranskripsi dan diatur secara
terkoordinasi. Kode lacI gen pengatur terdekat untuk protein penekan lac R. Baik gen regulator
dan lac operon itu sendiri mengandung promotor (PI dan Plac, masing-masing) di mana RNA
polimerase mengikat dan terminator di mana transkripsi berhenti. Letakkan tumpang tindih
dengan tempat operator (O) tempat bentuk aktif dari protein penekan mengikat. Operon
ditranskripsi menjadi molekul panjang tunggal mRNA yang mengkode ketiga polipeptida. Untuk
perincian peraturan, lihat Gambar 23-3.

713
GAMBAR 23-3 Peraturan Operon lac. (a) Transkripsi operasi lac diatur dengan mengikat dari represor
lac (R) ke operator. (B) Aktivitas represor lac pada gilirannya diatur oleh interaksinya
dengan sebuah bentuk dari laktosa disebut allolactose (L).

Keterangan :

a. Tidak ada laktosa, represor terikat pada operator, operon ditekan. Dengan tidak adanya laktosa,
represor tetap terikat pada operator, dan karena itu RNA polimerase dicegah dari bergerak ke bawah
operon lak dan menyalin gen-gennya.
b. Kehadiran laktosa, represor tidak terikat ke operator, operon diturunkan. Di hadapan laktosa,
represor diubah menjadi bentuk tidak aktif, yang tidak mengikat operator. Karenanya RNA
polimerase dapat bergerak melewati operator dan mentranskripsi gen lacZ, lacY, dan lacA ke dalam
mRNA tunggal.

Jika mengikat represor ke operator secara normal memblok transkripsi, bagaimana sel
“menghidupkan” transkripsi lac operon? Jawabannya adalah bahwa molekul induser berikatan
dengan represor lac, sehingga mengubah konformasinya sehingga represor kehilangan
kemampuan untuk berikatan dengan operator situs dalam DNA. Setelah lokasi operator tidak lagi
tersumbat oleh represor, RNA polimerase dapat mengikat ke promotor dan melanjutkan ke
operon, menyalin gen lacZ, lacY, dan lacA ke dalam molekul mRNA polycistronic tunggal
(Gambar 23-3b).

Karenanya, fitur penting dari protein represor adalah kemampuannya untuk eksis dalam dua
bentuk, hanya satu yang mengikat operator. Dengan kata lain, repressoris merupakan protein
alosterik. Seperti yang telah kita pelajari di Bab 6, protein alosterik dapat eksis di salah satu dari
dua keadaan konformasi, tergantung pada apakah molekul efektor yang sesuai ada atau tidak.
Dalam satu keadaan protein aktif; di negara lain itu tidak aktif, atau hampir jadi. Ketika molekul
efektor mengikat protein, ia menginduksi perubahan dalam keadaan konformasi protein dan
karenanya dalam aktivitasnya. Pengikatan mudah dibalik, bagaimanapun, dan keberangkatan
efek atau hasil dalam pengembalian cepat protein ke bentuk alternatif.

Gambar 23-3 menunjukkan interaksi yang dapat dibalik dari represor lac dengan efektornya,
yang sebenarnya bukan laktosa itu sendiri tetapi allolaktosa, isomer laktosa yang diproduksi
setelah laktosa memasuki sel. Dengan tidak adanya allolaktosa, represor mengikat operator lac
dan menghambat transkripsi operasi lac. Tetapi pengikatan allolactose ke repressor mengubah
repressor menjadi bentuk konformasi yang tidak lagi dapat mengikat operator lac dan
menghambat transkripsi. Dengan cara ini, laktosa memicu induksi enzim yang dikodekan oleh
operon lac. Eksperimen yang melibatkan operon lac biasanya dilakukan menggunakan sintetis b-
galactoside isopropylthiogalactoside (IPTG) daripada laktosa atau allolaktosa sebagai molekul
penginduksi. IPTG adalah penginduksi yang baik dari sistem tetapi tidak dapat dimetabolisme
oleh sel, sehingga penggunaannya menghindari kemungkinan komplikasi dari berbagai tingkat
efektor yang disebabkan oleh katabolismenya. Mengikuti penggunaan umum, kita sekarang
dapat secara formal mendefinisikan istilah induser sebagai merujuk pada molekul efektor yang
mengaktifkan transkripsi operon yang diinduksi. Karena operon lac dimatikan kecuali diinduksi,
dikatakan operon diinduksi. Untuk mem-brow istilah komputer, "status default" dari operasi
yang diinduksi mati. Meskipun kami telah fokus sejauh ini pada kontrol operon tunggal, itu
adalah hal yang umum untuk suatu peraturan individual protein untuk bertindak pada beberapa
operon, memungkinkan banyak gen untuk diatur secara terkoordinasi.

714
Studi tentang Bakteri Mutant Terungkap

Bagaimana Operon lac Diorganisasikan. Banyak bukti awal yang mengarah pada model operon
melibatkan analisis genetik bakteri mutan yang menghasilkan jumlah abnormal enzim lac operon
atau menunjukkan respons abnormal terhadap penambahan atau penghilangan laktosa. Mutasi ini
ditemukan berada di gen operon (lacZ, lacY, atau lacA) atau dalam elemen pengaturan sistem (O,
Plac, atau lacI). Kedua kelas mutasi ini dapat dengan mudah dibedakan karena mutasi pada gen
operon hanya memengaruhi satu protein tunggal, sedangkan mutasi pada daerah pengatur
biasanya memengaruhi ekspresi semua gen operon secara terkoordinasi.

Tabel 23-1 merangkum mutasi ini dan fenotipenya, dimulai pada baris 1 dengan fenotip yang
dapat diinduksi dari sel tipe liar (nonmutant). Tanda-tanda plus di kolom fenotip tabel
menunjukkan tingkat enzim yang tinggi. Tanda-tanda minus menunjukkan tingkat enzim yang
sangat rendah, meskipun bukan penghentian total produksi enzim. Bahkan dengan tidak adanya
laktosa, sel tipe liar menghasilkan sejumlah kecil enzim lac karena pengikatan represor ke
operator bersifat reversibel — represor aktif terkadang “jatuh” pada operator. Hasilnya rendah
Tingkat transkripsi latar belakang rendah yang dihasilkan adalah penting karena memungkinkan
sel untuk menghasilkan cukup izin galaktosida untuk memfasilitasi transportasi awal molekul
laktosa ke dalam sel sebelum induksi operasi lac.

Meneliti Tabel 23-1 harus membantu memperjelas bagaimana analisis fenotipe genetik membuat
Jacob dan Monod merumuskan model operon regulasi gen. Kami akan mempertimbangkan
masing-masing dari enam jenis mutasi yang ditunjukkan pada baris 2-7 dari tabel ini pada
gilirannya. Saat kami melakukannya, Anda harus dapat melihat bagaimana masing-masing jenis
mutasi berkontribusi pada formulasi model operon.

Mutasi Gen Operon

Mutasi pada gen lacY atau lacZ dapat menyebabkan produksi enzim yang berubah dengan
sedikit atau tanpa aktivitas biologis, bahkan di hadapan induser (Tabel 23-1, baris 2 dan 3).
Karena itu mutan seperti itu tidak dapat memanfaatkan laktosa sebagai sumber karbon, baik
karena mereka tidak dapat mengangkut laktosa secara efisien ke dalam sel (Y -mutan) atau
karena mereka tidak dapat memotong ikatan glikosidik antara galaktosa dan glukosa dalam
molekul laktosa (Zmutan). Perhatikan bahwa mutasi pada gen bakteri atau sekuens pengaturan
yang membuatnya cacat ditunjukkan dengan tanda minus superskrip. Sebagai contoh, genotipe
bakteri yang membawa gen Y yang rusak ditulis sebagai Y -. Alel tipe liar ditandai dengan tanda
plus superskrip.

Mutasi Operator

Mutasi pada operator dapat menyebabkan fenotip konstitutif; yaitu, sel-sel mutan akan terus-
menerus menghasilkan enzim lac, apakah induser ada atau tidak (Tabel 23-1, baris 4). Mutasi-
mutasi ini mengubah urutan dasar DNA operator sehingga tidak lagi dikenali oleh represor.
Genotipe dari mutan operator-konstitutif seperti itu diwakili sebagai Oc. Seperti yang diharapkan
untuk mutasi dalam situs pengatur, mutasi Oc secara simultan mempengaruhi sintesis ketiga
enzim lac dengan cara yang sama.

Mutasi Promotor

Mutasi promotor dapat menurunkan afinitas RNA polimerase untuk promotor. Akibatnya, lebih
sedikit molekul RNA polimerase mengikat per unit waktu ke promotor, dan laju produksi mRNA
menurun. (Namun, begitu molekul RNA polimerase menempel pada DNA dan mulai transkripsi,
molekul RNA memanjang pada tingkat normal.) Biasanya, mutasi promotor (P-) dalam operon
lac menurunkan baik peningkatan kadar enzim yang diproduksi di hadapan penginduksi dan
tingkat basal yang rendah dari produksi enzim lac berhasil mengatur sel tanpa adanya
penginduksi (Tabel 23-1, baris 5).
715

Mutasi Gen Regulatori. Mutasi pada gen lacI ada dua jenis. Beberapa mutan gagal menghasilkan
enzim lac, terlepas dari apakah induser ada, dan karena itu disebut mutan superrepresor (I pada
Tabel 23-1, baris 6). Entah molekul penekan dalam mutan seperti itu telah kehilangan
kemampuannya untuk mengenali dan mengikat induser tetapi masih dapat mengenali operator
atau yang lain memiliki afinitas tinggi untuk operator terlepas dari apakah inducer terikat
padanya. Dalam kedua kasus, represor mengikat erat ke operator dan menekan transkripsi, dan
karenanya sintesis enzim, dalam semua kondisi.

Kelas lain dari mutasi lacI melibatkan sintesis protein penekan mutan yang tidak mengenali
operator (atau, dalam beberapa kasus, tidak disintesis sama sekali). Operon lac dalam I - mutan
seperti itu tidak dapat dimatikan, dan karena itu enzim disintesis secara konstitutif (Tabel 23-1,
baris 7).

I - mutan, bersama dengan Oc dan P-mutan, menggambarkan pentingnya pengenalan spesifik

sekuens basa DNA oleh protein pengatur selama kontrol transkripsi gen. Perubahan kecil — baik
dalam urutan DNA promotor atau operator, atau dalam protein pengatur yang mengikat operator
— dapat secara dramatis memengaruhi ekspresi semua gen dalam operon.

Tes Cis-Trans Menggunakan Bakteri Diploid Sebagian. Keberadaan dua jenis mutan konstitutif
yang berbeda, Oc dan I -, menimbulkan pertanyaan tentang bagaimana satu jenis dapat
dibedakan dari yang lain. Tes cis-trans sering digunakan untuk membedakan antara mutasi cis-
bertindak, yang mempengaruhi situs DNA (misalnya, Oc), dan mutasi trans-akting, yang
mempengaruhi protein (misalnya, I -). Dasar dari uji cis-trans adalah sel (atau organisme) yang
memiliki dua salinan berbeda dari segmen DNA yang diminati. Seperti yang Anda ketahui, E.
coli biasanya haploid, tetapi Jacob dan Monod membuat sebagian bakteri diploid dengan
memasukkan salinan kedua bagian lac dari genom bakteri ke dalam plasmid F-faktor sel F +
(halaman 622). Salinan kedua ini dapat ditransfer dengan konjugasi ke bakteri inang dari
genotipe lac yang diinginkan untuk membuat diploid parsial seperti jenis yang tercantum dalam
Tabel 23-2.

-
Jika hanya satu salinan operon yang berisi mutasi regulasi I atau Oc, dimungkinkan untuk
menentukan apakah mutasi memiliki efek pada kedua salinan operon atau hanya pada salinan
operon di mana ia berada. Mutasi dikatakan bertindak dalam cis jika satu-satunya gen yang
terkena adalah mereka yang secara fisik terkait dengan lokus mutan (cis berarti "di sisi ini,"
dalam hal ini mengacu pada mutasi yang pengaruhnya terbatas pada gen yang terletak dalam
salinan fisik yang sama dari operasi lac). Sebaliknya, mutasi dikatakan bertindak dalam trans jika
gen di kedua salinan operon terpengaruh (trans berarti "di sisi lain," dalam hal ini mengacu pada
kemampuan mutasi untuk entah bagaimana mempengaruhi salinan lain dari Oper lac).

Untuk menentukan salinan operon lac yang diekspresikan dalam populasi sel tertentu, Jacob dan
Monod menggunakan sel diploid parsial yang mengandung satu salinan operon lac dengan gen Z
yang rusak dan salinan lainnya dengan gen Y yang rusak. Tabel 23-2 menunjukkan apa yang
terjadi jika salah satu dari salinan lac operon ini memiliki alel I - yang rusak dan yang lainnya
memiliki alel I + normal. Dalam sel-sel tersebut, b-galaktosidase dan permisen tidak dapat
diinduksikan, meskipun gen fungsional untuk salah satu enzim ini (alel Z + untuk b-
galaktosidase) secara fisik terkait dengan gen I yang rusak (Tabel 23-2, baris 3). Kita sekarang
tahu bahwa ini terjadi karena satu gen I fungsional yang ada dalam sel menghasilkan molekul
penekan aktif yang berdifusi melalui sitosol dan berikatan dengan kedua lokasi operator tanpa
adanya laktosa. Oleh karena itu represor dikatakan sebagai faktor trans-acting (istilah faktor
mengacu pada protein dalam konteks ini).

Hasil yang cukup berbeda diperoleh dengan diploid parsial yang mengandung alel O + dan Oc
(Tabel 23-2, baris 4). Dalam hal ini, gen-gen yang terkait dengan alel Oc secara konstitusional
ditranskripsikan (Z + Y-), sedangkan yang terkait dengan alel tipe liar tidak dapat diinduksi (Z-Y
+). Dengan kata lain, O locus bertindak dalam cis; itu mempengaruhi perilaku gen hanya di
operon itu secara fisik bagian dari. Spesifisitas cis seperti itu adalah karakteristik mutasi yang
memengaruhi situs pengikatan pada DNA daripada produk protein gen. Seperti sekuens DNA
nonkode lain yang terlibat dalam kontrol ekspresi gen, situs O dikatakan sebagai elemen
penggerak cis (istilah elemen mengacu pada sekuens asam nukleat dalam konteks ini).

716

Catabolite Activator Protein (CAP) secara positif Mengatur Operac lac

Dalam keadaan normal, kita telah melihat bahwa operon lac berada di bawah regulasi
negatif: Biasanya dimatikan dan hanya dihidupkan ketika laktosa hadir. Tetapi bagaimana jika
kedua laktosa dan glukosa hadir? Glukosa adalah sumber energi yang disukai untuk hampir
semua sel karena enzim dari jalur glikolitik dan asam trikarboksilat (TCA) biasanya diproduksi
secara terus menerus. Memang, sel-sel E. coli yang tumbuh di hadapan glukosa dan laktosa
menggunakan glukosa secara istimewa dan memiliki tingkat enzim yang sangat rendah yang
dikodekan oleh operon lac, meskipun terdapat penginduksi untuk operon itu. Sel bakteri
karenanya harus memiliki cara untuk menjamin bahwa sumber karbon lain hanya digunakan
ketika glukosa tidak tersedia. Fenomena ini, dikenal sebagai represi katabolit, mengacu pada
kemampuan glukosa untuk menghambat sintesis enzim katabolik yang dihasilkan oleh operon
bakteri yang diinduksi. Represi katabolit adalah contoh penting dari kontrol transkripsi positif.

Seperti mekanisme pengaturan lain yang kami temui, penggunaan glukosa yang istimewa
ini dimungkinkan oleh mekanisme kontrol genetik yang melibatkan protein pengatur alosterik
dan molekul efektor yang kecil. Molekul efektor aktual yang mengontrol ekspresi gen bukanlah
glukosa tetapi sinyal sekunder yang mencerminkan tingkat glukosa dalam sel. Sinyal sekunder
ini adalah bentuk AMP yang disebut siklik AMP atau cAMP (lihat Gambar 14-6). Glukosa
bekerja dengan secara tidak langsung menghambat adenylyl cyclase, enzim yang mengkatalisis
sintesis cAMP dari ATP. Jadi semakin banyak glukosa, semakin sedikit cAMP dibuat.

Bagaimana cAMP memengaruhi ekspresi gen? Efektor lain, bertindak dengan mengikat
protein pengatur alosterik. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 23-4, protein pengatur khusus
ini, yang disebut protein aktivator katabolit (CAP), atau protein reseptor cAMP, adalah protein
aktivator yang mengaktifkan transkripsi. Dengan sendirinya, CAP tidak berfungsi. Tetapi ketika
kompleks dengan cAMP, CAP dapat mengikat urutan basa tertentu dalam operon yang
menghasilkan enzim katabolik. Urutan dasar ini, CAP-binding ini, terletak di bagian atas
promotor. Gambar 23-4 menunjukkan lokasi situs pengikatan CAP (berlabel C) di operon lac.
Situs serupa terjadi pada operon yang diinduksi terlibat dalam metabolisme banyak gula , seperti
sukrosa, galaktosa, dan operon arabinosa. Ketika CAP, dalam bentuk aktifnya (yaitu kompleks
CAP-cAMP), menempel pada salah satu situs pengenalannya dalam DNA, pengikatan RNA
polimerase ke promotor ditingkatkan, dengan demikian merangsang inisiasi transkripsi. Jadi,
ketika glukosa tidak ada, CAP memiliki efek positif pada ekspresi gen dari operon lac. CAP-
cAMP kompleks meningkatkan transkripsi diinduksi operon. Sebagai contoh, transkripsi operasi lac
dapat ditingkatkan lima kali lipat dengan cara asalkan penekan untuk operasi itu telah dinonaktifkan oleh
kehadiran efektornya (yaitu, allolactose).

Situasi ini dapat berubah ketika konsentrasi glukosa di dalam sel tinggi. Dalam hal ini,
konsentrasi cAMP turun dan CAP sebagian besar dalam bentuk tidak aktif. Oleh karena itu CAP
tidak dapat merangsang transkripsi operasi lac. Dengan cara ini, sel-sel mematikan sintesis enzim
katabolik yang tidak diperlukan ketika glukosa tersedia secara melimpah sebagai sumber energi.

Gambar 23.4: Protein Aktivator Katabolit (CAP) dan Proteinnya Fungsi. CAP adalah protein
alosterik yang dikonversi menjadi bentuk aktifnya dengan cara mengikat siklik AMP (cAMP), yang
konsentrasinya dipengaruhi oleh kadar glukosa. Dua kompleks CAP-cAMP memediasi represi katabolit
dengan mengikat DNA dan mengaktifkan transkripsi berbagai operon yang diinduksi, termasuk operasi
lac yang ditunjukkan di sini.

717

Operon lac adalah contoh dari Dual kontrol Ekspresi Gen

Seperti yang baru saja kita lihat, operon lac tunduk kontrol positif dan negatif. Memang,
sebagian besar gen yang diatur ketat dalam prokariota dan eukariota berada di bawah dual
kontrol tersebut. Untuk menjaga agar jenis kontrol transkripsi negatif dan positif tetap jelas
dalam pikiran Anda, tanyakan tentang efek utama dari protein pengatur yang mengikat pada
DNA operon. Jika, dalam pengikatan pada DNA, protein pengatur mencegah atau mematikan
transkripsi, maka itu adalah bagian dari mekanisme kontrol negatif. Di sisi lain, jika ikatannya
dengan DNA menghasilkan aktivasi atau peningkatan transisi, maka protein pengatur merupakan
bagian dari mekanisme kontrol positif. Struktur Kompleks Penekan / Operator lac
mengkonfirmasi Model Operon Pada tahun 1996, Mitchell Lewis, Ponzy Lu, dan rekan
melaporkan struktur protein penekan lac yang terikat dengan DNA (Gambar 23-5). Struktur ini
mengkonfirmasi wawasan genetik dan biokimia sebelumnya tentang bagaimana transkripsi
diatur secara rinci. Protein represor yang dikodekan oleh gen lacl (Gambar 23-5a) benar-benar
berinteraksi dengan DNA operator sebagai tetramer (ic., Empat salinan protein bertindak
bersama-sama; Gambar 23-5b) represor mengikat operator utama, disebut O1 yang panjangnya
21 pasangan basa. Selain itu, ada dua sekuens DNA operator lainnya, disebut O2 dan O3 Ketika
represor terikat ke O1 dan O3 yang dianggap menyebabkan DNA menyiksa sebuah loop, yang
mana menghambat pergerakan RNA polimerase. Loop dianggap cukup besar sehingga CAP
dapat mengikat ke DNA bahkan ketika DNA di-loop (Gambar 23-5c). Ketika allolactose
berikatan di situs induser, konformasi protein berubah sehingga tidak dapat lagi berinteraksi
dengan DNA, loop menjadi rileks, dan RNA polimerase dapat bergerak di sepanjang DNA untuk
menyalin operasi lac. Gen-gen yang Terlibat dalam Sintesis Tryptophan Diatur menjadi Operon
yang Dapat Ditekan Meskipun banyak pekerjaan yang mengarah pada formula awal konsep
operon melibatkan operon E. coli, banyak sistem pengaturan bakteri lainnya sekarang diketahui
mengikuti umum yang sama pola. Pengodean operon untuk sekutu menyerupai operon lac yang
dapat diinduksi; yaitu, mereka dihidupkan oleh efektor alosterik tertentu, biasanya substrat
untuk jalur yang terlibat. Sebaliknya, operon yang mengatur enzim yang terlibat dalam jalur
anabolik (biosintetik) adalah operon yang dapat ditekan, mereka dimatikan secara alosterik,
biasanya oleh efektor yang merupakan produk akhir dari jalur. Operon tryptophan (trp) adalah
contoh yang baik dari operon yang menekan. Operon trp berisi gen yang mengkode enzim untuk
enzim yang terlibat dalam enzim triptofan yang terlibat dalam jalur katabolik yang dihasilkan
adalah contoh yang baik dari operon yang dapat ditekan. Oper trp berisi gen yang mengkode
enzim untuk terlibat dalam biosintesis triptofan, bersama dengan sekuens DNA yang mengatur
produksi enzim ini. Molekul efektor dalam hal ini adalah produk akhir dari jalur biosintetik,
asam amino triptofan. Produksi enzim yang dikode oleh operon trp ditekan di hadapan
tryptophan dan ditekan jika tidak ada (Gambar 23-6a). Gen pengatur untuk operon ini, yang
disebut trpR, kode untuk protein penekan trp yang - berbeda dengan represor lak - aktif
(mengikat DNA operator) ketika efektor melekat padanya dan tidak aktif dalam bentuk
bebasnya. Efektor dalam sistem tersebut (dalam hal ini, triptofan) kadang-kadang disebut
sebagai corepressor karena diperlukan, bersama dengan protein represor, untuk mematikan
transkripsi operon.

GAMBAR 23-5 Struktur Kompleks lac Repressor / Operator. Model operon represor lac terikat pada
DNA operator, berdasarkan pada struktur kristal sinar-X. (a) Monomer represor, (b) Dimer represor
terikat pada dua segmen 21-base-pair dari DNA operator (biru muda). (c) Penekan (merah muda) dan
CAP (biru muda) terikat ke DNA lac. Mengikat ke daerah operator O, dan O menyebabkan loop
terbentuk pada DNA promotor yang menekan transkrip yang menunjukkan situs pengikatan penginduksi,
dan situs pengikatan DNA berwarna merah. Dari M. Lewis, et al., "Struktur Kristal dari Penekan Operon
Laktosa dan Kompleksitasnya dengan DNA dan Induser.
 718

a) Tryptophan hadir, represor terikat ke operator,

operon ditekan. Ketika kompleks dengan triptofan,
protein represor yang dihasilkan oleh gen trpR
berikatan erat dengan trpoperator, sehingga
mencegah RNA polimerase dari menyalin gen-gen
operon.

b) Tidak ada triptofan, represor tidak terikat operator,

operon tertekan. Dengan tidak adanya triptofan,
trprepressor gratis tidak dapat mengikat ke lokasi operator. RNA polimerase karena itu dapat bergerak
melewati operator dan menyalin gen trpoperon, memberikan sel kemampuan untuk mensintesis
tryptophan.
GAMBAR 23-6 Peraturan Operon Tryptophan (trp) oleh Represor trp. Trpoperon E. coli terdiri dari
segmen DNA yang mencakup lima gen yang berdekatan (trpE, trpD, trpC, trpB, dan trpA) serta urutan
promoter (P trp), operator (O), dan leader (L). Gen-gen tersebut diatur dan ditranskripsi sebagai satu unit,
menghasilkan pesan polikistronik yang mengkode enzim-enzim yang terlibat dalam mensintesis triptofan.
Peran pengaturan tambahan yang dimainkan oleh segmen pemimpin mRNA akan dijelaskan pada Gambar
23-7 dan 23-8.

