Ekspresi Analisis Mutasi Fenilketonuria

Fenilketonuria adalah genetik autosomal resesif manusia

penyakit yang disebabkan oleh mutasi pada fenilalanin yang
hidroksilase (PAH) gen. Dalam karya ini kami memiliki
digunakan ekspresi sistem yang berbeda untuk mengungkapkan cacat lipat
dari protein PAH disebabkan oleh mutasi fenilketonuria
L348V, S349L, dan V388M. Jumlah mutan
protein dan / atau kegiatan sisa dapat diselamatkan oleh
chaperonin co-berlebih pada Escherichia coli atau
pertumbuhan pada suhu rendah dalam sel COS. thermal stabilitas
profil dan kursus degradasi saat PAH menyatakan
pada E. coli menunjukkan bahwa protein mutan kurang
stabil daripada enzim wild type, juga dikonfirmasi oleh
pulsa-mengejar percobaan menggunakan digabungkan dalam vitro transkripsi-
terjemahan sistem. Ukuran kromatografi eksklusi
menunjukkan diubah oligomerisasi, sebagian dikoreksi
dengan coexpression chaperonins, kecuali untuk
S349L mutan protein, yang ditemukan sebagai tidak aktif
agregat. PAH interaksi subunit dipengaruhi dalam
Protein S349L, seperti yang ditunjukkan dalam twohybrid mamalia
assay. Kesimpulannya, serin 349, terletak di
struktur tiga dimensi yang melapisi situs aktif dan
terlibat dalam pemeliharaan struktural mengikat besi
situs, sangat penting untuk stabilitas struktural dan perakitan
dan juga untuk sifat katalitik dari PAH
enzim, sedangkan L348V dan mutasi V388M mempengaruhi
lipat sifat dan stabilitas protein. itu
eksperimental modulasi aktivitas sisa mutan
memberikan penjelasan yang potensial untuk inkonsistensi yang ada
dalam genotipe-fenotip korelasi.

Fenilalanin hidroksilase mamalia (PAH, 1 fenilalanin

4-monooxygenase, EC 1.14.16.1) adalah besi non-heme dan
tetrahydrobiopterin tergantung enzim yang mengkatalisis hidroksilasi yang
dari fenilalanin menjadi tirosin. Cacat pada manusia
hidroksilase fenilalanin gen (GenBankTM referensi cDNA
urutan U49897, MIM 261.600) menyebabkan fenilketonuria (PKU),
gangguan resesif yang bila tidak ditangani sejak lahir mengarah ke
variabel derajat keterbelakangan mental. PKU dalam banyak
dianggap sebagai "model penyakit genetik," sebagai klinis dan biokimia
karakteristik yang didefinisikan dengan baik, pengobatan yang efektif memiliki
berhasil dilaksanakan, baik gen dan enzim
yang baik ditandai, mutasi telah diidentifikasi, genotipe-
korelasi fenotip telah ditetapkan, dan binatang
model telah diproduksi

(1). Meskipun PKU adalah klasik

monogenik gangguan, fitur yang berhubungan sangat kompleks, sebagai
ditunjukkan oleh Scriver dan Waters (2). Dari sudut genetik
pandang, lebih dari 380 mutasi telah dijelaskan terkait
untuk populasi yang berbeda (3). Setelah mendefinisikan mutasi
spektrum PKU di beberapa populasi, tujuan dari para peneliti
merupakan hasil studi dari genotipe-fenotip korelasi
(4-6). Studi-studi telah membahas penilaian
keparahan dari mutasi secara in vitro analisis ekspresi
dan pemeriksaan fenotip di homozigot atau fungsional
hemizigot pasien. Sampai saat ini 57 PKU mutasi telah
dinyatakan dalam setidaknya satu sistem in vitro (7), dan data
diperoleh telah memungkinkan dalam banyak kasus prediksi biokimia
fenotipe berdasarkan genotip. Namun demikian, beberapa
perbedaan telah terdeteksi di fenotipe genotipe-
korelasi, terutama pada pasien bantalan mutasi yang menghasilkan
protein immunoreactive menurun dan akibatnya
penurunan aktivitas bila diekspresikan secara in vitro (4-6). Ini adalah
kasus mutasi missense banyak, yang secara luas disebut
sebagai menyebabkan ketidakstabilan enzim PAH. Sekarang ada beberapa
laporan mendokumentasikan ketidakstabilan meningkat dan kerentanan
terhadap agregasi dan degradasi PKU protein mutan
(8 -10), dan baru-baru ini, stabilitas termodinamika asli
tipe liar PAH telah diperiksa (11, 12) menganalisis kontribusi
ketidakstabilan ke PKU dibandingkan dengan alasan lain untuk
penurunan aktivitas. Saat ini, pengetahuan tentang tiga dimensi
struktur PAH juga tersedia (13-15), memberikan
informasi penting untuk memahami efek dari mutasi yang berbeda
pada arsitektur protein. Enzim ini disusun
dalam tiga domain, yang fleksibel domain N-terminal peraturan
(Residu 1-110), sebuah domain-heliks katalitik kaya
(Residu 111-410), dan domain yang oligomerisasi (residu
411-452), yang meliputi motif tetramerization di ekstrim
C-terminal akhir (residu 428-452).