Faktor-faktor Sigma Menentukan Set Gen Yang Dapat Dinyatakan

Selain menggunakan protein pengatur yang mengaktifkan atau menekan operon tertentu, sel
bakteri juga menggunakan faktor sigma yang berbeda untuk mengontrol gen mana yang akan
ditranskripsi. Ingat dari Bab 21 bahwa inisiasi transkripsi yang tepat pada bakteri membutuhkan
enzim inti RNA polimerase untuk dikombinasikan dengan faktor sigma, sejenis protein yang
mengenali sekuens promotor gen. Dalam E. coli faktor sigma yang paling umum adalah s70,
yang memulai transkripsi gen yang produknya diperlukan untuk pertumbuhan rutin dan
metabolisme. Namun, perubahan dalam lingkungan sel, seperti kenaikan suhu, radiasi UV, atau
keasaman, dapat memicu penggunaan faktor sigma alternatif, seperti s dan s32. Ketika salah satu
dari faktor-faktor sigma alternatif ini terikat dengan enzim inti RNA polimerase, pengenalan
promotor diubah, dengan demikian memulai transkripsi gen penyandi protein yang membantu sel
beradaptasi dengan lingkungan yang diubah. Namun faktor sigma lain, s54, memungkinkan RNA
polimerase untuk secara istimewa menyalin gen yang produknya meminimalkan perlambatan
pertumbuhan dalam kondisi pembatasan nitrogen.

Perbedaan signifikan diamati pada jumlah dan jenis faktor sigma yang ditemukan pada berbagai
jenis bakteri. Sebagai contoh, E. colihas sekitar setengah lusin faktor sigma, sedangkan bakteri
tanah Bacillus subtilis dan Streptomyces coelicolor menggunakan lebih dekat ke 20 dan 60
faktor sigma yang berbeda, masing-masing. Dalam beberapa kasus, faktor sigma yang mengatur
transkripsi bakteri dihasilkan oleh bakteriofag. Pengaturan seperti itu memungkinkan bakteriofag
menginfeksi sel bakteri dan mengambil alih mesin transkripsionalnya dengan menghasilkan
faktor sigma spesifik yang berikatan dengan RNA polimerase bakteri dan menyebabkannya
hanya mengenali promotor virus.

719
Atenuasi Memungkinkan Transkripsi Diatur Setelah Langkah Inisiasi

Mekanisme pengaturan yang dibahas sejauh ini mengendalikan inisiasi transkripsi. Bakteri juga
menggunakan mekanisme pengaturan yang beroperasi setelah langkah inisiasi. Contoh klasik
pertama kali ditemukan ketika Charles Yanofsky dan rekan-rekannya menemukan bahwa operon
trp dari E. coli memiliki jenis baru situs pengaturan yang terletak antara promotor / operator dan
gen pertama operon, trp E. Rentang DNA ini, yang disebut pemimpin urutan (atau L),
ditranskripsi untuk menghasilkan segmen pemimpin mRNA, panjang 162 nukleotida, terletak di
ujung 5 'dari mRNA trp polikistronik (lihat Gambar 23-6b).

Analisis transkrip operon trp dibuat dalam berbagai kondisi mengungkapkan bahwa, seperti yang
diharapkan, panjang penuh, mRNA trp polikistronik diproduksi ketika triptofan langka. Ini
memungkinkan enzim

jalur biosintetik tryptophan akan disintesis, dan karenanya jalur menghasilkan lebih banyak
triptofan. Di sisi lain, ketika triptofan hadir, transkripsi gen yang mengkode enzim jalur triptofan
dihambat — juga seperti yang diharapkan. Namun, hasil yang tidak terduga adalah bahwa DNA
paling sesuai

dari urutan pemimpin masih dapat ditranskripsikan dalam kondisi seperti itu, meskipun mRNA
polikistron penuh panjang tidak diproduksi. Berdasarkan temuan ini, Yanofsky menyarankan
bahwa urutan pemimpin mengandung elemen kontrol yang lebih sensitif daripada mekanisme
penekan trp dalam menentukan apakah terdapat cukup triptofan untuk mendukung sintesis
protein. Urutan kontrol ini entah bagaimana menentukan bukan apakah transkripsi operon trp
dapat dimulai, tetapi apakah itu akan terus selesai. Kontrol semacam itu disebut pelemahan
karena perannya dalam menipiskan, atau mengurangi, sintesis mRNA.

Untuk melihat bagaimana atenuasi bekerja, mari kita lihat lebih dekat pada segmen pemimpin
mRNA operasi trp (Gambar 23-7). Pemimpin ini memiliki dua fitur yang tidak biasa yang
memungkinkannya untuk memainkan peran pengaturan. Pertama, berbeda dengan urutan
pemimpin yang tidak diterjemahkan biasanya ditemui di ujung 5 'dari molekul mRNA (lihat
Gambar 22-6), sebagian dari trp urutan pemimpin diterjemahkan, membentuk pemimpin asam
amino peptida panjang 14. Dalam urutan mRNA, pengkodean untuk peptida ini adalah dua
kodon yang berdekatan untuk asam amino triptofan; ini akan terbukti penting. Kedua, pemimpin
trp mRNA juga mengandung empat segmen (daerah berlabel 1, 2, 3, dan 4) yang nukleotidanya
dapat mendasarkan-berpasangan satu sama lain untuk membentuk beberapa struktur loop jepit
rambut yang khas. Wilayah yang terdiri dari daerah 3 dan 4 ditambah string yang berdekatan dari
delapan nukleotida U disebut terminator. Ketika pasangan basa antara daerah 3 dan 4
menciptakan loop jepit rambut, itu bertindak sebagai sinyal terminasi transkripsi (Gambar 23-
8a). Ingatlah bahwa sinyal terminasi bakteri khas yang ditunjukkan pada Gambar 21-11 juga
merupakan jepit rambut yang diikuti oleh string U's. Pembentukan struktur seperti itu
menyebabkan RNA polimerase dan rantai RNA yang tumbuh terlepas dari DNA.

Seperti yang disarankan percobaan Yanofsky, terjemahan RNA pemimpin memainkan peran
penting dalam mekanisme pelemahan. Ribosom menempel pada situs pengikatan pertamanya
pada trp mRNA segera setelah situs muncul, dan dari sana mengikuti dekat di belakang RNA
polimerase. Ketika kadar triptofan rendah (Gambar 23-8b), konsentrasinya dari tryptophanyl-
tRNA (molekul tRNA yang membawa tryptophan) juga rendah. Jadi, ketika ribosom tiba di
kodon tryptophan dari RNA pemimpin, ia berhenti sebentar, menunggu kedatangan
tryptophanyl-tRNA. Blok ribosom terhenti wilayah 1, memungkinkan jepit rambut alternative
struktur untuk membentuk dengan memasangkan daerah 2 dan 3, yang disebut jepit rambut
antiterminator. Ketika wilayah 3 terikat dalam hal ini cara, itu tidak dapat berpasangan dengan
daerah 4 untuk membuat struktur terminasi, dan transkripsi oleh RNA polimerase terus berlanjut,
akhirnya menghasilkan transkrip mRNA lengkap dari trpoperon. Ribosom menggunakan mRNA
ini untuk mensintesis enzim jalur triptofan, dan karenanya produksi triptofan meningkat.

GAMBAR 23-7 Urutan Pemimpin trp mRNA. Transkrip trpoperon mencakup urutan pemimpin 162
nukleotida yang terletak tepat di hulu kodon awal untuk trpE, gen operon pertama. Urutan pemimpin ini
mencakup bagian yang mengkode peptida pemimpin dari 14 asam amino. Dua kodon tryptophan (Trp)
yang berdekatan dalam urutan mRNA pemimpin memainkan peran penting dalam regulasi operon dengan
atenuasi. Pemimpin mRNA juga berisi empat daerah yang mampu membuat pasangan dalam berbagai
kombinasi untuk membentuk struktur jepit rambut, seperti yang ditunjukkan Gambar 23-8. Bagian dari
mRNA pemimpin yang mengandung daerah 3 dan 4 dan string delapan U disebut terminator.

720

GAMBAR 23-8 Redaman dalam Operasi TRP. Atenuasi tergantung pada kemampuan
daerah 1 dan 2 dan daerah 3 dan 4 dari urutan pemimpin mRNA TRP ke pasangan-dasar,
membentuk struktur sekunder jepit rambut. Jepit rambut 3-4 bertindak sebagai sinyal terminasi
transkripsi; segera setelah terbentuk, RNA polimerase dilepaskan dari DNA.

cara, itu tidak dapat memasangkan dengan wilayah 4 untuk membuat penghentian
struktur, dan transkripsi oleh RNA polimerase berlanjut, akhirnya menghasilkan transkrip mRNA
lengkap dari operon trp. Ribosom menggunakan mRNA ini untuk mensintesis enzim jalur
triptofan, dan produksi triptofan karena itu meningkat.
Namun, jika tryptophan berlimpah dan tryptophanyltRNA Level adalah tinggi, itu
ribosom tidak kios Di itu triptofan Kodon (Angka 23-8c). Sebagai gantinya, Itu ribosom
berlanjut untuk itu berhenti kodon di itu akhir dari itu coding urutan untuk itu pemimpin peptide
dan jeda sana, pemblokiran wilayah 2. Jeda ini Izin itu pembentukan dari itu 3–4 jepit rambut,
yang adalah transkripsi penghentian sinyal. Transkripsi Oleh RNA Polymerase oleh karena itu
dihentikan dekat akhir urutan pemimpin (setelah 141 nukleotida), dan pengkodean mRNA untuk
enzim yang terlibat dalam triptofan perpaduan adalah tidak lagi diproduksi. Probabilitas dari
mengakhiri melawan melanjutkan transkripsi sangat peka untuk perubahan kecil dalam
konsentrasi dari tryptophanyl-tRNA, Menyediakan lebih responsive control System dari bisa
menjadi tercapai oleh itu interaksi dari Gratis Triptofan dengan itu trp represor sebagai satu -
satunya cara peraturan.
Mekanisme sebelumnya, ditemukan pada E. coli, mengharuskan ribosom mulai
menerjemahkan mRNA sebelum transkripsi selesai. Namun, atenuasi tidak selalu memerlukan
penggandengan transkripsi ini dan terjemahan. Dalam bakteri B. subtilis, pemimpin RNA
ditranskrip dari operon trp tidak diterjemahkan oleh ribosom Dan namun masih berfungsi
sebagai attenuator. Di Ini kasus, pembentukan Dari itu terminator putaran dikendalikan oleh
Sebuah protein pengikat triptofan. Ketika triptofan hadir, kompleks protein-triptofan berikatan
dengan pemimpin RNA dan mengekspos loop terminator, sehingga berakhir transkripsi dan
mematikan operon trp.
Meskipun redaman pernah dianggap sebagai jenis regulasi yang tidak biasa, ternyata
relative umum, terutama pada operon yang mengkode enzim terlibat dalam biosintesis asam
amino. Beberapa mekanisme untuk mencapai redaman sekarang diketahui ada, dan dalam
beberapa operon, ini mungkin satu-satunya cara regulasi. Di lain-lain, pelemahan melengkapi
operator dalam mengatur Gen ekspresi, seperti pada trp operon.
721
Riboswitches Memungkinkan Transkripsi dan Terjemahan untuk Dikendalikan oleh
Interaksi Molekul Kecil dengan RNA

Kemampuan molekul kecil untuk menginduksi perubahan bentuk pada protein alosterik
memainkan peran sentral dalam mengatur ekspresi gen. Kita telah melihat, misalnya, bagaimana
transkripsi gen dikendalikan oleh pengikatan allolaktosa dengan protein penekan lak triptofan
dengan protein penekan trp, atau dari cAMP ke protein reseptor cAMP. Dalam setiap kasus,
produksi mRNA diubah oleh pengikatan molekul kecil ke protein pengatur.
 Molekul kecil juga dapat mengatur ekspresi gen dengan mengikat ke situs khusus di
mRNA yang disebut riboswitches. Pengikatan molekul kecil yang sesuai dengan riboswitch yang
sesuai memicu perubahan bentuk mRNA yang dapat mempengaruhi transkripsi atau terjemahan.
Riboswitch biasanya ditemukan di daerah pemimpin mRNA yang tidak diterjemahkan yang
ditranskripsi dari operon bakteri, meskipun mereka telah terdeteksi dalam mRNA dari archaea
dan juga eukariota. Salah satu riboswitch pertama yang ditemukan adalah dalam RNA yang
ditranskripsikan dari operon riboflavin (iga/rib) bakteri B. subtilis. Rib operon mengandung lima
gen yang mengkode enzim untuk terlibat dalam mensintesis koenzim esensial FMN dan FAD.
RNA yang ditranskripsi dari rib operon yang memiliki urutan pemimpin, seperti pemimpin trp
yang dibahas sebelumnya, dapat dilipat menjadi loop jepit rambut yang mengakhiri transkripsi.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 23-9a, pengikatan FMN dengan urutan pemimpin
mempromosikan/promotor pembentukan loop jepit rambut ini. Transkripsi rusuk operon karena
itu dihentikan ketika FMN hadir, menghentikan produksi enzim yang tidak diperlukan karena
mereka terlibat dalam mensintesis FMN itu sendiri.

Selain mengatur transkripsi, pengikatan molekul kecil ke riboswitch juga dapat mengontrol
terjemahan mRNA. Salah satu contoh terjadi dalam pengkodean mRNAs untuk enzim yang
terlibat dalam jalur untuk mensintesis FMN dan FAD dalam E. coli

(a) Pemutusan transkripsi. Mengikat molekul kecil
ke riboswitch dalam urutan pemimpin dari beberapa
mRNA memicu pembentukan loop jepit rambut
yang mengakhiri transkripsi. Pengikatan FMN
dengan urutan pemimpin mRNA yang ditranskripsi
dari oper tulang rusuk B. subtilis bekerja dengan
cara ini.
(B) inisiasi Translation. Dalam mRNA lainnya,
molekul kecil yang berikatan dengan riboswitch
memicu pembentukan loop jepit rambut yang berisi
situs tempat ribosom biasanya mengikat, sehingga
mengganggu inisiasi terjemahan. Dalam E. coli,
jenis kontrol ini digunakan oleh FMN untuk
menghambat penerjemahan kode mRNA untuk
enzim yang terlibat dalam sintesis FMN.
GAMBAR 23-9 Kontrol Riboswitch untuk Ekspresi Gen. Model-model ini menunjukkan dua
cara di mana pengikatan molekul kecil ke riboswitch di mRNA dapat melakukan kontrol atas (a)
transkripsi dan (b) translasi.

722

Berbeda dengan situasi pada B. subtilis, gen E. coli yang mengkode enzim-enzim ini tidak
dikelompokkan dalam satu operon tunggal, tetapi beberapa di antaranya masih dikendalikan oleh
riboswitch. Dalam hal ini, pengikatan FMN ke mRNA riboswitch mempromosikan
pembentukan loop jepit rambut yang mencakup urutan yang diperlukan untuk mengikat mRNA
ke ribosom. Dengan menjauhkan urutan ini, FMN terikat mencegah mRNA dari berinteraksi
dengan ribosom dan memulai terjemahan (lihat Gambar 23-9b).

Regulasi Gen Eukariotik: Kontrol Genomik

Pada hari-hari awal biologi molekuler, ada pepatah populer bahwa "apa yang benar dari
E. coli juga berlaku untuk gajah." Pepatah ini menyatakan keyakinan awal bahwa hampir semua
yang dipelajari tentang fungsi sel bakteri pada tingkat molekuler juga akan berlaku untuk
eukariota. Pre-diksi semacam itu ternyata hanya sebagian yang benar. Dalam hal jalur
metabolisme sentral, mekanisme untuk mengangkut zat terlarut melintasi membran, dan fitur
mendasar seperti struktur DNA, sintesis protein, dan fungsi enzim, ada banyak kesamaan antara
dunia bakteri dan eukariotik, dan temuan dari penelitian dengan bakteri seringkali dapat
diekstrapolasi untuk eukariota.
Ketika datang ke regulasi ekspresi gen, perbandingan perlu diteliti lebih cermat. DNA sel
eukariotik dikemas menjadi serat kromatin dan terletak di dalam nukleus yang dipisahkan dari
mesin sintetik sintetik oleh sebuah amplop nuklir. Genom eukariotik biasanya jauh lebih besar
daripada bakteri, dan eukariota multiseluler harus membuat berbagai jenis sel yang berbeda dari
genom yang sama. Perbedaan seperti itu memerlukan keragaman mekanisme kontrol genetik
yang dalam beberapa kasus berbeda secara signifikan dari yang diamati secara rutin pada bakteri.

Eukariota Multiseluler Terdiri dari Berbagai Jenis Sel Khusus

Untuk mengatur tahap diskusi kita tentang kontrol gen eukariotik, mari kita
pertimbangkan secara singkat tantangan besar yang dihadapi oleh eukariota multiseluler, yang
seringkali terdiri dari ratusan jenis sel yang berbeda. Dalam kasus-kasus seperti itu, satu
organisme tunggal terdiri dari campuran kompleks dari tipe sel khusus atau berbeda — misalnya,
saraf, otot, tulang, darah, tulang rawan, dan lemak — disatukan dalam berbagai kombinasi untuk
membentuk jaringan dan organ. Sel-sel yang berbeda dibedakan satu sama lain berdasarkan
perbedaan dalam penampilan mikroskopis mereka dan dalam produk yang mereka hasilkan.
Sebagai contoh, sel darah merah mensintesis hemoglobin, sel saraf menghasilkan
neurotransmiter, dan limfosit membuat antibodi. Perbedaan tersebut menunjukkan bahwa secara
selektif mengendalikan ekspresi berbagai gen yang berbeda harus memainkan peran sentral
dalam mekanisme yang bertanggung jawab untuk menciptakan sel-sel yang berbeda. Sel-sel
yang dibedakan dihasilkan dari populasi sel yang tidak dewasa dan tidak spesifik dengan proses
yang dikenal sebagai diferensiasi sel. Contoh klasik terjadi pada embrio, di mana sel-sel embrio
awal menghasilkan semua jenis sel yang membentuk organisme.
Ekspresi Gen Eukariotik Diatur di Lima Tingkat Utama
 Fakta bahwa tanaman atau hewan multisel mungkin perlu menghasilkan ratusan jenis sel
yang berbeda menggunakan genom tunggal menggarisbawahi kesulitan menjelaskan regulasi gen
eukariotik sepenuhnya dalam hal mekanisme bakteri yang diketahui - gajah bukan hanya E. coli
yang besar! Jika kita ingin benar-benar memahami regulasi gen dalam sel eukariotik, kita harus
mendekati topik dari perspektif eukariotik.
Pola gen yang diekspresikan dalam sel eukariotik yang diberikan pada akhirnya tercermin
dalam spektrum produk gen fungsional — biasanya molekul protein tetapi dalam beberapa kasus
RNA — diproduksi oleh sel itu. Pola keseluruhan adalah puncak dari kontrol yang diberikan
pada beberapa level yang berbeda. Titik-titik kontrol potensial ini disorot pada Gambar 23-10,
yang melacak aliran informasi genetik. dari DNA genom dalam nukleus menjadi fungsional
protein dalam sitoplasma (banyak, tetapi tidak semua, dari titik kontrol ini juga berlaku
untuk prokariota). Seperti yang dapat Anda lihat, kontrol diberikan pada lima tingkat utama: 1
genom, 2 transkripsi, 3 pemrosesan RNA dan ekspor dari nukleus ke sitoplasma, 4 terjemahan,
dan 5 acara pasca-penerjemahan. Mekanisme pengaturan dalam tiga kategori terakhir adalah
semua contoh kontrol pasca-transkripsional, sebuah istilah yang mencakup berbagai macam
peristiwa. Dalam sisa bab ini, kita akan memeriksa beberapa mekanisme yang digunakan
eukariota untuk melakukan kontrol atas ekspresi gen pada masing-masing dari lima level.
 GAMBAR 23-10 Berbagai Tingkat Ekspresi
dan Regulasi Gen Eukariotik. Ekspresi gen
dalam sel eukariotik diatur melalui
beragam mekanisme yang beroperasi
pada lima tingkat yang berbeda:

1 genom,

2 transkripsi,

3 RNA processing dan ekspor nuklir,

4 terjemahan, dan

5 posttranslasional acara Kontrol yang

beroperasi pada tiga level terakhir
semuanya dianggap sebagai mekanisme
kontrol posttranskripsi.

Sebagai Aturan Umum, Sel Multiseluler Organisme Semua Berisi Set Gen yang Sama
Level kontrol pertama diberikan pada level genom keseluruhan. Pada tanaman dan hewan
bersel banyak, setiap jenis sel khusus hanya menggunakan sebagian kecil dari jumlah total gen
yang terkandung dalam genom organisme. Namun hampir semua sel dalam organisme semacam
itu (selain sperma dan telur haploid) mempertahankan gen lengkap yang sama. Bukti dramatis
bahwa sel-sel khusus masih membawa gen lengkap yang disediakan pada tahun 1958 oleh
Frederick Steward, yang menumbuhkan tanaman wortel lengkap baru dari sel akar wortel
tunggal. Karena sel-sel dari setiap tanaman wortel baru mengandung DNA nuklir yang sama
yang ada dalam sel-sel akar wortel asli, setiap tanaman baru adalah klon (salinan identik secara
genetik) dari tanaman dari mana sel-sel akar asli diperoleh.
 Kloning sel hewan pertama yang berhasil dilaporkan pada tahun 1964 oleh John Gurdon
dan rekan-rekannya. Dalam penelitian dengan Xenopus laevis, katak cakar Afrika, mereka
mentransplantasikan inti dari sel-sel kecebong yang berdiferensiasi menjadi sel yang
berdiferensiasi dapat mengarahkan pengembangan seluruh organisme baru. Karena itu, nukleus
semacam itu dikatakan totipoten: nukleotida mengandung kumpulan gen lengkap yang
diperlukan untuk membuat organisme baru dengan tipe yang sama dengan organisme tempat
nukleus diambil.
Sebuah contoh dramatis tentang kloning hewan dilaporkan pada tahun 1997, ketika Ian
Wilmut dan rekan-rekannya di Skotlandia menjadi berita utama surat kabar dengan
mengumumkan kelahiran domba kloning, Dolly — mamalia pertama yang dikloning dari sel
yang berasal dari orang dewasa. Dolly lahir dari telur domba yang nukleus aslinya telah
digantikan oleh nukleus yang diambil dari sel tunggal domba dewasa. Teknik serupa kemudian
digunakan untuk mengkloning banyak mamalia lainnya. Seperti yang kita bahas dalam Kotak
23A, kloning adalah suatu prestasi luar biasa yang menimbulkan banyak pertanyaan ilmiah dan
etika tentang aplikasi teknologi seperti itu di masa depan.
Salah satu usulan utama penggunaan kloning memiliki relevansi dengan kedokteran. Obat
regeneratif modern berupaya menggantikan sel yang rusak pada pasien manusia dengan
pengganti yang direkayasa secara genetika. Kloning terapeutik disebut berusaha untuk
menghasilkan sel induk embrionik yang secara genetik cocok dengan pasien manusia tetapi
fleksibel dalam kemampuan mereka untuk membedakan. Alternatif yang menghindari banyak
hambatan etis kloning terapeutik adalah produksi sel induk berpotensi majemuk yang diinduksi
(lihat Kotak 23A).

Amplifikasi dan Penghapusan Gen Dapat Mengubah Genom

Meskipun bukti sebelumnya menunjukkan bahwa genom cenderung identik di semua sel
organisme eukariotik dewasa, beberapa jenis regulasi gen membuat pengecualian terhadap aturan
ini. Salah satu contoh adalah penggunaan amplifikasi gen untuk membuat banyak salinan dari
gen yang sama. Amplifikasi dilakukan dengan mereplikasi DNA dalam wilayah kromomal
tertentu berkali-kali berturut-turut, sehingga menghasilkan lusinan, ratusan, atau bahkan ribuan
salinan dari hamparan DNA yang sama. Amplifikasi gen dapat dianggap sebagai contoh kontrol
genomik - yaitu, perubahan regulasi dalam susunan atau organisasi struktural genom.
 Salah satu contoh amplifikasi gen yang paling banyak dipelajari melibatkan gen RNA
ribosom di Xenopus laevis, organisme yang digunakan Gurdon dalam eksperimen transplantasi
nuklirnya. Genom haploid Xenopus biasanya mengandung sekitar 500 salinan gen yang dikode
untuk 5.8S,
18S, dan 28S rRNA. Namun, DNA gen-gen ini secara selektif direplikasi sekitar 4000
kali selama oogenesis (perkembangan sel telur sebelum pembuahan). Akibatnya, oosit dewasa
mengandung sekitar 2 juta salinan gen untuk rRNA. Tingkat amplifikasi ini tampaknya
diperlukan untuk mempertahankan produksi ribosom yang sangat besar yang terjadi selama
oogenesis, yang pada gilirannya diperlukan untuk mempertahankan tingkat tinggi sintesis protein
yang diperlukan untuk perkembangan embrionik awal.
Contoh khusus amplifikasi gen ini melibatkan gen yang produknya adalah RNA dan
bukan molekul protein. Ekspresi gen yang mengkode protein — bahkan protein yang dibutuhkan
dalam jumlah besar, seperti protein ribosom — biasanya dapat ditingkatkan secara cukup dengan
meningkatkan laju terjemahan mRNA tanpa perlu amplifikasi gen. Meskipun demikian,
peningkatan produksi protein tertentu kadang-kadang dapat ditelusuri ke amplifikasi gen. Salah
satu contoh dalam sel normal adalah sintesis protein chorion dalam telur serangga. Amplifikasi
gen abnormal yang mengkode protein yang terlibat dalam pensinyalan siklus sel adalah kelainan
yang sering diamati pada sel kanker (Bab 24).
Selain memperkuat urutan gen yang produknya sangat diminati, beberapa sel menghapus
gen yang produknya tidak diperlukan. Contoh ekstrem penghapusan gen (juga disebut
pengurangan DNA) terjadi pada sel darah merah mamalia, yang membuang nukleinya
sepenuhnya setelah jumlah mRNA hemoglobin yang memadai telah dibuat. Contoh yang kurang
ekstrem terjadi pada cacing nema-tode dan pada sekelompok krustasea kecil yang dikenal
sebagai copepoda. Selama perkembangan embrionik dari cope-pods, daerah heterokromatik
(transkripsi tidak aktif) dari kromosom mereka dikeluarkan dan dibuang dari semua sel kecuali
yang ditakdirkan untuk menjadi gamet. Dengan cara ini, hingga setengah dari total konten DNA
organisme dikeluarkan dari sel-sel tubuhnya.

Box 23 Kloning dengan Transfer Nukleus dan Sel Punca Pluripotent

Dolly — Domba Tanpa Ayah
Pada bulan Februari 1997, Ian Wilmut menjadi berita utama surat kabar di seluruh dunia dengan
memperkenalkan kami pada Dolly, mamalia pertama yang pernah dikloning dari sel dewasa.
Dolly diciptakan dengan mengeluarkan nukleus dari sel domba dewasa dan memindahkannya ke
telur domba yang berbeda yang nukleusnya sendiri telah dihilangkan. Meskipun teknik transfer
nuklir ini telah digunakan sebelumnya untuk mengkloning mamalia, itu tidak pernah berhasil
dengan sel yang diambil dari orang dewasa.
Wilmut menduga bahwa kegagalan-kegagalan sebelumnya ini disebabkan oleh keadaan kromatin
dalam sel donor. Rahasianya Keberhasilan tim adalah bahwa mereka mengambil sel kelenjar
susu dari ambing domba betina berumur 6 tahun dan membuatnya kelaparan dalam budaya.
memaksa mereka ke fase G0 yang tidak aktif dari siklus sel. Ketika sel seperti itu digabungkan
dengan sel telur yang tidak memiliki nukleus, sel ini menghasilkan jumlah diploid DNA dalam
kondisi yang memungkinkan sitoplasma telur memprogram ulang DNA untuk mendukung
embrionik normal.
pengembangan. Menanamkan telur seperti itu ke dalam rahim orang lain
domba betina menyebabkan kelahiran domba tanpa ayah — yaitu, domba yang selnya memiliki
DNA nuklir yang sama dengan sel domba betina berusia 6 tahun yang menyediakan nukleus
donor (Gambar 23A-1). beberapa tahun dari percobaan perintis ini, teknik serupa telah
digunakan untuk mengkloning mamalia lain, termasuk ternak, tikus, kucing, anjing, dan, baru-
baru ini, monyet. Mengapa tim Wilmut mengejar teknologi seperti itu? Salah satu alasannya
adalah untuk mengkloning hewan transgenik yang berharga. Pendekatan ini telah digunakan
untuk menghasilkan domba yang menghasilkan susu yang mengandung protein penting secara
medis, seperti faktor pembekuan darah, yang sulit diproduksi dalam jumlah yang cukup dengan
cara lain. Aplikasi komersial termasuk mengkloning sapi yang paling besar atau kuda pacu
tercepat. Aplikasi kloning yang bahkan lebih dramatis melibatkan upaya untuk mengkloning
hewan yang hampir punah atau baru-baru ini punah.
Namun kemungkinan yang paling kontroversial menyangkut apakah itu akan menjadi etis untuk
mencoba kloning dengan sel manusia. Untuk saat itu, tampaknya menghasilkan klon manusia
yang sehat — atau kloning reproduksi — akan sangat sulit. Butuh 277 mencoba menghasilkan
Dolly, dan banyak binatang kloning yang tampak normal saat lahir mengembangkan masalah
kesehatan kemudian dan mati sebelum waktunya. Cacat umum ini hasil dari kegagalan DNA
dalam menyumbangkan nukleus untuk menjalani pemrograman ulang epigenetik yang tepat,
termasuk metilasi gen penting yang terkait dengan pertumbuhan. Dalam menghadapi masalah
seperti itu dan kegelisahan yang hampir universal tentang prospek kloning manusia, banyak
individu telah menyerukan hokum melarang penggunaan teknologi semacam itu untuk
menduplikasi manusia. Yang lain menyarankan bahwa masyarakat mungkin akhirnya
menemukan kloning dapat diterima dalam keadaan terbatas tertentu.

GAMBAR 23A-1 sang Dolly,

Mamalia Pertama yang Kloning dari seorang

Sel dewasa. (a) Dolly dulu dikloning dari

serum-kelaparan sel mammary (ambing) itu
menyatu dengan sel telur dari yang nukleus
telah dihapus. (B) Dolly sebagai orang
dewasa.

Sel Punca — Penuh Potensi

Aplikasi yang diusulkan paling sering dari teknik transfer nuklir adalah untuk
memproduksi sel induk yang secara genetik cocok dengan pasien manusia. Beberapa berharap
bahwa kloning terapeutik seperti itu dapat digunakan untuk menggantikan sel yang rusak pada
pasien manusia. Untuk melihat mengapa ini terjadi Pendekatan telah diusulkan, kita perlu
mempertimbangkan mengapa sel induk memiliki sifat yang bermanfaat.
 Sel induk ditentukan oleh kapasitasnya untuk mengisi ulang diri melalui pembelahan
berkelanjutan, serta oleh kemampuan mereka, dengan adanya sinyal yang sesuai, untuk
menghasilkan sel anak yang berdiferensiasi menjadi berbagai jenis sel khusus, biasanya disertai
dengan penghentian pembelahan sel. Sel induk dapat diisolasi dari organisme dewasa, seperti
darah tali pusat bayi baru lahir, serta dari orang dewasa. Sel-sel seperti itu, terutama dalam kasus
darah dan sumsum tulang, telah digunakan dengan sukses selama bertahun-tahun untuk
mengobati pasien manusia. Sel-sel induk semacam itu dianggap multipoten:
Mereka dapat membentuk beberapa tipe sel, tetapi repertoarnya cukup terbatas.
Sebaliknya, sel batang embrionik (ES), tidak mengalami keterbatasan ini. Mereka berpotensi
majemuk; yaitu, mereka dapat membentuk semua jenis sel yang menimbulkan organisme
manusia kecuali yang membentuk struktur seperti plasenta dan membran pendukung lainnya
yang diperlukan selama kehamilan.
Sel-sel ES berasal dari sel-sel massa sel dalam dari embrio awal, yang dikenal sebagai
blastokista (Gambar 23A-2a). Sel massa sel dalam, setelah diisolasi, berperilaku sebagai sel
induk sejati. Ketika diobati dengan berbagai faktor pertumbuhan atau dengan cara lain, mereka
dapat didorong menjadi berbagai jenis sel.
Kemampuan untuk mengisolasi dan menumbuhkan sel induk di laboratorium
meningkatkan kemungkinan bahwa para ilmuwan akan dapat menghasilkan yang sehat sel-sel
baru untuk menggantikan jaringan yang rusak pada pasien dengan berbagai penyakit. Sebagai
contoh, sel punca yang dapat berdiferensiasi menjadi sel saraf pada akhirnya mungkin digunakan
untuk memperbaiki kerusakan otak yang terjadi pada pasien yang menderita stroke, penyakit
Parkinson, atau penyakit Alzheimer. Atau sel punca mungkin digunakan untuk menggantikan sel
pankreas yang rusak pada pasien dengan diabetes atau sel otot rangka yang rusak ada pada
individu dengan distrofi otot. Jika sel-sel induk diproduksi menggunakan kloning terapeutik,
mereka akan memiliki manfaat lebih lanjut menjadi kecocokan genetik dengan sel-sel pasien
sendiri, menghindari masalah penolakan kekebalan tubuh.
Meskipun potensi perkembangan mereka dan janji mereka di terapi, ada keberatan etika
utama yang diajukan oleh banyak orang tentang pemanenan sel ES. Mengisolasi sel-sel ES tentu
melibatkan penghancuran organisme manusia — embrio. Banyak yang melihat masing-masing
organisme manusia sebagai tujuan yang tidak dapat diganggu gugat dalam dirinya sendiri, layak
untuk mendalam hormat moral, membuat pengadaan sel-sel ES secara etis tidak diizinkan. Intuisi
orang lain adalah bahwa blastocyst memiliki moral yang berbeda status dari organisme manusia
yang lebih maju, dan memandang produksi sel ES sebagai terapi medis potensial yang penting.
Jelas itu akan terjadi sangat diinginkan untuk menemukan sel-sel yang tampaknya memiliki
perkembangan potensial mirip dengan sel ES, tanpa masalah etika terkait.
Pada tahun 2006, Shinya Yamanaka mengumumkan metode seperti itu: Dia dan tim
penelitiannya telah berhasil membujuk sel-sel yang berbeda dari tikus menjadi kembali ke
keadaan pluripotent. Sel-sel induk berpotensi majemuk seperti itu (iPS) tampaknya memiliki
banyak sifat yang sama seperti sel-sel ES. Untuk menghasilkan sel iPS, tim Yamanaka memaksa
sel untuk mengekspresikan empat protein faktor transkripsi yang diekspresikan oleh sel
pluripoten: Oct4, Sox2, Klf4, dan c-Myc (Gambar 23A-2b). Pekerjaan lebih lanjut oleh
kelompok Yamanaka dan oleh James Thomson dan rekan-rekannya di University of Wisconsin
memperluas studi ini ke sel manusia. Kemajuan teknis telah pesat sejak itu. Sel-sel iPS tampak
sangat mirip dengan sel-sel ES, dan karenanya sel-sel itu tampaknya menjadi sumber yang ideal
dari sel-sel pluripoten yang cocok secara genetik untuk medis perawatan. Ada beberapa masalah
yang harus diatasi sebelum mereka dapat digunakan dalam terapi, namun. Pertama, dalam
eksperimen aslinya gen diperkenalkan menggunakan retrovirus, yang tergabung DNA-nya ke
dalam genom sel inang. Sejak itu telah ditunjukkan itu efek serupa dapat dicapai tanpa integrasi
DNA virus.
Kedua, c-Myc adalah proto-onkogen, yang dapat meningkatkan pembentukan tumor
(lihat Bab 24). Namun, beberapa tipe sel dapat diinduksi menjadi pluripotensi tanpa c-Myc.
Akhirnya, banyak sel iPS tampaknya tidak memiliki status metilasi dari DNA mereka yang
sepenuhnya direset, tidak seperti sel ES. Karena alasan ini, banyak ahli biologi sel punca yang
tidak menentang pemanenan sel ES mendukung kelanjutan sel ES dan iPS penelitian secara
paralel karena kedua jenis sel mungkin menunjukkan sifat yang agak berbeda. Mengingat sudut
pandang yang sangat bervariasi tentang sel-sel ES, kloning, dan prosedur serupa, debat terus
tentang etika ini teknologi. Laju pesat perkembangan ilmiah di bidang ini membuatnya penting
bagi masyarakat untuk tidak menghindar dari perdebatan.
 GAMBAR 23A-2 Dua Cara Berbeda untuk Menghasilkan Pluripoten Stem Cells. (a) Sel
batang embrionik (ES) diproduksi dari dalam sel massa sel dari blastokista. Embrio dihancurkan
untuk panen sel-sel ES. (b) Sel induk pluripotent terinduksi (iPS) dihasilkan ketika sel dipaksa
untuk mengekspresikan empat protein faktor transkripsi. Sel-sel pluripoten dipilih menggunakan
obat-obatan yang hanya memungkinkan sel-sel pluripoten bertahan hidup. Setelah sel ES atau
iPS diisolasi, mereka dikultur dalam berbagai kondisi, menyebabkan mereka berdiferensiasi
menjadi berbagai jenis sel.
Penyusunan Ulang DNA Dapat Mengubah Genom
Beberapa kasus diketahui di mana regulasi gen didasarkan pada pergerakan segmen DNA
dari satu lokasi ke lokasi lain dalam genom, suatu proses yang dikenal sebagai penyusunan ulang
DNA. Dua contoh yang sangat menarik melibatkan mekanisme yang digunakan oleh sel-sel ragi
GAMBAR
untuk mengendalikan perkawinan dan mekanisme yang 23-11 Mekanisme
digunakan olehKaset pada Saklar
vertebrata Jenis Ragi.
untuk
Kromosom 3 dari Saccharomyces cerevisiae berisi tiga
menghasilkan jutaan antibodi yang berbeda. salinan dari informasi tipe kawin. HMLa dan HMRa lokus
Pengaturan Ulang Tipe Ragi Kawin. Dalammasing-masing
ragi Saccharomyces cerevisiae,
berisi salinan lengkapperkawinan
dari a dan bentuk
gen, tetapi
terjadi ketika sel-sel haploid dari dua jenis perkawinan yangtranskripsi
berbeda,lokus ini disebut
yang dihambata oleh
dan produk-
a,
produk dari gen SIR. Jenis kawin sel yang sebenarnya
ditentukan oleh alel yang ada di lokus MAT. Ketika sel
mengganti tipe kawin, a atau DNA di lokus MAT
dihilangkan dan diganti dengan salinan DNA dari DNA
tipe-kawin alternatif. Sebagai contoh, gambar ini
bergabung bersama untuk membentuk sel diploid (lihat Gambar 14-18). Semua sel haploid
membawa kedua alel untuk tipe kawin; namun, fenotip kawin sel yang sebenarnya tergantung
pada alel mana dari dua, a atau a, yang hadir di situs khusus dalam genom yang disebut lokus
MAT. Sel sering berganti tipe kawin, mungkin untuk memaksimalkan peluang kawin. Mereka
melakukannya dengan memindahkan alel alternatif ke lokus MAT. Proses penataan ulang DNA
ini disebut mekanisme kaset karena lokus tipe kawin seperti dek kaset di mana a atau "kaset"
(alel) dapat dimasukkan dan "dimainkan" (ditranskripsi).

Gambar 23-11 menjelaskan mekanisme kaset ragi secara lebih rinci. Lokus MAT, yang
mengandung alel a atau alel, terletak pada ragi kromosom 3, kira-kira di tengah-tengah di antara
salinan ekstra dari dua alel. Lokus yang menyimpan salinan tambahan alel disebut HMLa, dan
lokus dengan salinan tambahan alel disebut HMRa. Untuk mengganti tipe kawin, endonuklease,
yang disebut HO endonuklease, menciptakan pemutusan kromosom di lokus MAT. Exonucleases
kemudian bekerja pada DNA yang dipotong untuk menurunkannya. DNA HMLa atau HMRa
digunakan sebagai templat untuk memperbaiki celah yang dihasilkan dalam DNA, yang
menghasilkan peristiwa konversi gen di lokus MAT yang mengganti alel tipe kawin yang
ditemukan di sana (kami membahas konversi gen pada Bab 20).
DNA dari dua tipe alel mengkodekan kode untuk faktor transkripsi yang mengontrol
ekspresi gen yang produk proteinnya memberi sel baik fenotip kawin "a" atau "a". Tetapi adanya
salinan tambahan alel di HMLa dan HMRa menimbulkan pertanyaan penting: Jika sel berisi
salinan lengkap alel dan alel di lokasi ini, mengapa protein tidak menentukan fenotipe a dan a
kawin terbuat? Jawabannya adalah bahwa sekelompok gen pengatur, yang dikenal sebagai gen
silent information regulator (SIR), bertindak bersama untuk mencegah pengungkapan informasi
genetik di HMLa dan HMRa. Protein yang dikodekan oleh gen SIR memblokir transkripsi
HMLa dan HMRa dengan mengikat urutan DNA spesifik yang mengelilingi a dan kaset DNA di
HMLa dan HMRa.
Pengaturan Ulang Antibodi Gen. Jenis penataan DNA yang agak berbeda digunakan oleh
limfosit sistem kekebalan vertebrata untuk menghasilkan molekul antibodi. Antibodi adalah
protein yang terdiri dari dua jenis subunit polipeptida, yang disebut rantai berat dan rantai ringan.
Vertebrata menghasilkan jutaan jenis anti-bodi yang berbeda, masing-masing diproduksi oleh
limfosit yang berbeda (dan turunannya) dan masing-masing mampu secara khusus mengenali
dan mengikat molekul asing yang berbeda. Tetapi keanekaragaman molekul antibodi yang sangat
besar ini menciptakan masalah potensial: Jika setiap molekul antibodi dikodekan oleh gen yang
berbeda, sebenarnya semua DNA seseorang akan ditempati oleh jutaan gen antibodi yang
dibutuhkan.
Limfosit mengatasi masalah ini dengan memulai dengan sejumlah kecil segmen DNA
yang berbeda dan menyusunnya kembali dalam berbagai kombinasi untuk menghasilkan jutaan
gen antibodi unik, masing-masing terbentuk dalam limfosit yang berkembang berbeda. Proses
penataan ulang melibatkan empat jenis sekuens DNA, yang disebut segmen V, J, D, dan C. Kode
segmen C untuk wilayah konstanta rantai berat atau ringan yang urutan asam aminonya sama di
antara berbagai antibodi. Segmen V, J, dan D menyatukan kode untuk daerah variabel yang
berbeda di antara antibodi dan memberikan masing-masing kemampuan untuk mengenali dan
mengikat pada jenis molekul asing tertentu.
Untuk melihat bagaimana ini bekerja, mari kita pertimbangkan rantai berat antibodi
manusia, yang dibangun dari sekitar 200 jenis segmen V, lebih dari 20 jenis segmen D, dan
setidaknya 6 jenis segmen J. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 23-12, daerah DNA yang
mengandung berbagai segmen V, D, dan J disusun kembali selama pengembangan limfosit untuk
secara acak menyatukan satu V, satu D, dan satu segmen J di setiap limfosit. Penataan ulang acak
ini memungkinkan sistem kekebalan untuk membuat setidaknya 200 20 6 = 24.000 jenis daerah
variabel rantai berat. Dengan cara yang sama, ribuan jenis wilayah variabel rantai cahaya yang
berbeda juga dapat dibuat (rantai cahaya dibangun dari tipe segmen V, J, dan C mereka sendiri;
mereka tidak menggunakan segmen D). Akhirnya, salah satu dari ribuan jenis rantai berat dapat
dirakit dengan salah satu dari ribuan jenis rantai lampu, menciptakan kemungkinan jutaan jenis
anti-benda. Hasil akhirnya adalah jutaan antibodi yang berbeda dihasilkan dari genom manusia
dengan menyusun ulang beberapa ratus jenis segmen V, D, J, dan C yang berbeda.
Proses penataan ulang DNA yang menciptakan gen antibodi juga mengaktifkan
transkripsi gen-gen ini melalui mekanisme yang melibatkan sekuens DNA khusus yang disebut
enhancers. Seperti yang akan kita bahas sebentar lagi, penambah meningkatkan tingkat inisiasi
transkripsi. Enhancers terletak di dekat sekuensing DNA yang mengkodekan untuk segmen C,
tetapi sekuens pemasar tidak ada di area ini sehingga transkripsi tidak terjadi secara normal.
Promotor untuk transkripsi gen terletak di hulu dari pengkodean DNA untuk segmen V, tetapi
tidak cukup efisien untuk mempromosikan transkripsi tanpa adanya urutan penambah. Oleh
karena itu, sebelum penataan ulang DNA, urutan promotor dan enhancer gen antibodi begitu
jauh sehingga transkripsi tidak terjadi. Hanya setelah penataan ulang mereka cukup dekat untuk
mengaktifkan transkripsi.

GAMBAR 23-12 Penataan Ulang DNA

Selama Pembentukan Rantai Berat
Antibodi. Pengkodean gen untuk rantai
berat antibodi manusia diciptakan oleh
penyusunan ulang DNA yang
melibatkan beberapa tipe segmen V, D,
dan J. Dalam contoh ini, eksisi DNA acak
menyatukan kombinasi unik dari
segmen V, D, dan J. Setelah transkripsi,
splicing RNA menghilangkan sekuens
RNA yang memisahkan segmen VDJ ini
dari segmen C.
Puff Kromosom Memberikan Bukti Visual Bahwa Dekondensasi Chromatin Terlibat
dalam Kontrol Genomik
Kami menemukan aspek lain dari kontrol level genom ketika kami mempertimbangkan
apa yang terlibat dalam pembuatan genom eukariotik — yaitu, DNA kromosom — yang dapat
diakses oleh mesin transkripsi sel. Ingat dari Bab 21 bahwa, untuk memulai transkripsi, sebuah
RNA polimerase eukariotik harus berinteraksi dengan DNA dan sejumlah protein spesifik (faktor
transkripsi umum) di daerah gen promotor. Kecuali ketika suatu gen ditranskripsikan, daerah
promotornya tertanam dalam struktur atas kromatin yang terlipat dan tertata. Dengan demikian,
beberapa derajat dekondensasi kromatin (berlangsung) tampaknya diperlukan untuk ekspresi gen
eukariotik.
Bukti paling awal bahwa dekondensasi kromatin diperlukan untuk transkripsi gen berasal
dari visualisasi mikroskopis dari beberapa jenis kromosom serangga yang tertangkap dalam
tindakan transkripsi. Karena DNA sebagian besar sel eukariotik tersebar di seluruh nukleus
sebagai massa serat kromatin yang saling terkait, biasanya sulit untuk mengamati transkripsi gen
individu dengan mikroskop. Tetapi cara mengatasi rintangan ini disediakan oleh tipe sel serangga
yang tidak biasa. Pada lalat buah Drosophila melanogaster dan serangga terkait, beberapa
jaringan yang aktif secara metabolis (seperti kelenjar ludah dan usus) tumbuh dengan
peningkatan yang sangat besar dalam ukuran, daripada jumlah, sel-sel penyusunnya.
Perkembangan sel raksasa disertai dengan putaran berturut-turut dari replikasi DNA, tetapi,
karena replikasi ini terjadi pada sel yang tidak membelah, kromatid yang baru disintesis
terakumulasi di setiap nukleus dan berbaris secara paralel untuk membentuk struktur
multistranded yang disebut kromosom polytene. Setiap kromosom polytene berisi beberapa
kromatid yang dihasilkan selama replikasi kedua anggota dari setiap pasangan kromosom
homolog. Keempat kromosom polytene raksasa yang ditemukan di kelenjar ludah larva
Drosophila, misalnya, dihasilkan oleh sepuluh putaran replikasi kromosom.
Kromosom polytene adalah struktur besar yang berukuran panjang ratusan mikrometer
dan lebarnya beberapa mikrometer — kira-kira sepuluh kali lebih panjang dan seratus kali lebih
luas daripada kromosom metafase sel eukariotik tipikal. Mikrograf pada Gambar 23-13
menunjukkan kromosom polytene. Terlihat di setiap kromosom polytene adalah pola
karakteristik pita gelap. Setiap pita mewakili domain kromatin yang sangat kental dibandingkan
dengan kromatin di wilayah "antar-pita" di antara pita. Aktivasi gen dari pita kromosom tertentu
menyebabkan untaian chro-matin yang dipadatkan mengental dan meluas ke luar, menghasilkan
embusan kromosom. Puff semacam itu terdiri dari loop DNA yang lebih sedikit terkondensasi
daripada DNA band di tempat lain dalam kromosom. Meskipun puff bukan satu-satunya situs
transkripsi gen di sepanjang kromosom polytene, tingkat dekondensasi kromosom pada puff
berkorelasi baik dengan peningkatan aktivitas transkripsi di situs-situs ini. Puff itu memang situs
transkrip aktif dikonfirmasi oleh fakta bahwa puff adalah situs di mana RNA polimerase II,
enzim kunci yang melakukan polarisasi dari RNA pengkode protein, terakumulasi.
Seiring perkembangan larva Drosophila melalui pengembangan, masing-masing
kromosom polytene dalam nukleus kelenjar ludah mengalami perubahan yang dapat direproduksi
dalam pola mengembang di bawah kendali hormon steroid serangga yang disebut ecdysone.
Ecdysone berfungsi dengan mengikat, dan dengan demikian mengaktifkan, protein pengatur
yang merangsang transkripsi gen tertentu. (Ini mirip dengan aksi hormon steroid vertebrata, yang
akan kita bahas nanti dalam bab ini.) Tampaknya, dengan kata lain, pola karakteristik engah
terlihat selama pengembangan larva Drosophila adalah manifestasi visual langsung dari
dekondensasi selektif. dan transkripsi segmen DNA spesifik sesuai dengan program
pengembangan yang ditentukan secara genetik.

GAMBAR 23-13 Puff dalam Kromosom

Polytene. Puff adalah daerah di mana
kromatin aktif transkripsi menjadi kurang
terkondensasi, seperti yang ditunjukkan
secara diagram. Mikrograf cahaya
menunjukkan bagian dari kromosom
polytene.