Tujuan pekerjaan ini adalah untuk memberikan informasi lebih lanjut

tentang efek dari tiga mutasi titik (L348V, S349L, dan
V388M) pada fungsi PAH, struktur, dan interaksi subunit.
L348V Mutasi telah dilaporkan memiliki 25-33% sisa
aktivitas dalam sel COS (3) dan merupakan contoh yang tidak konsisten
genotipe-fenotip korelasi, karena dikaitkan dengan berbagai
fenotipe pada pasien hemizigot fungsional (5). V388M
adalah salah satu mutasi yang paling sering di Spanyol, dan kami memiliki
menunjukkan bahwa mempertahankan aktivitas 43% dalam sel COS (16), meskipun
tingkat normal protein immunoreactive mutan yang terdeteksi.
Ini efek katalitik jelas adalah tdk sesuai dengan fakta
V388M yang mempengaruhi residu terletak di luar situs aktif dalam struktur tiga dimensi enzim
PAH (13). pada
Sebaliknya, S349L terletak melapisi situs aktif, tetapi ekspresi
baik dalam sel COS dan Escherichia coli yang diberikan yang sangat
tidak stabil protein (17). Untuk memperjelas dan memperluas hasil ini, kami
telah menggunakan sistem ekspresi beberapa pelengkap (eukariotik
dan prokariotik) dan eksperimental kondisi (co-berlebih
dengan chaperonins, suhu pertumbuhan yang berbeda),
memberikan bukti bahwa mutasi mempengaruhi langsung lipat
dan stabilitas protein. Selain itu, kita mengamati bahwa
mutasi S349L juga mempengaruhi sifat katalitik dari
enzim, yang disebabkan oleh fakta bahwa 349 adalah serin
terlibat dalam situs pengikatan besi. Mutan PAH subunit interaksi
telah diperiksa oleh sistem dua hibrida di mamalia
sel, dan oligomerisasi diubah didokumentasikan oleh ukuran
kromatografi eksklusi dari mutan PAH dinyatakan dalam E.
coli sistem. Pendekatan eksperimental yang berbeda digunakan
memungkinkan demonstrasi cacat lipat besar dari mutasi
menyebabkan ketidakstabilan protein, yang dapat dimodulasi secara eksperimental,
mengungkapkan kemungkinan mekanisme untuk memperhitungkan
yang ada inkonsistensi dalam fenotipe genotipe-
korelasi.