Sensitivitas DNase I Memberikan Bukti Lebih Lanjut untuk Peran Dekondensasi

Chromatin dalam Kontrol Genomik
Tidak adanya kromosom polytene di sebagian besar sel eukariotik membuat sulit untuk
memvisualisasikan dekondensasi kromatin di daerah gen aktif. Meskipun demikian, bukti lain
mendukung gagasan bahwa dekondensasi kromatin umumnya terkait dengan transkripsi gen.
Salah satu alat penelitian yang sangat berguna adalah DNase I, endonuklease yang diisolasi dari
pankreas. Dalam percobaan tabung reaksi, konsentrasi rendah DNase I secara istimewa
menurunkan DNA aktif transkripsional dalam kromatin. Meningkatnya kepekaan wilayah DNA
ini terhadap degradasi oleh DNase I memberikan bukti bahwa DNA tidak digulung.
Gambar 23-14 mengilustrasikan eksperimen sensitivitas DNase I klasik yang berfokus
pada gen ayam untuk globin polipeptida, salah satu subunit polipeptida hemoglobin. Gen globin
secara aktif diekspresikan dalam inti eritrosit ayam (sel darah merah). Berbeda dengan eritrosit
dari banyak vertebrata lainnya, eritrosit unggas mempertahankan nukleusnya pada saat dewasa.
Jika nuklei ini diisolasi dan kromatin dicerna dengan DNase I, gen globin sepenuhnya dicerna
pada konsentrasi DNase I yang rendah yang tidak mempengaruhi gen globin di jaringan lain,
seperti jaringan oviduk. Seperti yang Anda perkirakan, gen yang tidak aktif dalam eritrosit
(misalnya, gen untuk ovalbumin, protein putih telur) tidak dicerna oleh DNase I. Hasil
sebaliknya diperoleh ketika prosedur yang sama dilakukan dengan menggunakan kromatin
diisolasi dari saluran telur, di mana gen ovalbumin diekspresikan dan gen globin tidak aktif.
Dalam hal ini, gen ovalbumin lebih sensitif daripada gen globin untuk pencernaan DNase I. Data
tersebut menunjukkan bahwa transkripsi DNA eukariotik berhubungan dengan peningkatan
kepekaan terhadap pencernaan DNase I.
Hasil percobaan ini kompatibel dengan dua penjelasan alternatif: Entah kromatin
uncoiling diperlukan untuk memberikan faktor transkripsi dan akses RNA polimerase ke DNA,
atau pengikatan protein ini dengan DNA menyebabkan uncoiling. Masalah ini telah diselesaikan
oleh penelitian yang menunjukkan bahwa sensitivitas terhadap DNase I terdeteksi pada gen yang
sedang ditranskripsi secara aktif, pada gen yang baru-baru ini ditranskripsikan tetapi tidak lagi
aktif, dan dalam sekuens DNA yang terletak berdekatan dengan gen dari dua jenis sebelumnya.
Pengamatan seperti itu menunjukkan bahwa sensitivitas DNase I tidak disebabkan oleh proses
transkripsi gen itu sendiri, melainkan mencerminkan struktur chro-matin yang berubah di daerah
yang terkait dengan gen aktif atau berpotensi aktif. Agaknya ini berarti bahwa chro-matin
uncoiling adalah prasyarat untuk — alih-alih konsekuensi dari — aktivasi transkripsional.
 GAMBAR 23-14 Sensitivitas Gen Aktif dalam Chromatin terhadap Pencernaan dengan
DNase I. Konfigurasi kromatin gen aktif dapat dipelajari dengan memaparkan inti sel ke DNase
I, yang mencerna DNA dengan memotong ikatan fosfodiester internal. DNA dalam kromatin
terkondensasi dilindungi dari serangan DNase I karena sangat melilit dan terkondensasi.
Percobaan yang ditunjukkan di sini menggunakan kromatin dari dua jenis sel yang berbeda,
eritrosit ayam dan sel oviduk, dan berfokus pada gen untuk globin dan ovalbumin, yang masing-
masing diekspresikan dalam sel eritrosit dan sel telur. Mencerna kromatin dengan konsentrasi
rendah DNase I secara istimewa mencerna DNA di daerah yang tidak digulung (1). DNA
kemudian dimurnikan dan dicerna dengan enzim restriksi (2) yang melepaskan fragmen DNA
yang mengandung gen globin atau ovalbumin yang masih utuh (jika belum di-nick oleh DNase
I). Kehadiran fragmen pembatasan tersebut terdeteksi pada langkah 3 dengan memisahkan DNA
menggunakan elektroforesis, mentransfer fragmen yang terpisah untuk menyaring kertas (noda
Selatan), dan hibridisasi dengan probe DNA radioaktif untuk gen globin dan ovalbumin.
Perhatikan bahwa DNA yang diisolasi dari eritrosit kromatin yang diperlakukan dengan
meningkatnya jumlah DNase I mengandung semakin sedikit gen globin utuh, dan hasil yang
sebanding diperoleh untuk gen ovalbumin dalam kromatin oviduk. Sebaliknya, bahkan
konsentrasi tinggi DNase I tidak berpengaruh pada gen globin dalam oviduct chromatin atau
pada gen ovalbumin dalam chromatin erythrocyte. Dengan kata lain, gen lebih rentan terhadap
serangan DNase I dalam jaringan di mana mereka secara aktif ditranskripsi.
 DNase I juga telah digunakan dalam eksperimen jenis lain. Ketika nukleus diperlakukan
dengan konsentrasi DNase I yang sangat rendah, dimungkinkan untuk mendeteksi lokasi spesifik
dalam kromatin yang sangat rentan terhadap pencernaan. Situs-situs hipersensitif DNase I ini
cenderung muncul hingga beberapa ratus basis di hulu dari situs awal transkripsi dari gen aktif.
Dibandingkan dengan sebagian besar DNA yang ditemukan dalam gen aktif, situs hiper-sensitif
DNase I sekitar sepuluh kali lebih sensitif terhadap pencernaan DNase I. Daerah-daerah ini
tampaknya sesuai dengan daerah di mana DNA bukan bagian dari nukleosom. Gagasan bahwa
situs hipersensitif DNase I dapat mewakili daerah yang bebas dari nukleosom pertama kali
muncul dari penelitian yang melibatkan virus eukariotik SV40. Ketika virus SV40 menginfeksi
sel inang, molekul DNA sirkularnya menjadi terkait dengan histones dan membentuk nukleosom
khas yang dapat diamati dengan mikroskop elektron. Namun, sebagian kecil DNA virus tetap
sama sekali tidak tertutup dan bebas dari nukleosom (Gambar 23-15). Wilayah ini, yang
mencakup beberapa situs hipertensi DNase I, mengandung sekuens DNA yang mengikat protein
pengatur yang terlibat dalam pengaktifan transkripsi.

Metilasi DNA Berhubungan dengan Tidak Aktif Wilayah Genom

Cara lain untuk mengatur ketersediaan wilayah spesifik genom adalah melalui metilasi
DNA, penambahan kelompok metil ke basa sitosin tertentu dalam DNA. DNA kebanyakan
vertebrata mengandung sejumlah kecil sitosin teretilasi, yang cenderung mengelompok di dekat
ujung 5¿ gen tempat urutan promotor berada. Metilasi daerah promotor dapat memblokir akses
protein yang diperlukan untuk aktivasi transkripsional atau berfungsi sebagai situs pengikatan
untuk protein yang memadatkan kromatin menjadi konfigurasi yang tidak aktif. Efek bersihnya
adalah pembungkaman ekspresi gen secara lokal atau regional.
 GAMBAR 23-15 Molekul DNA Sirkular dari Virus
SV40 dari Sel Inang yang Terinfeksi. Dalam
mikrograf elektron berdaya tinggi ini dari
molekul DNA SV40, daerah kurung DNA tidak
memiliki nukleosom. Wilayah ini sesuai dengan
lokasi beberapa situs hipersensitif (TEM) DNase
I.

Enzim yang bertanggung jawab untuk metilasi DNA bertindak secara istimewa pada
sitosin yang terletak dalam sekuens 5 CG-CG-3 base yang dipasangkan basa menjadi sekuens 3’-
GC – 5’ komplementer yang sendiri telah dimetilasi. Dengan kata lain, jika untai DNA lama
dalam heliks ganda DNA yang baru direplikasi memiliki urutan 5’ – CG-3’ yang dimetilasi, maka
urutan 3¿ – GC – 5’ yang komplementer dalam untaian baru akan menjadi target untuk metilasi.
Fenomena ini memungkinkan pola metilasi DNA diwariskan selama putaran suksesi replikasi
DNA. Hasil akhirnya adalah bahwa metilasi DNA menyediakan sarana untuk menciptakan
perubahan epigenetik — yaitu, perubahan stabil dalam ekspresi gen yang ditransmisikan dari
satu generasi seluler ke generasi berikutnya tanpa memerlukan perubahan dalam urutan basa
yang mendasari gen.
Contoh mencolok melibatkan kromosom X mamalia betina, yang mewarisi kromosom X
dari masing-masing dua orang tua mereka. Karena laki-laki hanya memiliki satu kromosom X,
ketidakseimbangan potensial ada dalam ekspresi gen terkait-X antara laki-laki dan perempuan.
Solusi alami untuk masalah ini adalah dengan menonaktifkan satu dari dua kromosom X secara
acak pada wanita selama perkembangan embrionik awal. Selama proses inaktivasi X ini, DNA
dari satu kromosom X menjadi dimetabolisme secara luas, serat kromatin terkondensasi menjadi
massa heterokromatin yang padat yang DNAnya kurang dapat diakses oleh faktor transkripsi dan
RNA polimerase, dan transkripsi gen berhenti. Ketika sel-sel interfase diperiksa di bawah
lingkup mikro, kromosom X yang tidak aktif terlihat sebagai titik gelap yang disebut tubuh Barr.
Setelah kromosom X yang diberikan telah dinonaktifkan di sel tertentu, krom X yang sama tetap
tidak aktif di semua sel yang dihasilkan oleh pembelahan sel yang berhasil. Akibatnya
perempuan, seperti laki-laki, hanya mengandung satu kromosom X aktif per sel dewasa
Bukti tambahan menunjukkan bahwa metilasi DNA dapat menghambat aktivitas gen
telah datang dari penelitian menggunakan enzim restriksi MspI dan HpaII. Kedua enzim ini
membelah situs pengenalan –CCGG–. Namun, HpaII hanya berfungsi jika C pusat tidak
termetilasi, sedangkan MspI memotong apakah C termetilasi atau tidak (Gambar 23-16).
Membandingkan fragmen-fragmen DNA yang dihasilkan oleh dua enzim ini telah
mengungkapkan bahwa situs-situs DNA tertentu dimetilasi dengan cara spesifik jaringan —
yaitu, situs-situs tersebut dimetilasi dalam beberapa jaringan tetapi tidak pada yang lain. Secara
umum situs tersebut dimetilasi dalam jaringan di mana gen tidak aktif, tetapi mereka tidak
termetilasi dalam jaringan di mana gen aktif atau berpotensi aktif. Sebagai contoh, sekuens CG
yang terletak di dekat daerah promotor gen globin dimetilasi dalam jaringan yang tidak
menghasilkan hemoglobin tetapi tidak termetilasi dalam sel darah merah.
Pentingnya meresap metilasi DNA diperjelas oleh penemuan bahwa semakin banyak
penyakit manusia, termasuk kanker, terkait dengan kelainan pada metilasi DNA. Metilasi DNA
juga memainkan peran dalam pencetakan genom — proses yang menyebabkan gen tertentu
diekspresikan secara berbeda tergantung pada apakah mereka diwarisi dari ibu atau ayah
seseorang. Sebagai contoh, beberapa gen tercetak diekspresikan dalam salinan yang diwarisi dari
ibu dan dibungkam dalam salinan yang diwarisi dari ayah. Perilaku yang berbeda ini berasal dari
pola metilasi yang berbeda: Wilayah promotor dari salinan ayah diturunkan secara luas
dimetilasi, sedangkan wilayah yang sama dalam salinan ibu yang diwariskan tidak. (Mencetak
juga bekerja dengan cara yang berlawanan - salinan maternal daripada salinan paternal dari
beberapa gen tidak diaktifkan oleh metilasi). Beberapa penyakit dihasilkan dari penghapusan gen
spesifik yang dicetak. Salah satu contoh yang dipahami dengan baik melibatkan penghapusan di
wilayah yang sama dari kromosom manusia 15, yang mengandung gen yang dicetak. Sindrom
Prader-Willi ditandai oleh penghapusan gen ayah di wilayah ini dan ditandai oleh
keterbelakangan mental ringan, makan kompulsif dan obesitas, dan cacat dalam perkembangan
gonad. Sebaliknya, sindrom Angelman terjadi ketika gen di wilayah ini pada kromosom ibu
dihapus. Pasien sindrom Angelman sering menunjukkan tawa dan senyum, serta gerakan
mengepakkan tangan.
 Warisan bukan satu-satunya faktor yang mempengaruhi pola metilasi DNA: Penelitian
yang melibatkan kembar identik telah mengungkapkan bahwa lingkungan juga berperan.
Kembar identik menunjukkan pola metilasi DNA yang hampir tidak bisa dibedakan ketika si
kembar masih muda, tetapi perbedaan yang signifikan muncul ketika si kembar tumbuh lebih
tua. Perbedaan terbesar dalam metilasi DNA, dan dalam pola gen yang diekspresikan, terlihat
pada kembar yang menghabiskan banyak waktu terpisah, menunjukkan bahwa faktor lingkungan
memengaruhi metilasi DNA dan, pada gilirannya, ekspresi gen.

GAMBAR 23-16 Perbedaan dalam

Metilasi DNA yang Terdeteksi
Menggunakan Pencernaan
Enzimatik. Baik HpaII dan MspI
memotong DNA pada urutan
CCGG, tetapi HpaII tidak akan
memotong jika C kedua dimetilasi
(kuning). (a) Ketika DNA yang
ditampilkan dipotong dengan
HpaII, sebuah fragmen panjang
dihasilkan yang dapat dideteksi
menggunakan Southern blot (lihat
Kotak 18C). (B) Ketika DNA yang
sama dipotong dengan MspI, dua
fragmen pendek dari daerah yang
sama diproduksi.

Perubahan Histon dan Protein Renovasi Chromatin Dapat Mengubah Aktivitas Genom
Metilasi DNA bukan satu-satunya jenis perubahan genomik yang terlibat dalam kontrol
epigenetik. Mekanisme lain melibatkan perubahan histones, protein yang perannya dalam
pengemasan DNA kromosom dijelaskan pada Bab 18. Setiap molekul histone memiliki ekor
yang menonjol yang dapat ditandai di berbagai lokasi dengan penambahan kelompok metil,
asetil, atau fosfat. Berbagai kombinasi tag ini membuat kode histone yang dibaca oleh protein
lain sebagai serangkaian sinyal untuk memodifikasi struktur kromatin dan aktivitas gen.
Salah satu jenis reaksi penandaan melibatkan metilasi asam amino lisin, yang dapat
berfungsi sebagai sinyal untuk aktivasi atau represi ekspresi gen, tergantung pada lisin tertentu
dan kelas histone yang terlibat. Sebagai contoh, metilasi pada lisin 4 dalam histone H3 adalah
ciri khas dari gen yang paling aktif, sedangkan metilasi lisin 9 dan 27 dikaitkan dengan
pembungkaman gen. Dalam kasus-kasus tertentu, metilasi lisin 27 mengarah pada rekrutmen dan
aktivasi enzim yang memetilasi DNA yang berdampingan, sehingga membentuk dua perubahan
epigenetik yang terlibat dalam pembungkaman gen.
Mekanisme lain untuk mengubah struktur histon adalah melalui asetilasi — penambahan
gugus asetil ke rantai samping asam amino. Secara khusus, enzim histone acetyltransferase
(HAT) menambah kelompok asetil ke molekul histone dan dengan demikian mempromosikan
dekondensasi kromatin. Enzim lain, histone deacetylase (HDAC), melakukan fungsi yang
berlawanan, menghilangkan gugus asetil dari histones. Protein pengatur yang mengikat DNA
dapat merekrut kompleks yang mengandung enzim ini, sehingga mengubah ketersediaan suatu
wilayah DNA untuk transkripsi. Protein represor, yang menyebabkan transkripsi lebih jarang
terjadi di lokasi tertentu, merekrut kompleks HDAC, dan protein aktivator merekrut kompleks
HAT (Gambar 23-17a; kita akan membahas aktivator dan penindas transkripsional secara lebih
rinci nanti dalam bab ini). Bukti bahwa histone asetat terkait dengan gen aktif telah disediakan
oleh penelitian di mana chro matin diinkubasi dengan DNase I untuk secara selektif menurunkan
gen yang aktif transkripsi. Perawatan semacam itu menyebabkan pelepasan bentuk aseton
histone H3 dan H4, yang menunjukkan bahwa asetilasi histones ini terkait dengan aktivasi gen.
Perubahan yang disebabkan oleh asetilasi seperti itu dalam struktur nukleosom dianggap
melonggarkan pengemasan kromatin dan dengan demikian memfasilitasi akses faktor transkripsi
ke promotor gen.
 GAMBAR 23-17 Peran Asetilasi Histone dan Chromatin

Perbaikan Protein selama Aktivasi Transkripsional. (a)

Protein aktivator transkripsional merekrut histone
acetyltrans- ferase (HAT) kompleks ke daerah dekat
gen. Enzim ini kemudian menambahkan gugus asetil,
yang mengarah pada pembukaan atau penutupan dari
struktur kromatin di wilayah tersebut. (B) protein
remodeling Chromatin dapat memiliki beberapa efek
pada nukleosom. Dalam kasus ini ditunjukkan di sini,
protein remodeling kromatin menyebabkan sliding
nukleosom, memperlihatkan wilayah DNA yang
kemudian bisa ditranskripsi.

Namun cara lain di mana histones mempengaruhi struktur kromatin dan aktivitas gen
disarankan oleh penelitian yang menunjukkan bahwa kromatin aktif transkripsi sering tidak
memiliki histone H1. Karena histone H1 diperlukan untuk melipat kromatin menjadi serat
kromatin 30-nm (Gambar 18-22b), tidak adanya histone H1 dapat membantu mempertahankan
kromatin aktif dalam bentuk serat 10-nm yang tidak digulung. Ciri terkait lainnya dari kromatin
aktif transkripsional adalah kandungannya yang besar dari protein kelompok mobilitas tinggi
(HMG), sekelompok protein non-histone yang namanya mencerminkan mobilitasnya yang cepat
selama elektroforesis. Ketika protein HMG dikeluarkan dari persiapan kromatin terisolasi, gen
aktif kehilangan kepekaannya terhadap DNase I. Jika protein HMG tertentu kemudian
dipisahkan dari jaringan lain dan ditambahkan ke kromatin yang habis HMG, pola gen sensitif
DNase I ditemukan menyerupai jaringan dari mana kromatin, bukan protein HMG, diperoleh. Ini
berarti bahwa kromatin menunjukkan sifat spesifik jaringan yang dikenali oleh protein HMG,
yang memungkinkan mereka untuk mengikat secara selektif pada gen yang mampu diaktifkan
dalam jaringan tertentu. Pengikatan HMG diperkirakan memberikan sensitivitas DNase I dengan
membantu mengurai serat kromatin menjadi konfigurasi yang lebih terbuka, mungkin dengan
memindahkan histone H1 dari serat 30-nm.
Selain modifikasi histon dalam nukleosom, protein lain mengubah posisi nukleosom
sepanjang DNA. Protein remodeling kromatin ini memadukan hidrolisis ATP dengan perubahan
dalam organisasi dan posisi nukleosom di sepanjang DNA (Gambar 23-17b). Salah satu kelas
remodeler yang penting adalah keluarga SWI / SNF. Protein ini diduga meluncur nukleosom atau
menyebabkannya dikeluarkan dari daerah kromatin, membuat daerah DNA lebih mudah diakses
oleh mesin transkripsi. Ingatlah bahwa asetilasi histone berhubungan positif dengan aktivitas
gen. Remodeler SWI / SNF memiliki domain yang mengikat ekor protein histone yang
diasetilasi, menggabungkan perubahan histones dan remodeling kromatin.

PERATURAN GEN EUKARIOTIK: KONTROL TRANSKRIPSI

Kami sekarang telah menjelaskan beberapa perubahan peraturan umum dalam komposisi dan
struktur genom. Namun, adanya perubahan struktural yang terkait dengan daerah aktif genom
tidak menjawab pertanyaan mendasar tentang bagaimana sekuens DNA yang terkandung dalam
wilayah ini sebenarnya dipilih untuk aktivasi. Jawabannya dapat ditemukan dalam fenomena
kontrol transkripsi, tingkat utama kedua untuk mengendalikan ekspresi gen eukariotik (lihat
Gambar 23-10).

Set Gen yang Berbeda Ditranskripsi dalam Berbagai Tipe Sel

Ketika kita mempertimbangkan kontrol transkripsional, kita sampai pada tingkat regulasi gen di
mana pengetahuan telah berkembang dalam beberapa tahun terakhir. Bukti langsung pertama
tentang pentingnya regulasi transkripsional pada eukariota berasal dari eksperimen yang
membandingkan RNA yang baru disintesis dalam inti jaringan mamalia yang berbeda. Sel-sel
hati dan otak, misalnya, menghasilkan set protein yang berbeda, meskipun ada banyak tumpang
tindih antara kedua set. Bagaimana kita dapat menentukan sumber perbedaan ini? Jika protein
berbeda yang dihasilkan oleh kedua jenis sel tersebut merupakan cerminan dari transkripsi gen
diferensial — yaitu transkripsi gen yang berbeda untuk menghasilkan set RNA yang berbeda —
kita harus melihat perbedaan yang sesuai antara populasi RNA nuklir yang berasal dari sel otak
dan hati. Di sisi lain, jika semua gen sama-sama ditranskripsi dalam hati dan otak, kita akan
menemukan sedikit, jika ada, perbedaan antara populasi RNA nuklir dari dua jaringan, dan kita
akan menyimpulkan bahwa perbedaan spesifik jaringan dalam sintesis protein adalah karena
mekanisme posttranskripsi yang mengontrol kemampuan berbagai RNA untuk diterjemahkan.

Salah satu cara untuk membedakan antara alternatif-alternatif ini adalah dengan menggunakan
teknik transkripsi run-on nuklir, yang memberikan gambaran singkat tentang aktivitas transkripsi
yang terjadi dalam nukleus pada saat tertentu dalam waktu (Gambar 23-18). Inti transkripsi aktif
diisolasi secara lembut dari sel dan diizinkan untuk menyelesaikan sintesis molekul RNA dengan
adanya trifosfat nukleosida berlabel radioaktif. Ketika percobaan seperti itu dilakukan dengan
menggunakan sel hati dan otak, RNA yang baru ditranskripsi (berlabel radioaktif) dalam inti hati
mengandung sekuens dari gen spesifik hati, tetapi sekuens spesifik hati ini tidak terdeteksi dalam
RNA berlabel yang disintesis oleh inti otak yang terisolasi. . Demikian juga, RNA yang baru
ditranskripsi (berlabel radioaktif) dalam inti otak mengandung sekuens dari gen spesifik otak,
tetapi sekuens spesifik otak ini tidak terdeteksi dalam RNA berlabel yang disintesis oleh inti hati
yang terisolasi.

Dengan gagal mendeteksi sintesis RNA dari gen spesifik hati dalam inti sel otak dan sebaliknya,
percobaan ini menunjukkan bahwa ekspresi gen sedang diatur pada tingkat transkripsi. Dengan
kata lain, jenis sel yang berbeda mentranskripsi set gen yang berbeda, sehingga memungkinkan
setiap jenis sel untuk menghasilkan protein yang dibutuhkan untuk menjalankan fungsi khusus
sel tersebut.

Susunan Mikro DNA Memungkinkan Ekspresi Ribuan Gen untuk Dipantau secara
Bersamaan

Meskipun jenis pengamatan sebelumnya mengungkapkan bahwa set gen yang berbeda
ditranskripsi dalam tipe sel yang berbeda, mereka tidak dapat dengan mudah mengidentifikasi
gen individu mana yang dihidupkan atau dimatikan. Salah satu metode untuk menentukan
apakah gen tertentu aktif adalah untuk menguji mRNA yang sesuai menggunakan teknik deteksi
RNA yang agak aneh disebut Northern blotting untuk membedakannya dengan Southern blotting
(teknik deteksi DNA yang dijelaskan dalam Kotak 18C). Di Northern blotting, sampel RNA
difraksionasi ukuran dengan elektroforesis gel dan dipindahkan ke kertas blotting khusus.
Makalah ini kemudian diekspos ke penyelidikan DNA radioaktif (atau diberi label lain) yang
mengandung urutan gen yang menarik, dan jumlah mRNA dikuantifikasi dengan mengukur
radioaktivitas terikat.

GAMBAR 23-18 Demonstrasi Transkripsi Diferensial oleh Uji Coba Nuklir. Dalam studi
ini, B merupakan gen hipotetis yang diekspresikan hanya di jaringan otak, dan L adalah gen yang
diekspresikan hanya di jaringan hati. Inti yang terisolasi diinkubasi dalam larutan yang
mengandung ribonukleotida berlabel radioaktif, yang kemudian dimasukkan ke dalam mRNA
yang disintesis oleh gen aktif. Jika gen yang berbeda aktif di hati dan jaringan otak, beberapa
urutan berlabel dalam transkrip nuklir hati tidak akan hadir dalam transkrip otak dan sebaliknya.
Komposisi populasi RNA berlabel diuji dengan memungkinkan RNA berlabel untuk
berhibridisasi dengan sekuens DNA yang mewakili gen yang berbeda yang telah melekat pada
dukungan kertas-filter (). Transkrip hati berlabel hibridisasi dengan set gen yang berbeda dari
transkrip otak berlabel, menunjukkan bahwa identitas gen aktif dalam dua jaringan berbeda.

Atau, untuk memantau ekspresi ratusan atau bahkan ribuan gen secara bersamaan, alat yang
dikenal sebagai microarray DNA dapat digunakan. Sebuah microarray DNA adalah chip tipis,
seukuran kuku yang terbuat dari plastik atau kaca yang telah terlihat di lokasi tetap dengan
ribuan fragmen DNA yang sesuai dengan berbagai gen yang diminati. Sebuah array mikro
tunggal dapat berisi 10.000 tempat atau lebih, masing-masing mewakili gen yang berbeda. Untuk
menentukan gen mana yang diekspresikan dalam populasi sel tertentu, molekul RNA (produk
transkripsi gen) diisolasi dari sel dan disalin dengan enzim reverse transcriptase menjadi molekul
cDNA untai tunggal, yang kemudian ditempelkan pada pewarna fluorescent. Ketika susunan
mikro DNA dimandikan dengan cDNA fluoresens, setiap molekul cDNA akan terikat oleh
pasangan basa komplementer ke tempat yang mengandung gen spesifik yang ditranskripsi dari.

Gambar 23-19 mengilustrasikan bagaimana pendekatan ini dapat digunakan untuk

membandingkan pola ekspresi gen dalam sel otak dan hati. Dalam contoh khusus ini, dua
pewarna fluoresen digunakan: pewarna hijau untuk memberi label cDNA yang berasal dari sel
otak dan pewarna merah untuk label cDNA yang berasal dari sel hati. Ketika cDNA hijau dan
merah dicampur bersama dan ditempatkan pada microarray DNA, cDNA hijau akan mengikat
gen yang diekspresikan dalam sel otak, dan cDNA merah akan mengikat gen yang diekspresikan
dalam sel hati. Bintik-bintik hijau karenanya mewakili ekspresi gen yang lebih tinggi dalam sel-
sel otak, bintik-bintik merah mewakili ekspresi gen yang lebih tinggi dalam sel-sel hati, bintik-
bintik kuning (disebabkan oleh campuran fluoresensi hijau dan merah) mewakili gen yang
ekspresinya kira-kira sama, dan bintik-bintik hitam (tidak adanya fluoresensi) mewakili gen yang
diekspresikan dalam tipe sel. Akibatnya, mengukur warna dan intensitas setiap titik fluoresen
memungkinkan ekspresi ribuan gen untuk dipantau secara bersamaan. Data tersebut telah
mengungkapkan bahwa banyak gen diekspresikan secara selektif dalam tipe sel tertentu, seperti
sel otak, sel hati, atau sel lain yang dibedakan.
DNA microarrays juga memiliki aplikasi praktis. Sebagai contoh, kanker pada manusia yang
tampaknya merupakan penyakit yang sama berdasarkan pemeriksaan mikroskopis terkadang
menunjukkan profil ekspresi gen yang berbeda ketika diuji menggunakan teknologi microarray
DNA. Informasi tersebut memungkinkan kanker dari pasien yang berbeda untuk dikarakterisasi
dengan lebih akurat, sehingga meningkatkan prospek untuk perawatan khusus yang paling sesuai
untuk setiap orang.

GAMBAR 23-19 Menggunakan Susunan mikro DNA untuk Mempelajari Profil Ekspresi
Gen. Dalam contoh ini, ekspresi gen dalam sel-sel otak dan sel-sel hati dibandingkan dengan
mengisolasi mRNA dari dua populasi sel, menggunakan reverse transcriptase untuk membuat
salinan cDNA dari mRNA, dan menempelkan pewarna fluoresen hijau ke cDNA sel otak dan
fluoresen merah pewarna ke cDNA sel hati. Susunan mikro DNA yang berisi fragmen DNA yang
mewakili ribuan gen berbeda kemudian dimandikan dengan campuran dua populasi cDNA
(hanya sebagian kecil dari susunan mikro DNA yang diilustrasikan). Setiap cDNA berhibridisasi
ke tempat yang mengandung gen spesifik yang sesuai dengannya. Bintik-bintik hijau karenanya
mewakili gen-gen yang diekspresikan secara istimewa dalam sel-sel otak, bintik-bintik merah
mewakili gen-gen yang diekspresikan secara istimewa dalam sel-sel hati, bintik-bintik kuning
(campuran fluoresensi hijau dan merah) mewakili gen-gen yang ekspresinya mirip dalam dua
populasi sel, dan daerah gelap (bintik-bintik yang hilang) ) mewakili gen yang tidak
diekspresikan dalam kedua jenis sel.

Elemen Kontrol Proksimal Berbaring Dekat dengan Promotor

Dalam membahas bagaimana transkripsi gen diatur dalam jenis sel yang berbeda, kita sekarang
akan memusatkan perhatian kita pada gen pengkode protein, yang ditranskripsi oleh RNA
polimerase II. Seperti yang kita lihat di Bab 21, kekhususan transkripsi — yaitu, di mana pada
DNA dimulai — ditentukan bukan oleh RNA polimerase itu sendiri, tetapi oleh protein yang
disebut faktor transkripsi. (Tidak seperti faktor sigma bakteri, yang juga menentukan spesifisitas
inisiasi, tidak ada faktor transkripsi eukariotik yang dianggap sebagai bagian integral dari
molekul RNA polimerase.) Faktor transkripsi yang dibahas dalam Bab 21 adalah faktor
transkripsi umum, yang penting untuk transkripsi. dari semua gen yang ditranskripsi oleh jenis
RNA polimerase.

Untuk gen yang ditranskripsi oleh RNA polimerase II, faktor transkripsi umum berkumpul
dengan RNA polimerase pada promotor inti, wilayah DNA yang terletak tepat di sekitar titik
awal transkripsi (lihat Gambar 21-11b). Interaksi faktor transkripsi umum dan RNA polimerase
dengan promotor inti sering memulai transkripsi hanya pada tingkat "basal" yang rendah,
sehingga hanya beberapa transkrip yang diproduksi. Namun, di samping promotor inti, sebagian
besar gen pengkode protein memiliki urutan DNA pendek lebih jauh ke hulu (dan, dalam
beberapa kasus, hilir) tempat faktor transkripsi lainnya mengikat, sehingga meningkatkan
efisiensi promotor inti. Jika elemen DNA tambahan ini dihapus secara eksperimental, frekuensi
dan ketepatan transkripsi berkurang.

Dalam membahas sekuens DNA pengatur seperti itu, kami akan menggunakan istilah elemen
kontrol proksimal untuk merujuk pada sekuens yang terletak di hulu promotor inti tetapi dalam
sekitar 100-200 pasangan basa. Jumlah, lokasi yang tepat, dan identitas dari elemen-elemen
kontrol proksimal ini bervariasi dengan masing-masing gen, tetapi tiga jenis sangat umum: kotak
CAAT, kotak GC, dan oktamer (dua yang pertama dibahas pada Bab 21 dan diilustrasikan pada
Gambar 21). 23-20). Faktor transkripsi yang secara selektif mengikat salah satunya, atau urutan
kontrol lain yang berada di luar promotor inti, disebut faktor transkripsi regulasi. Mereka
meningkatkan (atau kadang-kadang mengurangi) inisiasi transkripsi dengan berinteraksi dengan
komponen-komponen aparatus transkripsi.

Enhancer dan Silencer Berada di Jarak Variabel dari Promotor

Elemen kontrol proksimal, seperti kebanyakan elemen kontrol bakteri, terletak dekat dengan
promotor inti di sisi hulu. Kelas kedua dari rangkaian kontrol DNA terletak di bagian hulu atau
hilir dari gen yang diaturnya dan seringkali terletak jauh dari promotor. Tipe kedua dari wilayah
kontrol ini disebut penambah jika merangsang transkripsi gen atau peredam jika menghambat
transkripsi. Awalnya, urutan kontrol seperti itu disebut elemen kontrol distal karena mereka dapat
berfungsi pada jarak hingga beberapa ratus ribu pasangan basa di hulu atau hilir dari promotor
yang mereka atur (kata distal berarti "menjauh dari"). Namun, ciri khas dari urutan tersebut
bukanlah seberapa jauh dari promotor mereka berada, tetapi fakta bahwa posisi mereka relatif

terhadap promotor dapat sangat bervariasi. Orientasi mereka bahkan dapat dibalik tanpa
mengganggu kemampuan mereka untuk mengatur transkripsi. Dengan demikian, perangkat
tambahan dan peredam tidak perlu ditempatkan pada jarak yang jauh dari promotor. Mereka
dapat ditempatkan cukup dekat dengan promotor dan bahkan kadang-kadang ditemukan dalam
gen; satu contoh adalah penambah yang ditemukan dalam intron gen antibodi tertentu.

GAMBAR 23-20 Anatomi Gen Eukariotik Khas, dengan Promotor Inti dan Daerah
Kontrol Proksimal. Diagram ini (bukan untuk skala) fitur gen eukariotik pengkode protein
khas, yang ditranskripsi oleh RNA polimerase II. Promotor - disebut promotor inti untuk
membedakannya dari wilayah kontrol proksimal - dicirikan oleh urutan inisiator (Inr) yang
mengelilingi titik awal transkripsi dan kotak TATA yang terletak sekitar 25 bp hulu (ke sisi 5 ')
dari titik awal. Promotor inti adalah tempat faktor transkripsi umum dan RNA polimerase
berkumpul untuk memulai transkripsi. Dalam sekitar 100 nukleotida hulu dari promotor inti
terdapat beberapa elemen kontrol proksimal, yang merangsang transkripsi gen dengan
berinteraksi dengan faktor transkripsi regulasi. Jumlah, identitas, dan lokasi pasti dari elemen
proksimal bervariasi dari gen ke gen. Di sini kami menunjukkan kasus sederhana yang
melibatkan satu salinan dari masing-masing dua elemen umum, kotak GC dan kotak CAAT. Unit
transkripsi mencakup 5 'wilayah yang tidak diterjemahkan (pemimpin) dan 3' wilayah yang tidak
diterjemahkan (trailer), yang ditranskripsi dan dimasukkan dalam mRNA tetapi tidak
berkontribusi informasi urutan untuk produk protein. Pada akhir ekson terakhir adalah situs di
mana, dalam transkrip primer, RNA akan dibelah dan diberi ekor poli (A).
Karena perangkat tambahan lebih dipahami daripada peredam suara, kami akan
mempertimbangkannya terlebih dahulu. Enhancer, bervariasi dalam urutan tertentu tetapi berbagi
sifat umum, dikaitkan dengan banyak gen eukariotik. Penambah tipikal mengandung beberapa
elemen kontrol yang berbeda di dalamnya, masing-masing terdiri dari sekuens DNA pendek
yang berfungsi sebagai situs pengikatan untuk faktor transkripsi regulasi berbeda. Beberapa dari
sekuens DNA ini mungkin identik dengan elemen kontrol proksimal; octamer dan kotak GC,
misalnya, dapat bertindak baik sebagai elemen kontrol proksimal dan sebagai komponen
peningkat. Agar penambah berfungsi, faktor transkripsi pengaturan yang mengikat berbagai
elemen kontrolnya harus ada. Karena peningkat terlibat dalam mengaktifkan transkripsi, faktor
transkripsi pengaturan ini disebut aktivator.

Untuk menyelidiki sifat-sifat peningkat, para peneliti telah menggunakan teknik DNA
rekombinan untuk mengubah lokasi dan orientasi penambah sehubungan dengan gen yang diatur.
Seperti ditunjukkan pada Gambar 23-21, studi tersebut mengungkapkan bahwa peningkat dapat
berfungsi dengan baik ketika dipindahkan pada jarak variabel dari titik awal transkripsi, selama
promotor hadir (Gambar 23-21a, d-g). Ketika promotor atau enhancer dihilangkan, tidak ada
ekspresi yang muncul (Gambar 23-21b, c). Aktivitas dipertahankan saat posisi

penambah dipindahkan lebih jauh ke hulu (Gambar 23-21e), ketika orientasinya relatif terhadap
awal gen terbalik (Gambar 23-21f), atau ketika penambah dipindahkan ke hilir ujung 3 'gen
(Gambar 23). -21g). Properti ini sering digunakan untuk membedakan peningkat dari elemen
kontrol proksimal, yang lokasi tepatnya dalam DNA cenderung lebih kritis untuk fungsinya.
Meskipun demikian, karena semakin banyak peningkat dan elemen kontrol proksimal telah
ditemukan dan diselidiki, perbedaan antara kedua kategori ini menjadi kurang jelas, dan sekarang
tampak bahwa spektrum luas elemen kontrol transkripsi ada dengan sifat yang tumpang tindih.
Pada satu ekstrim adalah elemen kontrol proksimal tertentu yang harus tepat berada di posisi
tertentu di dekat promotor - dalam kasus seperti itu, memindahkan mereka bahkan 15-20
nukleotida lebih jauh dari promotor menyebabkan mereka kehilangan pengaruhnya. Pada
ekstrem lain adalah peningkat yang posisinya dapat sangat bervariasi, hingga puluhan ribu
nukleotida jauh dari promotor, tanpa mengganggu kemampuan mereka untuk mengaktifkan
transkripsi.

GAMBAR 23-21 Pengaruh Orientasi Penambah dan Lokasi. Teknik DNA rekombinan
telah digunakan untuk mengubah orientasi dan lokasi elemen kontrol DNA dan
mempelajari efek dari perubahan tersebut pada transkripsi gen. Panah hitam menunjukkan
arah transkripsi gen G, dengan titik awal (nukleotida transkripsi pertama) berlabel +1. Angka-
angka lain memberikan posisi nukleotida relatif terhadap titik awal. (a) Promotor inti (P) sendiri,
di lokasi tipikalnya di bagian hulu gen G, memungkinkan tingkat transkripsi dasar terjadi. (B)
Ketika promotor inti dihapus dari gen, tidak ada transkripsi terjadi. (c) Penambah (E) saja tidak
dapat menggantikan daerah promotor, tetapi (d) menggabungkan penambah dengan promotor inti
menghasilkan tingkat transkripsi yang jauh lebih tinggi daripada yang terjadi pada promotor saja.
(e) Peningkatan transkripsi ini diamati ketika penambah dipindahkan lebih jauh ke hulu, (f)
ketika terbalik dalam orientasi, dan (g) bahkan ketika dipindahkan ke sisi gen 3 '.

Peredam berbagi banyak fitur penambah, kecuali bahwa peredam menghambat dan bukannya
mengaktifkan transkripsi. Karena pengikatan faktor transkripsi regulasi ke peredam mengurangi
daripada meningkatkan laju transkripsi gen, faktor transkripsi seperti itu disebut penekan
eukariotik. (Sementara mereka menyerupai penekan bakteri dalam mematikan transkripsi,
mekanisme eukariotik agak berbeda dan lebih bervariasi.) Kami menemukan contoh peredam
sebelumnya dalam bab ketika membahas gen SIR ragi, yang menghasilkan protein yang
menghambat transkripsi HMLa dan HMRa. gen tipe perkawinan dengan mengikat urutan DNA
yang mengelilingi kedua gen ini. Protein yang diproduksi oleh gen SIR adalah contoh dari
penekan, dan situs DNA yang terikat oleh penekan ini, yang terletak di dekat HMLa dan HMRa,
adalah contoh peredam suara.

Salah satu komplikasi yang dihadapi dengan peredam dan peningkat berasal dari kemampuan
mereka untuk mempengaruhi transkripsi gen yang jauh, yang bisa bermasalah jika gen dengan
fungsi yang berlawanan berada di daerah tetangga. Sebagai contoh, sekelompok gen yang aktif
dalam satu jenis sel mungkin terletak dekat set gen lain yang seharusnya tidak aktif dalam sel-sel
yang sama. Dalam situasi seperti itu, sekuens DNA yang disebut isolator kadang-kadang
digunakan untuk mencegah penambah (atau peredam) dari secara tidak sengaja bekerja pada
kedua kelompok gen secara bersamaan. Sekuens isolator, bersama dengan protein pengikatnya
yang terkait, menciptakan penghalang fisik antara daerah DNA tetangga yang mencegah
peningkat atau peredam dari mengerahkan efeknya melintasi penghalang..

Coactivators Memediasi Interaksi Antara Faktor Transkripsi Regulator dan Kompleks

RNA Polymerase

Karena peningkat dan peredam bisa berada jauh dari gen yang dikontrolnya, Anda mungkin
bertanya-tanya bagaimana pengaturan dicapai pada jarak yang begitu jauh. Dalam mengatasi
masalah ini, kami akan kembali fokus pada perangkat tambahan (peredam tampaknya
berperilaku dengan cara yang terkait). Dua prinsip dasar mengatur interaksi antara peningkat dan
gen yang mereka atur. Pertama, pengulangan molekul DNA dapat membawa penambah ke
kedekatan dengan promotor, meskipun keduanya terletak jauh dalam hal jarak linear di
sepanjang heliks ganda DNA. Dan kedua, beragam kelompok protein koaktivator memediasi
interaksi antara aktivator yang terikat dengan penambah dan kompleks RNA polimerase yang
terkait dengan promotor.

Beberapa jenis koaktivator berperan dalam interaksi ini, termasuk protein remodeling kromatin
dan enzim yang memodifikasi histone, yang telah kita lihat penting untuk mengubah struktur
kromatin. Selain itu, kompleks multiprotein besar yang disebut Mediator berfungsi sebagai
koaktivator dengan berfungsi sebagai "jembatan" yang berikatan dengan protein aktivator yang
terkait dengan penambah dan RNA polimerase, sehingga menghubungkan peningkat dengan
komponen yang terlibat dalam memulai transkripsi pada promotor RNA polimerase II. Mediator
berfungsi sebagai unit koordinasi pusat untuk pengaturan gen, menerima input positif dan negatif
dan mengirimkan informasi ke mesin transkripsi.

Gambar 23-22 menunjukkan bagaimana interaksi tersebut dapat memicu aktivasi gen. Pada
langkah 1, sekelompok protein aktivator berikatan dengan masing-masing unsur pengontrol
DNA di dalam penambah, membentuk kompleks multiprotein yang disebut enhosome. Satu atau
lebih dari protein aktivator ini menyebabkan DNA menekuk, menciptakan loop DNA yang
membuat penambah dekat dengan promotor inti. Pada langkah 2, aktivator berinteraksi dengan
koaktivator seperti protein remodeling kromatin (SWI / SNF) dan histone acetyltransferase
(HAT), yang mengubah struktur kromatin untuk membuat DNA di wilayah promotor lebih
mudah diakses. Akhirnya, aktivator mengikat Mediator (langkah 3), yang memfasilitasi
penentuan posisi yang benar dari RNA polimerase dan faktor transkripsi umum di situs promotor
dan dengan demikian memungkinkan transkripsi untuk memulai.

Urutan peristiwa dan rangkaian komponen tertentu yang terlibat dalam contoh sebelumnya
mewakili model umum yang perinciannya bervariasi di antara berbagai gen dan protein pengatur.
Tetapi rincian ini kurang penting daripada ide utama: Ketika protein aktivator untuk gen tertentu
hadir dalam sel, ikatannya dengan penambah dapat memicu interaksi dengan berbagai
koaktivator yang pada gilirannya menyebabkan pembentukan kompleks transkripsi pada
promotor, sehingga menghasilkan dalam inisiasi transkripsi yang lebih efisien. Dengan demikian,
transkripsi gen diferensial dalam sel ditentukan terutama oleh aktivator yang dibuat sel (serta
oleh faktor-faktor yang mengontrol aktivitas aktivator, suatu topik yang akan kita diskusikan
segera).

Berbagai Elemen Kontrol DNA dan Faktor Transkripsi Bertindak dalam Kombinasi
Kesadaran bahwa banyak unsur kontrol DNA dan faktor transkripsi pengaturannya terlibat dalam
mengendalikan transkripsi gen eukariotik telah mengarah pada model kombinatorial untuk
regulasi gen. Model ini mengusulkan bahwa sejumlah kecil elemen kontrol DNA yang berbeda
dan faktor transkripsi, yang bekerja dalam kombinasi yang berbeda, dapat membentuk pola
ekspresi gen yang sangat spesifik dan terkontrol secara tepat dalam tipe sel yang berbeda.

GAMBAR 23-22 Model untuk Tindakan Enhancer. Dalam model ini, penambah yang terletak
sangat jauh di sepanjang DNA dari gen pengkode protein yang diaturnya dekat dengan promotor
inti melalui pengulangan DNA. 1) Faktor transkripsi regulasi yang disebut aktivator pertama kali
mengikat elemen penambah, memicu pembengkokan DNA yang membawa aktivator lebih dekat
ke promotor inti. 2) Para aktivator kemudian berinteraksi dengan protein coactivator seperti
SWI / SNF, yang menyebabkan remodeling kromatin, dan HAT (histone acetyltransferase), yang
mengkatalisis asetilasi histone. Efek bersihnya adalah mendekondensikan kromatin dan membuat
DNA di wilayah promotor lebih mudah diakses. 3) Para aktivator kemudian mengikat
koaktivator lain yang disebut Mediator, dan kompleks aktivator-Mediator memfasilitasi
penentuan posisi yang tepat dari faktor transkripsi umum dan RNA polimerase di situs promotor,
yang memungkinkan transkripsi dimulai. Untuk kesederhanaan, angka tersebut diambil dengan
hanya dua aktivator, tetapi seringkali setengah lusin atau lebih terlibat.

Model dimulai dengan asumsi bahwa beberapa faktor transkripsi hadir dalam banyak tipe
sel. Ini termasuk faktor transkripsi umum, yang diperlukan untuk transkripsi dalam semua sel,
ditambah faktor regulasi yang diperlukan untuk menyalin gen konstitutif dan gen lain yang
sering diekspresikan. Selain itu, transkripsi gen yang mengkode protein spesifik jaringan
memerlukan adanya faktor transkripsi atau kombinasi faktor transkripsi yang unik untuk tipe sel
individu. Untuk mengilustrasikan konsep ini, Gambar 23-23 menunjukkan bagaimana model
seperti itu akan memungkinkan sel-sel hati untuk menghasilkan sejumlah besar protein seperti
albumin tetapi akan mencegah produksi signifikan protein-protein ini di jaringan lain, seperti
otak. Versi asli dari model kombinatorial adalah "semua atau tidak sama sekali," mengusulkan
bahwa transkripsi gen tidak dapat dimulai kecuali seluruh set faktor pengatur untuk gen hadir.
Apa yang sekarang tampak jelas adalah bahwa berbagai efisiensi inisiasi transkripsional
dimungkinkan untuk sebagian besar gen: tingkat basal, terjadi ketika tidak ada faktor regulasi,
hingga tingkat maksimum, yang terjadi hanya ketika set lengkap faktor pengaktif regulasi hadir.

Beberapa Motif Struktural Umum Memungkinkan Faktor Transkripsi Regulasi untuk

Mengikat DNA dan Mengaktifkan Transkripsi

Meskipun tidak semua faktor transkripsi mengikat langsung ke DNA, faktor-faktor yang
memainkan peran penting dalam mengendalikan transkripsi. Protein dalam kategori ini
mencakup faktor transkripsi umum TFIID dan, yang lebih penting, beragamnya faktor transkripsi
regulatori (aktivator dan penekan) yang mengenali dan mengikat urutan DNA spesifik yang
ditemukan dalam elemen kontrol proksimal, enhancer, dan peredam suara. Fitur-fitur apa dari
faktor transkripsi peraturan ini yang memungkinkan mereka untuk menjalankan fungsinya?

GAMBAR 23-23 Model Kombinatorial untuk Ekspresi Gen. Gen untuk protein albumin,
seperti gen lainnya, dikaitkan dengan berbagai elemen DNA pengatur. Di sini kami hanya
menampilkan dua elemen kontrol, serta promotor inti. Sel semua jaringan mengandung RNA
polimerase dan faktor transkripsi umum, tetapi sekumpulan faktor transkripsi regulatori yang
tersedia bervariasi dengan tipe sel. Seperti yang ditunjukkan di sini, (a) sel-sel hati mengandung
satu set faktor transkripsi regulatori yang mencakup faktor-faktor untuk mengenali semua elemen
kontrol gen albumin. Ketika faktor-faktor ini berikatan dengan DNA, mereka memfasilitasi
transkripsi gen albumin pada tingkat tinggi. (B) Sel-sel otak, bagaimanapun, memiliki
serangkaian faktor transkripsi regulatori yang berbeda yang tidak termasuk semua untuk gen
albumin. Akibatnya, dalam sel-sel otak, kompleks transkripsi dapat berkumpul di promotor tetapi
tidak sangat efisien. Hasilnya adalah sel-sel otak menyalin gen albumin hanya pada tingkat
rendah.

Faktor transkripsi regulatori memiliki dua aktivitas yang berbeda, kemampuan untuk
mengikat urutan DNA tertentu dan kemampuan untuk mengatur transkripsi. Dua aktivitas
tersebut berada di domain protein yang terpisah. Domain yang mengenali dan mengikat urutan
DNA tertentu disebut domain pengikatan DNA faktor transkripsi, sedangkan wilayah protein
yang diperlukan untuk mengatur transkripsi dikenal sebagai domain regulasi transkripsi (atau
domain aktivasi karena banyak faktor transkripsi yang mengaktifkan, bukannya menghambat,
transkripsi). Keberadaan domain pengikatan dan aktivasi DNA yang terpisah telah ditunjukkan
oleh percobaan "pertukaran domain" di mana wilayah pengikatan DNA dari satu faktor
transkripsi dikombinasikan dengan berbagai wilayah dari faktor transkripsi kedua. Molekul
hibrida yang dihasilkan dapat mengaktifkan transkripsi gen hanya jika mengandung domain
aktivasi yang disediakan oleh faktor transkripsi kedua. Pemisahan domain pengikatan dan
aktivasi DNA dari faktor transkripsi telah dieksploitasi dengan cara lain dalam teknik yang
dikenal sebagai sistem dua-hibrida ragi (Kotak 23B), yang biasanya digunakan untuk
mengidentifikasi protein yang berinteraksi.