PROSEDUR PERCOBAAN

Analisis ekspresi dilakukan dalam sel COS menggunakan RRC / CMV

vektor ekspresi (Invitrogen), seperti yang dijelaskan sebelumnya (16), dan di E.
coli menggunakan pMALc2 (Biolabs) di mana PAH kloning sebagai protein fusi
dengan MBP bawah kendali promotor diinduksi (17, 18). mutasi
diperkenalkan di urutan cDNA PAH oleh situs-diarahkan
mutagenesis menggunakan kit dari Promega Gene Editor. COS sel (4 3
106 atau 6 3 105), ditanam pada 37 atau 27 C yang transfected dengan Lipofectin yang
reagen (Life Technologies, Inc). Bantalan pGroESL plasmid
yang Groes dan gen GroEL dan resistensi kloramfenikol
adalah penanda dari DuPont. Plasmid pMALc2-PAH tipe liar atau
pMALc2-PAH mutan cotransformed dengan pGroESL ke dalam E. coli
JM109, dan koloni dipilih menggunakan piring LB dengan ampisilin
(0,1 mg / ml) dan kloramfenikol (0,1 mg / ml). Sel ditanam pada
37 C, dan ekspresi protein fusi MBPzPAH dan Groes dan
GroEL diinduksi oleh penambahan 1 mM isopropil-1-tio-BD-galactopyranoside.
Pada saat yang sama, 0,2 mM amonium sulfat besi adalah
ditambahkan. Bakteri dipanen 16-21 jam setelah induksi dan terganggu
dengan sonikasi dalam Na-HEPES 20 mM, NaCl 0,2 m, pH 7,0, dengan 1 mg / ml
lisozim dan 0,2 mM Pefabloc. Setelah sentrifugasi, supernatan
(ekstrak protein kasar) digunakan untuk mengukur aktivitas PAH residual dengan
memantau konversi 14C-14C untuk Phe-Tyr (17). Secara singkat, standar
reaksi campuran dilakukan dalam volume 50-ml akhir terkandung 150-300
mg protein total, katalase (10 ml pada konsentrasi 100 unit / ml),
14C-Phe (0,5 mCi, 0,450 mCi / mmol), dan 10 ml 1 mM 6-methyltetrahydropterin
(kofaktor sintetis, ditambahkan terakhir), dalam 20 mM Na-HEPES, 0,2 M
NaCl, pH 7. Setelah 1 jam pada 37 C, reaksi dihentikan oleh mendidih selama
5 menit dan sentrifugasi pada 10.000 3 g selama 5 menit. Contoh 6-ml
supernatan melihat ke pelat KLT, dikembangkan dua kali dalam
kloroform: metanol: amonia (55:35:10), dikeringkan, dan divisualisasikan oleh
autoradiografi.

Protein fusi tipe liar dan mutan dimurnikan dalam sebuah amilosa
disetimbangkan dengan 20 mM Na-HEPES, 0,2 M NaCl, pH 7,0, dan kolom
dielusi dengan buffer berisi 10 mM maltosa (18). Kegiatan PAH juga
diukur dalam fraksi dimurnikan, menggunakan 30-60 mg protein. ukuran
kromatografi eksklusi dari protein fusi dimurnikan dilakukan
pada 4 C setelah kondisi yang dijelaskan (18) dan menggunakan
HiLoad Superdex kolom 200HR (1,6 cm 3 60 cm) dipak dari
Amersham Pharmacia Biotech. Kromatografi cair cepat protein
sistem, UV monitor, dan perekam semua dari Amersham Pharmacia
Biotek. Penugasan satu bentuk enzim yang berbeda untuk puncak yang diperoleh
dalam kromatogram dilakukan dibandingkan dengan sebelumnya
diterbitkan elusi posisi tetramers dan dimer dari protein fusi
(18) dan massa molekul menggunakan estimasi nilai kalibrasi
kurva diperoleh dengan menjalankan protein standar berikut, diperoleh
Amersham Pharmacia Biotech dari: ribonuklease A (13,7 kDa), chymotrypsinogen
A (25 kDa), ovalbumin (43 kDa), albumin (67 kDa),
Aldolase (158 kDa), katalase (232 kDa), feritin (440 kDa), dan tiroglobulin
(669 kDa). Dekstran biru dan aseton digunakan untuk menentukan
volume void (V0 5 44.06 ml) dan volume pengecualian (VT 5 114,9
ml), masing-masing.

Pembelahan protein PAH dari mitra fusi MBP adalah

dilakukan dengan faktor Xa (rasio protein: Xa faktor 1:100) pada suhu 4 C selama 3 jam.
Reaksi selanjutnya diinkubasi pada 4 atau 37 C, dan Aliquot adalah
dihapus pada waktu yang berbeda hingga 24 jam. Setelah SDS-PAGE dan Coomassie
Biru pewarnaan, MBP dan PAH protein yang diukur oleh laser
densitometri.

Para TNT-T7 transkripsi-terjemahan sistem dari Promega adalah

digunakan untuk pulsa-mengejar percobaan. PAH tipe liar dan mutan
cDNA kloning dalam vektor RRC / CMV diamplifikasi menggunakan arti
primer yang memperkenalkan promotor T7 dan Kozak konsensus
dekat dengan ATG inisiasi kodon urutan (59-TAATACGACT
CACTATAGGGAGCCACCATGTCCACTGCGGTCCTGGAA-
39). lima mikroliter
dari produk reaksi polymerase chain dari jenis liar dan
cDNA mutan yang dicampur dengan lisat retikulosit dan [35S] metionin-
sistein (14,3 mCi / ml). Setelah inkubasi 35-menit pada 30 C
reaksi dihentikan dengan kelebihan dingin metionin, RNase (1 mg / ml),
dan DNase (1 mg / ml). Reaksi keseluruhan diinkubasi pada 37 C, dan
Aliquot telah dihapus pada waktu yang berbeda antara 1 dan 8 jam. semua sampel
dipisahkan oleh denaturing elektroforesis gel poliakrilamid, dan
protein PAH berlabel kuantitatif menilai dengan densitometri laser setelah
fluorography.