Penelitian telah mengungkapkan bahwa domain aktivasi sering memiliki proporsi asam
amino asam yang tinggi, menghasilkan muatan negatif yang kuat yang terkumpul di satu sisi
heliks. Mutasi yang meningkatkan jumlah muatan negatif cenderung meningkatkan kemampuan
protein untuk mengaktifkan transkripsi, sedangkan mutasi yang mengurangi muatan negatif
bersih atau mengganggu pengelompokan di satu sisi heliks mengurangi kemampuan untuk
mengaktifkan transkripsi. Beberapa jenis lain dari domain pengaktifan telah diidentifikasi dalam
faktor transkripsi juga. Beberapa diperkaya dalam asam amino glutamin, dan yang lain
mengandung prolin dalam jumlah besar. Karenanya beberapa jenis struktur protein mampu
menciptakan domain aktivasi yang dapat merangsang transkripsi gen.

Tipe unik dari struktur protein juga telah terdeteksi dalam domain pengikat DNA dari
faktor transkripsi. Faktanya, sebagian besar faktor transkripsi peraturan dapat ditempatkan ke
dalam salah satu dari sejumlah kecil kategori berdasarkan pola struktur sekunder, atau motif,
yang membentuk domain pengikatan DNA. Dalam paragraf berikut, kami menjelaskan secara
singkat beberapa motif pengikat DNA ini.

Helix - Putar - Helix Motif. Salah satu motif pengikatan DNA yang paling umum,
terdeteksi pada faktor transkripsi regulasi eukariotik dan prokariotik, adalah helix-turn-helix
(Gambar 23-24a). Motif ini terdiri dari dua heliks yang dipisahkan oleh lekukan di rantai
polipeptida. Meskipun urutan asam amino dari motif berbeda di antara berbagai protein pengikat
DNA, pola keseluruhan selalu sama: Satu heliks, yang disebut heliks pengenalan, mengandung
rantai samping asam amino yang mengenali dan mengikat urutan DNA spesifik dengan
membentuk ikatan hidrogen dengan basa yang terletak di alur utama heliks ganda DNA,
sedangkan heliks kedua menstabilkan konfigurasi keseluruhan melalui interaksi hidrofobik
dengan heliks pengenalan. Penekan lac dan trp, protein CAP, dan banyak protein penekan fag
adalah contoh protein prokariotik yang memperlihatkan motif helix-turn-helix, dan faktor
transkripsi yang mengatur perkembangan embrionik (kelas faktor yang dikodekan oleh gen
homeotik, dijelaskan kemudian) adalah contoh eukariotik. Gambar 23-24a termasuk model
penekan fag, protein helix-turnhelix, terikat pada DNA. Seperti banyak protein pengikat pengikat
DNA, penekan fag terdiri dari dua polipeptida yang identik, masing-masing mengandung domain
pengikat DNA.

Motif Jari Seng. Awalnya diidentifikasi dalam faktor transkripsi untuk gen rRNA 5S
(TFIIIA), motif pengikatan DNA jari seng terdiri dari heliks dan lembar b dua ikatan, yang
ditahan oleh interaksi residu sistein atau histidin yang diposisikan tepat dengan ion seng. .
Jumlah jari seng hadir per molekul protein bervariasi di antara faktor-faktor transkripsi yang
memilikinya, mulai dari dua jari hingga beberapa lusin atau lebih. Gambar 23-24b menunjukkan
protein dengan empat jari seng berturut-turut (TFIIIA memiliki sembilan). Jari seng menonjol
dari permukaan protein dan berfungsi sebagai titik kontak dengan urutan basa spesifik dalam alur
utama DNA.

GAMBAR 23-24 Motif Struktural Umum dalam Faktor Transkripsi Pengikat DNA.
Beberapa motif umumnya ditemukan dalam domain pengikat DNA dari faktor transkripsi
regulatori. Bagian-bagian dari domain ini yang secara langsung berinteraksi dengan sekuens
DNA spesifik biasanya heliks, yang disebut heliks pengenalan, yang cocok dengan alur utama
DNA. Dalam gambar ini, semua heliks ditampilkan sebagai silinder. (a) Motif helix-turn-helix, di
mana dua heliks bergabung dengan belokan pendek dan fleksibel. Model grafik komputer
menunjukkan penekan fag, contoh dari protein helix-turn-helix, terikat pada DNA. Ini adalah
dimer dari dua sub unit yang identik. Heliks dari dua domain pengikat DNA berwarna biru muda.
(B) Motif jari seng. Setiap jari seng terdiri dari heliks dan dua segmen, lembaran b antiparalel
(ditampilkan sebagai pita), semuanya disatukan oleh interaksi empat residu sistein, atau dua
residu sistein dan dua histidin, dengan ion seng. Di bagian atas diagram, residu utama ini
ditampilkan sebagai bola ungu kecil; ion seng ditampilkan sebagai bola merah yang lebih besar.
Protein jari seng biasanya memiliki beberapa jari seng berturut-turut; di sini kita melihat empat.
(c) Motif ritsleting leusin, di mana sebuah heliks dengan residu leusin yang diatur secara teratur
dalam satu polipeptida (hijau) berinteraksi dengan daerah yang serupa dalam polipeptida kedua
(ungu). Dua heliks melilit satu sama lain. (d) Motif helix-loop-helix, di mana heliks pendek
terhubung ke heliks yang lebih panjang oleh loop polipeptida berinteraksi dengan daerah serupa
di polipeptida lain untuk membuat dimer.

Motif Ritsleting Leucine. Motif ritsleting leusin dibentuk oleh interaksi antara dua rantai
polipeptida, masing-masing berisi heliks dengan residu leusin yang berjarak secara teratur.
Karena leusin adalah asam amino hidrofobik yang menarik satu sama lain, rentangan leusin yang
terpapar pada permukaan luar salah satu heliks dapat saling bertautan dengan rentangan leusin
yang sebanding di heliks yang lain, menyebabkan kedua heliks membungkus satu sama lain
menjadi koil bahwa “ritsleting” keduanya heliks bersama (Gambar 23-24c). Dalam beberapa
faktor transkripsi, ritsleting leusin digunakan untuk "zip" dua polipeptida identik bersama. Dalam
faktor transkripsi lain, dua jenis polipeptida bergabung bersama. Dalam kedua kasus, pengikatan
DNA dimungkinkan oleh dua daerah heliks tambahan yang terletak berdekatan dengan ritsleting
leusin. Dua segmen heliks ini, satu berasal dari masing-masing dari dua polipeptida, masuk ke
dalam alur utama DNA dan mengikat ke urutan basa tertentu.

ALAT PENEMUAN
Sistem Dua-Hibrida Ragi

Aktivator transkripsi memiliki dua domain esensial yang terpisah secara fisik yang mengarah
pada kemampuan mereka untuk mengatur transkripsi: domain yang mengikat DNA dan domain
aktivasi (lihat halaman 738). Kemampuan untuk memisahkan kedua bagian ini dari aktivator
transkripsional ragi yang dikenal sebagai Gal4 dieksploitasi oleh Stanley Fields dan rekannya
untuk mempelajari interaksi protein-protein dalam teknik yang disebut sistem dua-hibrida ragi
(Gambar 23B-1), atau uji perangkap interaksi. Gal4 mengaktifkan transkripsi gen (Gal1) yang
mengkodekan enzim metabolisme galaktosa. Untuk melakukannya, ia berikatan dengan urutan,
urutan pengaktifan hulu (atau UAS), dari Gal1. Kunci dari teknik twohybrid adalah
memungkinkan untuk menggunakan rekayasa genetika untuk memisahkan DNA yang
mengkodekan domain pengikatan DNA Gal4 dari domain aktivasi dan menempatkan setiap
bagian DNA pada plasmid yang berbeda. Pengkodean DNA dari domain pengikat DNA
ditempatkan di sebelah pengodean DNA dari suatu protein yang menarik. Konstruk semacam itu
disebut konstruk “umpan”, karena digunakan untuk “menangkap” interaksi dengan protein lain.
Plasmid yang terpisah berisi urutan yang mengkode domain aktivasi Gal4, ditambah DNA yang
mengkode protein yang ingin kami uji interaksi dengan protein umpan. Konstruk ini disebut
konstruk “mangsa” karena “ditangkap” oleh alat tes.

Kedua plasmid dimasukkan ke dalam ragi yang membawa gen reporter, seringkali gen lacZ.
Ketika gen ini ditranskripsi dan mRNA diterjemahkan dalam ragi, keberadaannya dapat dideteksi
melalui reaksi warna. Ragi yang membawa kedua plasmid diidentifikasi berdasarkan penanda
yang dapat dipilih yang dibawa oleh kedua plasmid. Jika protein umpan yang dihasilkan dalam
ragi mengikat protein mangsa, maka domain pengikatan dan aktivasi DNA dari Gal4 yang
melekat pada setiap fragmen protein disatukan cukup dekat untuk menyusun kembali aktivitas
pengaktifan transkripsi Gal4. Ketika ini terjadi, gen reporter diekspresikan, menunjukkan bahwa
umpan dan protein mangsa saling mengikat

Uji dua hibrida ragi adalah cara yang ampuh untuk menilai dengan cepat apakah protein
berinteraksi. Jika perpustakaan plasmid mangsa digunakan untuk mengubah ragi, metode ini
dapat digunakan untuk menyaring protein tidak dikenal yang mengikat umpan yang dikenal.
Selain itu, layar twohybrid lebar genom telah dilakukan dalam ragi, lalat, cacing, dan manusia.
Informasi dari layar besar ini dapat menunjukkan bahwa dua protein berinteraksi, yang dapat
ditindaklanjuti dengan menggunakan teknik biokimia yang lebih tradisional.
1. DNA yang mengkode protein "umpan" menyatu dengan domain pengikatan DNA Gal4 dan
protein "mangsa" yang menyatu dengan domain aktivasi Gal4 dimasukkan ke dalam ragi yang
membawa gen reporter yang mengandung urutan pengaktifan hulu Gal4 (UAS)

2. Jika protein A dan B berinteraksi, domain pengikatan dan aktivasi Gal4 disatukan,
mengaktifkan transkripsi gen reporter seperti.

3. Ragi di mana umpan berinteraksi dengan mangsa dapat dideteksi menggunakan reaksi warna

GAMBAR 23B-1 Sistem Ragi Dua-Hibrida. Sistem dua-hibrida ragi mendeteksi interaksi
protein-protein dengan menggunakan dua konstruksi DNA yang berbeda: (1) vektor "umpan"
yang memadukan DNA yang mengkodekan domain pengikatan DNA Gal4 ke DNA yang
mengkode protein yang diminati (Protein A), dan ( 2) vektor "mangsa" yang memadukan DNA
yang mengkode domain aktivasi Gal4 ke DNA yang mengkode protein kedua (Protein B). Jika
protein berinteraksi, gen reporter (dalam hal ini, lacZ) akan diekspresikan.

Helix- Loop -Helix Motif. Motif helix-loop-helix terdiri dari heliks pendek yang dihubungkan
oleh loop ke yang lain, lebih panjang heliks (Gambar 23-24d). Seperti ritsleting leusin, motif
helix-loop-helix mengandung daerah hidrofobik yang biasanya menghubungkan dua polipeptida,
yang mungkin mirip atau berbeda. Pembentukan bundel empat heliks menghasilkan penjajaran
heliks pengakuan yang berasal dari satu polipeptida dengan heliks pengakuan yang berasal dari
polipeptida lain, menciptakan domain pengikatan DNA dua bagian.
Elemen Respons DNA Mengkoordinasikan Ekspresi Gen yang Tidak Berdekatan

Sejauh ini kami telah memusatkan perhatian kami pada bagaimana faktor transkripsi mengikat
DNA dan mengatur transkripsi gen individu. Tetapi sel-sel eukariotik, seperti bakteri, seringkali
perlu mengaktifkan sekelompok gen terkait pada saat yang bersamaan. Pada eukariota uniseluler,
seperti pada bakteri, regulasi gen koordinat semacam itu mungkin diperlukan untuk merespons
beberapa sinyal dari lingkungan eksternal. Dalam eukariota multiseluler, regulasi gen koordinat
sangat penting untuk pengembangan dan fungsi jaringan khusus. Misalnya, selama
perkembangan embrionik, satu sel telur hewan yang dibuahi dapat menimbulkan triliunan sel
baru dari ratusan jenis yang berbeda, masing-masing menyalin kelompok gen yang berbeda —
sel saraf yang mengekspresikan gen yang diperlukan untuk fungsi saraf, sel otot yang
mengekspresikan gen yang diperlukan untuk fungsi otot , Dan seterusnya. Bagaimana eukariota
mengoordinasikan ekspresi kelompok gen terkait dalam kondisi seperti itu?

Berbeda dengan situasi dalam prokariota, di mana gen dengan fungsi terkait sering terletak
bersebelahan dalam operon, gen eukariotik yang harus dihidupkan (atau dimatikan) pada saat
yang sama biasanya tersebar di seluruh genom. Untuk mengoordinasikan ekspresi gen yang
terpisah secara fisik tersebut, eukariota menggunakan sekuens kontrol DNA yang disebut elemen
respons untuk menghidupkan atau mematikan transkripsi sebagai respons terhadap sinyal
lingkungan atau perkembangan tertentu. Elemen respons dapat berfungsi baik sebagai elemen
kontrol proksimal atau sebagai komponen peningkat. Dalam kedua kasus tersebut, menempatkan
jenis elemen respons yang sama di sebelah gen yang berada di lokasi kromosom yang berbeda
memungkinkan gen-gen ini dikendalikan bersama-sama walaupun mereka tidak terletak
bersebelahan satu sama lain.

Karena mereka memungkinkan kelompok gen dikendalikan secara terkoordinasi, elemen respons
memainkan peran penting dalam mengatur ekspresi gen selama perkembangan embrionik dan
selama respons jaringan terhadap perubahan kondisi lingkungan dan fisiologis. Pada beberapa
bagian berikutnya, kami akan menjelaskan beberapa contoh regulasi gen terkoordinasi tersebut.

Reseptor Hormon Steroid Bertindak sebagai Faktor Transkripsi yang Mengikat Elemen
Respon Hormon

Fenomena pengaturan gen terkoordinasi dengan baik diilustrasikan oleh perilaku protein reseptor
steroid, yang kami perkenalkan pada Bab 14. Reseptor steroid, serta reseptor retinoid terkait,
termasuk dalam golongan faktor transkripsi jari jari seng dan biasanya terdiri dari tiga domain. :
Satu domain mengenali dan mengikat elemen respons spesifik dalam DNA, domain msecond
mengikat hormon steroid tertentu, dan domain ketiga mengaktifkan transkripsi. Efek spesifik gen
hormon steroid berasal dari kemampuan reseptor steroid untuk bertindak sebagai faktor
transkripsi yang mengikat urutan DNA yang disebut elemen respons hormon. Semua gen yang
diaktifkan oleh hormon steroid tertentu dikaitkan dengan jenis elemen respons yang sama,
memungkinkan mereka untuk diatur bersama. Sebagai contoh, gen yang diaktifkan oleh estrogen
memiliki elemen respons estrogen 15-bp di dekat ujung hulu promotornya, sedangkan gen yang
diaktifkan oleh glukokortikoid terletak berdekatan dengan elemen respons glukokortikoid yang
menunjukkan urutan basa yang sedikit berbeda (Gambar 23-25a).

GAMBAR 23-25 Interaksi Reseptor Hormon Steroid dengan DNA. (a) Berbagai jenis
elemen respons hormon. Perhatikan bahwa ketiga contoh berisi pengulangan terbalik (dua
salinan dari urutan yang sama berorientasi pada arah yang berlawanan). Sebagai contoh,
membaca urutan elemen respons glukokortikoid dalam arah 5 '3' dari kedua ujung menghasilkan
urutan DNA yang sama: 5'-AGAACA-3 '. Nukleotida yang disorot adalah satu-satunya basa dari
urutan berulang terbalik yang bervariasi antara ketiga jenis elemen. Unsur hormon tiroid
mengandung urutan pengulangan terbalik yang sama dengan elemen estrogen, tetapi tiga basa
yang memisahkan dua salinan urutan dalam elemen estrogen tidak ada. ("N" menandakan bahwa
setiap nukleotida dapat ditemukan pada posisi itu. Garis putus-putus disertakan untuk membantu
Anda menyejajarkan daerah yang sebanding dari unsur-unsur estrogen dan hormon tiroid.) (B)
Aktivasi transkripsi oleh reseptor glukokortikoid. Hormon steroid cortisol (S) berdifusi melalui
membran plasma dan berikatan dengan reseptor glukokortikoid (GR), menyebabkan pelepasan
protein Hsp dan mengaktifkan situs pengikatan molekul DNA GR. Molekul GR kemudian
memasuki nukleus dan berikatan dengan elemen respons glukokortikoid dalam DNA, yang pada
gilirannya menyebabkan molekul GR kedua berikatan dengan elemen respons yang sama. Dimer
GR yang dihasilkan mengaktifkan transkripsi gen yang berdekatan.
Bagaimana elemen respons hormon ini digunakan oleh reseptor steroid untuk mengontrol
aktivitas gen? Untuk menggambarkan bagaimana pengaturan ini bekerja dengan hormon steroid
tertentu, mari kita pertimbangkan kortisol (hidrokortison) sebagai contoh. Kortisol adalah
anggota dari kelompok hormon steroid terkait, yang disebut glukokortikoid karena mereka
merangsang produksi glukosa dan dibuat di korteks adrenal. Menanggapi stres fisik, kortisol
dilepaskan dari kelenjar adrenal ke dalam aliran darah. Di antara banyak efeknya, kortisol yang
bersirkulasi masuk ke sel target di hati dan mengaktifkan transkripsi gen yang mengkode enzim
yang terlibat dalam mensintesis glukosa dari asam amino dan lipid.

Gambar 23-25b merangkum bagaimana kortisol mengatur ekspresi gen tersebut dengan mengikat
reseptor glukokortikoid yang ada dalam sel target kortisol. Biasanya reseptor glukokortikoid
(GR) terletak terutama di sitosol, di mana ia terikat pada anggota keluarga Hsp dari protein
pendamping. Selama masih terkait dengan protein Hsp, GR dicegah memasuki nukleus dan
mengikat DNA. Tetapi pengikatan kortisol ke GR memicu pelepasan protein Hsp. Molekul GR
(dengan kortisolnya yang terikat) kemudian bebas bergerak ke dalam nukleus, tempat ia
berikatan dengan elemen respons glukokortikoid di mana pun mereka berada dalam DNA.
Pengikatan molekul GR ke elemen respons pada gilirannya memfasilitasi pengikatan molekul
GR kedua dengan elemen respons yang sama. Dimer GR yang dihasilkan mengaktifkan
transkripsi gen yang berdekatan dengan merekrut koaktivator yang mempromosikan perakitan
mesin transkripsi.

Pengikatan dua molekul GR ini pada situs DNA yang sama terjadi karena urutan DNA dari
elemen respons glukokortikoid mengandung pengulangan terbalik - yaitu, dua salinan dari urutan
DNA yang sama berorientasi pada arah yang berlawanan. Oleh karena itu dua molekul GR dalam
dimer GR masing-masing berikatan dengan salah satu dari dua pengulangan urutan DNA.
Pengikatan dimer protein ke urutan berulang terbalik dalam elemen kontrol DNA adalah tema
umum di antara faktor-faktor transkripsi peraturan.

Karena elemen respons glukokortikoid terletak di dekat semua gen yang perlu dihidupkan oleh
kortisol, keberadaan kortisol mengaktifkan semua gen ini secara bersamaan, terlepas dari lokasi
kromosomnya. Meskipun ada perbedaan kecil antara berbagai hormon steroid, model ini
menyediakan kerangka kerja untuk memahami bagaimana hormon steroid, yang diangkut
melalui aliran darah ke hampir semua sel tubuh, dapat menghidupkan satu set gen tertentu dalam
jaringan target yang tepat.

Meskipun reseptor hormon steroid biasanya merangsang transkripsi gen, dalam beberapa kasus
mereka menghambatnya. Sebagai contoh, reseptor glukokortikoid berikatan dengan dua jenis
elemen respons DNA — satu jenis yang terkait dengan gen yang transkripsinya diaktifkan, yang
lain dengan gen yang transkripsinya dihambat. Setelah mengikat ke jenis elemen respon
penghambat, reseptor glukokortikoid tidak membentuk dimer seperti halnya ketika terikat
dengan mengaktifkan elemen respon. Sebagai gantinya, reseptor glukokortikoid nondimerisasi
menekan inisiasi transkripsi gen dengan merekrut histone deacetylase, yang mempromosikan
kondensasi kromatin. Adanya elemen respons aktifasi dan penghambatan yang terpisah untuk
reseptor hormon yang sama memungkinkan hormon tunggal untuk merangsang transkripsi gen
yang mengkode satu kelompok protein sementara secara bersamaan menekan transkripsi gen
yang mengkode protein lain.

CREB dan STAT adalah Contoh Faktor Transkripsi yang Diaktifkan oleh Fosforilasi

Reseptor hormon steroid yang telah kita diskusikan adalah protein allosterik yang mengatur
ekspresi gen dengan mengubah afinitas pengikatan DNA mereka sebagai respons terhadap
hormon steroid dengan cara yang hampir sama dengan represi bakteri yang mengubah sifat
pengikatan DNA setelah mengikat molekul kecil yang sesuai. Pendekatan alternatif untuk
mengendalikan aktivitas faktor transkripsi didasarkan pada fosforilasi protein (penambahan
gugus fosfat). Salah satu contoh umum dari jenis kontrol ini melibatkan cAMP (cyclic AMP),
messenger kedua yang banyak digunakan yang perannya dalam memediasi efek berbagai
molekul pensinyalan ekstraseluler dibahas pada Bab 14. Seperti yang kita lihat sebelumnya
dalam bab ini, cAMP juga memainkan peran dalam mengendalikan operon katabolit-tertekan
pada bakteri. Dalam eukariota, fungsi cAMP dengan merangsang aktivitas protein kinase A
(Gambar 14-8), yang pada gilirannya mengkatalisasi fosforilasi berbagai protein, termasuk faktor
transkripsi yang disebut CREB (Gambar 23-26). Protein CREB biasanya berikatan dengan
sekuens DNA yang disebut elemen respons cAMP (CRE), yang terletak berdekatan dengan gen
yang transkripsinya diinduksi oleh cAMP. Setelah difosforilasi, protein CREB merekrut
koaktivator transkripsi yang disebut CBP (protein pengikat CREB). CBP kemudian
mengkatalisis asetilasi histone, yang mengendurkan pengemasan nukleosom dan berinteraksi
dengan RNA polimerase untuk memfasilitasi perakitan mesin transkripsi di promotor gen
terdekat.

Fosforilasi protein juga terlibat dalam mengaktifkan keluarga faktor transkripsi yang disebut
STATs (untuk transduser sinyal dan aktivator transkripsi). Di antara molekul pensinyalan yang
mengaktifkan STAT adalah interferon, sekelompok glikoprotein yang diproduksi dan
disekresikan oleh sel-sel hewan sebagai respons terhadap infeksi virus. Interferon yang
disekresikan berikatan dengan reseptor pada permukaan sel tetangga, menyebabkan mereka
menghasilkan protein yang membuat sel target lebih tahan terhadap infeksi virus. Pengikatan
interferon ke reseptor permukaan selnya menyebabkan domain sitosol reseptor untuk bergabung
dengan dan mengaktifkan protein kinase intraseluler yang disebut Janus kinase (Jak). Protein Jak
teraktivasi pada gilirannya mengkatalisasi fosforilasi molekul STAT, yang biasanya hadir dalam
bentuk tidak aktif dalam sitoplasma. Fosforilasi menyebabkan molekul STAT untuk dimerisasi
dan bergerak dari sitoplasma ke nukleus, di mana mereka mengikat elemen respon DNA yang
sesuai dan mengaktifkan transkripsi

GAMBAR 23-26 Aktivasi Transkripsi Gen oleh Cyclic AMP. Gen yang diaktifkan oleh AMP
siklik memiliki elemen respons AMP siklik hulu (CRE) yang mengikat faktor transkripsi yang
disebut CREB. Di hadapan AMP siklik, protein sitoplasmik kinase A diaktifkan, dan subunit
katalitik teraktifasinya kemudian bergerak ke dalam nukleus, di mana ia mengkatalisis fosforilasi
CREB. CREB terfosforilasi berikatan dengan CBP, coactivator transkripsional yang
menunjukkan aktivitas histone acetyltransferase. Selain mengkatalisis asetilasi histone yang
mengendurkan pengemasan nukleosom, CBP mengaitkan dengan RNA polimerase dan
memfasilitasi perakitan mesin transkripsi pada promotor gen.

Jalur pensinyalan Jak-STAT menunjukkan kekhususan yang cukup besar. Sebagai contoh,
berbagai jenis interferon memicu fosforilasi dan aktivasi protein STAT yang berbeda. Setiap
STAT berasosiasi dengan elemen respons DNA tersendiri dan mengaktifkan transkripsi set gen
yang unik. Selain interferon, beberapa jenis molekul pensinyalan lain berikatan dengan reseptor
permukaan sel yang memicu fosforilasi STATs.