Profil stabilitas termal dilakukan dengan protein fusi dimurnikan

MBPzPAH dinyatakan dalam E. coli. Aliquot (20 ml, yang mengandung 30-60
mg protein murni) diinkubasi pada temperatur yang berbeda selama 10
min dan dingin di atas es. PAH aktivitas enzim kemudian diukur
seperti dijelaskan di atas.

Selama dua-hibrida analisis kita telah menggunakan Matchmaker mamalia

dua-hibrida assay kit (CLONTECH). Para PGL-G5 plasmid (baik yang disediakan
oleh P. Sta heli) digunakan sebagai vektor wartawan luciferase yang mengandung
gen di bawah kontrol promotor Gal4. Manusia full-length
PAH cDNA dipotong dari phPAH247 (19) dengan SmaI dan EcoRI dan
subcloned ke pBluescript. Untuk memperkenalkan PAH normal seperti fusi
protein ke Gal4 (domain mengikat, BD) dan VP16 (mengaktifkan domain,
M) protein, cDNA PAH itu dipotong dari pBluescript dengan
BamHI dan XbaI dan diligasi dengan AD dan BD vektor sebelumnya
dicerna dengan enzim yang sama. Kedua plasmid dengan cDNA yang normal
disekuensing menggunakan fmol sequencing kit (Promega) untuk mengkonfirmasi
di-frame kloning. Para GeneEditor in vitro situs-directed mutagenesis
sistem dari Promega digunakan untuk memperkenalkan L348V, S349L, dan
V388M mutasi pada urutan PAH. Sel COS yang berlapis dalam 6-baik
piring dengan kepadatan 4 3 105 sel / baik. Dalam setiap 1 mg transfeksi dari masing-masing
plasmid (vektor wartawan, AD-PAH dan BD-PAH vektor) diperkenalkan
menggunakan reagen Lipofectin (Life Technologies, Inc). Sel-sel yang
dipanen setelah 72 jam, dan aktivitas luciferase diukur. dalam
transfeksi percobaan menggunakan RRC / CMVPAH atau dalam dua-hibrida
sistem, protein PAH terdeteksi oleh Western blot menggunakan PH8 anti-
PAH monoklonal antibodi (20).

Untuk pemodelan homologi, model tiga dimensi dari L348V,

S349L, dan V388M dibangun atas dasar dari fenilalanin manusia
hidroksilase koordinat ditentukan oleh kristalografi sinar-x (13, 14,
15) (Protein Data Bank aksesi Kode 1PAH dan 2PAH). dalam
masing model, residu alanin sebelumnya diperkenalkan di
situs mutasi yang sesuai ditukar untuk residu benar.
Model tersebut dioptimalkan untuk stereokimia dan disempurnakan oleh energi
minimisasi menggunakan X-PLOR (21). Energi-diminimalkan struktur
dipanaskan pada 1000 K dan selanjutnya disempurnakan dengan pendinginan lambat
simulated annealing dinamika molekul protokol menggunakan X-PLOR.

HASIL
Seperti dijelaskan dalam sebuah laporan awal, kami telah diekspresikan
dan afinitas dimurnikan PAH protein sebagai protein fusi MBP dengan
(17). PAH dengan mutasi S349L menghasilkan tidak stabil
protein tidak terdeteksi dalam SDS-PAGE. Ungkapan ini
mutasi pada sel eukariotik menunjukkan bahwa enzim mutan
tidak terdeteksi oleh Western blot, dan akibatnya tidak ada sisa
aktivitas pada bakteri maupun dalam sel-sel COS dapat diukur (17). di
pekerjaan ini, kami telah menambah analisis ekspresi untuk dua
mutasi lain, L348V dan V388M, yang telah sebelumnya
dilaporkan untuk mempertahankan aktivitas sisa dalam sel COS, 25-33%
untuk L348V (3) dan 43% untuk V388M (16). Berdasarkan muncul
melihat bahwa mutasi missense banyak penyebab penyakit manusia
cacat lipat mengakibatkan ketidakstabilan protein (22), kita memiliki
menguji hipotesis ini menggunakan pendekatan eksperimental yang berbeda
dikenal untuk mencegah missfolding protein dinyatakan dalam eukariotik
dan sistem prokariotik.

Studi-In Ekspresi prokariotik prokariota, PAH dinyatakan sebagai protein fusi dengan MBP.
Ekspresi
protein mutan dibandingkan dengan wild type menghasilkan
variabel tetapi lebih rendah hasil protein fusi. Ketika kami melakukan
co-overekspresi dari pGroESL plasmid, ada
peningkatan dalam jumlah protein fusi, baik untuk
liar jenis dan PAH mutan, meskipun efeknya lebih
diucapkan untuk protein mutan, terutama bagi PAH menyimpan
S349L, yang seperti yang dijelaskan sebelumnya, tidak terdeteksi
tanpa chaperonin coexpression (Gambar 1). Dengan demikian, tingginya tingkat
Groes dan GroEL memiliki efek stabilisasi jelas pada mutan
protein, mengungkapkan cacat primer di lipat dan / atau oligomer
perakitan. Peningkatan protein mutan berkorelasi dengan
peningkatan aktivitas katalitik residual dengan coexpression chaperonin,
kecuali untuk mutasi S349L, enzim yang tidak
aktivitas diselamatkan (Tabel I).

Keadaan oligomer dari protein fusi dianalisis dengan

ukuran kromatografi eksklusi. Hal ini sebelumnya telah dijelaskan
bahwa struktur oligomer dari PAH mirip sebagai
fusi protein dengan MBP dan enzim sebagai terisolasi (18, 23), dan
hasil kami juga menunjukkan bahwa protein fusi wild type diselesaikan
menjadi tiga komponen utama, sebagian kecil dari molekul tinggi
massa agregat, eluting pada volume kosong kolom, seorang mayor
sesuai dengan tetramers fraksi, dan komponen kecil
dimer. Dengan coexpression chaperonin, tidak ada yang substansial
perubahan profil oligomer dari protein wild type (Gambar 2).
Mengenai protein mutan, L348V dan protein fusi V388M
menunjukkan proporsi yang jauh lebih rendah dari tetramers dan peningkatan
jumlah bentuk agregat. Ketika V388M ini coexpressed
dengan Groes dan GroEL, puncak utama yang sesuai dengan
bentuk tetrameric diamati dengan penurunan seiring dalam
bentuk agregat. Untuk L348V dengan chaperonins proporsi
dari tetramers juga meningkat, meskipun masih ada cukup
jumlah agregat (Gbr. 2). Sebaliknya, S349L
protein diselamatkan oleh coexpression chaperonin secara eksklusif pulih
sebagai agregat.

Selain lipat gangguan, mutasi bisa juga

mempengaruhi stabilitas enzim dirakit. Karena itu, kita
menganalisis profil inaktivasi termal untuk L348V dan
Protein fusi V388M dimurnikan dalam sistem ekspresi pMalc2.
Kurva enzim mutan jelas bergeser ke
suhu yang lebih rendah, menunjukkan stabilitas berkurang (Gambar 3).
Setengah denaturasi suhu adalah 59 C untuk wildtype yang
enzim, 50 C untuk L348V, dan 51 C untuk mutan V388M
protein. Profil denaturasi serupa diamati jika
enzim dinyatakan dengan atau tanpa chaperon
Pendekatan lain yang digunakan untuk menganalisis efek dari PAH
mutasi pada stabilitas protein dilakukan setelah
pencernaan dengan faktor Xa dari normal dimurnikan dan mutan
fusi protein. Protein dibelah yang kemudian diinkubasi
pada 4 atau 37 C sampai 24 jam, dan Coomassie Biru bernoda
band yang diukur dengan densitometri laser. Setelah pembelahan MBP dan wild type PAH pada
dasarnya stabil hingga 24 h,
rasio PAH / MBP dekat dengan 1 hingga 24 jam. Sebaliknya, segera
setelah pembelahan, jumlah PAH mutan terdeteksi
bentuk, dinyatakan sebagai PAH / MBP rasio, dikurangi menjadi 50% (untuk
V388M), 40% (L348V), atau 20% (dalam kasus S349L). ini
sisa protein mutan stabil hingga 24 jam. Data serupa
diperoleh jika protein fusi yang coexpressed dengan atau tanpa
chaperonins (data tidak ditunjukkan).