STATs dan protein CREB hanya dua dari banyak jenis faktor transkripsi yang diketahui
diaktifkan oleh fosforilasi. Anda belajar di Bab 14, misalnya, bahwa keluarga TGFb faktor
pertumbuhan mengikat reseptor membran plasma yang aktivasi menyebabkan fosforilasi protein
sitoplasma yang disebut Smads, yang kemudian melakukan perjalanan ke inti dan berfungsi
sebagai faktor transkripsi yang menghidupkan transkripsi dari gen spesifik. Dan kami
menjelaskan dalam Bab 19 bagaimana faktor-faktor pertumbuhan lain memicu aktivasi protein
kinase yang disebut MAP kinase, yang memfosforilasi dan mengaktifkan faktor-faktor
transkripsi yang terlibat dalam mengendalikan pertumbuhan dan pembelahan sel.

Elemen Respons Kejutan Panas mengkoordinasikan Ekspresi Gen yang Diaktifkan oleh
Suhu yang Ditinggikan
Gen heat-shock memberikan contoh lain tentang bagaimana eukariota mengkoordinasikan
regulasi gen yang terletak di lokasi kromosom yang berbeda. Gen heat-shock awalnya
didefinisikan sebagai gen yang diekspresikan sebagai respons terhadap peningkatan suhu. Tetapi
mereka sekarang dikenal merespons kondisi stres lainnya, dan karenanya mereka juga disebut
gen respons stres. Ada sejumlah gen kejut panas yang berbeda pada genom prokariotik dan
eukariotik, dan pemicu lingkungan yang tepat mengaktifkan semuanya secara bersamaan.
Sebagai contoh, secara singkat menghangatkan sel yang dikultur dengan menaikkan suhu
beberapa derajat mengaktifkan transkripsi beberapa gen heatshock. Meskipun fungsi gen ini
tidak sepenuhnya dipahami, protein yang diproduksi oleh setidaknya beberapa dari mereka
membantu meminimalkan kerusakan akibat denaturasi termal dari protein seluler yang penting.

Dalam sel-sel Drosophila, misalnya, produk paling menonjol dari gen kejut panas adalah Hsp70
(halaman 691), sebuah pendamping molekul yang terlibat dalam pelipatan protein normal yang
juga dapat memfasilitasi pengisian kembali protein yang rusak karena panas. Wilayah segera
hulu dari situs awal gen hsp70 berisi beberapa urutan yang biasa ditemui dalam promotor
eukariotik, seperti kotak TATA, kotak CAAT, dan kotak GC. Selain itu, urutan 14-bp yang
disebut elemen respons goncangan panas terletak 62 basis di hulu dari situs awal transkripsi gen
Drosophila hsp70 dan di lokasi yang sebanding pada gen lain yang transkripsinya diaktifkan oleh
suhu tinggi. Investigasi selanjutnya telah mengungkapkan bahwa aktivasi gen sengatan panas
dimediasi oleh pengikatan protein yang disebut faktor transkripsi sengatan panas ke elemen
respons sengatan panas. Faktor transkripsi heat-shock hadir dalam bentuk tidak aktif dalam sel-
sel yang tidak dipanaskan, tetapi suhu yang tinggi menyebabkan perubahan dalam struktur
protein yang memungkinkannya untuk mengikat elemen respons goncangan panas dalam DNA.
Protein kemudian dimodifikasi lebih lanjut oleh fosforilasi, yang membuatnya mampu
mengaktifkan transkripsi gen.

Sistem kejut panas lagi menggambarkan prinsip dasar regulasi koordinat eukariotik: Gen yang
terletak di lokasi kromosom yang berbeda dapat diaktifkan oleh sinyal yang sama jika elemen
respons yang sama terletak di dekat masing-masing.

Kode Gen Homeotik untuk Faktor Transkripsi yang Mengatur Perkembangan Embrionik

Beberapa contoh mencolok mengenai regulasi gen koordinat dalam eukariota melibatkan kelas
gen yang tidak biasa yang dikenal sebagai gen homeotik. Ketika mutasi terjadi pada salah satu
gen ini, hal aneh terjadi selama perkembangan embrionik - satu bagian tubuh digantikan oleh
struktur yang biasanya terjadi di tempat lain. Penemuan gen homeotik dapat ditelusuri kembali
ke tahun 1940-an, ketika Edward B. Lewis menemukan sekelompok gen Drosophila, kompleks
gen bithorax, di mana mutasi tertentu menyebabkan kelainan perkembangan drastis seperti
pertumbuhan sepasang sayap tambahan (bandingkan Gambar 23-27a dan Gambar 23-27b).
Belakangan, Thomas C. Kaufman dan koleganya menemukan kelompok gen kedua yang, ketika
bermutasi, menyebabkan perubahan perkembangan yang berbeda tetapi sama anehnya -
misalnya, menyebabkan kaki tumbuh dari kepala lalat sebagai pengganti antena (Gambar 23-
27c) . Kelompok gen ini adalah kompleks gen antennapedia. Gen bithorax dan antennapedia
disebut gen homeotik karena homeo berarti “sama” dalam bahasa Yunani, dan mutasi pada gen-
gen ini mengubah satu segmen tubuh Drosophila agar menyerupai yang lain. Sebuah petunjuk
tentang cara kerja gen homeotik pertama kali muncul dari penemuan bahwa masing-masing gen
bithorax dan antennapedia mengandung urutan 180-bp yang mirip di dekat ujung 3 'yang
menyerupai urutan sebanding yang ditemukan pada gen homeotik lainnya. Diberi nama
homeobox, urutan DNA ini menyusun 60 asam amino yang disebut homeodomain (Gambar 23-
28)

GAMBAR 23-27 Mutan Homeotic dari Drosophila. Mutasi pada kompleks gen bithorax
mengubah segmen toraks ketiga menjadi segmen toraks kedua (segmen penghasil sayap), dan
dengan demikian seperangkat sayap tambahan terbentuk. Mutasi pada kompleks gen
antennapedia menyebabkan tungkai berkembang di mana antena seharusnya berada.

Meskipun fenomena seperti itu mungkin awalnya tampak tidak lebih dari keanehan alam,
pertumbuhan sepasang sayap atau kaki ekstra di tempat yang salah menunjukkan bahwa gen
homeotik memainkan peran penting dalam menentukan rencana tubuh pengembangan embrio
terbang. Gen homeotik mengerahkan pengaruhnya dengan mengkodekan sekumpulan faktor
transkripsi regulatori yang mengaktifkan (atau menghambat) transkripsi gen yang penting secara
perkembangan dengan mengikat sekuens DNA spesifik. Dengan mengikat semua salinan unsur
DNA yang sesuai dalam genom, setiap faktor transkripsi homeotik dapat memengaruhi ekspresi
lusinan atau bahkan ratusan gen dalam embrio yang sedang tumbuh. Hasil dari regulasi gen
terkoordinasi ini adalah pembentukan karakteristik tubuh yang mendasar seperti bentuk dan
lokasi embel-embel.

GAMBAR 23-28 Gen dan Protein Homeotik. Mutan homeotik seperti pada Gambar 23-27
memiliki mutasi pada gen homeotik. (a) Gen-gen homeotik semuanya mengandung segmen 180-
bp, yang disebut homeobox, yang menyandikan homeodomain dalam protein homeotik. (b)
Homeodomain (merah) adalah domain pengikat DNA helix-turn-helix yang, dalam kombinasi
dengan domain aktivasi transkripsi, memungkinkan protein berfungsi sebagai faktor transkripsi
regulasi. Perhatikan bahwa homeodomain memiliki tiga heliks (ditampilkan sebagai silinder).

Hasil luar biasa dari genomik modern dan biologi perkembangan molekuler adalah tingginya
tingkat konservasi gen homeotik pada hewan. Urutan yang mirip dengan gen homotik lalat telah
terdeteksi pada gen organisme yang beragam seperti cacing nematoda, serangga, mangsa laut,
katak, tikus, dan manusia — jarak evolusi lebih dari 500 juta tahun. Hebatnya, dengan beberapa
pengecualian kecil, organisasi fisik gen Hox ini telah dipertahankan di jarak yang sangat jauh ini.
Baik pada lalat maupun vertebrata, lokasi 3'5 'dari gen-gen ini dalam kromosom berhubungan
dengan anterior ke daerah posterior sepanjang sumbu tubuh yang diatur protein ini (Gambar 23-
29). Pada vertebrata, tampaknya ada duplikasi set tunggal asli gen-gen ini yang dimiliki oleh
lalat buah dan hewan sederhana lainnya: Sedangkan lalat buah memiliki satu set gen homeotik,
mamalia memiliki empat set gen Hox. Berdasarkan analisis pola ekspresi gen Hox tikus dan efek
membuat mutan “knockout” untuk individu dan beberapa gen Hox, jelas bahwa, seperti rekan-
rekan lalat mereka, mereka mengontrol identifikasi struktur di sepanjang sumbu anterior-
posterior dari vertebrata. Mutasi pada gen Hox manusia juga telah diidentifikasi. Sebagai contoh,
mutasi pada lokus HoxD13 menghasilkan synpolydactyly, ditandai dengan fusi dan duplikasi jari
dan kaki. Tema utama dari upaya modern untuk menyatukan evolusi dan perkembangan biologi
adalah untuk memahami bagaimana perubahan halus dalam gen Hox menyebabkan perubahan
dalam rencana tubuh hewan yang lebih tinggi.

Regulasi Gen Eukariotik: Kontrol Pasca Transkripsi

Kami sekarang telah memeriksa dua tingkat regulasi pertama untuk ekspresi gen
eukariotik, yaitu kontrol genom dan kontrol transkripsi. Setelah transkripsi terjadi, aliran
informasi genetik melibatkan serangkaian peristiwa paska transkripsional yang kompleks, yang
salah satu atau semuanya dapat menjadi titik pengaturan (lihat Gambar 23-10, langkah, dan).
Regulasi pasca transkripsional mungkin sangat berguna dalam menyediakan cara untuk
menyempurnakan pola ekspresi gen dengan cepat, memungkinkan sel untuk merespons
perubahan sementara di lingkungan intraseluler atau ekstraseluler tanpa mengubah pola
transkripsi keseluruhannya.

Kontrol Pengolahan RNA dan Transkripsi Ekspor Nuklir

Kontrol posttranskripsi dimulai dengan pemrosesan transkrip RNA primer, yang
menyediakan banyak peluang untuk pengaturan ekspresi gen. Seperti yang telah kita pelajari di
Bab 21, hampir semua transkrip RNA dalam inti eukariotik menjalani pemrosesan substansial,
termasuk penambahan tutup 5' dan ekor 3' poli (A), modifikasi kimia seperti metilasi,
penyambungan ekson yang disertai dengan pengangkatan intron, dan pengeditan RNA. Di antara
peristiwa pemrosesan ini, splicing RNA adalah situs kontrol yang sangat penting karena
peraturannya memungkinkan sel untuk membuat berbagai mRNA berbeda dari premRNA yang
sama, sehingga memungkinkan gen untuk menghasilkan lebih dari satu produk protein.
Fenomena ini, yang disebut splicing alternatif, didasarkan pada kemampuan sel untuk
mengizinkan beberapa situs sambungan dilewati dan yang lainnya diaktifkan (lihat Gambar 21-
23). Hampir setengah dari semua gen manusia menghasilkan pre-mRNA yang disambungkan
secara alternatif, memperkuat pandangan bahwa kontrol penyambungan merupakan komponen
penting dari regulasi gen. Pola splicing ditentukan oleh berbagai faktor, termasuk keberadaan
protein pengatur dan molekul RNA nukleolar kecil (snoRNAs) yang mengikat splicing enhancer
atau splicing sequencer peredam dalam pre-mRNA. Dengan meningkatkan cara-cara pre-mRNA
yang diberikan dapat disambungkan, molekul pengatur ini memungkinkan gen tunggal untuk
menghasilkan puluhan atau bahkan ratusan mRNA alternatif. Sebuah contoh yang luar biasa
terjadi di telinga bagian dalam burung, di mana 576 bentuk mRNA alternatif disambungkan
dihasilkan dari gen saluran kalium tunggal. Ekspresi berbagai himpunan bagian mRNA ini dalam
sel yang berbeda di telinga bagian dalam memfasilitasi persepsi frekuensi suara yang berbeda.
Gambar 23-30 mengilustrasikan contoh lain dari splicing alternatif yang terdokumentasi
dengan baik, dalam hal ini melibatkan pengkodean mRNA untuk jenis antibodi yang disebut
immunoglobulin M (IgM). Protein IgM ada dalam dua bentuk, versi rahasia dan versi yang
dimasukkan ke dalam membran plasma sel yang membuatnya. Seperti semua antibodi, IgM
terdiri dari empat subunit polipeptida — dua rantai berat dan dua rantai ringan. Ini adalah urutan
rantai berat yang menentukan apakah IgM disekresi atau terikat membran. Pengkodean gen
untuk rantai berat memiliki dua situs poli (A) alternatif tempat transkrip RNA dapat berakhir,
menghasilkan dua jenis molekul premRNA yang berbeda pada ujung 3'. Ekson dalam pra-mRNA
ini kemudian disambungkan bersama dalam dua cara yang berbeda, menghasilkan mRNA yang
mengkode versi rantai berat yang disekresikan atau versi yang terikat pada membran plasma.
Hanya pola splicing untuk versi terikat-membran termasuk ekson yang mengkode domain asam
amino hidrofobik yang menjangkar rantai berat ke membran plasma.

Gambar 23-30
Setelah penyambungan RNA, langkah pasca-transkripsional berikutnya yang akan dikendalikan
adalah ekspor mRNA melalui pori-pori nuklir ke sitoplasma. Kita tahu bahwa langkah ekspor ini
dapat dikendalikan karena RNA yang menunjukkan cacat dalam pembatasan atau penyambungan
tidak siap diekspor dari nukleus. Bahkan dengan mRNA normal, molekul-molekul tertentu
dipertahankan dalam nukleus sampai ekspornya dipicu oleh stimulus yang menandakan bahwa
mRNA tertentu diperlukan dalam sitoplasma untuk diterjemahkan. Kontrol ekspor juga telah
diamati dengan RNA virus yang diproduksi dalam sel yang terinfeksi. Misalnya, HIV — virus
yang bertanggung jawab atas AIDS — menghasilkan molekul RNA yang tetap di dalam nukleus
sampai protein virus yang disebut Rev disintesis. Urutan asam amino dari protein Rev mencakup
sinyal ekspor nuklir (halaman 540) yang memungkinkan Rev untuk memandu RNA virus keluar
melalui pori-pori nuklir dan ke dalam sitoplasma.

746

Laju Translasi Dapat Dikendalikan oleh Faktor Inisiasi dan Penekan Translasional
 Setelah molekul mRNA dikeluarkan dari nukleus ke sitoplasma, beberapa mekanisme
kontrol translasi tersedia untuk mengatur kecepatan setiap mRNA yang diterjemahkan ke dalam
produk polipeptida. Beberapa mekanisme kontrol translasi bekerja dengan mengubah ribosom
atau faktor sintesis protein; yang lain mengatur aktivitas dan / atau stabilitas mRNA itu sendiri.
Kontrol translasi terjadi pada prokariota dan eukariota, tetapi kami akan membatasi diskusi kami
pada beberapa contoh eukariotik.
Salah satu contoh kontrol translasi yang dipelajari dengan baik terjadi dalam
mengembangkan eritrosit, di mana rantai globin polipeptida adalah produk utama terjemahan.
Sintesis globin tergantung pada ketersediaan heme — gugus prostetik yang mengandung besi
yang menempel pada rantai globin untuk membentuk produk protein akhir, hemoglobin.
Mengembangkan eritrosit biasanya mensintesis globin dengan kecepatan tinggi. Namun, sintesis
globin akan sia-sia jika tidak tersedia cukup heme untuk melengkapi pembentukan molekul
hemoglobin, sehingga eritrosit telah mengembangkan mekanisme untuk menyesuaikan sintesis
polipeptida agar sesuai dengan ketersediaan heme.
Mekanisme ini melibatkan protein kinase, yang disebut heme-controlled inhibitor (HCI),
yang aktivitasnya diatur oleh heme. HCI tidak aktif di hadapan heme. Tetapi ketika heme tidak
ada, HCI memfosforilasi dan menghambat eIF2, salah satu dari beberapa protein yang diperlukan
untuk memulai terjemahan dalam eukariota (halaman 687). Berkurangnya aktivitas eIF2
menekan semua aktivitas translasi, tetapi karena rantai globin menyumbang lebih dari 90%
polipeptida yang dibuat dalam mengembangkan eritrosit, dampak utama HCI dalam sel-sel ini
adalah pada sintesis globin. Kinase lain yang memfosforilasi eIF2 telah terdeteksi dalam
beragam jenis sel, menunjukkan bahwa fosforilasi eIF2 adalah mekanisme yang banyak
digunakan untuk mengatur terjemahan.
Penggunaan fosforilasi protein untuk mengontrol terjemahan tidak terbatas pada efek
pada eIF2. Faktor inisiasi eukariotik eIF4F (halaman 687), kompleks multiprotein yang berikatan
dengan tutup 5¿ mRNA, juga diatur oleh fosforilasi, walaupun dalam kasus ini fosforilasi lebih
aktif daripada menghambat faktor inisiasi. Contoh dari jenis kontrol ini diamati pada sel yang
terinfeksi oleh adenovirus, yang menghambat sintesis protein dalam sel yang terinfeksi dengan
memblokir fosforilasi eIF4E, subunit capbinding dari eIF4F. Virus lain menghambat kompleks
eIF4F dengan memproduksi protease yang memecah eIF4F menjadi dua fragmen, satu berisi
situs yang berikatan dengan 5' tutup molekul mRNA dan yang lainnya berisi situs yang berikatan
dengan ribosom. Anehnya, fragmen ribosomebinding masih dapat memulai terjemahan mRNA
virus (tetapi tidak seluler) dengan mengikat urutan IRES (halaman 687) yang terletak tepat di
hulu dari kodon awal dari beberapa mRNA virus. Ini memungkinkan virus untuk membajak
mesin terjemahan untuk menerjemahkan mRNA-nya sendiri sekaligus mematikan terjemahan
mRNA seluler normal.
Jenis kontrol translasi yang telah kita bahas sejauh ini relatif tidak spesifik karena mereka
mempengaruhi tingkat terjemahan semua mRNA dalam sel. Contoh dari jenis kontrol translasi
yang lebih spesifik terlihat dengan ferritin, protein penyimpan zat besi yang sintesisnya secara
selektif distimulasi dengan adanya zat besi. Kunci stimulasi selektif ini terletak pada urutan
pemimpin 5' dari feritin mRNA yang tidak diterjemahkan, yang mengandung segmen 28-
nukleotida — elemen respons-besi (IRE) —yang membentuk loop rambut yang diperlukan untuk
stimulasi sintesis feritin oleh besi. Jika urutan IRE secara eksperimental dimasukkan ke dalam
gen yang ekspresinya biasanya tidak diatur oleh zat besi, terjemahan mRNA yang dihasilkan
menjadi peka terhadap zat besi.
Gambar 23-31 menunjukkan bagaimana urutan IRE bekerja. Ketika konsentrasi besi
rendah, protein pengatur yang disebut IRE-binding protein berikatan dengan urutan IRE dalam
ferritin mRNA, mencegah mRNA membentuk kompleks inisiasi dengan subunit ribosom. Tetapi
protein pengikat IRE adalah protein alosterik yang aktivitasnya dapat dikendalikan oleh
pengikatan zat besi. Ketika lebih banyak zat besi tersedia, protein mengikat atom besi dan
mengalami perubahan konformasi yang mencegahnya mengikat ke IRE, sehingga
memungkinkan mRNA ferritin diterjemahkan. Oleh karena itu, protein pengikat IRE adalah
contoh dari penekan translasi yang secara selektif mengendalikan terjemahan mRNA tertentu.
Jenis kontrol translasi ini memungkinkan sel untuk merespons perubahan spesifik dalam
lingkungan lebih cepat daripada yang dimungkinkan melalui penggunaan kontrol transkripsi.
 Protein lain bertindak sebagai penekan translasi tetapi mengikat 3' daerah mRNA spesifik
yang tidak diterjemahkan. Salah satu contoh dari jenis kontrol ini adalah protein PUF, yang
mengatur penerjemahan protein penting selama pengembangan. Selain protein represor translasi,
kita akan melihat di bawah ini bahwa kelas penting RNA kecil — microRNA — juga
berinteraksi dengan 3'-UTR untuk mengatur terjemahan.
Translasi Juga Dapat Dikendalikan oleh Regulasi degradasi mRNA
Laju translasi juga dapat dikendalikan oleh perubahan stabilitas mRNA — dengan kata
lain, jika molekul mRNA terdegradasi lebih cepat, maka lebih sedikit waktu yang tersedia untuk
menerjemahkannya. Laju degradasi dapat diukur dengan pulse-chase experiment, di mana sel
pertama kali diinkubasi untuk periode waktu yang singkat ("the pulse") di hadapan senyawa
radioaktif yang dimasukkan ke dalam mRNA. Sel-sel kemudian ditempatkan dalam media
nonradioaktif, dan inkubasi dilanjutkan ("chase"). Tidak ada radioaktivitas tambahan yang
diambil oleh sel selama periode pengejaran (chase), sehingga nasib radioaktivitas yang
sebelumnya dimasukkan ke dalam mRNA dapat diukur dari waktu ke waktu. Pendekatan ini
memungkinkan peneliti untuk mengukur waktu paruh mRNA, yang merupakan waktu yang
diperlukan untuk 50% dari RNA awal (radioaktif) yang akan terdegradasi.
748
Waktu paruh mRNA eukariotik sangat bervariasi, mulai dari 30 menit atau kurang untuk
beberapa mRNA faktor pertumbuhan hingga lebih dari 10 jam untuk pengkodean mRNA b-
globin. Panjang ekor poli (A) adalah salah satu faktor yang berperan dalam mengendalikan
stabilitas mRNA. Messenger RNA dengan ekor poli (A) pendek cenderung kurang stabil
dibandingkan mRNA dengan ekor poli (A) yang lebih panjang. Dalam beberapa kasus, stabilitas
mRNA juga dipengaruhi oleh fitur spesifik dari daerah 3 region yang tidak diterjemahkan.
Sebagai contoh, mRNA berumur pendek untuk beberapa faktor pertumbuhan memiliki unsur
kaya AU tertentu di wilayah ini. Urutan kaya AU memicu penghapusan ekor poli (A) oleh enzim
degradatif. Ketika elemen kaya AU ditransfer ke ujung 3¿ dari pesan globin yang biasanya stabil
menggunakan teknik DNA rekombinan, mRNA hibrida memperoleh waktu paruh pendek yang
khas dari faktor pertumbuhan mRNA.
Cara lain untuk mengatur stabilitas mRNA diilustrasikan oleh aksi besi, yang, selain
berpartisipasi dalam kontrol translasi seperti yang baru saja dijelaskan, juga berperan dalam
mengendalikan degradasi mRNA. Penyerapan zat besi ke dalam sel mamalia dimediasi oleh
protein reseptor membran plasma yang disebut reseptor transferin. Ketika zat besi langka,
sintesis reseptor transferrin dirangsang oleh mekanisme yang melindungi reseptor transferrin
mRNA dari degradasi, sehingga membuat lebih banyak molekul mRNA tersedia untuk
diterjemahkan. Seperti ditunjukkan pada Gambar 23-32, mekanisme kontrol ini melibatkan IRE
(mirip dengan yang ada di ferritin mRNA) yang terletak di daerah 3¿ dari reseptor transferR
mRNA. Ketika kadar besi intraseluler rendah dan peningkatan penyerapan besi diperlukan,
protein IREbinding mengikat IRE ini dan melindungi mRNA dari degradasi. Ketika kadar zat
besi dalam sel tinggi dan pengambilan tambahan tidak diperlukan, protein pengikat IRE
mengikat atom besi dan terlepas dari mRNA, yang memungkinkan mRNA terdegradasi.
Ada dua mekanisme umum untuk menurunkan mRNA yang telah ditargetkan untuk
dihancurkan. Perbedaan utama adalah apakah mRNA terdegradasi dalam arah 3¿ 5¿ atau 5¿ 3¿.
Dalam jalur 3¿ 5¿, pemendekan ekor poli (A) dan penghilangan protein pengikat poli (A) dari
ujung 3¿ mRNA diikuti oleh degradasi rantai RNA oleh eksosom sitoplasma, suatu kompleks
dari beberapa 3¿ 5¿ exonucleases. Ketika eksosom akhirnya tiba di ujung 5¿ dari mRNA, tutup
5¿ dihancurkan oleh enzim yang merendahkan tutup. Sebaliknya, jalur 5¿ 3¿ melibatkan
pemendekan ekor poli (A) di ujung 3¿ diikuti dengan pengangkatan segera tutup dari ujung 5¿.
MRNA kemudian didegradasi oleh 5¿ 3¿ exonucleases. Enzim yang terlibat dalam jalur 5¿ 3¿ ini
terkonsentrasi dalam struktur sitoplasma yang disebut badan pemrosesan mRNA, atau hanya
tubuh P. Selain perannya dalam degradasi mRNA, badan P dapat berfungsi sebagai tempat
penyimpanan sementara untuk mRNA yang tidak diterjemahkan dan untuk perekrutan protein
yang terlibat dalam interferensi RNA, yang sekarang kita bahas.
Gangguan RNA Menggunakan RNA Kecil untuk Membungkam Ekspresi Gen yang
Mengandung Urutan Basa Pelengkap
Protein regulator seperti IRE-binding dan protein PUF, yang berikatan dengan mRNA
tertentu, bukan satu-satunya molekul yang digunakan oleh sel untuk mengendalikan aktivitas
mRNA. MRNA individu juga dikendalikan oleh kelas molekul RNA kecil yang menghambat
ekspresi mRNA yang mengandung urutan yang terkait dengan urutan yang ditemukan dalam
RNA kecil. Penghambatan yang dimediasi RNA tersebut, yang dikenal sebagai gangguan RNA
(atau RNAi), didasarkan pada kemampuan RNA kecil untuk memicu degradasi mRNA, atau
menghambat translasi mRNA, atau menghambat transkripsi gen yang mengkode untuk mRNA
tertentu.
Jenis gangguan RNA pertama yang ditemukan terjadi sebagai respons terhadap
keberadaan RNA untai ganda. Misalnya, jika tanaman terinfeksi virus yang menghasilkan RNA
untai ganda sebagai bagian dari siklus hidupnya, sel yang terinfeksi membatasi infeksi dengan
mengurangi ekspresi gen virus. Apalagi efeknya tidak terbatas pada gen virus. Jika gen tanaman
normal dimasukkan ke dalam virus menggunakan teknik rekayasa genetika, sel-sel yang
terinfeksi virus mengurangi ekspresi salinan mereka sendiri dari gen yang sama. Peran kausal
yang dimainkan oleh RNA beruntai ganda dalam tipe pembungkaman gen ini ditunjukkan pada
tahun 1998 oleh Andrew Fire dan Craig Mello, yang melaporkan bahwa menyuntikkan RNA
berganda ganda ke dalam cacing sangat mengurangi tingkat transkrip RNA yang mengandung
urutan yang saling melengkapi dengan yang ada di RNA untai ganda. Karena studi mereka
meletakkan dasar untuk bidang biologi baru yang sedang berkembang terkait dengan peran yang
dimainkan oleh RNA kecil dalam kontrol ekspresi gen, Fire dan Mello dianugerahi Hadiah Nobel
pada tahun 2006.
Gambar 23-33 menggambarkan bagaimana RNA untai ganda merobohkan/membongkar
ekspresi gen tertentu. Pertama, ribonuklease sitoplasma yang dikenal sebagai Dicer memotong
RNA untai ganda menjadi fragmen pendek sekitar 21-22 pasang basa panjang. Fragmen beruntai
ganda yang dihasilkan, yang disebut siRNAs (small interfering, or silencing, RNAs),
kemudian bergabung dengan sekelompok protein untuk membentuk penghambat ekspresi gen
yang disebut RISC (RNA-induced silencing complex). Jenis RISC tertentu ini dikenal sebagai
siRISC karena komponen siRNA menentukan gen mana yang akan ditargetkan untuk
dibungkam.
Setelah dimasukkan ke dalam siRISC, salah satu dari dua untaian siRNA terdegradasi.
RNA untai tunggal yang tersisa kemudian mengikat siRISC melalui pasangan basa
komplementer ke molekul mRNA target. Jika berpasangan antara siRNA dan mRNA adalah
pasangan yang sempurna (atau sangat dekat), degradasi mRNA dimulai oleh Slicer, komponen
ribonuclease dari siRISC yang memotong mRNA di tengah-tengah situs pelengkap. Jika
kecocokan antara siRNA dan mRNA tidak sempurna, terjemahan mRNA dapat dihambat tanpa
mRNA terdegradasi. Dan dalam beberapa kasus, siRISC dapat memasuki nukleus dan dipandu
oleh siRNA-nya ke urutan DNA nuklear yang saling melengkapi. Setelah dikaitkan dengan
sekuens gen ini, siRISC membungkam ekspresi mereka dengan menstimulasi metilasi DNA dan /
atau merekrut enzim yang menambahkan gugus metil ke histones, sehingga memicu
pembentukan bentuk kromatin (heterokromatin) yang tidak aktif secara transkripsi.
Gangguan RNA awalnya mungkin telah berevolusi untuk melindungi sel dari virus yang
menggunakan RNA untai ganda. Namun, itu juga ternyata menjadi alat laboratorium yang kuat
yang memungkinkan para ilmuwan untuk secara selektif merobohkan ekspresi gen apa pun yang
ingin mereka pelajari. Karena sekuens genom lengkap sekarang tersedia untuk berbagai
organisme, fungsi masing-masing gen dapat dieksplorasi secara sistematis dengan menggunakan
interferensi RNA untuk mematikannya. Para peneliti hanya mensintesis (atau membeli) siRNA
pendek yang saling melengkapi dengan urutan yang ada dalam gen yang ingin dibungkam.
Memperkenalkan siRNAs sintetik ini ke dalam sel memungkinkan masing-masing gen dimatikan
satu per satu. Untuk menggambarkan kekuatan luar biasa dari pendekatan ini, RNAi telah
digunakan untuk mempelajari peran 98% dari sekitar 20.000 gen pengkode protein dalam cacing
C. elegans dengan mematikannya satu per satu.
Aplikasi siRNA potensial lainnya adalah menggunakannya untuk membungkam gen yang
terlibat dalam berbagai penyakit. Misalnya, penelitian pada tikus menunjukkan bahwa
menyuntikkan hewan dengan siRNA diarahkan terhadap gen yang terlibat dalam metabolisme
kolesterol dapat mengurangi kadar kolesterol dalam darah. Meskipun pertanyaan mengenai
keamanan, efek samping, dan efektivitas masih harus dijawab, penggunaan terapi siRNAs
sebagai obat untuk mengobati atau mencegah penyakit manusia dianggap memiliki masa depan
yang cerah.

GAMBAR 23-33 Gangguan RNA oleh Double-Stranded RNA. Ketika sel bertemu RNA untai ganda,
Dicer memotongnya menjadi siRNA, panjangnya sekitar 21-22 pasang basa, yang kemudian
dikombinasikan dengan protein RISC untuk membentuk siRISC. Setelah degradasi salah satu dari dua
untaian siRNA, untai yang tersisa mengikat siRISC melalui pasangan basa komplementer dengan molekul
target mRNA dalam sitoplasma (4a) atau ke urutan DNA target dalam nukleus (4b), sehingga
membungkam ekspresi gen di kedua tingkat translasi atau transkripsi. Situasi yang paling umum
(ditunjukkan oleh panah padat) adalah kecocokan komplementer yang tepat antara siRNA dan mRNA
yang sesuai, yang memicu pembelahan mRNA oleh Slicer, komponen enzim siRISC.
MicroRNA Diproduksi oleh Gen Seluler Normal Membungkam Terjemahan RNA
Messenger Penting Secara MikroMikroRNA Diproduksi oleh Gen Seluler Membungkam
Terjemahan RNA Messenger Penting untuk Pembangunan
Temuan bahwa ekspresi gen dapat dibungkam dengan memasukkan RNA untai ganda ke
dalam sel menimbulkan pertanyaan apakah gen normal menghasilkan RNA yang berfungsi
dengan cara yang sebanding. Pencarian molekul semacam itu telah mengarah pada penemuan
microRNAs (miRNAs), sebuah kelas RNA untai tunggal dengan panjang sekitar 21-22
nukleotida yang diproduksi oleh gen yang ditemukan di hampir semua eukariota. MikroRNA ini
mengikat dan mengatur ekspresi RNA kurir yang dihasilkan oleh gen yang terpisah dari gen yang
menghasilkan mikroRNA.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 23-34, gen yang menghasilkan microRNA pada
awalnya ditranskripsi menjadi molekul RNA yang lebih panjang yang disebut microRNAs
primer (pri-miRNAs), yang terlipat menjadi loop hairpin. Pri-miRNA lingkaran ini dikonversi
menjadi miRNA matang dengan pemrosesan sekuensial. Pertama, enzim nuklir yang disebut
Drosha memecah primiRNA menjadi RNA jepit rambut yang lebih kecil, yang disebut
microRNA prekursor (pre-miRNAs), sekitar 70 nukleotida. Selanjutnya pre-miRNA diekspor ke
sitoplasma, di mana Dicer memotong loop hairpin untuk menghasilkan dua molekul RNA
pendek komplementer yang panjangnya 21-22 nukleotida.
Salah satu dari dua RNA pendek adalah microRNA matang, yang bergabung dengan
sekelompok protein untuk membentuk miRISC. Setiap miRISC menghambat ekspresi RNA
messenger yang mengandung urutan dasar yang saling melengkapi dengan microRNA yang
berada di dalam miRISC. Interaksi antara miRISC dan RNA messenger yang ditargetkan
berlangsung terutama di badan P sitoplasma (halaman 748). Kadang-kadang microRNA dalam
miRISC tertentu persis saling melengkapi dengan urutan yang ada dalam RNA messenger yang
ditargetkan. Dalam kasus seperti itu, pesan yang ditargetkan dihancurkan oleh mekanisme yang
mirip dengan yang diamati dengan siRNA. Akan tetapi, lebih umum bagi microRNA untuk
menunjukkan komplementaritas parsial ke situs dalam RNA messenger. Alih-alih memicu
degradasi RNA messenger, pengikatan miRISCs ke sebagian situs pelengkap menghambat
terjemahan pesan yang ditargetkan. Efek penghambatan ini biasanya membutuhkan pengikatan
beberapa miRISCs ke situs yang berbeda, sebagian komplementer dalam RNA messenger yang
diberikan. Namun, hambatan seperti itu tidak selalu permanen. Mengubah kondisi seluler dapat
memicu pelepasan RNA kurir dari menghambat miRISC, disertai dengan pergerakan RNA kurir
dari badan P ke penerjemahan ribosom secara aktif.
MicroRNA yang diproduksi oleh masing-masing gen ini mampu mengikat ke situs target
di sekitar 200 RNA messenger yang berbeda, dan banyak RNA messenger ditargetkan oleh
beberapa microRNA yang bekerja dalam kombinasi. MicroRNAs tampaknya memainkan peran
penting selama perkembangan embrionik, terutama dalam pembentukan tipe sel khusus seperti
neuron, sel imun, dan sel kerangka dan otot jantung. Salah satu cara mengungkap peran
perkembangan yang dimainkan oleh microRNA adalah dengan menggunakan teknik knockout
gen (halaman 638) untuk menghilangkan gen microRNA spesifik dari embrio tikus. Dalam satu
percobaan seperti itu, menghapus gen microRNA yang disebut miR-1-2 menyebabkan kerusakan
jantung parah yang menyebabkan lebih dari setengah tikus mati selama perkembangan embrio
atau dalam beberapa bulan pertama kehidupan. Di timur selusin mRNA yang ditargetkan untuk
regulasi oleh mikroRNA 1-2 telah diidentifikasi secara sementara. Termasuk dalam kelompok ini
adalah pengkodean mRNA untuk faktor transkripsi yang mengatur perkembangan sel otot dan
pengkodean mRNA untuk subunit saluran kalium yang membantu menjaga potensi membran
istirahat.

GAMBAR 23-34 Pembungkaman translasi oleh microRNAs. MicroRNA diproduksi oleh proses
multistep di mana gen microRNA pertama kali ditranskripsi menjadi transkrip primer (pri-miRNA) yang
dilipat menjadi loop jepit rambut. Enzim nuklir Drosha memecah pri-miRNA menjadi RNA jepit rambut
(kira-kira 70 nukleotida) yang lebih kecil, yang diekspor dari nukleus dan dibelah oleh Dicer untuk
 melepaskan molekul microRNA (miRNA) yang panjangnya 21-22 nukleotida. MiRNA kemudian
bergabung dengan protein RISC untuk membentuk miRISC, yang diarahkan oleh miRNA-nya ke
messenger RNA yang mengandung urutan yang saling melengkapi dengan yang ada di miRNA. Paling
umum, beberapa miRISC terikat pada RNA messenger yang sama melalui sekuens sebagian yang saling
melengkapi dan bersama-sama menghambat terjemahan. Kadang-kadang miRNA persis komplementer ke
situs dalam RNA kurir tertentu, menghasilkan degradasi RNA kurir oleh mekanisme yang mirip dengan
yang diamati dengan siRNAs.

Kontrol Posttranslational Melibatkan Modifikasi Struktur Protein, Fungsi, dan Degradasi

Setelah terjemahan molekul mRNA menghasilkan rantai polipeptida, masih ada banyak
cara untuk mengatur aktivitas produk polipeptida. Ini membawa kita ke level akhir dari
pengontrolan ekspresi gen, yaitu, berbagai mekanisme kontrol posttranslasional yang tersedia
untuk memodifikasi struktur dan fungsi protein (lihat Gambar 23-10, langkah). Termasuk dalam
kategori ini adalah perubahan struktural reversibel yang mempengaruhi fungsi protein, seperti
protein fosforilasi dan defosforilasi, serta perubahan permanen seperti pembelahan proteolitik.
Peristiwa pasca-translasional lainnya yang tunduk pada regulasi termasuk membimbing pelipatan
protein oleh protein pendamping, penargetan protein ke lokasi intraseluler atau ekstraseluler, dan
interaksi protein dengan molekul atau ion pengatur, seperti cAMP atau Ca2 +. Jenis-jenis
peristiwa paska translasional dibahas di tempat lain dalam konteks lain, tetapi kami kembali
menyebutkannya di sini untuk menekankan bahwa aliran informasi dalam sel tidak lengkap
sampai tersedia produk gen yang berfungsi dengan baik.
Sejauh ini kami telah fokus pada mekanisme kontrol yang memengaruhi ekspresi gen
dengan memengaruhi laju produksi protein dari masing-masing gen. Tetapi jumlah setiap protein
yang ada dalam sel dipengaruhi oleh laju degradasi serta laju produksinya. Dengan demikian,
mengatur laju degradasi protein adalah cara penting lainnya untuk mempengaruhi ekspresi gen.
Kontribusi relatif yang dibuat oleh laju sintesis dan degradasi protein dalam menentukan
konsentrasi akhir protein dalam sel dirangkum oleh persamaan:

di mana P adalah konsentrasi hadir protein yang diberikan, ksyn adalah konstanta urutan
laju untuk sintesisnya, dan kdeg adalah konstanta urutan laju untuk degradasinya. Seperti yang
kita lihat dengan mRNA (hal. 748), konstanta laju degradasi sering dinyatakan dalam bentuk
waktu paruh. Waktu paruh protein seluler berkisar dari beberapa menit hingga beberapa minggu.
Perbedaan waktu paruh seperti itu dapat secara dramatis memengaruhi kemampuan berbagai
protein untuk merespons perubahan kondisi.
Contoh mencolok diberikan oleh perilaku sel-sel hati yang terpapar pada hormon steroid
kortison, yang merangsang sintesis berbagai enzim metabolik. Ketika para peneliti memeriksa
dampak kortison pada dua enzim hati yang terlibat dalam metabolisme asam amino, tryptophan
pyrrolase dan arginase, mereka melihat perbedaan yang nyata: Konsentrasi tryptophan pyrrolase
dengan cepat meningkat sepuluh kali lipat, sedangkan konsentrasi arginase hanya meningkat
sedikit. Pada pandangan pertama, data seperti itu nampaknya mengindikasikan bahwa kortison
secara selektif merangsang sintesis tryptophan pyrrolase. Faktanya, kortison menstimulasi
sintesis tryptophan pyrrolase dan arginase dengan tingkat yang hampir sama. Penjelasan untuk
paradoks yang jelas adalah bahwa tryptophan pyrrolase memiliki waktu paruh yang jauh lebih
pendek (kdeg lebih besar) daripada arginase. Dengan menggunakan hubungan matematis yang
diringkas dalam Persamaan 23-1, perhitungan menunjukkan bahwa konsentrasi protein yang
menunjukkan waktu paruh pendek (kdeg besar) berubah lebih dramatis sebagai respons terhadap
perubahan laju sintetik daripada konsentrasi protein dengan setengah lebih panjang. -kehidupan.
Untuk alasan ini, enzim yang penting dalam regulasi metabolisme cenderung memiliki waktu
paruh pendek, memungkinkan konsentrasi intraselulernya meningkat dengan cepat atau menurun
sebagai respons terhadap perubahan kondisi.
Meskipun faktor-faktor yang menentukan tingkat degradasi berbagai protein tidak
sepenuhnya dipahami, jelas bahwa prosesnya tunduk pada regulasi. Pada tikus yang kekurangan
makanan, misalnya, jumlah enzim arginase dalam hati berlipat ganda dalam beberapa hari tanpa
perubahan terkait dalam tingkat sintesis arginase. Penjelasan untuk peningkatan yang diamati
adalah bahwa tingkat degradasi arginase melambat secara dramatis pada tikus yang kelaparan.
Efek ini sangat selektif; sebagian besar protein terdegradasi lebih cepat, tidak lebih lambat, pada
hewan yang kelaparan.
Ubiquitin Menargetkan Protein untuk Degradasi oleh Proteasomes
Contoh sebelumnya menimbulkan pertanyaan tentang bagaimana degradasi protein
individu diatur secara selektif. Metode yang paling umum untuk menargetkan protein spesifik
untuk penghancuran adalah dengan menghubungkannya dengan ubiquitin, rantai protein kecil
yang mengandung 76 asam amino. Ubiquitin bergabung untuk menargetkan protein dengan
proses yang melibatkan tiga komponen: enzim yang mengaktifkan ubiquitin (E1), enzim
ubiquitinconjugating (E2), dan protein pengenal substrat, atau ubiquitin ligase (E3). Seperti yang
ditunjukkan pada Gambar 23-35, ubiquitin pertama kali diaktifkan dengan melampirkannya pada
E1 dalam reaksi yang bergantung pada ATP. Ubiquitin teraktivasi kemudian ditransfer ke E2 dan
selanjutnya dihubungkan, dalam reaksi yang difasilitasi oleh E3, ke residu lisin dalam protein
target. Molekul tambahan ubiquitin kemudian ditambahkan secara berurutan, membentuk rantai
pendek.
Rantai ubiquitin ini berfungsi sebagai sinyal penargetan yang dikenali oleh struktur besar
yang merendahkan protein yang disebut proteasom. Proteasoma adalah protease dominan (enzim
pengurai protein) dari sitosol dan sering hadir dalam konsentrasi tinggi, terhitung hingga 1% dari
semua protein seluler. Setiap proteasome memiliki berat molekul sekitar 2 juta dan terdiri dari
setengah lusin protease yang terkait dengan beberapa ATPase dan situs pengikatan untuk rantai
ubiquitin. Berbentuk seperti silinder pendek, proteasome berikatan dengan protein di mana-mana
dan menghilangkan rantai ubiquitin mereka. Protein kemudian dimasukkan ke saluran pusat
proteasome dan ikatan peptida mereka dihidrolisis dalam proses yang bergantung pada ATP,
menghasilkan fragmen peptida kecil yang dilepaskan dari ujung silinder yang lain.
Kunci untuk mengatur degradasi protein terletak pada kemampuan untuk memilih protein
tertentu untuk ubiquitylation. Selektivitas ini sebagian berasal dari keberadaan berbagai bentuk
E3, masing-masing mengarahkan keterikatan ubiquitin ke protein target yang berbeda. Salah satu
ciri yang dikenali oleh berbagai bentuk E3 adalah asam amino yang ada di ujung-N dari protein
target potensial. Beberapa asam amino N-terminal menyebabkan protein secara cepat mengalami
ubiquitylated dan terdegradasi; asam amino lainnya membuat protein lebih rentan.
Urutan asam amino internal yang disebut degradasi juga memungkinkan protein tertentu
untuk dipilih untuk dihancurkan. Sebagai contoh, kita melihat di Bab 19 bahwa perkembangan
melalui tahap akhir mitosis dikendalikan oleh kompleks pemacu anafase, yang menargetkan
protein terpilih, seperti mitotic cyclin, untuk degradasi. Kompleks yang mempromosikan anafase
menyelesaikan tugas ini dengan berfungsi sebagai ubiquitin ligase (E3) yang berikatan dengan
protein target yang mengandung jenis degron tertentu, yang mempromosikan ubiquitylation dari
protein target ini dengan E2 dan degradasi selanjutnya oleh proteasom. Selain berpartisipasi
dalam mekanisme selektif untuk mendegradasi protein spesifik pada waktu yang tepat,
proteasom memainkan peran secara umum, mekanisme berkelanjutan untuk menghilangkan
protein yang rusak dari sel. Telah dilaporkan bahwa hingga 30% protein yang baru disintesis
rusak dan segera ditandai dengan ubiquitin, memicu kehancurannya oleh proteasome.

GAMBAR 23-35 Sistem Ubiquitin-Proteasome untuk Degradasi Protein Teratur. Ubiquitin melekat pada
lisin dalam protein yang ditargetkan melalui aksi berurutan dari enzim pengaktivasi ubiquitin (E1), enzim
konjugasi ubiquitin (E2), dan ligase ubiquitin (E3). Proteasome kemudian mendegradasi protein yang
ditargetkan menjadi peptida pendek.

Selain ubikuitylation, protein dapat menjalani modifikasi pasca-translasional terkait,

melalui penambahan pengubah kecil yang terkait ubiquitin (SUMOs). Peptida-peptida ini adalah
polipeptida mirip ubiquitin yang terkonjugasi dengan protein seluler dengan cara yang mirip
dengan ubiquitylation, menggunakan enzim yang serupa. SUMOylation tampaknya memiliki
banyak efek, termasuk mengubah stabilitas protein, pergerakan masuk dan keluar dari nukleus,
dan regulasi fungsi faktor transkripsi.
Meskipun sistem ubiquitin-proteasome adalah mekanisme utama yang digunakan oleh sel
untuk mendegradasi protein, itu bukan satu-satunya cara yang tersedia. Anda telah belajar di Bab
12 bahwa lisosom mengandung enzim pencernaan yang menurunkan semua kelas utama
makromolekul, termasuk protein. Lisosom dapat mengambil dan menurunkan protein sitosol
dengan lipatan membran lisosom, menciptakan vesikel kecil yang diinternalisasi dalam lisosom
dan dipecah oleh enzim hidrolitik organel. Proses microautophagy ini cenderung agak
nonselektif pada protein yang terdegradasi. Hasilnya adalah daur ulang yang lambat dan terus-
menerus dari asam amino yang ditemukan di sebagian besar molekul protein sel. Namun, dalam
kondisi tertentu, degradasi protein nonselektif semacam itu akan merusak sel. Sebagai contoh,
selama puasa yang berkepanjangan, degradasi protein seluler yang tidak selektif dapat
menyebabkan penipisan enzim kritis atau protein pengatur. Dalam kondisi ini, lisosom secara
khusus mendegradasi protein yang mengandung urutan penargetan yang terdiri dari glutamin
diapit di sisinya oleh tetrapeptida yang terdiri dari asam amino yang sangat basa, sangat asam,
atau sangat hidrofobik. Protein yang menunjukkan urutan ini ditargetkan untuk degradasi
selektif, mungkin karena mereka dapat dibuang ke sel.
Ringkasan Regulasi Gen Eukariotik
Anda sekarang telah melihat bahwa regulasi gen eukariotik meliputi beragam mekanisme
kontrol yang beroperasi pada lima level berbeda (lihat lagi Gambar 23-10 untuk ringkasan
visual). Level regulasi pertama, kontrol genomik, termasuk perubahan DNA (amplifikasi,
penghapusan, penyusunan ulang, dan metilasi), dekondensasi dan kondensasi kromatin,
modifikasi histon seperti metilasi dan asetilasi, dan perubahan protein HMG. Tingkat kedua,
kontrol transkripsi, melibatkan interaksi antara faktor transkripsi regulatori dan berbagai jenis
elemen kontrol DNA, yang memungkinkan gen khusus untuk dinyalakan dan dimatikan dalam
jaringan yang berbeda dan sebagai respons terhadap perubahan kondisi. Tingkat ketiga
melibatkan kontrol pemrosesan RNA dan ekspor nuklir dengan mekanisme seperti
penyambungan alternatif dan ekspor mRNA yang diatur melalui pori-pori nuklir. Tingkat
keempat, kontrol translasi, termasuk mekanisme untuk memodifikasi aktivitas faktor-faktor
sintesis protein dan untuk mengendalikan translasi dan degradasi mRNA spesifik melalui
penggunaan represor translasional dan microRNA. Akhirnya, tingkat kelima melibatkan berbagai
mekanisme kontrol posttranslasional untuk mengubah atau mengubah struktur dan fungsi protein
secara permanen, serta mekanisme untuk mengendalikan laju degradasi protein. Jadi, ketika
Anda membaca bahwa perubahan tertentu dalam fungsi atau perilaku seluler didasarkan pada
"perubahan ekspresi gen," Anda harus memahami bahwa penjelasan yang mendasarinya
mungkin melibatkan mekanisme yang beroperasi pada satu atau lebih dari level kontrol ini.
Karena eukariota memiliki genom yang lebih besar daripada prokariota, dan karena
mereka mengemas DNA mereka menjadi serat kromatin yang dipisahkan dari ribosom oleh
amplop nuklir, beberapa mekanisme kontrol yang dirangkum dalam paragraf sebelumnya benar-
benar unik untuk eukariota. Sebagian besar mekanisme kontrol yang ditemukan pada eukariota,
bagaimanapun, memiliki rekan di setidaknya beberapa prokariota juga.