Studi-Untuk Ekspresi eukariotik menguji relevansi

ini hasil yang diperoleh dalam sistem ekspresi E. coli, yang
mutasi juga disajikan dalam sel COS pada temperatur yang berbeda,
27 dan 37 C Pada suhu rendah, S349L mutan
protein dapat dideteksi dengan analisis Western blot, mencapai
dekat tingkat normal, walaupun tidak ada kegiatan diselamatkan. kedua
L348V dan V388M menunjukkan peningkatan aktivitas sisa pada
27 C, 38-77% dan 43-78%, masing-masing. barat
analisis blot menunjukkan tingkat yang sama dari immunoreactive
protein untuk protein tipe liar dan mutan diekspresikan di kedua
suhu (Tabel I).

Ekspresi dengan di Vitro Transkripsi-Terjemahan-Untuk mengkonfirmasi

cacat lipat menyebabkan ketidakstabilan protein, kita mempelajari
efek dari tiga mutasi pada stabilitas protein PAH
menggabungkan pulsa-mengejar metode dengan ekspresi protein dalam sistem ekspresi sel-
bebas. Dalam transkripsi dan translasi in vitro
dari cDNA mutan menghasilkan protein berlabel dalam
sama jumlah dengan tipe liar. Berlabel normal dan mutan
protein diinkubasi pada 37 C selama 7-jam. densitometri
kuantifikasi menunjukkan bahwa protein mutan
terdegradasi sedikit lebih cepat daripada enzim wild type, yang
efek akan lebih parah untuk protein S349L (Gambar 4).

Dua-hibrida Tes-Pengaruh mutasi titik pada

interaksi protein-protein dianalisis menggunakan dua-hibrida
assay pada sel mamalia. PAH protein diekspresikan fusi
DNA mengikat Gal4 domain (BD-PAH) dan aktivasi VP16
domain (AD-PAH). Co-transfeksi dari protein wild type
Gal4-PAH-PAH VP16 dan mengarah pada ekspresi
cotransfected penanda luciferase. Tidak ada perubahan substansial dalam luciferase
ekspresi diamati untuk L348V dan V388M
protein, menunjukkan bahwa mutasi ini tidak mempengaruhi
interaksi antara subunit PAH. Sebaliknya, luciferase
pekerjaan yang didapat setelah cotransfection dengan protein fusi S349L
berkurang menjadi 10% (Tabel I). Western blot studi
ekstrak dari sel COS cotransfected dilakukan, dan
protein mutan diekspresikan sebagai protein fusi dari BD dan AD
terdeteksi pada tingkat yang sama dengan tipe liar, menunjukkan bahwa
penurunan aktivitas luciferase ketika mutasi S349L adalah
ini bukan karena menurunnya tingkat protein fusi.

Tiga dimensi Struktural Analisis dan Pemodelan Molekul-

Struktural implikasi dari L348V, S349L, dan
Mutasi V388M didasarkan pada struktur kristal
dimer (residu 117-424) dan tetrameric (residu 118-452)
bentuk PAH (kode aksesi PDB 1PAH dan 2PAH). serin
349 terletak melapisi situs aktif, membentuk ikatan hidrogen
dengan histidin 285, yang merupakan salah satu dari enam ligan koordinasi
dari atom besi (Gambar 5A). Leusin 348 terletak di bagian dalam
protein, di dekat besi, pada jarak 10
. Valin 388 terletak di selembar b-hidrofobik, jauh dari
situs aktif, dikelilingi oleh leucines 333 dan 365.

PEMBAHASAN
Saat ini, sebagian besar mutasi missense PKU yang memiliki
ditandai diyakini menggoyahkan struktur protein.
Lebih dari 50 mutasi telah dinyatakan setidaknya dalam
satu dari sistem in vitro, dan kebanyakan dari mereka memiliki tingkat penurunan atau tidak ada
immunoreactive protein, berhubungan dengan penurunan atau tidak ada
sisa kegiatan dan tidak mempengaruhi tingkat mRNA (7). degradasi
protein PAH menyembunyikan mutasi missense bisa
dipromosikan oleh cacat dalam pelipatan atau dalam perakitan oligomer, seperti
telah diusulkan dalam studi terbaru mendokumentasikan oligomerisasi diubah
dan / atau peningkatan agregasi protein mutan PAH
(8, 10, 24). Dalam karya ini, kami melaporkan efek dari L348V,
S349L, dan mutasi V388M pada stabilitas PAH
protein melalui pendekatan eksperimental yang berbeda untuk mengungkapkan kemungkinan
lipat cacat.
Pekerjaan sebelumnya kami menunjukkan bahwa mutasi S349L
diekspresikan pada E. coli sebagai protein fusi MBP dengan menghasilkan
protein tidak stabil tidak terdeteksi dalam SDS-PAGE. Hal ini sesuai
dengan situasi di mana sel-sel COS S349L juga
tidak stabil dan tidak terdeteksi oleh Western Blot (17). Namun, kami menunjukkan bahwa
protein mutan dapat diselamatkan oleh chaperonin tinggi
tingkat dalam E. coli atau suhu rendah dalam sel COS, yang
dikenal untuk mengurangi cacat lipat, seperti yang telah dijelaskan dalam
lain penyakit yang melibatkan enzim mitokondria seperti media
rantai asil-KoA dehidrogenase (25), rantai pendek asil-KoA
dehidrogenase (26), atau E1 dekarboksilase dari rantai cabang
a-keto asam dehidrogenase kompleks (27). Namun demikian, katalitik
aktivitas dari protein mutan tidak diselamatkan baik
sistem, seperti yang dapat diprediksi dari hasil yang diperoleh setelah ukuran
kromatografi eksklusi dari protein fusi dinyatakan dalam E.
coli, yang terdiri eksklusif agregat tidak aktif. ini
menunjukkan bahwa selain dari perubahan struktural ada juga
katalitik efek. Dalam tiga hydroxylases asam amino aromatik,
PAH, tirosin hidroksilase, dan hidroksilase triptofan, yang
besi katalitik dikoordinasikan oleh tiga amino yang sangat lestari
asam (28). Dalam PAH itu dikoordinasikan oleh dua histidines (residu
285 dan 290) dan satu asam glutamat (residu 330), dan serin
349 membentuk ikatan hidrogen dengan histidin 285 peserta
langsung dalam pemeliharaan struktural dari situs pengikatan besi
(13). Pemeliharaan situs mengikat besi sangat penting untuk
integritas struktural dari monomer memungkinkan lipat yang benar /
oligomerisasi protein (29). Dengan cara ini, penggantian
dari residu penting akan mempengaruhi mengikat besi
situs (Gambar 5B) dan kemudian perakitan yang benar dari
PAH dimer dan karena itu kapasitas hidroksilasi dari
enzim.

Hasil yang diperoleh dengan L348V dan V388M menunjukkan bahwa mereka
yang mutasi struktural mempengaruhi lipat dan perakitan untuk
aktif tetramers. Ketika diekspresikan pada E. coli sebagai protein fusi,
jumlah protein dan peningkatan aktivitas residual dengan
Groes dan coexpression GroEL. Groes dan GroEL adalah
homolog prokariotik dari Hsp60/Hsp10 eukariotik, yang
pelabuhan domain ATPase dan diduga membantu polipeptida
melipat oleh sebagian berlangsung konformasi nonfunctional
bahwa dengan demikian lolos degradasi reinitiating proses lipat
(30). Meningkatkan kolam chaperonins karena itu akan meningkatkan
fraksi protein yang memperoleh konformasi fungsional.
Selain lipat gangguan, percobaan inaktivasi termal
mengungkapkan bahwa setengah denaturasi suhu dari
protein mutan jelas bergeser ke suhu yang lebih rendah,
menunjukkan stabilitas penurunan enzim dirakit dan terlepas
apakah protein telah diungkapkan dengan atau
tanpa chaperonins. Suhu setengah denaturasi diperoleh
untuk tipe liar fusi protein (59 C) berkorelasi dengan
hasil yang diperoleh oleh spektroskopi IR untuk PAH terisolasi
enzim (11).

Hasil Yang diperoleh Mencari Google Artikel L348V Dan V388M menunjukkan bahwa mereka
Yang MUTASI struktural mempengaruhi lipat Dan perakitan untuk
Aktif tetramers. Ketika diekspresikan PADA E. coli sebagai protein Fusi,
jumlah protein Dan peningkatan aktivitas sisa Mencari Google Artikel
Groes Dan coexpression GroEL. Groes Dan GroEL adalah
homolog prokariotik bahasa Dari Hsp60/Hsp10 eukariotik, Yang
Pelabuhan domain ATPase Dan diduga membantu polipeptida
melipat Oleh sebagian berlangsung nonfunctional konformasi
bahwa Google Artikel Baru demikian lolos degradasi reinitiating proses pengambilan lipat
(30). Meningkatkan kolam chaperonins KARENA ITU Akan meningkatkan
Fraksi protein Yang memperoleh konformasi Fungsional.
Selain lipat gangguan, Percobaan inaktivasi termal
mengungkapkan bahwa Setengah denaturasi SUHU bahasa Dari
protein mutan jelas bergeser Ke SUHU Yang lebih rendah,
menunjukkan penurunan stabilitas enzim dirakit Dan terlepas
apakah protein telah diungkapkan Mencari Google Artikel Baru atau
Tanpa chaperonins. Suhu Setengah denaturasi diperoleh
untuk tipe pembohong Fusi protein (59 C) berkorelasi Mencari Google Artikel Baru
Hasil Yang diperoleh Dibuat spektroskopi IR untuk PAH terisolasi
enzim (11).

Ukuran kromatografi eksklusi menunjukkan oligomerisasi sebuah

cacat karena sebagian besar protein mutan hadir sebagai agregat
bentuk, dan proporsi tetramers, yang merupakan
paling aktif bentuk (aktivitas spesifik '2, 5-kali lipat dibandingkan dengan
dimer) (23), secara jelas berkurang dibandingkan dengan wildtype yang
protein. Dalam kasus V388M, coexpression dari chaperonins
jelas menggeser profil oligomer untuk sebagian kecil dominan
tetramers. Untuk L348V, efek chaperonins tampaknya
terutama peningkatan jumlah protein. Pada sel COS kami
mengamati dekat jumlah normal protein mutan immunoreactive
pada 37 C dikaitkan dengan aktivitas dikurangi (38% untuk L348V
dan 43% untuk V388M). Hal ini dapat dijelaskan oleh fakta bahwa
kapasitas sistem lipat dalam sel COS tampaknya tidak
sehingga tingkat yang membatasi seperti dalam E. coli, yang lebih sensitif untuk
mengungkapkan
mutasi lipat, seperti yang telah dikatakan dalam rantai menengah asil-
KoA dehidrogenase defisiensi (31). Pada sel COS, mutan PAH
protein tampaknya terjebak dalam konformasi relatif stabil,
yang dapat merupakan intermediate lipat atau, dalam setiap
kasus, bukan bentuk benar dirakit tetrameric aktif sepenuhnya.
Menurunkan suhu budidaya memiliki efek positif yang jelas
dalam hasil protein mutan memperoleh konformasi fungsional,
sebagaimana tercermin dari peningkatan aktivitas sisa untuk dekat
level normal. Analisis struktur tiga dimensi menunjukkan
tidak jelas konsekuensi untuk mutasi L348V dan V388M, sebagai
tidak ada perubahan drastis diperkirakan. Namun, semua hasil yang diperoleh
baik di prokariotik dan eukariotik sistem ekspresi yang jelas dan menunjukkan efek asli pada
lipat untuk
L348V dan V388M mutasi

Kami juga menggunakan uji dua-hibrida dalam sel mamalia

sebagai pendekatan yang kuat untuk analisis pengaruh PKU
mutasi pada perakitan / oligomerisasi dari dimer PAH. di
percobaan ini ekspresi gen pelapor menyiratkan asosiasi
antara dua subunit PAH berbeda. para dramatis
penurunan aktivitas luciferase ketika sel-sel COS yang transfected
dengan protein mutan S349L menunjukkan efek
mutasi ini pada oligomerisasi enzim. di
Sebaliknya, L348V dan V388M menunjukkan tidak berpengaruh pada proteinprotein yang
interaksi dalam uji dua-hibrida, konsisten dengan
adanya beberapa dimer dan tetramers di prokariotik
ekspresi sistem. Hasil berkorelasi dengan pengamatan
dalam sistem eukariot mana ada beberapa aktivitas residual
hadir.

Sebagai kesimpulan penelitian ini menunjukkan bahwa

L348V, S349L, dan V388M mutasi mempengaruhi sifat lipat
dari protein PAH, meskipun S349L juga menunjukkan katalitik
akibat, karena residu ini terlibat langsung dalam besi
mengikat situs. Selain itu, kami menunjukkan bahwa L348V dan
V388M juga mempengaruhi stabilitas enzim sekali dirakit.
Paling signifikan, kami menunjukkan bahwa eksperimen jumlah
protein dapat dimodulasi tergantung pada chaperonin dan suhu
kondisi, memberikan petunjuk untuk menjelaskan genotypephenotype yang
inkonsistensi dijelaskan untuk beberapa mutasi. ini
hasil yang diperoleh dengan protein sitoplasmik memperpanjang sejenis di
penelitian in vitro enzim mitokondria (25-27), mengungkapkan
umum mekanisme kelainan genetik banyak.